Северин Е.С. - Биохимия

БИОХИМИЯ УЧЕБНИК АА. Я ВУЗОВ TOTAP-Men http://www.bestmedbook.com/ УДК 577.1(075.8) ББК 28.072я73 Б63 Рецензенты Зав. кафедрой биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики Астраханской государственной медицинской академии, канд. мед. наук, проф. Д.М. Никулина Зав. кафедрой общей и клинической биохимии No1 Ростовского государственного медицинского университета, докт. биол. наук, проф. З.И. Микашинович Зав. кафедрой общей и клинической биохимии No2 Ростовского государственного медицинского университета Л.М. Пустовалова коллектив Алейникова Т.Л., Авдеева Л.В., Андрианова Л.Е., Белушкина Н.Н., Волкова Н.П., Воробьева С.А., Голенченко В.А., Губарева А.Е., Корлякова О.В., Лихачева Н.В., Павлова Н.А., Рубцова Г.В., Силаева С.А., Силуанова С.Н., Титова Т.А. Б63 Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – 2-е изд., испр. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 784 с.: ил. – (Серия «XXI век»). ISBN 59231-0390-7 В учебнике рассмотрены основные положения классической биохимии. Приведены сведения о струк туре и свойствах биомолекул, биоэнергетике, молекулярных основах физиологических функций челове ка. Рассмотрены биохимические особенности важнейших органов и тканей. Изложены современные представления омолекулярных основах нарушений при ряде патологических состояний и болезней. Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, аспирантов. УДК 577.1(075.8) ББК 28.072я73 ISBN 5-9231-0390-7 АВТОРЫ Северин Евгений Сергеевич, докт. хим. проф., чл.-корр. РАН, зав. кафедрой биохимии ММА им. И.М. наук, Сеченова, ген. директор ОАО «Всесоюз ный научный центр молекулярной диагностики и лечения», редактор издания. Алейникова Татьяна Леонидовна, канд. доц. кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова (раздел 7), ответственный биол. наук, автор издания. Авдеева Людмила Викторовна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 6, 11). Андрианова Людмила Евгеньевна, канд. биол. наук, старший преподаватель кафедры биологической хи мии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 12, 15). Белушкина Наталья Николаевна, доц. кафедры био химии ММА им. И.М. Сеченова, ученый Молекулярная медицина секретарь ММА им. НИИ. Сеченова (раздел 2). Волкова Наталья Петровна, канд. мед. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Се ченова (раздел 1). Голенченко Вера Александровна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сече Нова (разделы 4, 5). Воробьева Светлана Анатольевна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 7, 11). Губарева Александра Евгеньевна, канд. мед. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сече нова (раздел 8). Корлякова Ольга Вениаминовна, канд. биол. наук, старший преподаватель кафедры биологической хи мии ММА им. И.М. Сеченова (раздел 9). Лихачева Нина Викторовна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Се ченова (раздел 9). Павлова Нина Александровна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сече нова (разделы 3, 6). Рубцова Галина Васильевна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Се ченова (разделы 3, 6). Алексеевна, докт, проф. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 4, 10, 16). Силуянова Светлана Николаевна, канд. биол. наук, доц. кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 12, 13, 15). Титова Татьяна Алексеевна, канд. биол. наук, стар ший преподаватель кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова (разделы 13, 14). Силаева Светлана биол. ПРЕДИСЛОВ ИЕ Биохимия — сравнительно молодая наука, возниқ шая на стыке биологии и химии в конце XIX века. Она изучает процессы развития и функционирования организмов на языке молекул, структуру и химичес- кие процессы, которые обеспечивают жизнь одно- и многоклеточных существ, населяющих Землю. Выда- ющиеся открытия в области учения о ферментах, биохимической генетики, молекулярной биологии и био энергетики превратили биохимию в фундаментальную дисцилину, позволяющую наук, решать многие важные проблемы биологии и медицины, Настоящий учебник является результатом мно голетней преподавательской кафедры биохимии Московской медицинской ака демии, и работы коллектива содержит информацию, касающуюся, глав ным образом, биохимии человека. Учебник пред назначен студентам и преподавателям медицинских вузов. По структуре и содержанию он соответству ет программе по биохимии для студентов медицин ских вузов, утвержденной Министерством здраво охранения РФ. Учебник знакомит читателей со структурно-функ циональными компонентами клеток и процессами, лежащими в основе жизнедеятельности здорового орга низма, а также с некоторыми нарушениями, которые приводят к возникновению болезней. Для него харак терно акцентирование внимания читателя на значении рассматриваемых вопросов для медицины. Книга со держит 16 разделов и приложение, в которое входят список сокращений, предметный указатель, словарь тер минов и лабораторные показатели. Первые разделы посвящены структуре и функциям белков, ферментов, витаминов и нуклеиновых кислот, подробно рассмат ривается синтез и регуляция информационного пото ка ДНҚ-РНКөбелок, причины, лежащие в основе биохимической индивидуальности организмов и воз никновения наследственных болезней. В разделах по обмену углеводов, липидов и аминокислот Внимание читателей фокусируется на процессах, обеспечиваю щих образование и потребление энергии в тканях орга низма и участие этих соединений в формировании структурных компонентов клеток. В книге обсуждает ся ключевая роль гормонов в межклеточных действиях и регуляции обмена веществ. Учебник со держит также ряд взаимо специализированных разделов: биохимия межклеточного матрикса, обезвреживание Токсических веществ в организме, биохимия крови, ОН когенез, представляющих особый интерес для медиков и врачей. Информация, приведенная во всех главах учебника, дана в соответствии с современным уровнем научных знаний в этих областях. Надеюсь, что учебник заинтересует широкий круг Читателей и окажется Полезным для рантов и научных сотрудников, работающих в области общей студентов, аспи и клинической биохимии, молекулярной биоло гии и медицины. Большое количество схем и рисунков, которыми усвоение снабжена книга, должны облегчить материала и могут быть использованы в преподавании биохимии. В то же время коллектив авторов готов рас смотреть предложения по улучшению книги и крити ческие замечания читателей, которые можно выслать по электронной почте: info@geotar.ru. составе Т.Л. Алейниковой, Л.В. Авдеевой, Н.П. Вол ковой, В.А. Голенченко, Благодарю коллектив авторов и особенно группу в А.Е. Губаревой и С.А. Сила евой за помощь в редакционной работе, а также со трудникам Издательского дома «ГЭОТАР-МЕД». Зав. каф. биохимии ММА им. И.М. Се ченова, чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северин СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ * или # — с последующим кодом из 6 цифр (символы * или # указывают на наличие аллелей, разных фе- нотипов заболевания или же включение в состав нозологической единицы нескольких и разных по ражённых генов) — менделевское наследование (по http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/). = — синоним * -аутосомное доминантное наследование р — аутосомное рецессивное наследование 8 — связанное с Х-хромосомой наследование В- клетки (в произносят как бэ) — В-лимфоциты CI, C2, С3 (произносят как си) и т.д. -компоненты системы комплемента 1, 2, 3 и т.д. Са?* катион(ы) кальция, ион(ы) кальция; ионизи рованный (свободный) кальций CD (от cluster of differentiation [произносят как си ди), кластер дифференцировки), см. Маркёр С!“ — анион(ы) хлора Fab см. «Фрагмент» FAD -- флавинадениндинуклеотид FMN - флавинмононуклеотид Н* - ион(ы) водорода, протоны (Н! — концентрация ионов водорода Hb — гемоглобин НЬСО — карбоксигемоглобин НЬО, — гемоглобин оксигенированный HLA (произносят как эйч эль эй, от human leukocyte antigens), см. «Антиген», см. «МНС» {g - иммуноглобулин, иммуноглобулины IRE – iron-responsive element, железочувствитель ный элемент К* -катион(ы) калия (К*) - концентрация ионов калия LT — leucotrіеnеѕ, лейкотриены MetHb – метгемоглобин МНС (произносят как эм эйч си, от major histocom patibility complex, главный комплекс гистосовмести мости) M— кажущаяся молекулярная масса Na* -- катион(ы) натрия [Nat) - концентрация ионов натрия NAD -никотинамидадениндинуклеотид NADP -никотинамидадениндинуклеотидфосфат No — оксид азота (NO), вырабатываемый в эндоте лий фактор релаксации (вазодилатации) HTф - нуклеозидтрифосфаты pСО, — парциальное напряжение двуокиси углеро да в артериальной крови pСО, — парциальное давление двуокиси углерода PG рrоstaglandins, простагландины Pi (H, PO) фосфат неорганический ро, — парциальное давление кислорода PPі (НР,0,) -пирофосфат неорганический SАГ – Sаденозилгомоцистеин SAM — Sаденозилметионин T, - трийодтиронин T, — тетрайодтиронин, тироксин Т-клетки --- Тлимфоциты TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухолей TX — тромбоксаны VIP (от Vasoactive Intestinal Polypeptide) вазоак тивный интестинальный (кишечный) полипептид (недопустимо написание – ВИП) Аг - антиген, антигены АД — артериальное давление АДГ — антидиуретический гормон (вазопрессин) АДФ - аденозиндифосфорная кислота, аденозинди фосфаты АКТГ - адренокортикотропный гормон АЛТ аланинаминотрансфераза АМФ — аденозинмонофосфат(ы) цАМФ — циклический аденозин-3",5'-монофосфат аrіоЛП - алолипопротеин АПФ -- ангиотензинпревращающий фермент АСТ ~ астартатаминотрансфераза АТ - антитело, антитела АТФ -- аденозинтрифосфорная кислота АТФ-аза -- аденозинтрифосфатаза All -- аденилатциклаза АХАТ - ацетил-КоАхолестеролацилтрансфераза BMK Высокомолекулярные кининогены ГАМК - Y- аминомасляная кислота ГДФ гуанозиндифосфат ГМК -- гладкомышечная клетка ГМФ — гуанозинмонофосфат ГПЭТЕ — гидрогероксидэйкозaтeтроеноаты ГТ — глутатионтрансфераза ГТФ - гуанозинтрифосфат ГЭТЕ — гидроксиэйкозaтeтроеноаты Д- дальтон (госле числового значения) ДАГ — диацилглицеролы ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДОФА — диоксифенилаланин ДФФ — диизопропилфторфосфат ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ИЛ - интерлейкин, интерлейкины ИМФ — инозинмонофосфат ИФ, -- инозинтрифосфат ИФН - интерферон, интерфероны кД -килодальтон КК — креатинкиназа КоА — кофермент (коэнзим) А Kog — кофермент (коэнзим) Q КЩP – кислотно-щелочное равновесие кф — Классификация Ферментов (<http: //www. expasy.ch/sprot/enzyme.html>). ҚФ приведены по Enzyme Nomenclature (NC-IUBMB, Комитет по Но менклатуре Международного Союза по Биохимии и Молекулярной Биологии) ЛГ — лютеинизирующий гормон, лютропин ЛДГ — лактатдегидрогеназа ЛП липопротейны ЛПВП — липопротеины высокой плотности ЛП-липаза - липопротеинлиrтаза ЛПНП — липопротеины низкой плотности ЛПОНГI — липопротеины очень низкой плотности ЛППТ — липопротеины промежуточной плотности ЛХАТ лецитинхолестеролацилтрансфераза МАГ моноацеилглицероны МАО -- моноаминооксидаза ОГІК - общий путь катаболизма мяPHII — малые ядерные рибонуклеопротеины ПТГ — паратиреоидный гормон СЕ - субъединица ПКА — протеинкиназа А ПКС — протеинкиназа с ПОЛ - перекисное окисление липидов ПОМК -проолиомеланокортин ПФ - пиридоксальфосфат ПЦР — полимеразная цепная реакция ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты РНК — рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная РНК рРНК — рибосомная РНК тРНК - транспортная РНК PHP -рибонуклеотидредуктаза РЭС ретикулоэндотелиальная система ССС — сердечно-сосудистая система СТГ — соматотропный гормон ТАГ триацилглицеролы ТДФ — тиаминдифосфат ТТГ — тиреотропный гормон УДФ — уридиндифосфат УМФ — урилинмонофосфат УТФ - уридинтрифосфат УФО — ультрафиолетовое облучение ФАФС – 3-фосфоаденозин-5-фосфосульфат ФРДФ — фосфорибозилдифосфат ФСГ – фолликулостимулирующий гормон, фолли тропин ХГТ — хорионический гонадотропин ХМ - Хиломикроны ЦДФ — цитидиндифосфат ЦМФ Цитидинмонофосфат ЦНС -- центральная нервная система ЦПЭ -- цепь переноса электронов ЦТК — циклі трикарбоновых кислот, цикл Кребса ЦТФ --цитидинтрифосфат ЭР - эндоплазматический ретикулум РАЗДЕЛ СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ в живых клетках происходит синтез множества органических молекул, среди которых главную роль играют полимерные макро молекулы — белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды. жит белкам. От родителей детям передаётся генетическая инфор мация о специфической структуре и функциях всех белков данно го организма. Синтезированные белки выполняют Особая роль в жизнедеятельности живых организмов Принадле многообразные функции: ускоряют химические реакции, выполняют транспорт ную, структурную, защитную функции, участвуют в передаче сиг налов от одних клеток другим и таким образом реализуют наслед ственную информацию. Поэтому белки называют также протеинами (от греч. proteos — первый). На долю белков внутри клетки приходится более половины их сухого вещества. В организме человека насчитывают около 50 000 индивидуальных белков. Видовая и Индивидуальная специфичность набора белков в данном организме определяет особенности его строения и функционирования. Набор белков в дифференцирук щихся клетках одного организма определяет морфологические и функциональные особенности каждого типа клеток. Как и любой полимер, белок состоит из мономерных единиц, или «строительных блоков». В белках организма человека такими мономерами служат 20 из нескольких сотен известных в природе аминокислот. Аминокислоты, находящиеся в белках, связаны друг с другом пептидными связями, Линейная последовательность ами нокислот в белке уникальна для каждого индивидуального белка; информация о ней содержится в участке молекулы ДНК, называе мой геном. Полипептидные цепи за счёт внутримолекулярных взаимодей ствий образуют пространственные структуры — конформации бел ков. На определённом участке белковой молекулы из радикалов аминокислот формируется активный центр, который может спе цифично (комплементарно) связываться с молекулами-лигандами. Взаимодействие белков с лигандами лежит в основе их функцио нирования. Изменения последовательности аминокислот в белках могут приводить к изменению пространственной структуры и фун кций данных белков и развитию заболеваний, 1. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ БЕЛКОВ. ПЕПТИДНЫЕ СВЯЗИ, СОЕДИНЯЮЩИЕ АМИНОКИСЛОТЫ В ЦЕПИ 19 из 20 аминокислот содержат в а-положе нии асимметричный атом углерода, с которым связаны 4 разные замещающие группы. В ре зультате эти аминокислоты в природе могут на-- ходиться в двух разных изомерных формах — L и D. Исключение составляет глицин, который не имеет асимметричного а-углеродного атома, так как его радикал представлен только атомом водорода. В составе белков присутствуют толь ко Lизомеры аминокислот. COOH НәN-C-H CH3 LАланин Белки — полимерные молекулы, в которых мономерами служат аминокислоты. В составе белков в организме человека встречают только 20 а-аминокислот. Одни и те же аминокислоты присутствуют в различных по структуре и фун кциям белках. Индивидуальность белковых мо лекул определяется порядком чередования аминокислот в белке. Аминокислоты можно рас сматривать как буквы алфавита, при помощи которых, как в слове, записывается информа ция. Слово несёт информацию, например о предмете или действий, а последовательность аминокислот в белке несёт информацию о по строении пространственной структуры и функ ции данного белка. COOH H-C-NH, CH3 DАланин COOH H2N-C-H H Глицин (не имеет изомерных форм) А. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ 1. Общие структурные особенности аминокислот, входящих в состав белков Общая структурная особенность аминокис лот наличие аминои карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же о-углеродным ато Мом. R — радикал аминокислот — в простейшем случае представлен атомом водорода (глиЦИН), но может иметь и более сложное строение. Чистые L- или D-стереоизомеры могут за дли тельный срок самогіроизвольно и неферментатив но превращаться в эквимолярную смесь L- и D Изомеров. Этот процесс называют рацемизацией. Рацемизация температуре скоростью. Это каждой L-аминокислоты при даННОЙ идёт с определённой обстоятельство можно использовать для установ ления возраста людей и ЖИВОТНЫХ. Так, в твёрдой эмали зубов имеется белок дентин, в котором L аспартат переходит в D-изомер при температуре тела человека со скоростью 0,01% в год. В период формирования зубов в дентине содержится только L-изомер, поэтому по содержанию D-аспартата можно рассчитать Возраст обследуемого. Все 20 аминокислот в организме человека раз личаются по строению, размерам и физико-хи мическим свойствам радикалов, присоединён НЫХ К -углеродному атому. NH3* - CH - COO В водных растворах при нейтральном значе нии рН а-аминокислоты существуют в биполярных ионов. виде В отличие от 19 остальных а-аминокислот, пролин — иминокислота, радикал которой свя зан как с а-углеродным атомом, так и сами ногруппой, в результате чего молекула приоб ретает циклическую структуру. 2. Классификация аминокислот по химическому строению радикалов По химическому строению аминокислоты можно разделить на алифатические, аромати ческие и гетероциклические (табл. 1-1). В составе алифатических радикалов могут на ходиться функциональные группы, придающие им специфические свойства: карбоксильная (-COOH), амино (-NH,), тиальная (-SH), амид ная (-CO-NH,), гидроксильная (-OH) и гуани диновая (NH-C=NH) группы. NH, Названия аминокислот можно построить по заместительной номенклатуре, но обычно ис пользуют тривиальные названия (табл. 1-2). HN — Сн -Союн H,C, CH2 CH2 Пролин Таблица 1-1. Классификация основных аминокислот белков по их химическому строению Тривиальные названия аминокислот Сокращённые названия русские латинские Строение радикалов калов Гли 1. Глицин Аланин 2. 3. Валин I. Аминокислоты с алифатическими радикалами Gly G Ала Ala A Val V -Н -CH3 CHa Вал LCHSCH Иле Тре ACII Миновая кислота 4. Лейцин Лей Leu L -СНСн< Ch 5. Изолейцин Ile I -CH-CH2CH3 CH3 I. Аминокислоты, содержащие в алифатическом радикале дополнительную функциональную группу Гидроксильную группу 6. Серин Сер Ser S -CH2OH 1. Треонин Thr T -CHOH-CH; Карбоксильную группу 8. Аспарагиновая Asp D -CH2COOH кислота Глу Glu E -CH2-CH2-COOH Амидную группу 10. Аспарагин Асн Asn N -CH2-CONH2 11. Глутамин Глн Gin e -CH2-CH2-CONH2 Аминогру ппу 12. Лизин Лиз Lys K -(CH2)-NH Гуанидиновую группу 13. Аргинин Арг Arg R -(CH2)-NH-C-NH2 Серу NH 14. Цистеин Цис Cys C -CH2-SH Мет Met M -СН2-СН2-S-CH, ІІ, Аминокислоты, содержащие ароматический радикал Фен Phe F ОНИН илаланин 17. Тирозин Тир Tyr Y -сн: «Сон IV. Аминокислоты с гетероциклическими радикалами Trp W 18. Триптофан Три -СНС 19. Гистидин Гис His H CHEME N нокислота 20. Пролин Про Pro P. -COOH Дана полная формула Таблица 1-2. Примеры названий аминокислот по заместительной номенклатуре и соответствующие тривиальные названия Формула аминокислоты Тривиальное название Название аминокислоты по заместительной номенклатуре 2-амино-3гидроксипропановая кислота H2N-CHCOOH CH2 Серин он -амин ДеТИЈТиомасляная кислота Метионин H2N-CHCOOH CH CH, CH3 Для записи аминокислотных остатков в мо ным молекулам, в результате чего поверхность лекулах пептидов и белков используют трёхбук соприкосновения их сводой уменьшается. венные сокращения их тривиальных названий, ав некоторых случаях и однобуквенные симво Аминокислоты с полярными незаряженными лы (см. табл. 1-1). радикалами Тривиальные названия часто происходят от Радикалы этих аминокислот лучше, чем гид названия источника, из которого они впервые рофобные радикалы, растворяются в воде, так были выделены, или от свойств данной амино как в их состав входят полярные функциональ кислоты. Так, серин впервые был выделен. Изные группы, образующие водородные связи с фиброина шёлка (от лат. serieит - шелковис водой. К ним относят серин, треонин и тиро тый), а глицин получил свое название из-за зин, имеющие гидроксильные группы, аспара сладкого вкуса (от греч. glykos — сладкий). гин и глутамин, содержащие амидные группы, и цистеин с его тиольной группой. 3. Классификация аминокислот Цистеин и тирозин содержат соответственно по растворимости их радикалов в воде тиольную и гидроксильную группы, способные Все 20 аминокислот в белках организма че- к диссоциации с образованием н“, но при рН ловека можно сгруппировать по способности их около 7,0, поддерживаемого в клетках, эти груп радикалов растворяться в воде. Радикалы мож пы практически не диссоциируют. но выстроить в непрерывный ряд, начинающий ся полностью гидрофобными и заканчиваюцИЙ Аминокислоты с полярными отрицательно ся сильно гидрофильными. заряженными радикалами Растворимость радикалов аминокислот оп К этой группе относят аспарагиновую и глу-ределяется полярностью функциональных таминовую аминокислоты, имеющие в радикале групи, входящих в состав молекулы (полярные дополнительную карбоксильную группу, при рН группы притягивают воду, неполярные её от около 7,0 диссоциирующую с образованием СОО и Н. Следовательно, радикалы данных аминокислот — анионы. Ионизированные фор Аминокислоты с неполярными радикалами мы глутаминовой и аспарагиновой кислот назы К неполярным (гидрофобным) относят ра вают соответственно глутаматом и аспартатом. дикалы, имеющие алифатические углеводород Аминокислоты с полярными положительно Hые цепи (радикалы аланина, валина, лейцина, заряженными радикалами изолейцина, пролина и метионина) и аромати ческие кольца (радикалы фенилаланина и трип Доктолнительную положительно заряженную тофана). Радикалы таких аминокислот в воде группу в радикале имеют лизин и аргинин. У стремятся друг к другу или к другим гидрофоб- лизина вторая аминогрунтла, способная присо такива 12 сильно кислой среде все аминокислоты приоб ретают положительный заряд. Напротив, увеличение концентрации ОН" групп вызывает отщепление Н* от основных функциональных групп, что приводит к умень шению положительного заряда. В сильно ще лочной среде все аминокислоты имеют суммар НЫЙ отрицательный заряд. единять H*, располагается в £-положении али фатической цепи, а у аргинина положительный заряд приобретает гуанидиновая группа. Кроме того, гистидин содержит слабо ионизированную имидазольную группу, поэтому при физиоло гических колебаниях значений pH (от 6,9 до 7,4) гистидин заряжен либо нейтрально, либо поло жительно. При увеличении количества прото нов в среде имидазольная группа гистидина способна присоединять протон, приобретая по ложительный заряд, а при увеличении концен трации гидроксильных групп — отдавать про тон, теряя положительный заряд радикала. Положительно заряженные радикалы - катио ны (см. схему ниже). Наибольшей растворимостью в воде обла дают полярные заряженные радикалы амино кислот. 4. Изменение суммарного заряда аминокислот в зависимости от рН среды При нейтральных значениях рН все кислот- ные (способные отдавать H*) и все основные (спо собные присоедиНЯТЬ Н*) функциональные грунт Ты находятся в диссоциированном состоянии. Поэтому в нейтральной среде аминокисло Ты, содержащие недиссоциирующий радикал, имеют суммарный нулевой заряд. Аминокисло Ты, содержащие кислотные функциональные группы, имеют суммарный отрицательный за ряд, а аминокислоты, содержащие основные функциональные группы, — положительный за ряд (табл. 1-3). Изменение pH в кислую сторону (т.е. повы шение в среде концентрации н+) приводит к подавлению диссоциации кислотных групп. В 5. Модифицированные аминокислоты, присутствующие в белках Hеriосредственно в синтезе белков организма человека принимают участие только 20 перечис ленных аминокислот. Однако в некоторых бел ках имеются нестандартные модифицированные аминокислоты — производные одной из этих 20 аминокислот. Например, в молекуле коллагена (фибриллярного белка межклеточного матрикса) присутствуют гидроксипроизводные лизина и пролина -- 5-гидроксилиЗИН и 4- гидроксипролин. Модификации аминокислотных остатков осу ществляются уже в составе белков, т.е. только H2N-CH-COOH HŅ— CH-COOH HEN-CH-COOH CH2 H,C, CH2 СН2 CH2 CH CH-OH Тоос соо CH2 NH2 ү-Карбоксиглута Гидроксилизин Гидроксипролин миновая кислота CH Модифицированные кислоты, найденные в составе белков После окончания Их синтеза. Введение допол нительных функциональных групп в структуру аминокислот придаёт белкам свойства, необхо Аминокислоты с анионными радикалами Аминокислоты с катионными радикалами *H5N-CH соо" "HNH-CH соо (СН2)4 NH3+ *HN-CH -соо" *HN–CH – соо" (СН2)3 CH2 CH2 сор: NH *HN-CH соо" CH2 CH2 соо" Глутам ат C=NH, мн* Аспарт ат NH2 Аргинин Глутамат Лизин Гистидин Схема. Структура полярных заряженных аминокислот в диссоциированной форме Таблица 1-3. Изменение суммарного заряда аминокислот в зависимости от рН среды Сильно кислая среда Нейтральная среда Сильно щелочная среда 1. Аминокислоты -CH-COOH + + NH3-CH-COO — FOH NH2-CH-COO с недиссоциирующими радикалами NH3 Суммарный заряд = +1 Суммарный заряд = (0) Суммарный заряд = -1 2. Аминокислоты с анионными групами в радикале NH3-CH- COOH + +_ NH3-CH-Coo-- +OHNH2-CH-COO CH, CH2 CH2 COOH соос соо Суммарный заряд = +-1 Суммарный заряд = -1 Суммарный заряд = -2 3. Аминокислоты с катионными группами в радикале NH2-CH-COOH + NH3-CH-COO-TURNH2-CH-COO (СН2)4 (СН2)4 (СН2)4 NH3* NH3 NH2 Суммарный заряд = +2 Суммарный заряд = +1 Суммарный заряд = -1 димые для выполнения ими специфических функций. Так, у- карбоксиглутаминовая кисло та входит в состав белков, участвующих в свёр Тывании крови, и две близко лежащие карбок сильные группы в их структуре необходимы для связывания белковых факторов с ионами Са2+. Нарушение карбоксилирования глутамата при Водит к снижению свёртываемости крови. Значение гидроксильных групп в составе ли Зина и пролина описано в разделе 15. ре, можно использовать НИнгидриновую ре акцию. Эта реакция основана на том, что бесцвет ный нингидрин, реагируя с аминокислотой, конденсируется в виде димера отщепляемый от ааминогруппы аминокисло ты. В результате образуется пигмент красно фиолетового цвета. Одновременно происходит декарбоксилирование аминокислоты, что при водит к образованию CO, и соответствующего альдегида. Нингидриновую реакцию широко используют при изучении первичной структу через атом азота, ры белков (см. схему ниже). Так как интенсивность окраски пропорцио нальна количеству аминокислот в растворе, используют для концентрации - аминокислот. её 6. Химические реакции, используемые для обнаружения аминокислот Способность аминокислот вступать в те Иные химические реакции определяется нали чием в их составе или измерения функциональных групп. Так как все аминокислоты, входящие в состав бел ков, содержат у а-углеродного атома амино- и карбоксильную группы, они могут вступать в характерные для всех аминокислот химичес кие реакции. Наличие каких-либо функцио нальных групп в радикалах индивидуальных аминокислот определяет их способность всту пать в специфичные для данных аминокислот реакции. 2 x FOOH. H2N-CH-COOH о Нингидрин Аминокислота О= оно. •ер - сә, но + R- С + CO2 + 3H,0 - =0 СО НИнгидриновая реакция на ааминокислоты для обнаружения и количественного огіре- деления аминокислот, находящихся в раство Нингидриновая реакция, используемая для определения а-аминокислот 14 Специфические реакции на отдельные аминокислоты Качественное и количественное отдельных аминокислот возможно благодаря на личию в их радикалах особенных функциональ ных групп. определение Аргинин определяют с помощью качествен ной реакции на гуанидиновую группу (реакция Сакагучи), а цистеин выявляют реакцией Фоля, специфичной на SH-группу данной аминокис лоты. Наличие ароматических аминокислот в растворе определяют ксантопротеиновой реак цией (реакция нитрования), а наличие гидро ксильной группы в ароматическом кольце ти розина — с помощью реакции Миллона. Пептиды, содержащие более 10 аминокислот, называют «ПолетиДЫ», а полипептиды, состоя щие из более чем 50 аминокислотных остатков, обычно называют белками. Однако эти названия условны, так как в литературе термин «белок» ча сто употребляют для обозначения полипептида, содержащего менее 50 аминокислотных остатков. Например, гормон глюкагон, состоящий из 29 аминокислот, называют белковым гормоном. Мономеры аминокислот, входящих в состав бел қов, называют «амиюкислотные остатки». Амино кислотный остаток, имеющий свободную амино труту, называется Nконцевым и пишется слева, а имеющий свободную Q-карбоксильную груп пу — Cконцевым и пишется справа. Пептиды Пи шутся и читаются с N-конца. Цепь повторяющих ся атомов в полипептидной цепи -NH-CH-CO носит название «пептидный остов» (см. схему Б). При названии полипептида к сокращённому названию аминокислотных остатков добавляют суффикс -ил, за исключением Cконцевой ами нокислоты. Например, тетрапептид Сер-Гли Про-Ала читается как серилглицилпролилаланин. Пептидная связь, образуемая иминогруппой пролина, отличается от других пептидных свя зей, так как атом азота гептидной группы свя зан не сводородом, асрадикалом. Пептиды различаются по аминокислотному со ставу, количеству и порядку соединения амино Б. ПЕПТИДНАЯ СВЯЗЬ. СТРОЕНИЕ и БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ а-Аминокислоты могут ковалентно связы ваться друг с другом с помощью пептидных свя зей. Пептидная связь образуется между а-кар боксильной группой одной аминокислоты и -аминогруппой другой, т.е. является амидной связью. При этом происходит отщепление мо лекулы воды (см. схему А). 1. Строение пептида — — — 1 Количество аминокислот в составе может сильно варьировать. Петтиды, содержащие до 10 аминокислот, пептидов называют олигопептиды. Час то в названии ство входящих в состав олигопептида аминокис лот: трипептид, пентапетид, октапептид и т.д. таких молекул указывают количе *HAN-CH-co-NH-CH+co-N=CH-co-NHCH-coo CH2 н H2C CH, CH3 он CH2 Серилглицилпролилалани н H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH - н -но -Н,0 HN -CH-CO-NH-CHCOOH R, T R, R, Образование дипептида Пleriтидная СВЯЗЬ Схема А. Образование дипептида Радикалы аминокислот (боковая цель) R, R2 R, *H3N-CH-CO-NH-CHCO-NH-CH-Co.... NH-CH- соо - пептидный остов Аминокислотный остаток N-конец C-конец Схема Б. Строение пептидов g-Уrrеродный атом кислот. Сер-Гис-Про-Ала и Ала-ПроГис-Сер — Два разных пептида, несмотря на то, что они имеют одинаковые количественный и качественный со ставы аминокислот, Радикал аминокислоты Плоскость пептидной группы Рис. 1-1. Плоскости расположения пептидных групп и Q-углеродных атомов в пространстве. П=0 ни I-Z O=0 2. Характеристика пептидной связи Пептидная связь имеет характеристику час тично двойной связи, поэтому она короче, чем остальные связи пептидного остова, и вслед ствие этого мало подвижна. Электронное стро ение пептидной связи сткую структуру пептидной группы. Плоскости пептидных групп расположены под углом друг к другу (рис. 1-1). Связь между а-углеродным атомом и а-ами ногруппой или х-карбоксильной группой спо собна к свободным вращениям (хотя ограниче на размером и характером радикалов), что позволяет полипептидной цепи принимать раз личные конфигурации. Пептидные связи обычно расположены в транс-конфигурации, т.е. ауглеродные атомы располагаются по разные определяет плоскую жё стороны от пептид ной связи. В результате боковые радикалы ами нокислот находятся на наиболее удалённом рас стоянии друг от друга в пространстве (рис. 1-2). Пептидные связи очень гірочны и самопроиз ВОЛЬНО не разрываются при нормальных услови Ях, существующих в клетках (нейтральная среда, температура тела). В лабораторных условиях Гид ролиз пептидных связей белков проводят в запа сконцентрированной (6 янной моль/л) ампуле соляной кислотой, при температуре более 105 °С, причём полный гидролиз белка до свободных аминокислот проходит примерно за сутки. В живых организмах пептидные связи в бел қах разрываются с помощью специальных про теолитических ферментов (от англ. protein - бе лок, lysis разрушение), называемых также протеазами, или пептидгидролазами. Для обнаружения в растворе белков и пепти дов, а также для их количественного определе ния используют биуретовую реакцию (положи тельный результат ДЛЯ веществ, содержащих в своём составе не менее двух пептидных связей). Рис. 1-2, Транс-конфигурация пептидных связей. Функци ональные группы --Со- и -NH-, образующие гептидные свя зи, не ионизированы, но полярны, и могут участвовать в об разовании водородных связей. Количество аминокислотных остатков в структуре биологически активных пептидов может варьировать от 3 до 50. К одним из са мых «маленьких» пептидов можно отнести ти реотропин-рилизинг-гормон и глутатион (три пептиды), а также энкефалтины, имеющие в своём составе 5 аминокислот. Однако большин ство биологически активных пептидов имеет в своём составе более 10 аминокислот, например нейропептид Y (регулятор аппетита) содержит 36 аминокислот, а кортиколиберин — 41 ами нокислоту. Некоторые из пептидов, в частности боль шинство пептидных гормонов, содержат теп тидные связи, образованные о-аминогруппой и а-карбоксильной группой соседних аминокис- . лот. Как правило, они синтезируются из неак тивных белковых предшественников, в которых специфические протеолитические ферменты разрушают определённые пептидные связи. Ангиотензин 1| - октапетид, образуюіций ся из крупного белка плазмы крови ангиотен 3. Биологическая роль пептидов В организме человека вырабатывается мно жество пептидов, участвующих в регуляции раз личных биологических процессов и обладающих высокой физиологической активностью. 16 Зиногена в результате последовательного дей ствия двух протеолитических ферментов. Первый протеолитический фермент ренин от щепляет от ангиотензиногена с N-конца пеп тид, содержащий 10 аминокислот, называемый ангиотензином 1. Второй протеолитический фермент карбоксидипептидилпептидаза отщеп ляет от С-конца ангиотензина | 2 аминокисло ты, в результате чего образуется биологически активный ангиотензин II, участвующий в регу ляции АД и водно-солевого обмена в организ ме (см. схему А). Однако в некоторых биологически активных пептидах могут содержаться либо необычные аминокислоты, либо существовать необычные связи между аминокислотами, не встречающи еся в белках. Пример пептида, содержащего необычную для белков связь между аминокислотами, ~~ трипептид глутатион, построенный из глутама та, цистеина и глицина (см. схему Б). N-концевая аминокислота глутамат связана со второй аминокислотой цистеином не через а-карбоксильную группу, а через үкарбоксиль ную группу его радикала. Глутатион - широко распространённый пептид организма человека. Он может быть использован в окислительно восстановительных реакциях как донор и ак цептор водорода и необходим для работы ряда ферментов. Функции пептидов зависят от их первичной структуры. Ангиотензин I по структуре очень похож на ангиотензин II (имеет только две до полнительные аминокислоты с C-конца), но при этом не обладает биологической активностью. Изменение в аминокислотном составе пеп тидов часто приводит к потере одних и возник новению других биологических свойств. В ка честве примера можно рассмотреть структуру и свойства двух пептидных гормонов — оксито цина и вазопрессина. В гипоталамусе окситоцин и вазопрессин об разуются в результате частичного (ограничен ного) протеолиза более крупных белковых пред шественников. Из гипоталамуса по нервным Волокнам эти гормоны внутри секреторных гра нул перемещаются в нервные окончания аксо нов, находящихся в задней доле гипофиза. После действия специфических стимулов эти гормо ны выделяются в кровь (см. схему А на с. 13). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N-конец Асіп -Арг - Вал- Тир-ИлеГис – Про- Фен- Гис - Лей- Вал-Пептид C-конец Ангиотензиноген I Ренин — 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Асп - Арг - Вал- Тир-Иле-Гис – Про- фен-Гис -Лей + Пептид Ангиотензин ! 1 Карбоксидипептидилипептидаза 1 2 3 4 5 6 7 8 Асп - Арг - Вал-Тир-Иле- Гис – Про- Фен + Гис - Лей Ангиотензин II Схема А Глу Цис Гли was one con con-cancomor coau-ca-coo *H3N-CH-CH-CH2-CH2-co-NH-CH-CONH-CH2-COO соо” Схема Б. Трипептид глутатион (глутамилцистеинилглицин) Окситоцин и вазопрессин в своей структуре имеют много общего: • оба содержат 9 аминокислотных остатков; •7 аминокислотных остатков из 9 идентичны; • 2 остатка цистеина соединены дисульфид ной связью; • на C-конце пептидов д-карбоксильная груп па глутамата амидирована. Несмотря на небольшие отличия в последо вательности аминокислот (замены аминокислот в положениях 3 и 8) эти гормоны сильно отли чаются по физиологическому действию. Так, окситоцин выделяется в кровь во время корм ления ребёнка, вызывает сокращение миоэпи телиальных клеток протоков молочных желёз и стимулирует выделение молока. Кроме того, окситоцин влияет на гладкую мускулатуру мат ки во время родов, вызывая её сокращение. В отличие от окситоцина, основное физио логическое действие вазопрессина - увеличе ние реабсорбции воды в почках при уменьше нии АД или объёма крови (поэтому другое название этого гормона — антидиуретический). Кроме того, вазопрессин вызывает сужение ГМК сосудов. Интересно отметить, что наличие в положе нии 8 основной аминокислоты важно для прояв ления антидиуретической активности, а амино кислоты с гидрофобным радикалом в положении 3 - для сокращения ГМК. Так как пептиды - мощные регуляторы био логических процессов, их можно использовать как лекарственные препараты. Основное препят ствие для терапевтического использования — ИХ быстрое разрушение в организме. Одним из важ нейших результатов исследований является не только изучение структуры пептидов, но и полу чение синтетических аналогов природных пеп Тидов целенаправленными изменениями вих структуре с и функциях. Например, синтезирован итептид 1-дезамино 8-D-аргинин-вазопрессин (ДАВ), структура ко торого представлена на схеме Б. В структуре этого пептида (по сравнению с вазопрессином) нет аминогруппы на N-конце, и вместо L-аргинина в положении 8 стоит D-аргинин. Такой синтетический пептид обла дает только антидиуретической химически устойчив, т.е. при введении в орга низм вызывает длительную активностью и реакцию. Такой ис кусственный аналог гормона (по сравнению с природным) более эффективен при лечении гор мональной недостаточности. Открытые и изученные в настоящее время пептиды можно разделить на группы по их ос новному физиологическому действию: • пептиды, обладающие гормональной актив ностью (окситоцин, вазопрессин, рилизинг гормоны гипоталамуса, меланоцитстимули рующий гормон, глюкагон и др.); N-конец C-конец 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NH,- Цис- Тир-ИлеГлн- Асп-Цис- Про-Лей - Глу - CONH, Lorem S S Окситоцин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NH,- Цис-Тир-фен-Глн-АслЦис-Про-Арг -Глу -CONH, — $ — S Вазопрессин N-конец C-конец Схема А N-конец C-конец 1 2 3 4 5 6 7 8 9 н- Цис-Тир- фен-Глн Асп-Цис- Про-Арг -Глу-CONH, L -S - S 8-D-аргининвазопрессин Схема Б 18 н н н н Н — N-C ~ C-N C -C -N . но CHE O • пептиды, регулирующие процессы пищева рения (гастрин, холецистокинин, вазоинте стинальный пептид, желудочный ингибиру ющий пептид и др.); • пептиды, регулирующие тонус сосудов и АД (брадикинин, калидин, ангиотензин II); • пептиды, регулирующие аппетит (лептин, нейропептид Ү, меланоцитстимулирующий гормон, В- эндорфины); • пептиды, обезболивающим обладающие дей ствием (энкефалины и эндорфины и другие опиоидные пептиды). Обезболивающий эф фект этих пептидов в сотни раз превосходит анальгезирующий эффект морфина; • пептиды, участвующие в регуляции высшей нервной деятельности, в биохимических процессах, связанных с обучения, памяти, возникновения чувства страха и т.д. механизмами сна, Однако такое деление пептидов крайне ус ловно. Появились данные о том, что многие пептиды обладают широким спектром дей ствия. Так, меланоцитстимулирующий гормон, помимо стимуляции пигментообразования, участвует в регуляции аппетита (вместе с леп тином подавляет потребление пищи и являет ся антагонистом нейропептида Y). В то же вре мя B-эндорфины, кроме анальгезирующего эффекта, — синергисты нейропептида Ү, т.е. усиливают потребление пищи. Описанный Выше вазопрессин, кроме антидиуретического и сосудосуживающего действия, имеет свой ство улучшать память. ІІ. СТРУКТУРА БЕЛКОВ Пептидные цепи содержат десятки, сотни и Тысячи аминокислотных остатков, соединённых прочными пептидными связями. За счёт внут римолекулярных взаимодействий белки образу ют определённую пространственную структуру, называемую «конформация белков». Линейная Последовательность аминокислот в белке содер жит информацию о построении трёхмерной про странственной структуры. Различают 4 уровня структурной организации белков, называемых первичной, вторичной, третичной и четвертич ной структурами (рис. 1-3). Существуют общие правила, по которым идёт формирование про странственных структур белков. Рис. 1-3, Этапы формирования конформации белков. 1 — первичная структура; 2 — вторичная структура; 3 — тре тичная структура; 4 — четвертичная структура. А. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА личественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка. Необходимо помнить, что для исследования нужно иметь определённое количество чистого белка, без примесей других белков или пептидов. Кислотный гидролиз белка Аминокислотные остатки в пептидной цепи белков чередуются не случайным образом, а расположены в определённом порядке. Линей ную последовательность аминокислотных остат ков в полипептидной цепи называют «первич ная структура белка». Первичная структура каждого индивидуально го белка закодирована в участке ДНК, называе мом геном. В процессе синтеза белка информа ЦИЯ, находящаяся в гене, сначала переписывается на мРНК, а затем, используя мРНК в качестве матрицы, на рибосоме происходит сборка пер Вичной структуры белка (см. раздел 4). Каждый из 50 000 индивидуальных белков организма человека имеет уникальную для даң ного белка первичную структуру. Все молекулы данного индивидуального белка имеют олина- ковое чередование аминокислотных остатков в белке, что в первую очередь отличает данный Индивидуальный белок от любого другого. Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептид ных связей в белке. Анализируемый белок гид ролизуют в 6 мол/л HCI при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате такой обра ботки разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты. Кроме того, глутамин и аспара Гин гидролизуются до глутаминовой и аспара Гиновой кислот (т.е. разрывается амидная связь в радикале и от них отцепляется аминогруппа). Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии Б. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА Изучение первичной структуры белков име ет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования амино кислотных остатков в индивидуальных белках и сопоставляя эти знания с особенностями про странственного расположения молекулы, мож но выявить общие фундаментальные законо мерности формирования пространственной структуры белков. Кроме того, многие генетические болезни — результат нарушения в аминокислотной после довательности белков. Информация о первич ной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогно зирования развития заболевания. Установление первичной структуры белков Включает 2 основных этапа: • определение аминокислотного состава изу чаемого белка; • определение аминокислотной последова тельности в белке. гидролизом белков, разделяют в колонке ска тионообменной смолой. Такая синтетическая смола содержит прочно связанные с ней отри цательно заряженные группы (например, остат ки сульфоновой Смесь аминокислот, полученных кислотным кислоты -S0, ), к которым присоединены ионы Na* (рис. 1-4). В катионообменник Вносят смесь аминокис лот в Кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут по ложительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше сум марный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, ар Гинин и гистидин наиболее прочно связывают ся с катионообменником, а аспарагиновая и глу таминовая кислоты — наиболее слабо. Высвобождение аминокислот из колонки осу ществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличивающейся ион ной силой (т.е. с увеличением концентрации NaCI) и pH. При увеличении рН аминокисло ты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и проч ность связи с отрицательно заряженными час тицами смолы. Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении pH и ионной силы. Со 1. Определение аминокислотного состава белка Первый этап в определении первичной струк туры белков заключается в качественной и ко20 SO3 Na* частицы смолы SO3 Na* +NH3-CHCOOH R (заряд о или +) Буфер Смесь аМИНОКИСЛОТ SO3 H2N-CHCOOH R.* so,*н,N- Сн- соон R,0 . Катионообменник + Na” т. | + он т Soz+H3N-CH-COOH R? ПІШІ Сбор SO3 Na+ + NH3-CH-COOR Элюата Коллектор для сбора фракций Рис. 1-4. Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии. А. Хроматографическая колонка, наполненная катионообменной смолой, Б. Этапы разделения аминокислот: 1 -- присоединение аминокислот к частицам Смоль; 2 » Высвобож Дение аминокислот при определённом значении pH и концентрации NaCI. бирая с нижнего конца колонки раствор (Элюат) В виде небольших порций, можно получить фрақ ции, содержащие отдельные аминокислоты. Количественный анализ полученных фракций Количество каждой из аминокислот в данном белке определяют, нагревая отдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соеди нение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты, поэтому 110 спектрофотометрическому измерению света, поглощённого нингидриновыми производными, можно определить содержание каждой аминокис лоты в Гидролизате данного белка. В настоящее время процесс разделения и ко личественного определения аминокислот в Гид ролизате белка полностью автоматизирован и осуществляется в специальном приборе — ами нокислотном анализаторе. 2. Определение аминокислотной последовательности в белке Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах Фенилизотиоционат (ФИТЦ) – реагент, ис пользуемый для определения N-концевой ами нокислоты в пептиде. Он способен реагировать с а-аминогруппой и акарбоксильной группой свободных аминокислот, а также с N-концевой аминокислотой в пептидах (см. схему ниже). В результате взаимодействия с Nконцевой аминокислотой полипептида образуется фенил Тиогидантионовое производное, в котором дес- табилизирована пептидная связь между х-кар боксильной груттой N-концевой аминокислоты и а-аминогруппой второй аминокислоты в пеп Тиде. Эта связь избирательно гидролизуется без повреждения других пептидных связей. кислот. Так как с помощью более продуктивно определяют аминокислотную последовательность лишь небольших пептидов, Молекулы полипептида секвенаторов най расцеляют по специ фическим местам на фрагменты. Используя несколько разных расщепляюцих агентов (ими могут быть ферменты или хими ческие вещества) в разных пробах очищенного полипептида, можно получить частично пере крывающие установлен друг друга фрагменты с ной аминокислотной последовательностью. С их помощью можно воссоздать правильный Порядок фрагментов и получить полную после довательность аминокислот в Толипептидной цепи. « N-c= 0 | , NH-CH- co... NH- CH-COOH S=CNC RiRaß, Ферментативное расщепление полипептида по специфическим участкам Для специфического расщепления пептидных связей в белке можно использовать несколько разных ферментов. Наиболее широко исполь зуют ферментативный гидролиз полипептида протеолитическим ферментом — трипсином, который относят к группе пищеварительных ферментов (его вырабатывает поджелудочная железа). Фермент обладает высокой специфич ностью действия. Он расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвует карбок сильная группа остатков лизина или аргинина. После реакции выделяют комплекс ФИТЦ АК, идентифицируют его хроматографически ми методами. ФИТЦ можно использовать вновь с дыдущем цикле, для определения следующей укороченным пептидом, полученным в пре аминокислоты. Этот процесс ступенчатого рас щепления пептида с N-конца был автоматизи рован и реализован в приборе — секвенаторе, с помощью которого можно определять последо вательность аминокислотных остатков в олиго пептидах, состоящих из 10-20 аминокислот. Многие полипептиды имеют первичную структуру, состоящую более чем из 100 амино - NH - Сн- со- NH -- CH – со Лиз или Арг Трилсин Исходя из установленного количества остат ков лизина и аргинина, можно предсказать ко личество получаемых при гидролизе трипсином фрагментов. Так, если в полипептидной цепи б остатков аргинина и лизина, то при расщепт -N=c=s + HN - CH-CO-NH-CH - со... - NH - Снсоон ФИТЦ RAR Пептид R, NH CO-NH-CH-Co. - NH - CH - COOH Rn se R, Схема 22 лении трипсином можно получить 7 фрагмен- тов. Затем в каждом фрагменте устанавливают аминокислотную последовательность. лекулы индивидуальных белков (т.е. имеющих одинаковую первичную структуру) образуют в растворе одинаковую конформацию. Следова тельно, вся информация, необходимая для фор мирования пространственных структур, нахо дится в первичной структуре белков. В белках различают 2 основных типа конфор мации полипептидных цепей: вторичную и тре тичную структуры. Химическое расщепление полипептида по специфическим участкам 1. Вторичная структура белков В некоторых случаях предпочтителен не фер ментативный, а химический гидролиз. Так, ре агент бромциан расщепляет только пептидные связи, в которых карбоксильная группа при надлежит остатку метионина. Зная количество остатков метионина в полипептидной цепи, легко установить количество получаемых фраг ментов. Далее для каждого фрагмента в секве наторе также устанавливают аминокислотную последовательность. Вторичная структура белков — пространствен ная структура, образующаяся в результате взаи модействий между функциональными групами, входящими в состав пептидного остова. При этом пептидные цепи могут приобретать регулярные структуры двух типов: (х-спираль и В-структура. Q-Спираль Получение аминокислотной последовательности полипептида с помощью перекрывающихся фрагментов Для успешного установления Последователь ности полученных фрагментов полипеттида не обходимо получить пептиды с перекрывающи мися последовательностями. аминокислотными Это достиганот обработкой отдельных проб дан ного полиггептида разными реагентами, расщегі ляющими белок в разных местах. Необходимо провести столько расщеплений, чтобы получить набор пептидов, обеспечивающих терекрывание всех участков, необходимых для определения последовательности исходного полипептида. Петтиды, полученные при гидролизе белка трипсином Ала-Гис-Арг Про-Мет-ТирЛиз, Вал-Гли В данном тигіе структуры пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образова ния водородных связей между атомами рода карбонильных грунти и атомами азота ами ногрупп, входящих в состав пептидных групп через 4 аминокислотных остатка. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали (рис. 1-5). На один виток 0спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. в образовании водородных связей участвуют практически все атомы Кислорода и водорода пеп тидных груп. В результате (zстираль «стягива ется» множеством водородных кисло связей. Несмотря на то, что данные связи относят к разряду сла бых, их количество обеспечивает максимально Возможную стабильность о- спирали. Так как все Гидрофильные группы петтидного остова обыч но участвуют в образовании водородных связей, гидрофильность (т.е. способность образовывать Водородные связи с водой) а-спиралей уменьша ется, а их гидрофобность увеличивается. -Спиральная структура - наиболее устой чивая конформация пептидного остова, отве чающая минимуму свободной энергии. В резуль тате образования (х-спиралей полипептидная цепь укорачивается, но если создать условия для разрыва водородных связей, политептидная цепь Вновь удлинится. стороне а-спирали и направлены от пептидного остова в стороны. Они Радикалы аминокислот находятся на наружной не участвуют в образова Ала-Гис-Apr-Про-Мет Тир-Лиз-Вал-Гли Пептиды, полученные при гидролизе белка бромцианом Установление первичной структуры белка с помощью пе рекрывающихся пептидных фрагментов. В. КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВ Линейные полипептидные цепи индивидуаль ных белков за счёт взаимодействия функцио нальных групп аминокислот приобретают оп ределённую пространственную трёхмерную структуру, называемую «конформация». Все мо 23 77 нии Водородных связей, характерных ДЛЯ Вторич ной структуры, но некоторые из них могут нару шать формирование д-спирали. К ним относят: • пролин. Его атом азота входит в состав жёс ткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролина, образующего пептид ную связь с другой аминокислотой, нет ато ма водорода. В результате пролин не спосо бен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и аспиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб; • участки, расположены заряженных где последовательно несколько одинаково лов, между возникают электро радика которыми статические силы отталкивания; участки с близко расположенными объём ными радикалами, механически нарушаю щими формирование а-спирали, например метионин, триптофан. Водородные СВЯЗИ НЕ М. . Радикалтыг аминокислот Гептидный остов ВСтруктура В-Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пеп ГИДНЫХ групп линейных областей одной полипеп Гидной цепи, делающей изгибы, или между раз ными полипептидными целями. В-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному «гармошкой», – В- складчатый слой (рис. 1-6). Рис. 1-5. а-Спираль. На рисунке показаны пространственное строение -спирализованного участка полипептидной цепи и образование водородных связей, участвующих формирова Нии а-спирали. - Радикалы ЯАМИНОКИСЛО Т Водородные Связи Рис. 1-б. Вторичная структура белков в виде В-складчатого слоя. в 24 разовавшийся после разрыва слабых внутримо лекулярных связей и потерявший свою упоря доченную структуру. Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипеп тидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие меж ду линейными участками внутри одной полипеп тидной цепи, называют внутрицепочечными. BB-структурах Водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи. Если связанные полипептидные цепи направ лены противоположно, возникает антипараллель ная 3-структура, если же N- и С-концы полипеп тидных цепей совпадают, образуется структура параллельного рскладчатого слоя (рис. 1-7). В отличие от а-спиралей, разрыв водород ных связей, формирующих р- структуры, не вы Зывает удлинения данных участков полипептид Hых цепей. Как а-спираль, так и В-структуры обнаруже ны в глобулярных и фибриллярных белках. Содержание разных типов вторичных структур в белках Содержание рассмотренных выше типов вто ричных структур в разных белках неодинаково. По наличию а-спиралей и Вструктур глобуляр ные белки можно разделить на 4 категории. • К первой категории относят белки, в струк туре которых обнаружены только аспира ли. К ним принадлежат такие белки, как миоглобин и гемоглобин (рис. 1-8). • Ко второй категории относят белки с 4-спи ралями и р-структурами, иногда образующи Ми однотипные сочетания, встречающиеся в разных индивидуальных белках (рис. 1-9). Характерные сочетания аспиралей и В структур, обнаруженные во многих фермен тах, можно рассмотреть на примере строе ния доменов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и фосфоглицераткиназы (ФГК). Домен -участок Полипептидной цепи, который са мостоятельно от других участков той же цепи образует структуру, во многом на по минающую глобулярный белок. В одном из доменов лактатдегидрогеназы в центре расположены 3-структуры полипеп Тидной цепи в виде скрученного листа, и каждая В-структура связана с а-спираль Hым участком, находящимся на поверхно сти молекулы. Как видно из рис. 1-9, сход ный домен имеется также в молекуле фосфоглицераткиназы. Нерегулярные вторичные структуры В белках отмечают области с нерегулярной вто ричной структурой, которые часто называют бес порядочными клубками. Они представлены пет леобразными и кольцеобразными структурами, имеющими меньшую регулярность укладки, чем описанные выше а-спираль и р-структура, Од нақо и они не так сильно варьируют от одной молекулы белка к другой. В каждом индивиду альном белке они имеют свою фиксированную конформацию, определяемую аминокислотным составом данного участка цепи и окружающих его участков. Термином «беспорядочный клубок» также часто называют денатурированный белок, об N-конец FВ-изгиб 1 C-конец и Рис. 1.7. Параллельный и антипараллельный В-складчатые слои. В-Структуры обозначень широкими стрелками. А ~ антипа раллельная р-структура; Б – параллельные В-складчатые структуры. 25 ": : • В третью категорию включены белки, име ющие только В-структуры. Такие структуры обнаружены в иммуноглобулинах, в фермен те супероксиддисмутазе (рис. 1-10). • В четвёртую категорию включены белки, име ющие в своём составе лишь незначитель ное количество регулярных вторичных струк тур. и : . * .. *, - ул 2. Третичная структура белков Третичная структура белков трёхмерная про странственная образующаяся структура, за счёт взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи. с Рис. 1-8. Восемь а-спиралей в структуре миоглобина (А) и Вцепи гемоглобина (Б). Связи, участвующие в формировании третичной структуры белков Гидрофобные взаимодействия При укладке полипептидная цепь белка стре Мится принять энергетически выгодную форму, характеризующуюся минимумом свободной энер Гии. Поэтому гидрофобные радикалы аминокис Лот стремятся к объединению внутри глобуляр ной структуры растворимых в воде белков. Между Ними Возникают так называемые гидрофобные вза имодействия, а также силы ван дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу атомами. В результате внутри белковой глобулы формирует ся гидрофобное Гидрофильные ядро. группы пеп Тидного остова при формировании вторичной структуры образуют множество водородных свя зей, благодаря чему исключается связывание с Ними ВОДЫ внутренней, и разрушение плотной структуры белка. КА Б Рис. 1-9. а-Спирали и В-структуры в домене лактатдегид рогеназы (А) и фосфоглицераткиназы (Б). ВСтруктур ы В с Ионные и водородные связи Гидрофильные радикалы аминокислот стре мятся образовать водородные связи с водой и поэтому в основном располагаются на поверх ности белковой молекулы. Все гидрофильные группы радикалов амино Кислот, оказавшиеся Гидрофобного внутри ядра, взаимодействуют друг с другом с помощью ион ных и водородных связей (рис. 1-11). Ионные связи могут возникать между от рицательно заряженными (анионными) карбоксильными группами радикалов ас парагиновой и глутаминовой кислот и по ложительно заряженными (катионными) Рис. 1-10. 3-Складчатая вторичная структура в констант ном домене иммуноглобулина (А) и ферменте супероксид дисмутазе (Б). О-К-~-0 ҫ=0 CHE CH2 СА, DE CHA + Nha н: Сн, N ч Н. Рис. 1-11. Типы связей, возникающих между радикалами аминокислот при формировании третичной структуры белка. 1 — ионные связи; 2 — водородные связи; 3 — гидро фобные связи; 4 - дисульфидные связи. ков цистеина. Эти два остатка цистеина могут находиться далеко друг от друга в линейной первичной структуре белка, но при формиро вании третичной структуры они сближаются и образуют ковалентное связывание ра прочное дикалов (рис. 1-12). Большинство внутриклеточных белков лише но дисульфидных связей. Однако такие связи распространены в белках, секретируемых клет кой во внеклеточное пространство. Полагают, что эти ковалентные связи стабилизируют кон формацию белков вне клетки и предотвращают их денатурацию. К таким белкам относят гор мон инсулин и иммуноглобулины. Инсулин — белковый гормон; содержит 51 аминокислоту, состоит из двух полипептидных цепей (цепь А содержит 21 аминокислоту, цепь В ---- 30 аминокислот). Инсулин синтезируется в В-клетках поджелудочной железы и секретиру ется в кровь в ответ на повышение концентра ции глюкозы в крови. В структуре инсулина имеются 2 дисульфидные связи, соединяющие 2 полипептидные цепи А и В, и 1 дисульфидная связь внутри цепи А (рис. 1муноглобулинов рассмотрена в подразделе 6 Д. Все белки с одинаковой первичной структу рой, находящиеся в одинаковых 13). Структура им условиях, при обретают одинаковую, характерную для данного индивидуального белка конформацию, опреде ляющую его специфическую функцию. Функ ционально активную конформацию белка назы вают «нативная структура». группами радикалов лизина, аргинина или гистидина. Водородные связи возникают между гидро фильными незаряженными группами (таки ми как -ОН, -CONH,, SH- группы) и любы ми другими гидрофильными группами. Белки, функционирующие в неполярном (ли пидном) окружении, например белки мембран, имеют обратное устройство: гидрофильные ра дикалы аминокислот расположены внутри бел ка, в то время как гидрофобные аминокислоты локализованы на поверхности молекулы и кон тактируют с неполярным окружением. В каж дом случае радикалы аминокислот занимают наиболее выгодное биоэнергетическое положе Ние. 3. Конформационная лабильность белков Ковалентные связи Третичную структуру некоторых белков ста билизируют дисульфидные связи, образующие- ся за счёт взаимодействия SH-групп двух остат Гидрофобные взаимодействия, а также ион ные и водородные связи относят к числу сла бых, так как их энергия лишь ненамного пре вышает энергию теплового движения атомов при комнатной температуре (т.е. уже температуре возможен при разрыв данной таких связей). -NH-CH-co CH2 Остатки » SH Пептидный + остов -NH-CH-CO CH2 Окислитель ('l2O2) цистеина ус — - Н,0 дисульфидная S Связь CH2 -NH-CH- CO CH2 -NH-CH-co Рис. 1-12. Образование дисульфидной связи в белках. ., ..: Aцепь А-Цепь . .. . "hя -OSOOOес сфе-соо әл-ӨӨӨӨӨое еёӨӨӨӨӨӨӨӨё-сот (лей Bank ГлуX Алаклей) 15 B-yenb Рис. 1-13. дисульфидные связи в структуре гормона инсулина. Поддержание характерной для белка конфор- мации возможно благодаря возникновению множества слабых связей между различными участками полипептидной цепи. Однако белки состоят из огромного числа атомов, находящихся в постоянном (броуновс ком) движении, что приводит к небольшим пе ремещениям отдельных участков Полипептид ной цепи, которые обычно не нарушают общую структуру белка и его функции. Следовательно, белки обладают конформационной лабильнос тью — склонностью к небольшим изменениям конформации за счёт разрыва одних и образо вания других слабых связей. Конформация белка может меняться при изменении химических и физических свойств среды, а также при взаи модействии белка с другими молекулами. При этом происходит изменение пространственной структуры не только участка, контактирующего с другой молекулой, но и конформации белка в целом. Конформационные изменения играют огромную роль в функционировании белков в живой клетке. ального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубков, отличающихся друг от друга трёхмер ной структурой. Потеря нативной конформа ции сопровождается утратой специфической функции белков. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается. В денатурированном белке гидрофобные ра дикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри Гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой кон центрации белка и отсутствии сильного отталки вающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происхо дит образование осадка. Компактная, плотная пространственная струк тура нативного белка при денатурации резко уве личивается в размерах и становится легко дос тупной для расщепления тептидных связей протеолитическими ферментами (рис. 1-14). Тер мическая обработка Мясной пищи перед употреб лением не только улучшает её вкусовые качества, но и облегчает её ферментативное переваривание в Пищеварительной системе. Кроме того, денату рирующим действием на пищевые белки обла дает и кислая среда желудка, вызывающая дена турацию тех белков, которые не подвергались 4. Денатурация белков Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её на- тивной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит слу чайный характер, то молекулы одного индивиду28 предварительной обработке, а температурной также оказывает денатурирующее микроорганизмов, действие на белки попавших в желудок с пищей. дит разрыв связей, участвующих в формиро вании вторичной и третичной структуры на тивных белков, и образование новых связей с химическими реагентами; 5. Факторы, вызывающие денатурацию белков NH H2N-C-NH2 Мочевина H2N-C-NHCI Гуанидинхлорид Денатурацию белков вызывают факторы, спо собствующие разрыву гидрофобных, водород ных и ионных связей, стабилизирующих кон формацию белков: • Высокая температура (более 50 °С), увеличи вающая тепловое движение атомов в молеку ле и приводящая к разрыву слабых связей; • интенсивное встряхивание раствора, при Водящее к соприкосновению белковых мо лекул с воздушной средой на поверхности раздела фаз и изменению конформации этих молекул; • органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными груп пами белков, что приводит к их конформа ционным изменениям. Для денатурации бел ков в биохимических исследованиях часто используют мочевину или гуанидиHхлорид, которые образуют Водородные связи с ами но- и карбонильными труппами некоторыми остова и функциональными пептидного группами радикалов аминокислот. Происхо • кислоты и щелочи, изменяя рН среды, ВЫ зывают перераспределение связей в моле куле белка; • соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют проч ные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изме НЯЯ их конформацию и активность; • детергенты - вещества, содержащие гидро фобный углеводородный радикал и гидро фильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). Гид рофобные радикалы белков взаимодейству ют с гидрофобными частями детергентов, что изменяет конформацию белков, Дена турированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирую щего вещества удерживают его в растворе. К наиболее известным детергентам относят различные мыла (рис. 1-15). Нативный белок Денатурированные молекулы того же белка Рис. 1-14. Структура нативной молекулы белка (в центре) и трёх денатурированных молекул этого же белка. Активный центр, Гидрофобная часть humo, Om Алло, Детергент Нативный белок Гидрофобными участками детергент присоединяется к гидрофобным радикалам аминокислот полипептидной цепи Рис. 1-15. Денатурация белков с помощью детергентов. 6. Медицинские аспекты қонформационной лабильности белков кого ряда. Обладающие высокой гидрофобнос Тью, они эффективно действуют на вегетативные формы бактерий и грибы, вызывая денатурацию их белков. Эффективность антисептических свойств уменьшается с увеличением растворимо сти препарата в воде. Склонность большинства белков к денатура ции в процессе их выделения, хранения и ис пользования затрудняет их получение серьёзно и применение в медицине. Для правильного обращения с белковыми ле карственными препаратами к ним прикладыва ЮТ Инструкцию, в которой указывают условия хранения большинство ИХ и использования. Так, белковых препаратов необходимо хранить в Холодильнике при температуре не выше 10 °С, растворять сухие препараты охлаждённой до комнатной температуры кипячёной водой во из бежание их денатурации. HOYVOH CH3 Крезол Фенол Резорцин 7. Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине В биохимических исследованиях перед опре делением в биологическом материале низкомо лекулярных соединений из раствора обычно удаляют белки. Для этой цели чаще всего ис Тользуют трихлоруксусную кислоту. После её добавления в раствор денатурированные белки выпадают в осадок и легко удаляются фильтро ванием. же использовать для денатурации ферментов в Трихлоруксусную кислоту целях прекращения реакции. можно так- ферментативной В медицине денатурирующие агенты часто ис- пользуют для стерилизации медицинских инст рументов и материала, а также в качестве анти- септиков. Например, в автоклавах при высокой температуре стерилизуют медицинские инстру менты и материалы. Фенол и его производные (крезол, резорцин) относят к известным антисептикам ароматичес Раствор крезола в калийном мыле известен как препарат лизол, применяемый в качестве дезинфицирующего средства. Берёзовый дёготь - одна из основных со ставных частей мази Вишневского, содержит в своем составе фенол. Препарат, используемый для лечения ран, обладает высоким антимик робным действием. Значительное количество антисептиков пред ставлено солями тяжёлых металлов. Их анти микробное действие связано с тем, что уже в довольно низких концентрациях они взаимо действуют с белками микроорганизмов, блоки руют их SH-группы и изменяют их конформа цию. Из-за высокой токсичности большинство лекарств, содержащих соли тяжёлых металлов, применяют в качестве поверхностных антисеп тиков. Так, высокой антимикробной активностью об ладает сулема — дихлорид ртути (HgCl,). Её используют для обработки рук и дезинфекции помещений. Случайное или преднамеренное от равление препаратами ртути вызывает тяжёлые некротические поражения слизистой оболочки пищеварительного тракта и некротические изме нения в почках. Антимикробными свойствами обладают и препараты серебра, такие как Ляпис (AgNO), колларгол (серебро Коллоидальное), при меняемые для обработки слизистых оболочек при Инфекционных заболеваниях. В данный структурный мотив входят две а спирали: одна более короткая, другая более длинная, которые соединены поворотом поли пептидной цепи. Более короткая сх-спираль рас полагается поперёк бороздки, а более длинная а-спираль -- в большой бороздке, образуя не ковалентные специфические связи радикалов аминокислот с нуклеотидами ДНК (рис. 1-17). Г. СУПЕРВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ 3. Супервторичная структура в виде «цинкового пальца» Этот вид супервторичной структуры также часто отмечают в ДНҚсвязывающих белках. «Цинковый палец» — фрагмент белка, содер жащий около 20 аминокислотных остатков, в котором атом цинка связан с радикалами четы рёх аминокислот: обычно с двумя остатками Стрелки ~ Bструктуры Пространственная структура каждого белка индивидуальна и определяется его первичной структурой. Однако сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выя вило наличие у них похожих сочетаний вторичной специфичес элемен структуры. тов Такой кий порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков. Супервторичная структура формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания -спи ралей и В-структур часто обозначают как «струк турные мотивы». Они имеют специфические названия: «Qспираль-поворот-а-спираль», «структура 3-бочонка», «лейциновая застёжка молния», «Цинковый палец» и др. Специфичес кое пространственное расположение о-спиралей и В-структур формируется за счёт межрадикаль ных взаимодействий. КА, требата на на .. ** . Е : : ~-Спираль : Рис. 1-16. Супервторичная структура в виде 3-бочонка. А триозофосфатизомераза; Б ~ домен пируваткиназы. Р. 1. Супервторичная структура типа р-бочонка Такая структура действительно напоминает бочонок, где каждая Вструктура (обозначен ная на рис. 1- 16 стрелкой) расположена внут ри и связана с а-спиральным участком поли пептидной цепи, находящимся на поверхности молекулы. Супервторичную структуру в виде рбочонка имеют некоторые ферменты, например триозо фосфатизомераза и один домен пируваткиназы (рис. 1-16). Двойная спираль ДНК --2 •Спирали ДНК-связывающего белка 2. Структурный мотив «спираль поворот-аспираль» Этот «структурный мотив» обнаружен во мно ГИХ ДНКсвязываюцих белках. Двухспиральная структура ДНК имеет две бороздки — большую и малую. Большая бороздка хорошо приспособ лена для связывания белков, имеющих неболь щие спиральные участки. Рис. 1-17. Связывание супервторичной структуры «с-спи раль-поворот-а-спираль» ДНК-связывающего белка в большой бороздке ДНК. 31 Цистеина и двумя — гистидина. В некоторых случаях вместо остатков гистидина также нахо дятся остатки цистеина (рис. 1-18). Два близко лежащих остатка цистеина отделе Hы от двух других остатков гистидина (или цисте ина) аминокислотной последовательностью, состо ящей примерно из 12 аминокислотных остатков. Этот участок белка образует а-спираль, которая может специфично связываться с регуляторными участками большой бороздки ДНК. Crrецифич Ность взаимодействия ДНК-связывающего белка с определённой областью ДНК зависит от после довательности аминокислотных остатков, распо ложенных в области «Цинкового пальца». Лейциновые остатки а-спирали одного белка могут взаимодействовать с лейциновыми остат ками другого белка с помощью гидрофобных взаимодействий, соединяя их вместе (рис. 1-19). Примером соединения белков с помощью «лейциновой застёжки-молнии» могут служить гистоны. Гистоны — ядерные белки, в состав которых входит большое количество положи тельно заряженных аминокислот - аргинина и лизина. Молекулы гистонов объединяются в комплексы, состоящие из 8 мономерных бел ков с помощью «лейциновых застёжек», несмот ря на то, что все мономеры имеют сильный по ложительный заряд. 4. Супервторичная структура в виде «Лейциновой застёжки-молнии» Д. ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА БЕЛКОВ Некоторые ДНК-связывающие белки олиго мерны, т.е. содержат в своём составе несколько полипептидных цеrіей. Кроме того, существуют белки, которые функционируют в комплексе с другими белками. Объединение протомеров или отдельных белков в комплексы иногда осуще ствляется с помощью структурных мотивов, на зываемых «лейциновая застёжка-молния». На поверхности каждой из двух взаимодей ствующих полипептидных цепей или белков имеется а-спиральный участок, содержащий по крайней мере 4 остатка лейцина. Лейциновые остатки располагаются через каждые б амино кислот один от другого. Так как каждый виток а-спирали содержит 3,6 аминокислотных остат ка, радикалы лейцина находятся на поверхнос ти каждого второго Витка. Если полипептидная цепь белка содержит бо лее 200 аминокислот, как правило, её простран ственная структура сформирована в виде двух или более доменов. Домен участок полипеп Тидной цепи, который в процессе формирова ния пространственной структуры приобрёл независимо от других участков той же цепи кон формацию глобулярного белка. Так, лёгкая цепь иммуноглобулина G состоит из двух доменов. В некоторых случаях доменами называют от дельные структурные участки полипептидной цепи. Домены обычно можно выделить, действуя на белок протеолитическими ферментами, лег ко разрывающими гептидные полипептидной цепи, расположенной между доменами. После связи на участке этого некоторые домены мо гут сохранять свои биологические свойства. і --- -о-х-шо q-спиральный участок «Цинкового пальца», связывающийся с ДНК -о- Остатки о-г “Остатки Гис Цис Рис. 1-18. Фрагмент ДНК-связывающего белка в форме «цинкового пальца». 32 Гидрофобные радикалы Лей -спиральный участок -... другого белка • q•Спиральный участок одного белка ΛΛΛΛΛΛΛΛΑ Рис. 1-19. «Лейциновая застёжка-молния» между «спиральными участками двух белков. Е. ЧЕТВЕРГИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛков Многие белки содержат в своём составе толь ко одну полипептидную цепь. Такие белки на зывают мономерами. К мономерным относят и белки, состоящие из нескольких цепей, но соединённых ковалентно, например дисуль фидными связями (поэтому инсулин следует рассматривать как мономерный белок). В то же время существуют белки, состоя щие из двух и более полипептидных цепей. После формирования трёхмерной структуры каждой полипептидной цепи они объединя ются с помощью тех же слабых взаимодей ствий, которые участвовали в образовании третичной структуры: гидрофобных, ионных, Водородных. Количество и взаиморасположение полипеп тидных цепей в пространстве называют «чет вертичная структура белков». Отдельные поли пептидные цепи в таком белке носят название протомеров, или субъединиц. Белок, содержа щий в своём составе несколько протомеров, называют олигомерным. от двух до четырёх полипептидных цепей (ди мерные, тетрамерные белки). Так, фермент гексокиназа содержит в своём составе 2 протомера; белок эритроцитов гемог лобин и фермент лактатдегидрогеназа -- 4 про томера; фермент внутренней мембраны митохон дрий цитохромоксидаза — 13 протомеров, а глутаминсинтетаза — 12 протомеров (рис. 1-20). Имеются также крупные многофункциональные комплексы, содержащие в своём составе несколь ко десятков полипептидных цепей, натример пи руватдегидрогеназный комплекс состоит из 312 протомеров. Некоторые олигомерные белки содержат идентичные протомеры (например, гексоки наза), другие состоят из разных протомеров. Так, в составе гемоглобина присутствуют 2 g Вид сбоку Вид сверху 1. Количество протомеров в структуре олигомерных белков В состав олигомерных белков может входить от двух до нескольких десятков протомеров, хотя наиболее часто встречают белки, содержащие Рис. 1-20. Субъединичная структура глутаминсинтетазы. 2—2128 Протомер и 2 B-протомера, ав составе лактатдегидроге назы, имеющей 4 протомера, 2 типа мономе ров (Н и М) в разных тканях могут находить ся в разных сочетаниях (например, 4H либо 3H+HM и т.д.). Олигомерные белки имеют большую моле Кулярную массу. Белки с молекулярной массой более 50 000 дпрактически всегда содержат несколько мономерных полипептидных цепей. По сравнению с индивидуальными ми белками олигомеры выполняют более слож ные функции. мономерны Протомер 2. Сборка протомеров в олигомерный белок. Комплементарность протомеров Рис. 1-21. Схема образования димерной белковой моле кулы. Между протомерами АиБ образуется множество сла бых связей, обозначенных на рисунке чёрточками. Комплементарность - универсальный прин цип, свойственный живой природе и лежащий в основе узнавания и соединения не только протомеров, но и других (не обязательно бел ковых) молекул. III. ФОРМИРОВАНИЕ ГРУКТУРЫ БЕЛКА «Узнавание» и присоединение отдельных про томеров олигомерного белка происходят благо даря формированию на их поверхности контак THых участков. Последние состоят из радикалов аминокислот, собранных в данном месте в про цессе образования третичной структуры белка. Совокупность этих радикалов формирует уни кальные поверхности, способные с высокой специфичностью объединяться друг с другом. Специфичность связывания контактных уча стков определяется их комплементарностью. KoMILлементарность — пространственное и Хими ческое соответствие В КЛЕТКЕ взаимодействующих повер хностей. Впадины и выступы на поверхности одной молекулы должны совпадать с выступами и впадинами на поверхности другой молекулы, как два куска неровно разорванной бумаги. Кро ме того, функциональные группы радикалов ами нокислот на одной контактирующей поверхнос ти должны образовывать слабые химические связи с радикалами аминокислот на другой по верхности (рис. 1-21). В области контактных поверхностей обычно содержится много гидро фобных радикалов аминокислот, объединения гидрофобное которых в результате формируется ядро олигомерного белка. Гидрофильные ради калы могут образовывать водородные и ионные связи. Таким образом, взаимодействие протомеров осуществляется во многих точках ющих поверхностей, с образованием десятков слабых связей. Благодаря этому контактные поверхности соединяются с высокой специфич ностью, контактиру и ошибки формирования четвертичной структуры белков практически исключены. Формирование трёхмерной структуры бел ков - важнейший биологический процесс, так как от пространственной структуры белков за висит их биологическая функция. Процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру по лучил название «фолдинг белков». Индивидуаль ные белки, продукты одного гена, имеют иден тичную аминокислотную последовательность и приобретают в одинаковых условиях клетки одинаковую конформацию и функцию. Это положение подтверждается способностью неко торых белков после денатурации (при которой происходит разрыв слабых связей, но не повреж дается первичная структура белков) спонтанно восстанавливать свою уникальную конформа цию и функцию. Однако в клетке концентрация белков на столько высока, что существует большая веро ятность взаимодействия белков с несформиро ванной конформацией. На их поверхности располагаются гидрофобные радикалы, склон 34 ные к объединению. Поэтому для многих белков, имеющих высокую молекулярную массу и сложную пространственную фолдинг протекает структуру, при участии специальной группы бел ков, которые называют «шапероны» (от франц. shaperon - Няня). А. РЕНАТИВАЦИЯ БЕЛКОВ Долгое время считалось, что процесс денату рации белков необратим. Однако оказалось, что некоторые очищенные и денатурированные бел ки способны в опытных условиях восстанавли вать конформацию при удалении денатурирую щих агентов. Ренативация рибонуклеазы В начале 60-х г. XX века обнаружили, что про цесс денатурации белков может быть обрати мым. Это открытие было сделано при изучении денатурации рибонуклеазы – фермента, рас щепляющего связи между нуклеотидами в РНК. Рибонуклеаза — глобулярный белок, содержа Щий одну полипептидную цепь, состоящую из 124 аминокислотных остатков. Его конформа цию стабилизируют 4 дисульфидные и множе ство слабых связей. Обработка рибонуклеазы рмеркаптоэтанолом (формула р- меркаптоэтанола - HO-CH-CH, SH) приводит к разрыву дисульфидных связей и Восстановлению SH-групп цистеиновых, остат ков, что нарушает компактную структуру белка. Добавление 8 м раствора мочевины или 6 м раствора гуанидинхлорида, вызывающих разрыв слабых связей в белке и образование новых во дородных связей с денатурирующими агентами, приводит к образованию случайным образом свёрнутых полипептидных цепей рибонуклеазы, лишённых ферментативной активности, т.е. к денатурации фермента. Денатурирующие аген Ты не разрушают первичную структуру белка, Однако если Путём диализа очистить рибо нуклеазу от денатурирующих агентов и р-мер кап-тоэтанола, ферментативная активность бел ка постепенно восстанавливается. Этот процесс называется ренатурацией, или ренативацией белка. Сульфгидрильные группы денатурирован ного фермента под действием кислорода возду ха окисляются, в результате вновь возникают 4 дисульфидные связи, характерные для натив ной структуры белка. Из 105 возможных спо собов связывания восьми SH- групп остатков Цистеина реализуется только один вариант, ха рактерный для нативной конформации белка (рис. 1-22). Возможность ренативации впоследствии была доказана и для других белков, в частности ми оглобина. Сохранность первичной структуры белка — необходимое условие для восстановле Ния ero кoнформации. На основании этих опы тов был выведен фундаментальный принцип молекулярной биологии: аминокислотная пос ледовательность белков определяет их конфор мацию и специфическую функцию. Формирование пространственной структуры белка - самопроизвольный процесс, при кото ром белок стремится принять в данных услови ях конформацию с наименьшей свободной энер гией. Изменение условий окружающей среды или изменение первичной структуры данного белка могут привести к изменению его конфор мации и функции. Б Нs Хэ . ОНЫ Нs-40 [ 58 Добавление ение th HS (HS | Нs-26 \ 84 3 26 26 мочевины и 3-мер каптоэтанола Нs 95 Нs 110 мочевины и В-мер қапто этанола 40 Рис. 1-22, Денатурация и ренативация рибонуклеазы. А - нативная молекула рибонуклеазы, в третичной структуре которой имеются 4 дисульфидные связи; Б – денатурированная молекула рибонуклеазы; В~ нативная молекула рибонуклеазы, в струк туре которой вновь образованы 4 дисульфидные связи между теми же остатками Цистеина. Б. СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ НАПЕРОНОВ В ФОЛДИНГЕ БЕЛКОВ В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке оли гомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные каг регации. На вновь синтезированном полипеri Тиде имеется множество гидрофобных радика лов, которые в трёхмерной структуре спрятаны Внутри молекулы. Поэтому на время форми рования нативной конформации реакционно способные аминокислотные остатки одних бел ков должны быть отделены от таких же групі других белков. Во всех известных организмах от прокарио тов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящи мися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название «папероны». 1. Классификации шаперонов (0) В соответствии с молекулярной массой все ша пероны можно разделить на 6 основных групп: • высокомолекулярные, с молекулярной мас сой от 100 до 110 кД; • Ш-90 -- смолекулярной массой от 83 до 90 кД; • Ш-70 — смолекулярной массой от 66 до 78 кД; • ШІ-60; • Ш-40; • Низкомолекулярные шапероны с молекуляр ной массой от 15 до 30 кД. Среди шаперонов различают: конститутив ные белки (высокий базальный синтез кото рых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны от носят к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрес совым воздействиям. Название «белки тепло Вого шока» возникло в результате того, что Впервые эти белки были обнаружены в клет ках, которые подвергались воздействию высо кой температуры. 2. Роль шаперонов в фолдинге белков При синтезе белков N-концевая область по липептида синтезируется раньше, чем C-кон цевая область. Для формирования конформа ции белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосомe защиту реакционно-способ ных радикалов (особенно гидрофобных) осуще ствляют Ш-70. ШШ-70 -- высококонсервативный класс бел ков, который присутствует во всех отделах Клет ки: цитоплазме, ядре, ЭР, митохондриях. В об ласти карбоксильного конца единственной полипептидной цепи шаперонов есть участок, образованный радикалами аминокислот в фор ме бороздки. Он способен взаимодействовать с участками белковых молекул и развёрнутых по липептидных цепей длиной в 7-9 аминокис лот, обогащённых гидрофобными радикалами. В синтезирующейся полипептидной цепи такие участки встречают примерно через каждые 16 аминокислот. Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеюіцих сложную конформацию (например, до менное строение), осуществляется в сrіециальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 фун кционируют в виде олигомерного комплекса, со стоящего из 14 субъединиц (рис. 1-23). Ш-60 образуют 2 кольца, каждое из которых состоит из 7 субъединиц, соединённых друг с другом. Субьединица Ш-60 состоит из 3 доме нов: апикального (верхушечного), промежуточ ного и экваториального, Верхушечный домен имеет ряд гидрофобных остатков, обращённых в полость кольца, сформированного субъеди ницами. Экваториальный домен имеет участок связывания с АТФ и обладает АТФазной ак тивностью, т.е. способен гидролизовать АТФ до АДФ и Н,РО. Шапероновый комплекс имеет высокое срод ство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых моле кул (прежде всего участки, обогащённые гид рофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участ ков Ш-60. В специфической среде этой полос ти, в изоляции от других молекул клетки про исходит перебор возможных конформаций белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация. 36 Апикальный домен Generatio nC Белковая субъеди ница Ш-60 r Промежуточный домен owanymount som Экваториальный домен А. Вид сбоку С Б. Вид сверху Рис. 1-23. Структура шаперонового комплекса, состоящего из 14 белковых молекул Ш-60. Рибосома — мРНК Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гид ролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фол динг белков требует затрат большого количе ства энергии. Таким образом, синтез и фолдинг белков про текают при участии разных групп шаптеронов, препятствующих нежелательным взаимодей ствиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного форми рования нативной структуры (рис. 1-24). Синтезирующийся полипептид Шапероны-70 е в Полипептид 3. Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий Шапероны-60 Шаrероновый комплекс 9 - Нативный белок Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (от англ. hеаt shock protein). При действии различных стрессовых факто ров (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФо, изменение рН среды, изменение моляр ности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках уси ливается синтез БТІ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатуриро Рис. 1-24, Участие шаперонов в фолдинге белков. А – уча стие шаперонов-70 в предотвращении Гидрофобных взаимо действий между участками синтезирующегося полипептида; Б– формирование нативной конформации белка в шапероно вом комплексе. 31 дегенеративные ток, наблюдают их изменения и разрастание соединительнотканных альных клеток. Развиваются болезни, называе мые амилоидозами. Для каждого вида амилои доза характерен определённый тип амилоида. В настоящее или гли время описано более 15 таких бо лезней. могут ванных белков, они препятствовать их полной денатурации и восстанавливать натив ную конформацию белков. Установлено, что кратковременные стрессо Вые воздействия увеличивают повышают устойчивость организма к длитель Hым стрессовым воздействиям. Так, кратковре менная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повы шает устойчивость миокарда к длительной ише мии, вызванной стенокардией или закупоркой сосудов сердца тромбом. В настоящее время пер спективными исследованиями в медицине счи выработку тают поиски БТШи фармакологических и молекуляр но- биологических способов активации синтеза БТШІ в клетках. 4. Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипеп тидных цепей может принимать одну стабиль ную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энерги ей Гиббса, но с различными свойствами. Пер Вичная структура большинства известных бел ков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конфор мации. Однако некоторые растворимые в воде бел ки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амило идом (от лат. amylum -- крахмал). Так же как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом. Это может происходить: • при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концент рация в клетке; • при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конфор мацию других молекул белка; • при активации протеолиза нормальных бел ков организма, с образованием нераствори мых, склонных к агрегации фрагментов; • в результате точечных мутаций в структуре белка. В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция кле Болезнь Альцхаймера Болезнь Альцхаймера — наиболее часто от мечаемый В-амилоидоз нервной системы, как правило, поражающий лиц преклонного возра ста и характеризующийся прогрессирующим расстройством памяти и полной деградацией личности. В ткани мозга откладывается В-ами лоид — белок, образующий нерастворимые фиб риллы, нарушающие структуру и функции не рвных клеток. В-амилоид — продукт изменения конформации нормального белка организма человека. Он образуется из более крупного пред шественника частичным протеолизом и синте зируется во многих тканях. В-Амилоид, в отли чие от своего нормального предшественника, содержащего много а-стиральных участков, имеет вторичную р-складчатую структуру, ar регирует с образованием нерастворимых фиб рилл, устойчив к действию протеолитических ферментов. Причины нарушения фолдинга нативных бел ков в ткани мозга ещё предстоит выяснить. Воз можно, с возрастом уменьшается синтез шапе ронов, способных участвовать в формировании и поддержании нативной конформации белков, Или увеличивается активность протеаз, что при водит к увеличению концентрации белков, склонных изменять конформацию. Прионовые болезни Прионы — особый класс белков, обладаю щих инфекционными свойствами. Попадая в организм человека или спонтанно возникая в нём, они способны вызывать тяжёлые неизле чимые заболевания ЦНС, называемые прионо выми болезнями. Название «прионы» проис ходит от аббревиатуры английской фразы proteinaceous infectious particle — белковая ин фекционная частица. Прионовый белок кодируется тем же геном, что и его нормальный аналог, т.е. они имеют идентичную первичную структуру. Однако два белка обладают различной конформацией: при 38 мацию, обладает и уникальной функцией, отличающей его от всех остальных белков. На бор индивидуальных белков выполняет в клет ке множество разнообразных и сложных фун кций. Необходимое условие для функционирования белков — присоединение к нему другого веще ства, которое называют «Лиганд». Лигандами могут быть как низкомолекулярные вещества, так и макромолекулы. Взаимодействие белка с лигандом высокоспецифично, что определяет ся строением участка белка, называемого цент ром связывания белка слигандом или актив Hым центром. А. Активный IIЕНТР БЕлков оновый белок характеризуется высоким содержанием В-слоёв, в то время как нормальный белок имеет много а-спиральных участков. Кро ме того, приоНовый белок обладает устойчиво стью к действию протеаз и, попадая в ткань мозга или образуясь там спонтанно, способству ет превращению нормального белка в прионо- Вый в результате межбелковых взаимодействий, Образуется так называемое «ядро Полимериза Ции», состоящее из агрегированных прионовых белков, к которому способны присоединяться новые молекулы нормального белка. В резуль дят характер тате в их пространственной структуре происхо- конформационные перестройки, Hые для прионовых белков. Известны случай наследственных форм при случаи наследственных форм при- оновых болезней, вызванных мутациями в струк туре данного белка. Однако возможно и зараже ние человека прионовыми белками, в результате чего возникает заболевание, приводящее к гибе ли больного. Так, куру — прионовая болезнь аборигенов Новой Гвиней, эпидемический ха рактер которой связан с традиционным канни бализмом в этих племенах и передачей инфек ционного белка от одной особи к другой. В связи с изменением образа их жизни данное заболева Ние практически исчезло. В настоящее время интерес к прионовым бо лезням Возрок в связи с заражением людей при онами при употреблении мясопродуктов, полу ченных от прионов, коров» (бо животных, являющихся носителями вызывающих «бешенство лезнь Кройтцфельдта-Якоба). Несмотря на то, что прионовые белки человека и животных раз личаются лишь незначительно, долгое время по лагали, что существуют межвидовые барьеры на пути передачи болезни. Однако последние дан ные показали, что эти барьеры не абсолютны, и что существует принципиальная возможность передачи болезни от одного вида другому. Так, в Великобритании к середине 1999 г. было зареги- стрировано около 40 случаев данного заболева ния. Прогноз не исключает развития эпидемии прионовой болезни в ближайшие 10-15 лет. и изБИРАТЕЛЬНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ ЕГО слиҒАНДОМ Активный центр белков ~ определённый уча сток белковой молекулы, как правило, находя щийся в её углублении («кармане»), сформиро ванный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способ ный комплементарно связываться слигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга. Высокая специфичность связывания белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда (рис. 1-25). Под комплементарностью понимают про странственное и химическое соответствие вза имодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и простран ственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и «Подгоняется» под лиганд. Кро ме того, между функциональными групами лиганда и радикалами аминокислот, образую Щих активный центр, должны возникать свя зи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ион ными, водородными, гидрофобными), так и ко валентными. IV. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ Каждый индивидуальный белок, имеющий уникальную первичную структуру и конфор 39 et Лиганд 1 1 Белок — Рис. 1-25. Взаимодействие белка с лигандом. А и Б - некомплементарное взаимодействие и разрушение связей между бел ком и лигандом; В - комплементарное взаимодействие белка с лигандом. 1. Характеристика активного центра Активный центр белка относительно изо лированный — от окружающей белок среды учас тоқ, сформированный аминокислотными остат ками. В этом участке каждый остаток благодаря своему индивидуальному размеру и функцио нальным группам формирует «рельеф» актив ного центра. Объединение таких аминокислот в единый функциональный комплекс изменяет реакцион ную способность их радикалов, подобно тому, как меняется звучание музыкального инструмен та в ансамбле. Поэтому аминокислотные остат ки, входящие в состав активного центра, часто называют «ансамблем» аминокислот. Уникальные свойства активного центра за висят не только от химических свойств фор мирующих его аминокислот, но и от их точ ной взаимной ориентации в пространстве. Поэтому даже незначительные нарушения об щей конформации белка в результате точеч Hых изменений его первичной структуры или условий окружающей среды могут привести к изменению химических и свойств радикалов, формирующих активный центр, нарушать связывание белка с лигандом и его функцию. При функциональных денатурации активный центр белков разрушается, и происходит утра та их биологической активности. Часто активный центр формируется таким об разом, что доступ воды к функциональным груп пам его радикалов ограничен, т.е. создаются условия для связывания лиганда с радикалами аминокислот. В некоторых случаях лиганд присоединяется. только к одному из атомов, обладающему опре делённой реакционной способностью, напри мер присоединение 0, к железу миоглобина или гемоглобина. Однако свойства данного атома избирательно взаимодействовать с 0, опреде ляются свойствами радикалов, окружающих атом железа в составе гема. Гем содержится и в других белках, таких как цитохромы. Однако функция атома железа в цитохромах иная, он служит посредником для передачи электронов от одного вещества другому, при этом железо становится то двух-, то трёхвалентным. Центр связывания белка с лигандом часто рас полагается между доменами. Например, піроте олитический фермент трипсин, участвующий в гидролизе пептидных связей пищевых белков в кишечнике, имеет 2 домена, разделённых бо роздкой. Внутренняя мируется аминокислотными радикалами этих поверхность бороздки фор 40 доменов, стоящими в политетидной цепи да леко друг от друга (Сер, Гисен Аспу). Разные домены в белке могут перемещаться друг относительно друга при взаимодействии с лигандом, что облегчает дальнейшее функцио нирование белка. В качестве примера можно рассмотреть работу гексокиназы, фермента, ка- тализирующего перенос фосфорного остатка с АТФ на молекулу глюкозы (при её фосфорили ровании). Активный центр гексокиназы расrio лагается в расщелине между двумя доменами (рис. 1-26) При связывании гексокиназы с глю козой окружающие её домены сближаются, и субстрат оказывается в «Ловушке», что облегча ет его дальнейшее фосфорилирование. Основное свойство белков, лежащее в осно ве их функций, — избирательность присоеди нения к определённым участкам белковой мо лекулы специфических лигандов. занные с белком, выполняющие вспомога тельную роль при функционировании бел ков (например, железо, входящее в состав гемоглобина). В тех случаях, когда аминокислотные (стат Ки, формирующие активный центр, не могут обеспечить функционирование данного белка, к определённым участкам активного центра могут присоединяться небелковые молекулы. Так, в активном центре многих ферментов при сутствует ион металла (кофактор) или органи ческая небелковая молекула (кофермент). Не белковую часть, прочно связанную с активным центром белка и необходимую для его функци онирования, группа». называют Миоглобин, гемоглобин и цитохромы имеют в активном «Іростетическая центре простетическую группу — гем, содержащий железо (более подробно гемсолер жащие белки описаны в разделе 4, а кофакторы и коферменты — в разделе 2). Соединение протомеров в олигомерном бел ке — пример взаимодействия высокомолекуляр НЫХ ЛИганов. Каждый протомер, соединёнНЫЙ с другими протомерами, служит для них лига - Дом, так же как они для него. Иногда присоединение какого-либо лиганда Изменяет конформацию белка, в результате чего формируется центр связывания с другими ли гандами. Например, белок кальмодулин после связывания счетырьмя ионами Са? В специ фических участках гіриобретает способность взаимодействовать с некоторыми ферментами, меняя их активность, 2. Многообразие лигандов • Лигандами могут быть неорганические (ча сто ионы металлов) и органические веще ства, низкомолекулярные и высокомолеку лярные вещества; • существуют лиганды, которые изменяют свою ХИМИческую структуру при присоединении кактивному центру белка (изменения суб страта в активном центре фермента); • существуют лиганды, присоединяющиеся к белку только в момент функционирова - Ния (например, (,, транспортируемый те моглобином), и лиганды, постоянно свя Глюкоза ху Домены ¥ексокиназы Рис. 1-26. Связывание гексокиназы с глюкозой. 3. Сродство активного центра лиганду Скорость взаимодействия белка с лигандом определяется концентрациями белка и лиганда в растворе, а также степенью комплементарно сти белка и лиганда, Константа диссоциации — характеристика срод ства активного центра лиганду. Так как взаимодействие белка с лигандом — обратимый процесс, то его можно описать следующим уравнением: P+ LF PL, К дисс где р - белок, L - лиганд, PL - комплекс белка с лигандом, К, — константа скорости свя зывания белка с лигандом, К, — константа ско рости распада комплекса РL. Когда скорости образования и распада комп лекса равны, говорят о том, что система нахо дится в состоянии равновесия: [P] [L] K = [PL] К. : Отсюда: [P] [L] К дисс = росту концентрации комплекса [PL]. Эта за висимость носит характер гиперболической кривой (рис. 1-27). Кривая стремится к мақ симуму, когда при некоторой концентрации лиганда все молекулы белка находятся в свя занном слигандом состоянии (происходит насыщение белка лигандом). Степень насы щения белка лигандом можно выразить сле дующим уравнением: степень насыщения - [PL]/PJx100 (где P, — концентрация белка до добавления лиганда). При полунасыщении белка лигандом концен трации [PL] и [P] равны, и из уравнения К “дисе? приведённого выше, следует, что K = [L], т.е. К численно равна концентрации ли ганда, при которой 50% белка находится в комплексе с лигандом. Поэтому по кривой насыщения можно найти кие, и оценить сродство данного белка лиганду. Зависимость между образованием комплекса [PL] и концентрацией белка при избытке лиганда Как было сказано выше, при возрастающей концентрации лиганда насыщение белка ог раничено его концентрацией. При избытке лиганда все молекулы белка находятся в со ставе комплекса [PL]. Однако, если увели чивать концентрацию белка, то количество [PL] начнёт увеличиваться пропорциональ но концентрации белка. Концентрацию ком Іплекса (PL) можно регистрировать, напри [PL] Соотношение констант распада [PL] комп лекса и его образования называется констан той диссоциации (к ) комплекса [PL]. Чем меньше Ке, тем больше молекул лиганда свя зано с белком, тем больше комплементарность между Ри Lи тем больше сродство лиганда к белку. То есть между К. и сродством лиган да к белку имеется обратно пропорциональная связь. Иногда при описании процесса связывания белка с лигандом используют величину, обрат ную кисе, называемую константой связывания (К) или ассоциации. Степень насыщения, % 100 ... Писс "Дисс 1 Kes = к дисс [PL. [P] L. ИСС Между К. и сродством лиганда к белку суще ствует прямо пропорциональная зависимость. Зависимость насыщения белка лигандом от кон центрации лиганда при постоянной концентра ции белка При постоянной концентрации белка увели чение концентрации лиганда приводит к т 2 4 6 [L], моль/л Kджс Рис. 1-27. График насыщения белка лигандом. мер С ПОМОЩЬЮ Измерения Тоглощения све та. Учитывая, что его количество пропорци онально концентрации белка, можно на ос новании построенного графиқа определять концентрацию белка в растворе (рис. 1-28). рез синапсы с помощью химических молекул, называемых нейромедиаторами. Нейромедиатор, Выделяемый при прохождении импульса нервны ми окончаниями, должен высокоспецифично вза имодействовать с белками-рецепторами на пост синаптической мембране. Однако, модифицируя химическую структуру нейромедиатора, можно получить вещества, которые также связывались бы с рецептором, но при этом менялся физиоло гический эффект: уменьшался или усиливался. В фармакологии такие вещества называют «анта гонисты» и «агонисты» соответственно. Б. ВЕЩЕСТВА, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ Ингибиторы белковрецепторов в холинэргических синапсах лиганда с Хотя взаимодействие активным цен тром белка высокоспецифично, всегда можно Подобрать другое вещество, которое так же бу дет взаимодействовать с белком. Лиганд, взаи модействующий с белком и нарушающий его функцию, называют «Ингибитор белка». Если это вещество по структуре похоже на лиганд, его называют структурным аналогом лиганда; оно также взаимодействует с активным центром бел ка. Аналог, замещаюцций естественный лиганд в активном центре белка и снижающий его функ цию, называют «конкурентный ингибитор белка». 1. Лекарственные препараты как модуляторы белковых функций Аналоги естественных лигандов белков ис пользуют в медицине в качестве лекарственных средств. Широкое применение такие лекарства нашли в регуляции передачи возбуждения че рез синапсы, Передача сигнала от нерва к нерву или от не рва к эффекторному органу осуществляется че В качестве примера можно рассмотреть лекар ства, нарушающие проведение нервного импуль са через холинергические синапсы, где в каче стве нейромедиатора используется ацетилхолин. Холинергические белки-рецепторы неоднород ны по своей структуре и способны связываться с другими, кроме ацетилхолина, лигандами. Их делят на 2 большие группы: • М-холинорецепторы, названные так из-за их способности избирательно взаимодей ствовать с мускарином (токсин мухомора); • Н-холинорецепторы, избирательно связы вающие никотин. В нервно-мышечных синапсах присутствуют H-холинорецепторы, взаимодействие которых с ацетилхолином вызывает сокращение мышц. Для расслабления мышц в эндоскопических иссле дованиях, а также при разнообразных Хирурги ческих операциях используют структурные ана логи ацетилхолина, служащие ингибиторами данных рецепторов. Пример такого вещества -- Дитилин, относящийся к группе лекарственных веществ, называемых миорелаксантами (вызы вающими мышечное расслабление). Первона чально эти свойства были обнаружены у ядa қy раре, в связи с чем данные препараты называют также курареподобными (см. схему Ана с. 44). Наиболее известный специфический инги битор М-холинорецепторов — атропин. Атро пин — алкалоид, содержащийся в некоторых растениях: красавке, белене, дурмане. Он при холинорецепторам, соединяется к мнаходя щимся на мембране эффекторных клеток, В области окончаний парасимпатических нервов. Атропин препятствует их взаимодействию с ацетилхолином (антагонист природного лиган че е м ты . . ш. — . . . . . . . . — — — — — — 1 2 3 4 5 [P] На оси А регистрируют изменение, например поглощения света, вызванное образованием комплекса (PL) Рис. 1-28. График зависимости изменения поглощения све та, отражающего концентрацию комплекса [PL] от концен трации белка Р. 43 да), тем самым устраняя эффекты раздраже- реналин). Мезатон повышает тонус сосудов и ния парасимпатических нервов. АД, поэтому его используют при гипотонии и Так как ацетилхолин, связываясь с М-холи- коллапсе. Он менее подвержен действию инак норецепторами, вызывает сокращение многих тивирующих его ферментов, поэтому оказыва гладких мышц, атропин (как лекарственный ет более длительный и сильный эффект, чем препарат) снимает мышечные спазмы (спазмо его природные аналоги (см. схему Б). литик). Кроме того, он снижает стимулируемую ацетилхолином секрецию желёз (бронхиальных, 2. Яды - специфические лиганды пищеварительных, потовых). определённых белков М-холинорецепторы присутствуют в разных Некоторые яды, попадая в организм челове отделах ЦНС. Передозировка атропина может ка, прочно связываются с определёнными бел Вызвать двигательное и речевое возбуждение. ками, ингибируют их и тем самым вызывают нарушения биологических функций. Лекарственные вещества - стимуляторы Например, а-нейротоксины кобры и крайта белковых функций специфически взаимодействуют с холинерги Однако некоторые структурные аналоги ли- . ческими рецепторами постсинаптических мем ғандов рецептторных белков не являются инги бран, блокируя их работу, и оказывают кура биторами, а вызывают такие же или более силь реподобное действие. Q-Нейротоксины ные физиологические эффекты, чем природные небольшие белки с молекулярной массой око Лиганды. Их более сильный и длительный эф ло 7000 д(65-70 аминокислотных остатков). фект часто связан с тем, что модифицирован. Их третичную структуру стабилизируют 4 или ные лиганды медленнее инактивируются и раз 5 специфических дисульфидных связей (в за рушаются в организме. Например, мезатон по висимости от вида токсина). Сродство нейро структуре похож на нейромедиаторы симпати токсинов к холинергическим рецепторам очень ческой нервной системы (норадреналин и ад- высоко (Кие= 10-1"). Очевидно, между токси ДИСС CH3 CH3-N*-CH2-CH2-O- C-CH3 CH3 SCH3 Ацетилхолин CH3 CH3 СН2 — N*-СН2СН2-0-с 2-С-О-СН2-СН2-N* -- CH3 CH3 Дитилин H2C-CH-CH2 | | N-CH, CH -o-c-c H2C-CH-CH2 Атропин Схема А он ОН ОН но-С-СН- СН2-NH, Он он Ho-e-CHCH,- NH CH3 он сня -CHCH2-NH CH3 Норадреналин Адреналин Мезатон Схема Б 44 тенсивной мышечной работы, когда парциаль ное давление кислорода в ткани падает, о, ос вобождается из комплекса с миоглобином и используется в митохондриях клеток Для полу чения необходимой для работы мышц энергии. 2. Строение миоглобина ном и рецептором образуется множество свя зей, что и приводит к их практически необра тимому соединению. Необходимо помнить, что между лекарствами и ядами часто существует прозрачная граница, и эффект их действия зависит от дозы вводимого вещества. Так, лекарства, назначаемые в дозах, болыших чем терапевтические, могут действовать как яды, т.е. вызывать серьёзные нарушения об- мена веществ и функций организма, аяды в микродозах часто используют как лекарственные препараты. Например, атропин, широко приме Няемый для снятия спазмов гладких мышц, в больших дозах вызывает возбуждение ЦНС, а в ещё больших дозах -- сон, переходящий в кому. Известное гипотензивное средство клофелин передозировке вызывает коллапс. V. ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ ГЕМОГЛОБИНА при Олигомерные белки проявляют свойства, от сутствующие у мономерных белков. Влияние чет вертичной структуры на функциональные свой ства белка можно рассмотреть, сравнивая строение и функции двух родственных гемсодержащих бел ков: миоглобина и гемоглобина. Оба белка име ют общее эволюционное происхождение, сход ную конформацию отдельных полипептидных цепей и сходную функцию (участвуют в транс порте кислорода), но миоглобин - мономерный белок, а гемоглобин — тетрамер. Наличие чет вертичной структуры у гемоглобина придаёт это му белку свойства, отсутствующие у миоглобина. Миоглобин содержит небелковую часть (гем) и белковую часть (апомиоглобин). Гем — молекула, имеющая структуру цикли ческого тетрапиррола, где 4 пиррольных коль ца соединены метиленовыми мостиками и содержат 4 метильные, 2 винильные и 2 про пионатные боковые цепи. Эта органическая часть гема называется протопорфирином. Возможны 15 вариантов расположения бо ковых цепей, но в составе гемопротеинов присутствует только один изомер, называе мый протопорфирин IX. В геме 4 атома азо та пиррольных колец протопорфирина IX связаны четырьмя координационными свя Зями с Fe**, находящимся в центре молеку лы (рис. 1-29). Апомиоглобин - белковая часть миоглобина; первичная структура представлена последо вательностью из 153 аминокислот, которые Во вторичной структуре уложены в 8 а-си ралей. а-Спирали обозначают латинскими буквами от А до H, начиная с N-конца по липептидной цепи, и содержат от 7 до 23 аминокислот. Для обозначения индивиду альных аминокислот в первичной структу ре атомиоглобина используют либо напи сание их порядкового номера от N-конца (например, Гиска, Фена), либо букву аспи рали и порядковый номер данной амино Кислоты в этой спирали, начиная с N-кон ца (например, Гис F). Третичная структура имеет вид компактной глобулы (внутри практически нет свобод ного места), образованной за счёт петель и поворотов в области неспирализованных участков белка. Внутренняя часть молеку лы почти целиком состоит из гидрофобных радикалов, за исключением двух остатков Гис, располагающихся в активном центре. А. СТРУКТУРА И ФУНКЦии миоглоБИНА Миоглобин относят к классу гемсодержа щих белков, т.е. он содержит простетическую группу — гем, довольно прочно связанную с белковой частью. Миоглобин относят к гло булярным белкам; он имеет только одну по липептидную цепь. 1. Клеточная локализация и функция 3. Связывание гема с апомиоглобином Миоглобин содержится в красных мышцах и участвует в запасании кислорода. В условиях инГем — специфический лиганд апомиоглоби на, присоединяющийся к белковой части в уг 45 Винильная группа CH Метильная группа CHE г + CH=CH, нас 1 HC, н NH Пиррольное кольцо Н3Сд 5 CH CH2 Пропионатная группа CH2 H CH2 CH2 Coo COO Гем (тетрапиррол) Рис. 1-29. Строение rема, входящего в состав миоглобина и гемоглобина. Б. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГЕМОГЛОБИНА Гемоглобины — родственные белки, находящи-- еся в эритроцитах человека и ППОЗВОНОЧНЫХ ЖИВот Hых. Эти белки выполняют 2 важные функции: • перенос 0, из лёгких к периферическим тка Ням; • участие в переносе Cо, и протонов из пе риферических тканей в лёгкие для последу ющего выведения из организма. Кровь ежедневно должна переносить из лёг Ких в ткани около 600 л 0,. Так как 0, плохо растворим в воде, то практически весь кислород в крови связан с гемоглобином эритроцитов. От способности гемоглобина насыщаться 0, в лёгких и относительно легко отдавать его в лублении между двумя а-спиралями F и Е. Центр связывания с гемом образован пре имущественно гидрофобными остатками ами нокислот, окружающими гидрофобные пир рольные кольца гема. Две боковые группы пропионовых кислот, ионизированные при фи зиологических значениях рН, выступают на Поверхности молекулы. В активный центр апомиоглобина кроме гид рофобных аминокислот входят также 2 остатка Гис (Гиса и Гис, или Гис Е, и Гис Fa), играю щие важную роль в функционировании белка. Они расположены по разные стороны от плос кости гема и входят в состав спиралей Fи Е, между которыми располагается гем. Атом же леза в геме может образовывать 6 координаци онных связей, 4 из которых удерживают Fe2+ в центре протопорфирина IX (соединяя его с ато мами азота пиррольных колец), а 5-я связь воз никает между Fe2+ и атомом азота имидазоль ного кольца Гис F (рис. 1-30). Гис E, хотя и не связан с гемом, но необхо дим для правильной ориентации и присоеди нения другого лиганда — О, к миоглобину. Аминокислотное окружение гема создаёт ус ловия для довольно прочного, но связывания о, с Fe2+ миоглобина. Гидрофоб ные остатки обратимого аминокислот, окружающие гем, препятствуют проникновению в центр связы вания миоглобина воды и окислению Fe?* в Fe*, Трёхвалентное железо в составе гема не спо собно присоединять 0,. г Гис F8 RS А Гис Е F. Спи- J раль E- спи- 1 раль Рис. 1-30. Расположение гема в активном центре апоми оглобина и протомеров апогемоглобина. 46 тезироваться в клетках костного мозга уже на 8-м месяце развития плода. 2. Строение гемоглобина А Строение протомеров гемоглобина капиллярах тканей зависят количество получае мого тканями 0, и интенсивность метаболизма. С другой стороны, о, — сильный окислитель, избыток поступления 0, в ткани может привес ти к повреждению молекул и нарушению струк туры и функций клеток. Поэтому важнейшая ха рактеристика гемоглобина — его способность регулировать сродство к 0, в зависимости от тка невых условий. Гемоглобины, так же как миоглобин, отно сят к гемопротеинам, но они имеют четвертич ную структуру (состоят из 4 полипептидных це пей), благодаря которой возникает возможность регуляции их функций. Конформация отдельных протомеров гемог лобина удивительно напоминает конформацию миоглобина, несмотря на то, что в первичной структуре их полипептидных цепей идентичны только 24 аминокислотных остатка. Протомеры гемоглобина, так же как и апомиоглобин, состо ят из 8 спиралей, свёрнутых в Шотную глобу лярную структуру, содержащую внутреннее гид рофобное ядро и «карман» для связывания гема. Соединение гема с глобином (белковой частью) аналогично таковому у миоглобина — гидрофоб ное окружение гема, за исключением 2 остатков Гис Е, и Гис F (рис. 1-31). Однако тетрамерная структура гемоглобина представляет собой бо лее сложный структурно-функциональный ком плекс, чем миоглобин. 1. Гемоглобины человека Гемоглобины взрослого человека В эритроцитах взрослого человека гемоглобин составляет 90% от всех белков данной клетки. Гемоглобин А - основной гемоглобин взрос лого организма, составляет около 98% от общего количества гемоглобина, тетрамер, состоит из 2 полипептидных цепей аи 2 В (223). Гемоглобин А, находится в организме взрос лого человека в меньшей концентрации, на его долю приходится около 2% общего гемоглобина. Он состоит из 2 а- и 28-це пей. Гемоглобин А,, — гемоглобин А, модифици рованный ковалентным присоединением к нему глюкозы (так называемый гликози лированный гемоглобин). Гемоглобины, синтезирующиеся в период внутриутробного развития плода: Эмбриональный гемоглобин синтезируется в эмбриональном желточном мешке через несколько недель после оплодотворения. Представляет собой тетрамер 2£2є. Через 2 нед после формирования печени плода в ней начинает синтезироваться гемоглобин F, который к 6 мес замещает эмбриональ ный гемоглобин. Гемоглобин F — фетальный гемоглобин, синте зируется в печени и костном мозге плода до периода его рождения. Имеет тетрамерную структуру, состоящую из 2 а- и 2 ү-цепей. После рождения ребёнка постепенно замеща- ется на гемоглобин А, который начинает синРоль гистидина Е, в функционировании миоглобина и гемоглобина Гем имеет высокое сродство к оксиду угле рода (СО). В водной среде свободный от белко вой части гем связывается с СО в 25 000 раз сильнее, чем 0,. Высокая степень сродства гема к со по сравнению с 0, объясняется разным пространственным расположением комплексов Fe2+ гема с СО и О, (рис. 1-31, A). В комплексе Fe2+ rема с со атомы Fe+, угле рода и кислорода расположены на одной пря мой, а в комплексе Fe2+ гема с 0, атомы железа и кислорода расположены под углом, что отра жает их оптимальное пространственное распо ложение, В миоглобине и гемоглобине над Fe2+ в обла сти присоединения 0, расположен Гис Е, на рушающий оптимальное расположение со в центре связывания белков и ослабляющий его взаимодействие с гемом. Напротив, тот же Гис Е, создаёт оптимальные условия для связыва ния 0, (рис. 1-31, Б). В результате сродство тема к со в белках всего в 200 раз превышает его сродство к 0,. Снижение сродства гемсодержащих белков к со имеет важное биологическое значение. Со образуется в небольших количествах при катаболизме некоторых веществ, в частности 47 보 на Гис Е, Гис E7 o=0-Р-2 Плоскость гема | холб=o - Гис Fa 2 N---- с Рис, 1-31. Пространственное расположение со иО,, связанных со свободным гемом (А) и гемом в составе гемоглобина или миоглобина (Б). гема. Этог Эндогенно образующийся со бло кирует около 1% гемсодержащих белков. Если бы сродство гема к со не уменьшалось под ВЛИЯНием белкового окружения, эндогенный оксид углерода мог бы Вызывать серьёзные от равления. 3. Связывание гемоглобина е 0, в лёгких и его диссоциация из комплекса в тканях Основная функция гемоглобина — доставка 0, от лёгких к тканям. Олигомерная структура гемоглобина обеспечивает быстрое насыщение его кислородом в лёгких (образование оксиге моглобина - Hb(0,)), возможность ОТщетіле Ния кислорода от гемоглобина в капиллярах тканей при относительно высоком парциальном давлении 0,, а также возможность регуляции сродства гемоглобина к 0, в зависимости от по требностей тканей в кислороде. Четвертичная структура гемоглобина Кооперативные изменения конформации протомеров 0, связывается с протомерами гемоглобина через Fe2+ , который соединён с четырьмя атома ми азота иррольных колец гема и атомом азота Четыре полипептидные цепи, соединённые Вместе, образуют почти правильную форму шара, где каждая 4-цепь контактирует с двумя В-цепями (рис. 1-32). Так как в области контакта между а- и В-, а также между - и В, -цепями находится мно го гидрофобных радикалов, то между этими по липептидными целями формируется сильное соединение за счёт возникновения в первую очередь гидрофобных, а также ионных и водо родных связей. В результате образуются Диме ры ар, иар,. Между этими димерами в тетра мерной молекуле гемоглобина возникают в основном полярные (ионные и водородные) связи, поэтому при изменении рН среды в кис Хую или целочную сторону в первую очередь разрушаются связи между димерами. Кроме того, димеры способны легко перемещаться от носительно друг друга. Так как поверхность протомеров неровная, полипептидные цени в центральной области не могут плотно прилегать друг к другу, в резуль тате в центре формируется «центральная Іно лость», піроходящая сквозь вск молекулу гемог лобина. Центральная полость ( 2 Рис. 1-32. Строение гемоглобина. 48 Изменение конформации (а следовательно и функциональных свойств) всех протомеров оли гомерного белка при присоединений Лиганда только к одному из них носит название коопе ративных изменений конформации протомеров. Аналогичным образом в тканях диссоциация каждой молекулы 0, изменяет конформацию всех протомеров и облегчает отщепление пос ледующих молекул 0,. Гис F белковой части протомера. Связывание 0, с оставшейся свободной координационной свя зью Fe* происходит по другую сторону от плоскости гема в области Гис Е. (аналогично тому, как это происходит у миоглобина). имодействует обеспечивает Гис Е, не вза с 0,, но оптимальные условия для его связывания (рис. 133). В дезоксигемоглобине благодаря ковалентной связи с белковой частью атом Fe2+ выступает из плоскости гема в направлении Гис F. Присое динение 0, катому Fe2+ одного протомера вы зывает его перемещение в плоскость гема, за ним перемещаются остаток Гис Е, и полипеп Тидная цепь, в состав которой он входит. Так как протомер связан с остальными протомера ми, а белки обладают конформационной лабиль ностью, происходит изменение конформации всего Конформационные белка. изменения, произошедшие в других протомерах, облегчают присоединение следующей молекулы 0,, что вызывает новые конформационные изменения в белке и ускорение связывания следующей молекулы 0,. Четвёртая молекула 0, присоеди няется к гемоглобину в 300 раз легче, чем пер вая молекула (рис. 1-34). Кривые диссоциации 0, для миоглобина и гемоглобина Кооперативность в работе прогомеров гемогло бина можно наблюдать и на кривых диссоциации О, для миоглобина и гемоглобина (рис. 1-35). Отношение занятых 0, участков связывания белка к общему числу таких участков, способ ных к связыванию, называется степенью на сыщения этих белков Кислородом. Кривые дис социации показывают, насколько насыщены данные белки 0, при различных значениях пар циального давления кислорода. Кривая диссоциации 0, для миоглобина имеет Вид простой гиперболы. Это указывает на то, что миоглобин обратимо связывается слиган дом, и на это не оказывают влияние никакие посторонние факторы (схема ниже). MB + 0, 2 MBO, Дезоксимиоглобин Оксимиоглобин Схема 2+ + 0, Гис F-Fe имeтта». Гис Fo-Fe'о, Ткани Лёгкие 100 ----чын 1 Гемоглобин Химиоглобин Рис. 1-33. Изменение положения Fe2+ и белковой части re моглобина при присоединении 0,. Степень насыщения белков кислородом, % - Pso=26 P50 • Хаа ** 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Парциальное давление О2, мм рт. ст. Рис. 1-34. Кооперативные изменения конформации про томеров гемоглобина при присоединении О. са голема е наменетиканормац ии п Рис. 1-35. Кривые диссоциации кислорода для миоглоби на и гемоглобина в зависимости от парциального давле ния кислорода. 49 клеток с использованием 0,, доставляемого ге моглобином из лёгких. В результате окисления веществ образуются конечные продукты распа да — CO, и Н, О, количество которых пропор ционально интенсивности процессов окисления. СО,, образовавшийся в тканях, транспорти руется в эритроциты. Там под действием фер мента карбангидразы происходит увеличение скорости образования Н,СО, Слабая угольная кислота может диссоциировать на Н* и НСО, Процессы образования и распада оқсимиог лобина находятся в равновесии, и это равно весие смещается влево или вправо в зависимо сти от того, добавляется или удаляется кислород из системы. Миоглобин связывает кислород, который в капиллярах тканей высвобождает ге моглобин, и сам миоглобин может освобож дать 0, в ответ на возрастание потребностей в нём мышечной ткани и при интенсивном ис пользовании 0, в результате физической на грузки. Миоглобин имеет очень высокое сродство к 0,. Даже при парциальном давлении 0,, рав ном 1-2 мм рт. ст., миоглобин остаётся связан ным с О, на 50%. Кривая диссоциации 0, для гемоглобина. Из гра фика на рис. 1-35 видно, что гемоглобин имеет значительно более низкое сродство к 0,; полунасыщение гемоглобина 0, наступает при более высоком давлении 0, (около 26 мм рт. ст.). Кривая диссоциации для гемоглобина имеет сигмоидную форму (S-образную). Это ет на то, что протомеры гемоглобина работают кооперативно: чем указыва больше 0, отдают протоме ры, тем легче идёт отщепление последующих молекул 0,. В капиллярах покоящихся мышц, где давле ние 0, составляет около 40 мм рт. ст., большая часть кислорода возвращается в составе оксиге моглобина обратно в лёгкие. При физической работе давление 0, в капиллярах мышц падает до 10-20 мм рт. ст. Именно в этой области (от 10 до 40 мм рт. ст.) располагается «крутая часть» S-образной кривой, где в наибольшей степени проявляется свойство кооперативной работы про Томеров. Следовательно, благодаря уникальной струк туре каждый из рассмотренных белков приспо соблен выполнять свою функцию: миоглобин – присоединять 0,, высвобождаемый гемоглобином, накапливать в клетке и отдавать в случае крайней необходимости; гемоглобин — присое Динять 0, в лёгких, где его насыщение доходит до 100%, и отдавать 0, в капиллярах тканей в зависимости от изменения в НИХ давления 0, СО, + H,0 e H,CO, H* + НСО,. Равновесие реакции в эритроцитах, находя Щихся в капиллярах тканей, смещается вправо, так как образующиеся в результате диссоциа ции угольной кислоты протоны могут присое диняться к специфическим участкам молекулы гемоглобина: к радикалам Гисак двух В-цепей, радикалам Гис, и концевым а-аминогруппам двух а-цепей. Все эти 6 участков при переходе гемоглобина от окси- к дезоксиформе приоб ретают большее сродство к н* в результате ло кального изменения аминокислотного окруже ния вокруг этих участков (приближения к ним отрицательно заряженных карбоксильных групп аминокислот). Присоединение 3 пар протонов к гемоглоби ну уменьшает его сродство к 0, и усиливает транспорт 0, в ткани, нуждающиеся в нём (рис. 1- 36, A). Увеличение освобождения 0, гемог лобином в зависимости от концентрации Н* называют эффектом Бора (по имени датского физиолога Христиана Бора, впервые открывше го этот эффект). В капиллярах лёгких высокое парциальное дав ление 0, приводит к оксигенированию гемогло бина и удалению 6 протонов. Реакция CO,+ +H,0 H,CO, «+» Н* + НСО, сдвигается влево и образующийся СО, выделяется в альвеолярное пространство и удаляется с выдыхаемым возду хом (рис. 1-36, Б). Следовательно, молекула гемоглобина в ходе эволюции приобрела способность восприни мать и реагировать на информацию, получае мую из окружающей среды. Увеличение кон центрации протонов в среде снижает сродство О, к гемоглобину и усиливает его транспорт в ткани (рис. 1-37). Большая часть СО, транспортируется кровью в виде бикарбоната НСО,. Небольшое количе 4. Перенос H* и со, из тканей в лёгкие с помощью гемоглобина. Эффект Бора Окисление органических веществ с целью по лучения энергии происходит в митохондриях 50 Капилляры тканей Капилляры лёгких Ткани Лёгкие Органические вещества - 402 HbO2)4 - HbН* нь(O2)4 •r Ньн* Катаболизм КНСО, А нсо HO + CO2 CO2 + H2O H2CO3 H2CO3 + H2O + CO2 Эритроцит Плазма Эритроцит Рис. 1-36. Перенос Н+ и со, с кровью. Эффект Бора. А - Влияние концентрации CO, и Н* на высвобождение О, из комплекса с гемоглобином в тканях (эффект Бора); Б - оксигенирование дезоксигемоглобина в лёгких, образование и выделение СО, Ткани Лёгкие 5. 2,3-Бифосфоглицерат — аллостерический регулятор сродства гемоглобина к о, 2,3-Бифосфоглицерат (БФГ) - вещество, синтезируемое в эритроцитах из промежуточ ного продукта окисления глюкозы 1,3-бифос фоглицерата. 7,6 7,2 6,8 pH Степень насыщения НЬ Кислородом, % Hb o-p-o-CH2-CH2соо o-p=o 11 10 40 50 80 120 2,3-Бифосфоглицерат Парциальное давление О2, мм рт. ст. Рис. 1-37. Влияние pH на кривую диссоциации О, для ге моглобина. Регуляция с помощью 2,3бифосфоглицерата сродства гемоглобина к 0, ство CO, переноситься присоединяясь (около 15-20%) может в лёгкие, обратимо к нейонизи рованным концевым а-аминогруппам. R-NH,+ + CO, = RNH-CO0-+ H*, в результате образу- ется карбогемоглобин, где R — полипептидная цепь гемоглобина. Присоединение со, к гемог- лобину также снижает его сродство к 0,. В нормальных условиях 2,3-бифосфоглице рат присутствует в эритроцитах примерно в той же концентрации, что и гемоглобин. БФГ, при соединяясь к гемоглобину, также может менять его сродство к 0,. В центре тетрамерной молекулы гемогло бина есть полость, образованная аминокис лотными остатками всех четырёх протомеров. 51 рыв ионных связей между димерами ав, и а,в, приводит к «расслаблению» белковой молеку лы, уменьшению центральной полости и вы теснению БФГ. Ткани Hв(O2)4 + БФС е Hв- БФГ + 402 Лёгкие Центральная полость — место присоединения БФГ. Размеры центральной полости могут менять ся: отцепление 0, от оксигемоглобина вызывает его конформационные изменения, которые спо собствуют образованию дополнительных ионных связей между димерами ар, иа,В,. В результате пространственная структура дезоксигемоглобина становится более жёсткой, напряжённой, а цент ральная полость расширяется. Поверхность полости ограничена остатками аминокислот, в числе которых имеются положи тельно заряженные радикалы Лиз, Гиса, В-це пей и положительно заряженные а-аминогруппы N-концевого валина В-цепей. В расширенную Полость дезоксигемоглобина БФГ, имеющий силь НЫЙ отрицательный заряд, присоединяется с по мощью ионных связей, образующихся с положи тельно заряженными функциональными групами двух В-цепей гемоглобина. Присоединение БФГ ещё сильнее стабилизирует жёсткую структуру дез Оксигемоглобина и снижает сродство белка к 0, (рис. 1-38). Присоединение дезоксигемоглобину БФГ к происходит в участке, ином по сравнению с ге мом, где происходит связывание 0,. Такой ли ганд называется «аллостерический», а центр, где связывается аллостерический лиганд, — «алло стерический центр» (от греч. «аллос» - другой, иной, «стерос» — пространственный). В лёгких высокое парциальное давление 0, приводит к оксигенированию гемоглобина. Раз Изменение концентрации БФГ как механизм адаптации организма к гипоксии. Концентрация БФГ в эритроцитах людей, живущих в опреде лённых климатических условиях, — величина постоянная. Однако в период адаптации к вы сокогорью, когда человек поднимается на вы соту более 4000 м над уровнем моря, концент рация БФГ уже через 2 дня возрастает почти в 2 раза (от 4,5 до 7,0 мм). Это снижает сродство гемоглобина к 0, и увеличивает количество 0,, транспортируемого в ткани (рис. 1-39). Такую же адаптацию наблюдают у больных с заболеваниями лёгких, при которых развивает ся общая гипоксия тканей. Так, у больных с Тяжёлой обструктивной эмфиземой лёгких пар циальное давление в них снижается от 100 до 50 мм рт. ст. Но при этом в эритроцитах усили вается выработка БФГ, и его концентрация по вышается с 4,5 до 7,0 мм, что существенно уве личивает доставку 0, в ткани. 2,3-БФГ=0 (гемоглобин без 2,3-БФГ) Х ис,83 2,3-БФГ=5 ммоль/л (норма) Степень насыщения O2 Кислородом, % с Вал Ban 1-NA 2,3-БФГ=8 ммолып (кровь человека, адап тированного к высоте) ИС,43 ЛИЗА 40 80 120 Парциальное давление О2, мм рт. ст. Рис. 1-38. Взаимодействие 2,3-бифосфоглицерата с ами нокислотными остатками центральной полости дезокси- гемоглобина. Рис. 1-39. Влияние различных концентраций 2,3-бифосфо глицерата на сродство rемоглобина ко.. 52

Северин Е.С. - Биохимия

Related documents

Products

Support

Северин Е.С. - Биохимия

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib