M - Молекулярная диагностика

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ TRICHOMONAS VAGINALIS
НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ НАСБА В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Рыжих П.Г., Гущин А.Е., Шипулин Г.А.
ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия
Введение
Trichomonas vaginalis играет важную роль в развитии воспалительных заболеваний
урогенитального тракта мужчин и женщин. Клинические симптомы трихомонадной
инфекции довольно часто стерты и не специфичны, что делает необходимым применение
лабораторных методов диагностики. На сегодняшний день культуральный метод
диагностики трихомониаза, является «золотым стандартом» - высокочувствительным и
высокоспецифичным.
Но
его
существенными
минусами
являются
длительность
исполнения (от 2-х до 7-ми суток), высокие требования к качеству питательных сред и
условиям транспортировки клинического материала. Более быстрый и недорогой метод
микроскопии окрашенного мазка наиболее популярен среди методов лабораторной
диагностики трихомонадной инфекции в Российской Федерации. Однако высокая
субъективность и низкая чувствительность микроскопии при бессимптомной инфекции
существенно перевешивают плюсы метода. С появлением методов амплификации
нуклеиновых кислот, наиболее известный из которых – ПЦР, появились новые
возможности для диагностики T.vaginalis. Данные методы становятся инструментами
выбора в диагностике многих инфекций благодаря высокой чувствительности и
специфичности. Помимо ПЦР – метода амплификации ДНК, все больше внимания стали
привлекать методы амплификации РНК, к которым относится реакция транскрипционной
амплификации
НАСБА
(NASBA
–
Nucleic
Acid
Sequence-Based
Amplification)
(BioMerieux). Использование в качестве мишени РНК дает целый ряд преимуществ перед
ПЦР. Во-первых, количество рибосом в одной клетке содержится от нескольких тысяч до
нескольких десятков тысяч, в зависимости от фазы жизненного цикла микроорганизма.
Во-вторых, в то время как ДНК – достаточно стабильный материал и обнаружение ДНК
еще не означает наличие жизнеспособных микроорганизмов, РНК – наоборот крайне
нестабильный материал и достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении
клеток микроорганизмов. Это дает возможность не только более правильно судить о
наличии текущей инфекции, но и более точно и надежно оценивать результаты
проведенного
лечения.
В-третьих,
поскольку,
метод
ПЦР
является
наиболее
чувствительным и специфичным методом для диагностики T.vaginalis по сравнению с
бактериоскопией и культуральным посевом, то НАСБА может использоваться в качестве
референсного метода для подтверждения результатов ПЦР.
Целью нашей работы стала разработка и апробация набора реагентов для
диагностики T.vaginalis на основе технологии НАСБА в реальном времени.
Материалы и методы
В работе был использован «Базовый набор «Nuclisens», который включает в себя
комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала и комплект реагентов
для проведения амплификации (солевые компоненты, дНТФ, комплекс ферментов в виде
лиофилизированной сферы с AMV- обратной транскриптазой, Т7 РНК-полимеразой,
РНКазойН и необходимые для их растворения компоненты).
Нами были разработаны реагенты, специфичные к мишени. Были выбраны
праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для специфического участка 18S рРНК
T.vaginalis на основе информации международного банка генетической информации
GenBank; получены рекомбинантные количественно охарактеризованные препараты
внутреннего контрольного образца (ВКО) и положительного контрольного образца
(ПКО), а также флуоресцентно-меченый зонд к ВКО. Реакцию NASBA с детекцией
продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием
прибора «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).
В рамках апробации разработанного набора реагентов проводили сравнение с
зарегистрированным набором
реагентов на основе ПЦР «АмплиСенс Trichomonas
vaginalis-FL» (№ ФСР 2009/06556 от 31 декабря 2009 г.) производства ФГУН ЦНИИ
эпидемиологии согласно инструкции производителя на чистой культуре
T.vaginalis,
которую получали с помощью диагностической среды «Vagicult» («Orion Diahnostica»,
Финляндия), согласно инструкции производителя. Кроме того было проведено
исследование на клиническом материале – соскобного отделяемого урогенитального
тракта мужчин и женщин.
Результаты
В результате проведенной работы по оптимизации условий анализа был разработан
набор реагентов «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ» на основе технологии
НАСБА в реальном времени. С использованием рекомбинантного препарата РНК ПКО
было установлено, что предел детекции реакции амплификации набора составил 50-100
копий РНК. Сравнение пределов детекции двух технологий – ПЦР и НАСБА проводилось
на чистой культуре T.vaginalis, полученной из клинического материала. Для этого из
исходного образца культуры готовили серию 10-кратных разведений, из которых
выделяли нуклеиновые кислоты и проводили амплификацию разработанным набором для
НАСБА в сравнении с ПЦР тест-системой «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL»,
использующей праймеры к фрагменту ДНК повторов в геноме трихомонад. Каждое
разведение тестировалось в трех повторах. Исследования показали как минимум
стократное превышение предела детекции НАСБА по сравнению с ПЦР (см. таблицу 1) на
трех образцах культуры, полученных от трех разных пациентов в разные временные
периоды.
Таблица 1. Сравнение пределов детекции методов ПЦР и НАСБА на 10х
разведениях культуры T.vaginalis
Разведения
Культура 2
Культура 3
ПЦР*
NASBA
ПЦР*
NASBA
ПЦР*
NASBA
-1
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
-2
10
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
10-3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
-4
3 из 3
3 из 3
2 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
-5
1 из 3
3 из 3
0 из 3
3 из 3
3 из 3
3 из 3
-6
0 из 3
3 из 3
0 из 3
1 из 3
0 из 3
3 из 3
-7
0 из 3
1 из 3
0 из 3
0 из 3
1 из 3
3 из 3
-8
0 из 3
0 из 3
0 из 3
0 из 3
0 из 3
0 из 3
10
10
10
10
10
10
*
Культура 1
«АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL»
Расчеты показали, что указанный предел детекции обеспечивает аналитическую
чувствительность ПЦР позволяющую определять возбудитель, в концентрации 5х102
клеток T.vaginalis на мл. С учетом полученных результатов методом НАСБА можно
обнаруживать возбудитель при концентрации как минимум в 10-100 раз меньше, т.е. до 550 клеток в мл.
Апробация набора реагентов «Амплисенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ» на
основе НАСБА в реальном времени была проведена на клиническом материале (соскобах
из уретры и цервикального канала) полученном от 154 пациентов, которые были
разделены на 2 группы. У пациентов первой группы (n=54) трихомонадная инфекция была
установлена на основании ПЦР-исследования с помощью набора реагентов «Амплисенс
Trichomonas vaginalis-FL». РНК Trichomonas vaginalis была обнаружена с помощью
разработанного набора реагентов в 54 образцах из 54. Вторая группа пациентов (n=100)
выступала в качестве контрольной. У пациентов данной группы результаты ПЦР на
T.vaginalis были отрицательными. РНК T.vaginalis также не была обнаружена методом
НАСБА ни в одном из образцов контрольной группы.
Заключение
Впервые был разработан набор реагентов для выявления T.vaginalis в клиническом
материале на основе технологии НАСБА в реальном времени - «Амплисенс Trichomonas
vaginalis-РИБОТЕСТ». Предел детекции данного набора на чистой культуре в 100 раз
выше по сравнению с ПЦР. Диагностическая чувствительность двух молекулярнобиологических
методов
на
исследованном
клиническом
материале
совпадала.
Разработанный набор реагентов может использоваться для лабораторной диагностики
урогенитального
трихомониаза.
На
данный
набор
получено
регистрационное
удостоверение (№ ФСР 2010/07305 от 22 апреля 2010 г) разрешающее его использование в
клинической лабораторной практике.