Диагностика трихомониаза - Молекулярная диагностика
advertisement
Объективные данные сравнения чувствительности и специфичности ПЦР и НАСБА с микроскопией в диагностике трихомониаза Рыжих П.Г.1, Гущин А.Е.1, Березина Л.А.2, Куляшова Л.Б.2, Махлай Н.С.2 1 ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва 2ФГУН НИИЭМ им.Пастера, Роспотребнадзора г. Санкт-Петербург Методы диагностики трихомонадной инфекции • Микроскопия - нативного препарата - окрашенного препарата • Культуральный посев • Методы амплификации нуклеиновых кислот Используемые методы диагностики трихомониаза в КВД РФ (86 лабораторий-100%)* Метод диагностики Применение в КВД (%) Микроскопия 100 % ИФА (серолог.) 74% Бак. посев. 56% ПЦР 35% Два метода 87% Фриго Н.В., Ротанов С.В. Лесная И.Н., соавт., Вестник дерматологии и венерологии № 5, 2008г. Зарубежные данные Метод Диагностическая чувствительность1-5 Микроскопия 50 – 64,9% Культура клеток 73 – 89,2% ПЦР 93 – 98,7% 1Shaio et al, JCM, 1997; 35:132-138 2Paterson et al, Sex Transm Inf 1998;74:136-139 3Cindy Van der Schee et al, JCM, 1999;37:4127-4130 4Ryu et al, Yonsei Medical Jornal, 1999;40:56-60 5Nye et al, Am J Obstet Gynecol 2009;200:188.e1-188.e7 Отечественные данные Метод Микроскопия Культура клеток ПЦР 1Теличко Диагностическая чувствительность1,2 38,9 – 98,8% 75 – 88,7% 63,2 – 97,1% И.Н., Раводин Р.А. и соавт., Вестник Российской военно-медицинской академии, № 2(16), 2006 2Мавзютов А.Р., Мустафина Г.Р. и соавт., Российский журнал кожных и венерологических болезней, № 5, 2010 Цель исследования провести объективное сравнение МАНК с микроскопическим методом выявления T.vaginalis в модельном эксперименте и в клиническом материале I. Проведение модельного эксперимента Создание идеальных условий Отсутствие характерных для клинического материала примесей (эпителиоциты, макрофаги, нормофлора и др.) Сведение к минимуму возможности диагностических ошибок и повышение объективности исследования Получение культуры T.vaginalis Vagicult («Orion Diagnostica», Финляндия) Инкубация (370С – 72 часа) Анализ результатов: Подвижные клетки типичной грушевидной формы Модельный эксперимент по установлению предела детекции разных методов Культура T.vaginalis Микроскопия нативного препарата Микроскопия окрашенного препарата МАНК Микроскопия Нативный Препарат (увеличение 400Х) 10 мкл Культура Tv Окраска по Романовскому-Гимзе (увеличение 900Х) Анализ результатов Просмотр 100 полей зрения (5-10 в рутинном скрининге) Нативный препарат: учитывались только подвижные формы Окрашенный препарат: учитывались подвижные и неподвижные формы ПЦР «АмплиСенс T.vaginalis-FL» (№ ФС 012б2006/5190-06) Количество циклов – 45 Мишень – ДНК повторы для ПЦР выявления, 237 п.о. Копийность мишени – 102 – 103 копий в геноме (Paces et al, 1992) Аналитическая чувствительность– 500 копий/мл* * 1 мл PBS с клиническим материалом Методика количественного определения T.vaginalis Мишень – Ca2+ АТФаза, 186 п.о. Копийность – 1 копия в геноме (Meade et al, 2007) Количество циклов – 45 3 ДНК-калибратора Реакция транскрипционной амплификации НАСБА «АмплиСенс T.vaginalis-РИБОТЕСТ» (№ ФСР 2010/07305) Мишень – 18S рРНК Копийность – 103 – 104 копий в клетке Аналитическая чувствительность– 100 копий РНК в реакцию Результаты сравнения ПЦР ПЦР (АС T.vaginalis -FL) (Ca2+ АТФаза) Исходны й - - - 10-1 3 из 3 3 из 3 3 из 3 10-2 3 из 3 3 из 3 3 из 3 10-3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 10-4 3 из 3 3 из 3 3 из 3 10-5 1 из 3 0 из 3 3 из 3 10-6 0 из 3 0 из 3 3 из 3 10-7 0 из 3 0 из 3 1 из 3 10-8 0 из 3 0 из 3 0 из 3 Разведения НАСБА Микроскопия (нативны й) Микроскопия (окрашенны й) 15 (в поле зре-я) 17 (в поле зре-я) 31 28 4 6 0 0 0 0 0 0 28 (в поле зре-я) 26 (в поле зре-я) 61 56 29 27 2 5 0 0 0 0 ГЭ/мл 3,4x106 3,9x105 3,5x104 2,0x103 Количество ГЭ T.vaginalis в 10 мкл образца, наносимого на стекло, соответствует количеству ГЭ попадающих в ПЦР реакцию Таким образом Предел детекции метода микроскопии нативного и окрашенного препаратов составил 3,9х105 и 3,5х104 ГЭ/мл соответственно, что в 1000 и 100 раз выше предела детекции метода ПЦР ~2,0х102 ГЭ/мл Предел детекции НАСБА по сравнению с пределом детекции метода микроскопии окрашенного препарата был ниже в 104 раз II. Оценка на клиническом материале Trichomonas vaginalis? Вегетативная форма Trichomonas vaginalis Круглая сперматида с вакуолизированной цитоплазмой Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д., соавт «Лабораторная диагностика мужского бесплодия», 2006 Клинический материал Пациенты с диагнозом хронический трихомониаз и положительными результатами световой микроскопии 25 образцов (20 мужчин и 5 женщин), не содержащие клетки, обладающие характерными морфологическими признаками T.vaginalis после культивирования* *Среда «СВТ», производства НИИЭМ им.Пастера Роспотребнадзора (ФСР 2009/05982) Специфическая ПЦР Пара праймеров 1 TvG1/TvG2 2 TVT-3/TVT -4 3 TVCA-1/TVCA-23 Мишень ДНК повторы (GenBank: L23861.1) 18S рДНК (GenBank: U17510.1) Ca2+ АТФаза (GenBank: U65066.1) Копийность Микроорганизмы 10^2 - 10^3 T.vaginalis ~250* T.vaginalis 1 T.vaginalis Были получены отрицательные результаты для всех образцов * Draft Genome Sequence of the Sexually Transmitted Pathogen Trichomonas vaginalis, 2007 ПЦР на группы микроорганизмов Пара праймеров 1 Tspp-1/Tspp24 Мишень Микроорганизмы 18S рДНК Тип Parabasalia, включая Trichomonas vaginalis Trichomonas tenax Pentatrichomonas hominis Dientamoeba fragilis 2 Flag1-F/Flag1-R 18S рДНК Представители Mastigofora, включая Toxoplasma gondii Thaumatomonadida Trypanosoma sp. Isospora belli 3 Flag3-R/Flag3-F 18S рДНК Retortamonas intestinalis Retortamonas sinensis 4 CIL-F4/All2230-R 18S рДНК Тип Ciliophora, включая Balantidium coli Все перечисленное, включая Fungies 5 All1181-F/All2230-R 18S рДНК Homo sapiens Enteromonas hominis Chilomastix mesnili ПЦР на группы микроорганизмов Пара праймеров 1 Tspp-1/Tspp24 Мишень Микроорганизмы 18S рДНК Тип Parabasalia, включая Trichomonas vaginalis Trichomonas tenax Pentatrichomonas hominis Dientamoeba fragilis 2 Flag1-F/Flag1-R 18S рДНК Представители Mastigofora, включая Toxoplasma gondii Thaumatomonadida Trypanosoma sp. Isospora belli 3 Flag3-R/Flag3-F 18S рДНК Retortamonas intestinalis Retortamonas sinensis 4 CIL-F4/All2230-R 18S рДНК Тип Ciliophora, включая Balantidium coli Все перечисленное, включая Fungies 5 All1181-F/All2230-R 18S рДНК Homo sapiens Enteromonas hominis Chilomastix mesnili Определение нуклеотидных последовательностей Используемый набор: «ABI Prism™ Big Dye v.1.1», (Applied Biosistems, США) Прибор «ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer», (Applied Biosistems, США). • Показана 100% гомология с ДНК человека • ДНК простейших не обнаружена Заключение Сравнительный анализ пределов детекции микроскопии нативного и окрашенного препаратов, ПЦР и НАСБА для выявления T.vaginalis показал более высокую чувствительность при использовании методов ПЦР и НАСБА Полученные результаты свидетельствуют о субъективности микроскопического анализа и необходимости широкого внедрения ПЦР и НАСБА в диагностику трихомонадной инфекции
