1. Классификация генов. Репрессия – блокировка экспрессии генов, то есть блокировка процесса, в ходе которого наследственная информация от гена преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок Геном организма любого биологического вида содержит: Репрессированные гены - это большая часть (90%) генов, находящаяся в неактивном состоянии. Дерепрессированные гены – около 10% генов, которые активно транскрибируются. Среди дерепрессированной части генома различают: а) конститутивные гены – гены с постоянной экспрессией, функционирующие на всех стадиях онтогенеза, т.н. гены домашнего хозяйства (гены, кодирующие тРНК, рРНК, ДНК-полимеразы, РНКполимеразы, белки-гистоны, белки рибосом и тд) б) регулируемые гены – гены, функционирующие в разных тканях на разных этапах онтогенеза, они могут включаться и выключаться, их активность регулируется; т.н. гены роскоши ( ген синтеза белковых гормонов, ген устойчивости к антибиотикам, ген устойчивости к тяжелым металлам, ген конъюгации) 2. Регуляция экспрессии у прокариот. Теория оперона. Изучение регуляции экспрессии генов на стадии транскрипции у прокариот привело к созданию в 1961 г. модели оперона (Жакоб и Моно). Оперон – это тесно связанная последовательность структурных генов, определяющих синтез группы ферментов для какой-либо одной цепи биохимических реакций и регулирующаяся как единое целое. В состав оперона входят: промотор, ген-оператор, структурные гены, терминатор. Работой всего оперона управляет белок-регулятор, который синтезируется на гене-регуляторе (расположен на некотором расстоянии от оперона) и может присоединяться к гену-оператору, блокируя его. Особенностью прокариот является транскрибирование и-РНК со всех структурных генов оперона, которая затем разрезается на фрагменты, соответствующие матрицам для синтеза отдельных ферментов. Индуктором транскрипции является лактоза. 3. Регуляция экспрессии генов у эукариот. Транскриптон. Так как процесс реализации наследственной информации у эукариот многоступенчатый (транскрипция, процессинг, трансляция, посттрансляционные процессы) и растянутый во времени, то регуляция тонкой работы генов осуществляется на каждом из этапов: 1) На этапе транскрипции: Транскриптон – единица регуляции активности гена. Наличие множества генов-регуляторов, синтезирующих большое количество белков-регуляторов. Такие гены располагаются в разных частях генома. Наличие генов-регуляторов, ускоряющих (энхансеры) и тормозящих (сайленсеры) транскрипцию. Наличие генов-регуляторов, которые могут управлять несколькими генами, оказывая различные эффекты. Индукторами транскрипции чаще всего выступают гормоны. Наличие гистонной регуляции – потеря связи ДНК с гистоном Н1 инициирует транскрипцию. 2) На этапе процессинга: o Альтернативный сплайсинг. o Интроны могут кодировать фермент (матюраза), который вырезает интроны и сшивает экзоны, следовательно, отвечает за правильность сплайсинга. 3) На этапе трансляции: На стадии инициации возникает блок, препятствующий связи иРНК—т-РНК—формилметионин. В результате транскрипция не происходит. 4) На этапе посттрансляционных процессов: Активной формы молекулы белка не образуется. 4. Современное состояние теории гена. Современные теории гена сформирована благодаря переходу генетики на молекулярный уровень анализа и отражает тонкую структурнофункциональную организацию единиц наследственности. Основные положения этой теории следующие: 1) Ген(цистрон) – функциональная неделимая единица наследственного материала (ДНК у организмов и РНК у некоторых вирусов), определяющая проявление наследственного признака или свойства организма. 2) Большинство генов существует в виде двух или большего числа альтернативных (взаимоисключающих) вариантов аллелей. Все аллели данного гена локализуются в одной и той же хромосоме в определенном ее участке, которую назвали локусом. 3) Внутри гена могут происходить изменения в виде мутаций и рекомбинаций; минимальные размеры мутона и рекона равны одной паре нуклеотидов. 4) Существуют структурные и регуляторные гены. 5) Структурные гены несут информацию о последовательности аминокислот в определенном полипептиде и нуклеотидов в р-РНК, т-РНК. 6) Регуляторные гены контролируют и направляют роботу структурных генов. 7) Ген не принимает непосредственного участия в синтезе белка, он является матрицей для синтеза различных видов РНК, которые непосредственно принимают участие в синтезе белка. 8) Существует соответствие (колиннеарность) между расположением триплетов из нуклеотидов в структурных генах и порядком аминокислот в молекуле полипептида. 9) Большинство мутаций гена не проявляются в фенотипе, так как молекулы ДНК способны к репарации (восстановлению своей нативной структуры) 10) Генотип являет собой систему, которая состоит из дискретных единиц – генов. 11) Фенотипическое проявление гена зависит от генотипической среды, в которой находится ген, влияние факторов внешней и внутренней среды. 5. ДНК-диагностика. Это комплекс методов, направленный на анализ структуры ДНК. Чаще всего 1 этап ДНК-диагностики – полимеразная цепная реакция (ПЦР). 1993г. – Кэрри Мулис разработал ПЦР и получил Нобелевскую премию. Цель ПЦР: накопление изучаемого фрагмента ДНК. Плюс метода в том, что она позволяет работать с минимальным количеством ДНК. Компоненты ПЦР: Изучаемая ДНК Термофильная ДНК-полимераза (выделенная из бактерий, обит. в горячих источниках) Праймеры Нуклеотиды Соли Mg2+ для активации ДНК-полимеразы Праймеры – короткие искусственно синтезированные одноцепочечные фрагменты ДНК. Они крепятся на границах изучаемого фр-та ДНК ближе к 3’ концу. С двух сторон ограничивают фрагмент ДНК и определяют специфичность ПЦР. ЭТАПЫ ПЦР Извлечение ДНК из исследуемого материала (крови – много клеток и ДНК, безопасно, легко) А) Фенольно-хлороформная Б) Специальные наборы реактивов экстракция Технически просто Основана на классической хим.р. Не нужен специалист Выделяется вся ДНК Технически сложно (нужен Применяется при рутинных специалист и много денег) исследованиях ДНК 1. Применяется в научных исследованиях 2. Сборка реакционной смеси o В специальную пробирку вносят все компоненты ПЦР o ВАЖНО! Избежание загрязнения материала посторонней ДНК o Спецодежда, маски, перчатки o Ламинарные шкафы – рабочая зона, обдуваемая потоком стерильного воздуха 3. Проведение ПЦР в специальном аппарате – ТЕРМОЦИКЛЕРЕ 1 Этап - Денатурация ДНК 92-95 гр. По Цельсию 10 секунд Разрыв водородных связей между цепями 2 Этап – Отжиг праймера 30-50 гр. По Цельсию 20-30 секунд Прикрепление праймера к комплементарным участкам ДНК 3 Этап – Синтез ДНК 65-70 гр. По Цельсию 30-40 секунд Активация ДНК-полимеразы и начало синтеза новой цепи ДНК от 5 к 3 концу Длина синтезируемой ДНК регулируется длительностью этапа Процесс цикличен; после каждого цикла количество копий изучаемой ДНК удваивается Дополнительные штуки Эффектор - малая небелковая молекула, которая селективно связывается с теми или иными белками и регулирует их биологическую активность. Факторы транскрипции – особые белки, необходимые для связывания РНКполимеразы с промотором. Они могут иметь тканевую специфичность, то есть для трансляции одного и того же гена в разных тканях необходимы разные белки. Гормональная регуляция o o o o Особенностью регуляции транскрипции у эукариот является подчиненность этих процессов влияниям со стороны гормонов. Гормоны играют роль индукторов транскрипции. Некоторые стероидные гормоны связываются с белками-рецепторами и образуют комплексы. Активированный гормоном рецептор приобретает способность соединяться со специфическими участками хроматина, ответственными за регуляцию активности генов. Специфичность регулирующего воздействия гормона на транскрипцию обусловлена не только природой гормона, но и природой клетки-мишени, которая синтезирует специфический белок. Например, влияние тестостерона на развитие тканей организма по мужскому типу при наличии особого белка-рецептора. Отсутствие белка-рецептора не дает возможности тестостерону проникнуть в ядра клеток-мишеней и обеспечить включение определённого набор генов. Развивается синдром тестикулярной феминизации (Морриса) Энхансеры – участки ДНК, являющиеся регуляторными элементами, которые усиливают транскрипцию гена. Функции: Могут лежать на 3 и на5 конце; в интронах Активируют гены независимо от ориентации 1 энх. может активировать транскрипцию нескольких генов На энхансеры влияют белки и гормоны Сайленсеры – участки ДНК, ослабляющие транскрипцию генов. Располагаются как перед геном, так и после него. ТАТА-бокс - специфическая последовательность нуклеотидов, присутствующая в промоторных областях генов эукариот; выполняет регуляторную функцию участвует в инициации транскрипции, обеспечивая ориентацию РНК-полимеразы.
