ЗАНЯТИЕ 1 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРОЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения белков из мышечной ткани. Проанализировать аминокислотный состав выделенных из мышечной ткани белков, используя цветные реакции на белки и аминокислоты. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ 1. Белки: элементный и аминокислотный состав. Физиологическая роль белков. 2. Гидролиз белков (кислотный, щелочной, ферментативный, полный и частичный). 3. Качественное обнаружение белков с помощью цветных реакций (биуретовой, нингидриновой). 4. Хроматографические методы изучения аминокислотного состава гидролизатов белков. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ Биуретовая реакция Принцип метода: реакция основана на том, что в щелочной среде в присутствиеи солей меди белки дают фиолетовое окрашивание, обусловленное образованием комплекса ионов меди с пептидной группировкой. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе, и является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы. Ход работы: в пробирку наливают 1-2 мл раствора белка, добавляют 1-2 мл 10% раствора NaОН и 1-2 капли 1% раствора CuSO4. Результат: Вывод: Нингидриновая рекция Принцип метода: основан на том, при нагревании с -аминокислотами, а также полипептидами нингидрин образует фиолетово-розоватое окрашивание. При нагревании с нингидрином аминокислоты подвергаются окислительному дезаминированию идекарбоксилированию, при этом выделяется углекислый газ, аммиак, образуется альдегид, восстановленный нингидрин конденсирует с аммиаком и окисленным нингидрином, образуя окрашенное соединение. Ход работы: к 0,5 мл раствора белка добавить 5 капель 0,2 % водного раствора нингидрина и прокипятить 2-3 минуты. Результат: Вывод: Хроматографическое разделение аминокислот на бумаге Определение содержания отдельных амнокислот методом хроматографии на бумаге важно для изучения обмена белков и аминокислот в организме. С помощью бумажной хроматографии можно легко провести разделение аминокислот, содержащихся в гидролизате различных белков, сыворотке крови, моче и т.д. Принцип метода. Основан на том, что различные растворители (Н-бутанол СН3СООН; фенол, насыщенный водой и др.), смачивая хроматографическую бумагу, создают на ней две фазы: неподвижную водную фазу и подвижную фазу органического растворителя. Неподвижная водная фаза образуется в силу значительной гигроскопичности бумаги, т.е. свойства задерживать определенное количество влаги на поверхности волокон целлюлозы. Органический растворитель, двигаясь по бумаге, увлекает за собой аминокислоты, которые перемещаются с различной скоростью. Она зависит от способности аминокислот растворяться в органическом растворителе (или воде). От избирательной адсорбции, от окружающей температуры, сорта бумаги, растворителя и ряда других факторов. Хроматографию проводят в герметических камерах, насыщенных парами растворителя. Для проведения восходящей хроматографии на нижний конец хроматографической бумаги наносят определенный объем исследуемого раствора, высушивают, нижний край бумаги помещают в растворитель и бумагу закрепляют в этом положении. Камеру закрывают. Растворитель поднимается по бумаге и увлекает за собой аминокислоты. При этом происходит разделение аминокислот из смеси. После того, как фронт растворителя по бумаге достигнет определенного уровня, бумагу вынимают из камеры, высушивают, а аминокислоты проявляют с помощью нингидрина. Скорость передвижения аминокислот на бумаге характеризуется коэффициентом распределения Rf. Это отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (А) к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя (Б) А Rf.= ---Б Rf. является величиной, характерной для каждой аминокислоты, и постоянен при данных условиях опыта. Ход работы. На конце полоски фильтровальной бумаги размером 1х15см сделать прокол иглой, продеть нитку, завязать петлю. На противоположном конце простым карандашм, отступив от края на 1 см, нанести кружок, в который наносят смесь аминокислот. На дно пробирки, не задевая стенок, поместить 1,5 мл растворителя. Придерживая за нитку, опустить бумажку до соприкосновения ее нижнего краяс ратворителем и закрыть пробирку, чтобы бумажка висела на нитке, касаясь нижним краем растворителя. Через час бумагу вынимают, просушивают, смачивают 0,5% раствором нингидрина в ацетоне, снова просушивают, и помещают в термостат на 15 минут при температуре 55С в темноте. Отмечают появление фиолетовых пятен. Проводят расчет для каждой аминокислоты. Результат. Вывод. ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ: 1. Повторить классификацию и строение аминокислот (знать формулы) 2. Повторить типы связей в молекулах белка, стабилизирующих первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. 3. Знать образование ди-, три- и полипептидов и их название. 4. Повторить методы изучения аминокислотного состава белков с помощью цветных реакций и хроматографии.
