Физическая химия биополимеров НГУ-2012 Лаврик О.И. C

CH3
N
Физическая химия биополимеров
Лаврик О.И.
НГУ-2012
O
4. Ингибирование ферментативных реакций.
Методы описания и определения констант
ингибирования. Применение элементов теории
графов для вывода кинетических уравнений в
стационарном режиме
Cкорость
ферментативной
реакции
v
Активаторы
стимулируют каталитическую
активность ферментов
v
Ингибиторы
подавляют каталитическую
активность ферментов
Взаимодействуя с ферментом, ингибиторы по тому или
иному механизму тормозят катализ, и, таким образом,
уменьшают скорость ферментативной реакции.
Природные ингибиторы – продукты
биохимической цепи
Ингибитор
Малонат
Сукцинат
Фумарат
Аллостерическое (от греч.
"инопространственный") ингибирование
В процессе окисления глюкозы происходит фосфорилирование
АDР АТР, для накопления энергетических запасов клетки в виде АТР.
При накоплении в системе достаточного количества АТР процесс
целесообразно притормозить:
АТР
Фруктозо-6-фосфат
АDP
Фруктозо-1,6-дифосфат
Аллостерическое (от греч.
"инопространственный") ингибирование
Каталитический центр
АТР
АТР
АТР
АТР
Аллостерический центр
Фосфорилирование
Ингибирование
фосфорилирования
Искусственные ингибиторы – лекарства,
подавляющие активность вредных ферментов
O
HN
HO
O N
O
N3
Противовирусный препарат азидотимидин –
нуклеозид ингибирующего субстрата ревертазы ВИЧ,
аналог природного субстрата
Связывание
ингибитора
с ферментом
Обратимое
Необратимое
Обратимое связывание ингибитора
с ферментом
Необратимое связывание ингибитора
с ферментом
Пример необратимого ингибитора –
пара-хлормеркурийбензоат (р-ClHg-бензоат)
р-ClHg-бензоат модифицирует фермент по
функциональной группе в активном центре,
ковалентно связываясь с SH-группой цистеина и
блокируя активность фермента.
O
NH
CH
SH
C
O
+
ClHg
CH
COOH
-HCl
S
Hg
COOH
Пример обратимого ингибитора
Обратимые ингибиторы, как правило – аналоги субстратов.
Фенилаланин
Фенилаланинол
Фенилаланинол – аналог фенилаланина, конкурентный
ингибитор фенилаланил-тРНК-синтетазы
Типы ингибирования
1.
Конкурентное ингибирование,
2.
Неконкурентное ингибирование,
3.
Бесконкурентное ингибирование,
4.
Смешанное ингибирование.
k1,,k2,, k3, k4, k-1, k-2, k-3, k-4 – константы скорости соответствующих реакций,
KS, KS', KI, KI' – константы диссоциации комплексов фермента с субстратом
и/или ингибитором,
γ, γ', δ – численные коэффициенты.
Рассмотрен случай kβ = 0, то есть когда тройной комплекс ESI не
распадается с образованием продукта. При этом скорость реакции
образования продукта равна:
v = kα[ES] (при [S]0, [I]0 >> [E]0).
Конкурентное ингибирование
(δ = γ = 0)
V=
Vmax
KS  [I ] 
1  
1
[S ]  K I 
Неконкурентное ингибирование
(δ = γ = 1, KS = KS', KI = KI')
Vmax
V=
 [I ] 
1 

 KI 
KS
1
[S ]
Смешанное ингибирование
(δ = γ ≠ 1, KS ≠ KS', KI ≠ KI')
Vmax
V=
1  [ I ] 


K'
I

1  [ I ] 
K I 
K S 
1
[ S ] 1  [ I ] 


K'
I

Бесконкурентное ингибирование
(δ = γ' = 0)
Vmax
 [I ] 
1 

 KI 
V=
1 KS
1
 [I ] 
[S ]
1 

 KI 
Графические методы определения кинетических
параметров реакции в присутствии ингибитора
На приведенных ниже схематически изображенных
графиках:
V – максимальная скорость реакции,
К – эффективная константа, полученная
экспериментально,
KI – константа ингибирования;
а - конкурентное, б - неконкурентное,
в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование.
Метод Лайнуивера-Берка 1/v (1/[S])
I2 > I1, -1/K = -1/KM(1+[I]/KI)
Vmax
V=
K  [I ] 
1  S 1  
[S ]  K I 
1/v
Vmax
V=

[I ] 


1


KI 


KS
1
[S ]
1/v
Vmax
Vmax
1  [ I ]


K'I 


V=
1  [ I ]

KI 
KS 


1
[ S ] 1  [ I ]


K'I 


V=
1/v
1
1
[S ]

[I ] 

1  K 

I 

KS

[I ] 

1  K 

I 

1/v
1/[S]
а - конкурентное, б - неконкурентное,
в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование
- [I]=0
Метод Эди-Хофсти v (v/[S])
I2 > I1, tg α = -K = -KM(1+[I]/KI)
Vmax
V=
K  [I ] 
1  S 1  
[S ]  K I 
v
Vmax

[I ] 

1  K 

I 

KS
1
[S ]
V=
v
Vmax
Vmax
1  [ I ]


K'I 


V=
1  [ I ]

KI 
KS 


1
[ S ] 1  [ I ]


K'I 


V=
v
1
1
[S ]

[I ] 

1  K 

I 

KS

[I ] 

1  K 

I 

v
v/[S]
а - конкурентное, б - неконкурентное,
в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование
- [I]=0
Метод Диксона 1/v([I])
S2 > S1
Vmax
V=
K  [I ] 
1  S 1  
[S ]  K I 
1/v
Vmax
V=

[I ] 

1  K 

I 

KS
1
[S ]
1/v
Vmax
Vmax
1  [ I ]


K'I 


V=
1  [ I ]

KI 
KS 


1
[ S ] 1  [ I ]


K'I 


V=
1/v
1
1
[S ]

[I ] 

1  K 

I 

KS

[I ] 

1  K 

I 

1/v
[I]
а - конкурентное, б - неконкурентное,
в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование
Метод Корниш-Боуден [S]/v ([I])
S2 > S 1
Vmax
V=
K  [I ] 
1  S 1  
[S ]  K I 
[S]/v
Vmax
V=

[I ] 

1  K 

I 

KS
1
[S ]
[S]/v
Vmax
Vmax
1  [ I ]


K'I 


V=
1  [ I ]

KI 
KS 


1
[ S ] 1  [ I ]


K'I 


V=
[S]/v
1
1
[S ]

[I ] 

1  K 

I 

KS

[I ] 

1  K 

I 

[S]/v
[I]
а - конкурентное, б - неконкурентное,
в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование
Применение теории графов в
ферментативной кинетике
Теория графов
Задача, положившая начало развитию теории графов:
как пройти по всем семи мостам, не проходя ни по одному дважды.
Теорема Эйлера: если сеть имеет не более двух «странных»
(с нечетным количеством связей) вершин, есть по крайней
мере один подобный путь.
Граф Эйлера, 1736 г.
B
B
A
D
A
D
A
C
C
Леонард Эйлер
1707-1783
Швейцарский и
российский математик
Теория графов
Задача: пройти через все вершины по одному разу
(номера вершин указывают последовательность шагов,
прохождение каждого ребра не обязательно).
Граф
Гамильтона,
1859 г.
Уильям Роуэн Гамильтон
1805-1865
Ирландский математик и физик
Теория графов
Граф – это схематическое изображение некоторого множества элементов и
их взаимосвязей. Граф состоит из вершин – узлов и соединяющих их
линий. В применении к ферментативной кинетике узлам сопоставляются
ферментные формы.
Ветви графа – линии, соединяющие узлы, имеют направление. Ветвям
графа сопоставляются элементарные стадии ферментативной реакции.
Вес ветви – число, характеризующее ветвь графа, эквивалентно константе
скорости реакции.
Путь графа – непрерывная совокупность ветвей, в которой ни одна из
вершин не встречается более одного раза, не замкнутая (не должно быть
циклов).
База – одна из вершин.
Базовое дерево – совокупность ветвей, проходящих через все узлы и
ведущих к базе.
Определитель узла (базы) (D) – сумма величин (базовых) деревьев.
Скорость ферментативной реакции можно выразить формулой:
v = E0
k D ,
D
r
r
где kr – константа скорости реакции, приводящей к
i
образованию продукта.
Теория графов. Пример 1:
односубстратная ферментативная реакция
Граф:
kr = k2
Вес параллельных ветвей, ведущих от узла ES к узлу E, складывается:
Dr = DES = k1S
DE = k-1 + k2
k 2 k 1S

v = E0
k 1S  k -1  k 2
k 2E0
k  k2 1
1  -1
k1 S
Теория графов. Пример 2:
конкурентное ингибирование
Граф:
Определители (Di) и их деревья:
DES = k-ik1S
DEI = k-1kiI + kiIk2
DE = k-ik-1 + k-ik2
k 2 k -i k 1S

v = E0
k -i k 1S  k i Ik -1  k 2   k -i k -1  k 2 
Здесь константа ингибирования
k 2E0
k 2E0

k -1  k 2 k i I  k -i
k  k2 
k
1
1  i
1  -1
k 1S
k -i
k 1S  k -i
k i
k 1  k 2
 KI , а
 KM
ki
k1

I 

Теория графов. Пример 3:
бесконкурентное ингибирование
Граф:
Определители (Di) и их деревья:
DES = k-ik1S
DESI = k1SkiI
DE = k-ik-1 + k-ik2
k 2E0
k 2 k -i k 1S

v = E0
k -i k 1S  k 1 k i SI  k -i k -1  k -i k 2 k -1  k 2 k i I  k -i

k 1S
k -i

k
k 2 E 0 / 1  i
k -i


k -1  k 2
1

k
k 1S1  i
k -i


I 


I 
