ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ. УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ.
УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА-МЕНТЕНА
Ферментами (энзимами) называются вещества белковой природы, которые ускоряют
химические реакции, протекающие в клетках и тканях живого организма. Поэтому их еще
называют биокатализаторами, а словами академика Павлова «возбудителями жизни».
Молекула фермента имеет чередующиеся полярные группы СООН, NH2, NH, OH, SH
и др. и неполярные гидрофобные группы (первичная структура). Макромолекула фермента
может изгибаться и свертываться в клубки с образованием внутримолекулярных водородных
связей (вторичная структура белка). Сложные ферменты содержат ионы металлов с
переменной
степенью
окисления
(Fe,Cu),
которые
участвуют
в
окислительно-
восстановительных реакциях. Ферменты классифицируют по типу катализируемой реакции:
гидролазы (реакции гидролиза), изомеразы (изомерные превращения), оксиредуктазы
(окислительно-восстановительные
реакции).
Активные
центры
фермента
способны
избирательно связывать молекулу реагирующего вещества (субстрата), образую с ней
единый
фермент-субстратный
комплекс.
Большое
значение
имеет
геометрическое
соответствие структур активного центра фермента и самого субстрата – «ключ-замок».
Активность ферментов в миллионы раз выше химических катализаторов.
Ферментативный катализ занимает промежуточное положение между гомогенным и
гетерогенным катализом. Его отличительные черты: высокая каталитическая активность
(малые количества фермента и высокие скорости), специфичность или селективность
действия (один фермент ускоряет определенную реакцию), низкие температуры и сильное
влияние рН среды и присутствия других веществ. Ингибиторами (I) называют вещества,
осложняющие течение ферментативной реакции вследствие образования комплексов с
ферментом или фермент-субстратным комплексом.
В фармацевтической продукции ферментные препараты занимают большую часть
ассортимента. При инфекционных заболеваниях используются препараты, разрушающие
оболочку болезнетворных бактерий. Широко известны препараты, применяемые при
нарушениях функций желудочно-кишечного тракта, ферменты для рассасывания гнойных
скоплений и тромбов, например, стрептокиназа.
Кинетика ферментативных реакций.
Скорость ферментативной (энзимной) реакции Vферм зависит от концентрации
фермента СE и концентрации субстрата CS. Наблюдается прямо пропорциональная
зависимость Vферм от от начальной концентрации С0,Е (первый порядок по ферменту).
Зависимость Vферм от концентрации субстрата имеет нелинейный вид (рис.1), однако, при
низких концентрациях субстрата порядок по субстрату первый, а при высоких – нулевой.
Рис.1.
Зависимость скорости ферментативной
реакции от концентрации субстрата
Рис.2.
Определение константы Михаэлиса
графическим методом
Простейшая схема ферментативного катализа /1/ включает обратимое образование
фермент-субстратного комплекса (ES), который необратимо превращается в продукт (Р)
K k1 / k1
k2
E  S 
 ES 
EP
/1/.
Константа равновесия первой стадии выражена через константы скорости прямо (k1) и
обратной реакции (k1), а константа скорости второй стадии k2<< k1 , т.е вторая стадия
является лимитирующей. Скорость ферментативной реакции равна
Vôåðì  k2CES
(2).
На основании схемы /1/ приведём вывод уравнения Михаэлиса-Ментена, используя метод
стационарных концентраций dP/dt =0 , т.е. условие, что в последовательной реакции
концентрация промежуточного вещества остается постоянной.
dP
 Vôåðì  k1CS CE  k1CES  k2CES  0
dt
(1)
Производная dP/dt  есть скорость ферментативной реакции, которую можно записать с
учетом закона действия масс через концентрации веществ и комплекса и константы скорости
отдельных стадий.
Текущую концентрация фермента в системе выразим через начальную концентрацию
и концентрацию комплекса (материальный баланс)
k1CS C0,E  CES CS  k1CES  k2CES  0
CE  C0,E  CES (3) и тогда получим
(3`) .
Раскрыв скобки, найдем текущую концентрацию фермент-субстратного комплекса (4)
CES 
k1CS C0,E
CS C0,E
CC

 S 0,S
k1CS  k 1  k 2 k1  k 2  C
K M  CS
S
k1
Скорость ферментативной реакции равна
Vôåðì 
k 2 C0 , S C S
K M  CS
(5), где
(4).
Vmax  k2C0,S

максимальная скорость реакции при бесконечно большой концентрации субстрата (нулевой
порядок по СS), тогда уравнение Михаэлиса-Ментена имеет вид
Vôåðì 
Vmax CS
K M  CS
(6).
Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна
половине максимальной скорости. Величина КМ характеризует специфичность фермента к
субстрату (чем меньше КМ, тем больше специфичность). Значения лежат в интервале от 106
до 101 моль/л.
Определение КМ и Vmax по экспериментальным данным. Уравнение (6) преобразуют в
1
линейную форму
Vôåðì

1
Vmax

KM 1

Vmax CS
(7). Представляя зависимости начальной
скорости от начальной концентрации субстрата в обратных координатах находят тангенс
угла наклона b и отрезок, отсекаемый по оси ординат, равный коэффициенту а линейного
уравнения y=а+bx. По значению а находят максимальную скорость реакции, а из b 
значение КМ =b/a, как это показано на рис.2.
Ингибирование. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за активные центры
фермента и к стадиям /1/ добавляется стадия
ингибирования называется выражение
KI 
EI
 EI /2/.
CE  CI
CEI
Константой
. При конкурентном ингибировании
константа Михаэлиса увеличивается, а Vmax остается неизменной.
Неконкурентный ингибитор обратимо связывает как фермент /стадия 3/, так и ферментсубстратный комплекс /стадия 4/:
EI
 EI
/3/
и
ES  I 
 ESI
/4/. При неконкурентном
ингибировании константа Михаэлиса не изменяется, а Vmax уменьшается.
Смешанное ингибирование описывается сложными кинетическими схемами (механизмами) и
изменяются как константа КМ, так и Vmax.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. См. задания.