роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных
advertisement
На правах рукописи ПОГУЛЬСКАЯ Елена Николаевна РОЛЬ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP И HSP32 У ПРОРОСТКОВ ЯЧМЕНЯ 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.П. КОРАБЛЕВА доктор биологических наук В.В. КУЗНЕЦОВ Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова Защита состоится 30 мая 2006 г. в 15.00 ч на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2. С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1. Автореферат разослан 28 апреля 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Хлоропласты содержат около 3500 различных белков, только небольшая часть которых кодируется пластидным геномом. Большинство белков пластид кодируется ядром. Координация экспрессии генов хлоропластных белков, кодируемых двумя клеточными геномами, достигается путем обмена информацией между ними, в котором участвуют специфические регуляторные сигналы, идущие как от ядра к пластидам, так и от пластид к ядру. Ключевая роль в этих процессах принадлежит клеточному ядру. Сигналы, посылаемые ядром в различные компартменты клетки (ядерные или антероградные сигналы) изучены значительно лучше, чем сигналы, генерируемые хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы). Предположение о существовании «пластидного сигнала», который регулирует экспрессию ядерных генов хлоропластных белков, было высказано впервые в середине 80-х годов (Börner, 1986; Oelmüller, Mohr, 1986). В последние годы интерес к исследованию пластидных сигналов сильно возрос. Было установлено, что пластидными сигналами, «запускающими» синтез кодируемых ядром пластидных белков, могут являться продукты синтеза белка в пластидах, активные формы кислорода (синглетный кислород и перекись водорода), редокс-состояние электрон-транспортной цепи фотосинтеза, а также интермедиаты биосинтеза тетрапирролов. Было доказано, что пластидные сигналы регулируют экспрессию ряда генов фотосинтеза (Pfannschmidt, 2003). Однако данные о передаче сигналов от хлоропластов к ядру по-прежнему немногочисленны. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, только начинается. Не идентифицированы ни механизмы, позволяющие пластидному сигналу проходить через оболочку органелл, ни молекулы-мессенджеры, локализованные в цитоплазме/ядре. В связи с изложенным, большой интерес представляет исследование роли пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков хлоропластов, поскольку эти белки играют важную роль в защите растений от стрессовых факторов окружающей среды (интенсивный свет, экстремальные температуры, засуха и др). В хлоропластах высших растений идентифицированы мультигенное семейство стрессовых белков Elip, локализованных в тилакоидах, и стрессовый белок теплового шока Hsp32, локализованный в строме хлоропластов. Действие пластидного сигнала на транскрипцию ядерных генов стрессовых белков хлоропластов практически не изучено. Белки семейства Elip (ранние индуцируемые светом белки) синтезируются в растениях на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, а также в условиях светового стресса, засухи и действия 3 низких температур (Adamska et al., 2001). У высших растений белки, относящиеся к мультигенному семейству Elip, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane, Kloppstech, 2000). Белки теплового стресса образуются у растений в условиях повышенной температуры окружающей среды. Низкомолекулярный белок Hsp32 играет существенную роль в устойчивости к тепловому стрессу и в процессах развития растений (Kruse et al., 1993). Цель и задачи работы. Целью данной работы было исследование роли пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид – гена низкомолекулярного белка светового стресса Elip и гена белка теплового шока Hsp32 с использованием ингибиторного анализа. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи: 1. Изучить экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид Elip, Hsp32 и маркерных генов белков фотосинтеза Lhcb1, RbcS на уровне мРНК и на уровне белков в условиях, позволяющих выявить пластидный сигнал. 2. Изучить импорт белков в хлоропласты в условиях окислительного стресса, вызванного недостатком каротиноидов у стрессовых белков пластид Elip и Hsp32 и белков фотосинтеза Lhcb1 и RbcS. 3. Изучить участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов (Mg-протопорфирина IX и монометилового эфира Mg-протопорфирина IX), продуктов синтеза пластидных белков и редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза в регуляции транскрипции гена Elip. Научная новизна. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов стрессовых белков пластид и генов белков фотосинтеза. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32. Регуляция гена Elip отличается от регуляции экспрессии гена близкородственного белка Lhcb1. Показано, что в регуляции транскрипции гена Elip участвуют интермедиаты биосинтеза тетрапирролов и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (пула пластохинонов). Впервые установлено, что экспрессия одного и того же гена Elip может кооперативно регулироваться несколькими (по крайней мере, двумя) хлоропластными сигналами. Впервые обнаружено накопление в оболочке хлоропластов 4 предшественников пластидных стрессовых белков в условиях фотодеструкции, что обусловлено нарушениями импорта белков-предшественников в пластиды. Научно-практическая ценность. Полученные данные позволяют существенно расширить представления обусловливающих о механизмах координированную внутриклеточной экспрессию генов в передачи различных сигналов, структурах растительной клетки. Настоящая работа является фундаментальным исследованием. Полученные данные могут быть использованы при проведении генно-инженерных работ по созданию продуктивных сортов сельскохозяйственных растений. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Съезде Общества Физиологов растений России (г. Пенза, 2003), V-м Международной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (г. Минск, 2004), XVIIой молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (г. Москва, 2005) и на 11-ом Конгрессе Общества фотобиологов (г. Э-лебен, Франция, 2005). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (175 источников). Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 19 рисунков и 3 таблицы. 5 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы В обзоре литературы рассмотрены современные представления о регуляции экспрессии ядерных генов белков пластид с помощью сигналов, генерируемых хлоропластами, и о медиаторах, участвующих в этом процессе. Основное внимание уделено рассмотрению классов пластидных сигналов, структуры и функций белков Elip и Hsp32. Материалы и методы исследования Растения и условия выращивания. Проростки ячменя (Hordeum vulgare L.) выращивали при 20°С в водной культуре в темноте в течение 7 сут. Для ингибирования биосинтеза тетрапирролов использовали 2,2’-дипиридил («Sigma», США). Этиолированные проростки обрабатывали 2,2’-дипиридилом в конечной концентрации 5 мМ и освещали светом 30 мкмоль квантов м–2 сек-– 1 в течение 8 ч. Для выявления роли пластидного сигнала в опытах использовали растения, обработанные норфлуразоном (SAN 9789, 4-хлор -5-(метиламино)-2(α,α,α-три-фтор-м-толил-3-(2Н)пиридазинон; NF), что приводило к фотодеструкции хлоропластов. Cемена замачивали в дистиллированной воде, содержащей 0,5 мМ NF, и выращивали в водной культуре в темноте в присутствии той же концентрации ингибитора. В опытах с ингибитором синтеза белка в пластидах использовали линкомицин в конечной концентрации 0,5 мМ. Затем проростки освещали светом 300 мкмоль квантов м-– течение суток. Условия теплового стресса: контрольные и обработанные NF 2 с– 1 в интактные растения инкубировали в течение 2 ч при 42°С в термостате в темноте. Для создания условий светового стресса этиолированные проростки в течение 24 ч освещали светом 300 мкмоль квантов м-– 2 с-– 1. Для того чтобы выяснить, может ли редокс-состояние хлоропластов являться пластидным сигналом при экспрессии гена Elip, мы использовали 3-(3’, 4’дихлорфенил)- 1,1’ –диметилмочевину (DCMU; диурон; 120 мМ) – специфический ингибитор, блокирующий транспорт электронов от фотосистемы 2 к пулу пластохинонов (PQ), что предотвращает восстановление последнего. Проростки ячменя (Hordeum vulgare L.) выращивали при 20°С в водной культуре в темноте в течение 6 сут, затем переносили на раствор ингибитора - 120 мМ, опрыснув раствором DCMU той же концентрации. Затем проростки освещали светом 300 мкмоль квантов м-– 2 с– 1 в течение суток. Содержание Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира определяли с помощью спектрофлуориметра RF-5301PC («Shimadzu», Япония). Длины волн возбуждения (Ex) и испускания (Em) флуоресценции составляли 420 и 598 нм, соответственно (Rebeiz et al., 1966; Rebeiz et al., 1975). 6 Геномную ДНК выделяли из контрольных проростков ячменя с помощью СТАВ-буфера и депротеинизации хлороформом. Выделение РНК и нозерн-гибридизация. Суммарную РНК выделяли из контрольных и обработанных ингибиторами проростков ячменя с помощью фенольной депротеинизации. Препараты тотальной РНК, фракционированные методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле и окрашенные EthBr, переносили на нитроцеллюлозный фильтр с помощью капиллярного блоттинга и проводили нозерн-гибридизацию. Фильтр помещали в раствор для предварительной гибридизации, которую проводили в течение 2 ч в термостате при 42°С в присутствии 50%-ного формамида, 5 х раствора Денхарда (1 x Денхард : 0,02%-ный Фиколл, 0,02%-ный поливинилпирролидон, 0,02%-ный БСА), 5 x SSC (1 x SSC : 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат Na, pH 7,0), 1%-ного Ds-Na и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Для обнаружения мРНК, кодируемой геном Elip, использовали пробы, полученные с помощью амплификации геномной ДНК ячменя. РНК-блоты гибридизовали с меченными [α-32P]dATP ДНК-зондами. ДНК-зонды метили [α-32P]dATP с помощью набора для случайного мечения праймеров («Random Primer», «СилексМ»; Россия). подтверждающим рРНК, нанесение окрашенные равных бромистым количеств этидием, суммарной служили РНК и контролем, эффективность последующего переноса РНК на мембрану. Для тестирования линейности ответа использовали несколько разных по времени экспозиций с пленкой. Радиоавтограммы фотографировали и анализировали с помощью видеосистемы “DNA Analyzer” и специализированного программного обеспечения “Gel Explorer” («Хеликон», Россия). Амплификацию гена Elip проводили с помощью Tag-полимеразы («СилексМ», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. 30 мкл стандартной реакционной смеси содержали: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 50 мМ KCl; 2,5 мМ MgCl2; 1,5 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов («СилексМ», Россия); по 10 мкМ праймеров: 5'– TTGATTAATGGCGACCATGATG – 3' (прямой) и 5'– CACAACCTGTACTTAGCTAGTA – 3' (обратный); 10 нг ДНК-матрицы; 5 единиц Tag-полимеразы. Полимеразную реакцию проводили на многоканальном амплификаторе ДНК ТП-4ПЦР-01 «Терцик» (АО «ДНКТехнология»). Реакция протекала при следующих условиях: 1-ый цикл – 94°, 10 мин; 30 циклов: 94°, 30 сек; 56°, 30 сек; 72°, 45 сек; последний цикл 72°, 5 мин. Продукты амплификации (ампликоны) разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, содержащем 1 х буфер ТАЕ (0,04 М трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА) в присутствии EthBr при 100 В. Фрагмент геля, содержащий необходимый ПЦР-продукт, вырезали, и ДНК экстрагировали с помощью набора «Выделение ДНК из агарозных гелей» («СилексМ», Россия). Путем секвенирования подтверждали идентичность ПЦР-продуктов. 7 В реакции обратной транскрипции, сопряженной с ПЦР (ОТ-ПЦР), матрицей служила суммарная РНК, выделенная из листьев ячменя, как описано выше. Обратную транскрипцию проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя фермента, используя 100 ед. обратной транскриптазы («СибЭнзим», Россия). Для подтверждения отсутствия примесей геномной ДНК в препаратах РНК проводили реакции без добавления обратной транскриптазы. Проводили также обработку выделенной РНК ДНКазой. кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров: 5'– CGAGCGCGACGAGTCCGA – 3' (обратный для кДНК), 5'– GCGGCTCGGCCCGGTCTCT – 3' (прямой для ПЦР-продукта), 5'– AGAGCTCCGCGTTGGCGTTCATG – 3' (обратный для ПЦР-продукта). В качестве гена для нормирования данных была исследована 18S рРНК с использованием специфических праймеров: 5'– AAGAAGCTAGCTGCGGAGGGATGG – 3' (обратный для кДНК), 5'– GACAGTCGGGGGCATTCGTATTTC – 3' (прямой для ПЦР-продукта), 5'– CCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAG – 3' (обратный для ПЦР-продукта). ПЦР-продукты фракционировали с помощью электрофореза в 1,5%-ной агарозе. Выделение пластид из проростков ячменя. Интактные пластиды выделяли из 200-400 г проростков ячменя и очищали с помощью центрифугирования в градиенте Перколла (Юрина и др.). Выделение суммарных белков клетки. Для выделения суммарных белков 100 мг листьев гомогенизировали в жидком азоте, переносили в 1мл буфера, содержащего 12,5 мМ Tрис-HCl, pH 6,8, 2%-ный Ds-Na, 1 мМ ЭДТА, 6 мМ DTT и 10%-ный глицерин. Экстракт прогревали при 65°С в течение 15 мин и затем центрифугировали 15 мин при 18 000 g. Концентрацию белка определяли по Лоури, и белки анализировали с помощью Ds-Na-ПААГ. Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез белков (10 мкг на дорожку) проводили в 12,5%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по Лэммли (Laemmli, 1970). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Schleicher and Schüll», Германия) с размером пор 0,45 мкм (Towbin et al., 1979). Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 4°С в блокирующем буфере: 5%-ное обезжиренное сухое молоко в 20 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,2), 0,15 М NaCl, 0,1%-ный Твин 20, и затем инкубировали с первичными антителами, разведенными 1:2000, к соответствующему белку (ELIP, HSP32, Lhcb1 или RbcS) в течение ночи при 4°С. Мембраны инкубировали 2 ч при комнатной температуре с антикроличьими IgG козы, конъюгированными с щелочной фосфатазой. Специфические белковые полосы обнаруживали с помощью субстратов для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий. Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Пептидные карты получали с помощью ограниченного протеолиза белков. Переваривание белков в ПААГ проводили по методу Кливленда (Cleveland, 1983). Для 8 переваривания использовали химотрипсин (20 мкг/мл) и протеазу М8 (16 мкг/мл). Полипептиды, образовавшиеся при протеолизе, обнаруживали с помощью иммуноблоттинга. Обработка хлоропластов трипсином. Осадок хлоропластов суспендировали в 0,5 мл буфера: 330 мМ сорбит, 50 мМ HEPES-KOH, pH 8,0, содержащего 20 мкг/мл трипсина (из поджелудочной железы быка; «Boehringer», Германия). Инкубацию с трипсином проводили в течение 15 мин во льду. Затем хлоропласты разбавляли 5 мл исходного буфера, содержащего ингибитор трипсина (20 мг/мл; яичный ингибитор трипсина, «Boehringer», Германия) или ингибиторы протеаз (1 мМ ФМСФ, 1 мМ бензамидин). Хлоропласты осаждали центрифугированием, и суммарные белки хлоропластов анализировали с помощью Ds-Na ПАAГ электрофореза с последующим иммуноблоттингом. Результаты и их обсуждение 1. Влияние фотодеструкции хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне мРНК у NF- обработанных растений Для обнаружения действия пластидного сигнала применяют методы ингибиторный анализ или анализ мутантов с нарушениями механизма передачи сигнала. При изучении влияния хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков использовали растения, у которых в результате фотодеструкции пластиды лишенны каротиноидов и внутренних структур. Проростки ячменя, выращенные в темноте в присутствии NF (ингибитора биосинтеза каротиноидов) освещали интенсивным светом, что приводит к фотоокислительному разрушению хлоропластов. В обесцвеченных пластидах отсутствует большинство внутренних структур, в числе которых тилакоидные мембраны и рибосомы; ДНК и оболочка пластид повреждаются относительно мало. Анализ пигментного состава пластид показал отсутствие каротиноидов и хлорофиллов в растениях, обработанных ингибитором. В апикальной части контрольных проростков хлоропласты содержат регулярно организованные тилакоидные мембраны, в то время как в растениях, обработанных NF, пластиды апикальной части листьев почти лишены внутренней мембранной системы. Такие же повреждения ультраструктуры пластид в результате обработки этим соединением наблюдаются и в базальной части проростков ячменя. В контрольных растениях клетки содержат дифференцированные хлоропласты с типичной ультраструктурой, пластиды опытных растений полностью лишены внутренних мембран. Исследование экспрессии четырех ядерных генов пластидных белков: двух генов стрессовых белков Elip и Hsp32 и двух генов белков фотосинтеза Lhcb1 и RbcS с помощью нозерн-гибридизации показало, что ген Hsp32 экспрессируется практически в одинаковой степени у контрольных и NF-обработанных растений, тогда как содержание транскриптов 9 гена Elip снижено у опытных растений (рис. 1). Относительное содержание транскриптов в обработанных NF проростках составляло 50-70% и 90-95% от контроля для Elip и Hsp32, соответственно. Гены Lhcb1 и RbcS не транскрибируются у NF-обработанных растений. Таким образом, показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков Lhcb1 и Elip. NF + – + – + – + – а б Elip Hsp32 Lhcb1 RbcS в относительное содержание, % Lhcb1= RbcS >Elip> Hsp32 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Т Т Elip Hsp32 Lhcb1 RbcS 10 Рис. 1. Радиоавтограмма нозерн-блот гибридизации меченных 32Р Elip, Hsp32, Lhcb1 и RbcS с суммарной РНК NF-обработанных и контрольных растений ячменя - а; б – рРНК каждого из образцов, окрашенные EthBr, представленных в (а); в – относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip, Hsp32, Lhcb1, RbcS у проростков, обработанных норфлуразоном. – контроль, - опыт. 2. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у NFобработанных растений С помощью вестерн-блот анализа клеточных экстрактов NF-обработанных и контрольных проростков ячменя определяли содержание пластидных белков Elip, Hsp32, Lhcb1 и RbcS. Содержание белков Lhcb1 и RbcS понижено у NF-обработанных проростков по сравнению с контрольными растениями (рис. 2). NF + – Elip + – Hsp32 + – Lhcb1 + – RbcS Рис. 2. Вестерн-блот анализ белков Elip, Hsp32, Lhcb1 и RbcS NF-обработанных и контрольных растений ячменя. 7-сут этиолированные проростки освещали (300 мкмоль м-2 с-1) в течение 24 ч. В опытах с Hsp32 проростки предварительно подвергали тепловому стрессу (42°С, 2 ч). Стрелками отмечены дополнительные белки. Однако у обработанных NF проростков ячменя обнаружено накопление дополнительных, более высокомолекулярных, белков как в случае белка теплового шока Hsp32, так и белка светового стресса Elip. При совместном действии фотоокислительного стресса, вызванного ингибитором биосинтеза каротиноидов, и теплового стресса кроме зрелого Hsp32, обнаруживается дополнительный белок с молекулярной массой 36 кДа. В случае Elip кроме зрелого белка 13 кДа – белок с молекулярной массой 17 кДа (рис. 2). Дополнительные белки обнаруживаются уже при 2-ч экспозиции проростков на свету и их содержание продолжает возрастать при увеличении продолжительности экспозиции на свету. На примере белка теплового стресса Hsp32 показана динамика накопления предшественников белков (рис. 3). Рис. 3. Иммуноблот-анализ содержания Hsp32 у NFобработанных (черный столбик – белок 36 кДа, серый столбик – Hsp32) и контрольных (белые столбики – белок 36 кДа, заштрихованные столбики – Hsp32) проростков ячменя. Проростки инкубировали 2 ч при 42° и затем освещали (300 мкмоль м-2 с-1) в течение 4 24 ч. Суммарные белки фракционировали с помощью 11 Ds-Na-ПААГ электрофореза, после чего проводили иммуноблоттинг. В растениях, подвергнутых только тепловому стрессу, накапливается зрелый белок Нsp32 (заштрихованные столбики), причем его содержание возрастает с увеличением продолжительности освещения до 12 ч. Следовое количество белка с молекулярной массой 36 кДа также обнаруживается в этих препаратах, но его содержание не изменяется при освещении. В то время как в растениях, подвергнутых совместному действию теплового шока и окислительного стресса, содержание дополнительного белка 36 кДа увеличивалось линейно вплоть до 24 час экспозиции проростков на свету, содержание Hsp32 выходило на плато на ранних стадиях освещения (черные и серые столбики, соответственно). Получены сходные пептидные карты для зрелого Нsp32 и дополнительного белка 36 кДа (рис. 4). Рис. 4. Пептидная карта Hsp32 и белка 36 кДа. Переваривание белков химотрипсином проводили in situ. Пептиды обнаруживали с помощью вестерн-блот анализа. Белки выделяли из NF- обработанных (NF) и контрольных (K) проростков ячменя, освещенных в течение 24 ч. Справа видны пептиды зрелого белка у NFобработанных проростков. Двусторонними стрелками обозначено положение пептидов, обнаруженных в обоих образцах. Пунктирной стрелкой отмечено положение предшественника белка Hsp32 у NF-обработанных проростков. М - зрелый белок, Р – предшественник. Это указывает на высокую степень гомологии между этими белками и доказывает наличие взаимосвязи предшественник-продукт. Таким образом, показано, что в присутствии NF происходит накопление предшественника Нsp32. Другой возможностью показать связь предшественник-продукт для Hsp32 и белка 36 кДа является доказательство того, что при удалении NF содержание дополнительного белка (предположительно предшественника) уменьшается. Было показано, что через 16 час после удаления NF из среды с помощью двукратной отмывки корней растений водой содержание белка 36 кДа резко уменьшается (рис. 5). Рис. 5. Действие удаления NF на содержание предшественника Hsp32. NF- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя подвергали тепловому шоку (42° С, 2 ч) и затем освещали 8 ч (300 мкмоль м-2 с-1). Корни растений отмывали, 12 проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч. Белки выделяли из NFобработанных проростков (1,3), проростков, Тот факт, что обнаруживаются следовые количества этого белка, объясняется, видимо, неполной отмывкой корней от вермикулита, содержащего NF. Эти данные подтверждают, что белок 36 кДа является предшественником Hsp32. На рис. 6 представлено действие NF на содержание предшественника другого стрессового белка пластид Elip (13 кДа), кодируемого ядром и локализованного в тилакоидных мембранах. В этом случае наблюдается накопление более высокомолекулярного белка с молекулярной массой 17 кДа. 1 2 3 4 5 Рис. 6. Действие удаления NF на содержание предшественника Elip. NF- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя освещали 8 ч (300 мкмоль квантов м-2 с-1), затем корни растений отмывали, проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч. Белки выделяли из NFобработанных проростков (1,3), проростков, перенесенных на воду (4) и контрольных (2,5) проростков ячменя. Процесс накопления дополнительных белковых компонентов в присутствии NF является обратимым. Эти белки практически исчезают при отмывке корней растений от NF. Наличие нескольких минорных белковых иммунодетектируемых зон, наблюдаемых на рис. 5, объясняется тем, что в растениях имеется семейство белков Elip. На основании отличия по молекулярной массе, иммунологического сходства, пептидного картирования, а также опытов по удалению NF нами было установлено, что более высокомолекулярные белки являются предшественниками стрессовых белков Hsp32 и Elip. Для того чтобы выяснить, где накапливаются предшественники стрессовых белков в клетках обработанных NF растений, очищенные в градиенте Перколла хлоропласты обрабатывали трипсином. Обнаружено, что предшественники белков чувствительны к действию трипсина, в то время как зрелые белки, прошедшие процессинг и находящиеся внутри пластид, не разрушаются при такой обработке органелл (рис. 7). 13 Рис. 7. Действие трипсина на хлоропласты из NF-обработанных (+) и контрольных (-) проростков ячменя. Переваривание трипсином (20 мкг/мл, 4° С, 15 мин) не импортируемых в пластиды белков. М – зрелые белки, Р – предшественники белков. Это указывает на то, что часть предшественников стрессовых белков у NF-обработанных растений не проходит через мембрану оболочки, и позволяет считать, что накопление предшественников пластидных белков происходит за счет нарушения транслокации предшественников стрессовых белков в пластиды. 3. Влияние пластидных сигналов разных классов на регуляцию экспрессии ядерного гена пластидного белка Elip 3.1. Сигнальная роль интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. Чтобы изучить участие тетрапирролов в регуляции транскрипции ядерного гена Elip, а именно - роль Mgпротопорфирина IX (Mg-прото IX) и его монометилового эфира – Mg-прото IX-Me в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного пластидного белка Elip, были проведены опыты с 2,2’-дипиридилом. Дипиридил блокирует биосинтез тетрапирролов, локализованных в хлоропластах, на стадии превращения Mg-прото IX-Me в протохлорофиллид, что приводит к накоплению в хлоропластах Mg- прото IX- Me. В ходе измерения содержания интермедиатов биосинтеза хлорофилла обнаружено, что, по сравнению с контрольными растениями, количество Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me увеличивается в 5,8 раз в проростках, обработанных 2,2’-дипиридилом. Как видно из табл. 1, у NF-обработанных проростков ячменя также наблюдается повышенное содержание Mgпрото IX и Mg-прото IX-Me. По-видимому, негативная регуляция NF транскрипции генов белков хлоропластов может быть обусловлена накоплением интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. 14 Таблица 1. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в проростках ячменя Содержание Mg-прото IX + Mg- прото IX-Me Вариант нмоль/г сырого веса % от контроля Контроль 0,073 ± 0,020 100 Норфлуразон* 0,116 ± 0,025 159 0,423 ± 0,024 579 2,2’- Дипиридил** * Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на растворе 5 x 10-5 М NF или воде (контроль), а затем освещали в течение 24 ч. ** Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на воде, а затем на растворе 5 мМ 2,2’-дипиридила или воде (контроль) в течение 8 ч на свету (30 мкмоль м-2 с-1). Среднее значение получено из трех независимых экспериментов. Это может объясняться тем, что синтез тетрапирролов до стадии протохлорофиллида локализован в окружающей мембране (оболочке) хлоропластов, а последующие стадии – во внутренних (тилакоидных) мембранах. При фотодеструкции в первую очередь разрушаются внутренние мембраны хлоропластов, в то время как оболочка остается неповрежденной, поэтому там накапливаются Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me. В результате анализа данных ОТ-ПЦР было обнаружено, что уровень экспрессии гена белка светового стресса хлоропластов в проростках, обработанных 2,2’-дипиридилом, ~ на 50% ниже, чем в контрольных растениях (рис. 8). 15 120 110 100 отн. содержание,% 90 80 70 60 50 40 в Т 30 20 10 0 К ДП Рис. 8. Содержание транскриптов ядерного гена стрессового белка Elip у контрольных растений и растений, обработанных 2,2’-дипиридилом (ДП). а - радиоавтограмма (нозернгибридизация), б – электрофореграмма суммарной РНК, окрашенной EthBr, в – относительное содержание (% от контроля) транскриптов гена Elip у проростков ячменя, обработанных 2,2’-дипиридилом. К-контроль. На основании данных о содержании предшественников биосинтеза тетрапирролов в опытных и контрольных растениях, и данных, полученных с помощью ОТ-ПЦР, можно сказать, что содержание тетрапирролов в клетках коррелирует с содержанием транскриптов гена Elip. Эксперименты по изучению влияния повышенного содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me на экспрессию генов Elip показали, что накопление в хлоропластах Mgпрото IX и его монометилового эфира приводит к частичному ингибированию транскрипции гена низкомолекулярного пластидного белка светового стресса Elip. Оба метода оценки содержания транскриптов гена Elip (нозерн-гибридизация и ОТ-ПЦР) дали сходные результаты. 3.2. Влияние синтеза белка в пластидах на экспрессию гена Elip. Для того чтобы выяснить возможную роль хлоропластных белков как пластидного сигнала, регулирующего экспрессию гена Elip, нами был использован линкомицин, ингибирующий синтез белков в пластидах. Проростки ячменя в течение 5 сут росли в темноте на 0,5 мМ растворе линкомицина, а затем были выставлены на свет (300 мкмоль квантов м–2сек–1) на 48 ч. С помощью нозерн-гибридизации мы сравнили уровень транскриптов гена Elip в опытных и контрольных растениях. Экспрессия ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip в опытных проростках не отличалась от его экспрессии в растениях, не подвергавшихся обработке ингибитором. Таким образом, подавление синтеза пластидных белков в 7-сут 16 растениях не оказывает влияния на экспрессию гена Elip. У таких растений процесс трансляции в пластидах не участвует в регуляции экспрессии гена Elip. Ранее было показано, что на начальных этапах прорастания обработка линкомицином приводит к снижению экспрессии ядерных генов, кодирующих белки фотосинтеза хлоропластов. В проростках табака в результате действия ингибитора не накапливаются транскрипты генов Lhcb1 и RbcS в первые 2-3 дня развития проростков. На этом основании был сделан вывод о необходимости трансляции в хлоропластах в этот период развития проростков (Sullivan, Gray, 1999; Gray et al., 2003). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция в пластидах 7-сут проростков ячменя не влияет на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. По-видимому, синтез пластидных белков нужен для формирования сигнальной системы хлоропластов на более ранних этапах развития проростков. 3.3. Регуляция экспрессии гена Elip редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Для того чтобы выяснить может ли редокс-состояние электрон-транспортной цепи хлоропластов выступать в роли пластидного сигнала при экспрессии гена Elip, мы использовали 3-(3’, 4’- дихлорфенил)- 1,1’ –диметилмочевину (DCMU) – специфический ингибитор, блокирующий транспорт электронов от ФСII к пулу пластохинонов (PQ), что предотвращает восстановление последнего и приводит к накоплению пула окисленного PQ. Опытные растения ячменя выращивали в течение 7 сут в темноте в водной культуре. После этого проростки переносили в среду, содержащую 120 мкМ DCMU, таким же раствором опрыскивали растения и в течение 24 ч освещали белым светом (300 мкмоль квантов м–2 с–1). Световой режим контрольных и опытных растений был идентичен. Как следует из таблицы 2, фотохимическая активность ФСII у обработанных DCMU растений ингибирована на 30% по сравнению с контролем. Таблица 2. Фотохимическая эффективность ФСII в проростках ячменя после обработки DCMU Варианты F0 Fm Fv = Fm – F0 Fv / Fm Fv / Fm % отн. ед. Контроль 46 256,0 ± 0,030 210 0,820 ± 0,012 100 DCMU 46 107,5 ± 0,021 61,5 0,572 ± 0,02 70 Снижение фотохимической активности ФСII приводит к окислению пула пластохинонов. С помощью ОТ-ПЦР определяли уровень транскриптов у контрольных и 17 обработанных DCMU проростков ячменя. В ходе исследований было показано, что содержание транскриптов Elip понижено у растений, обработанных ингибитором, и составляет всего 20-30% от контроля (рис. 9). Подавление переноса электронов от ФСII к пулу пластохинонов на 30% приводит к снижению уровня транскрипции гена Elip на 80%. М DCMU – + относительное содержание, % п.н. а 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 б Т К DCMU Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР-продукта (567 п.н.) гена Elip, полученного с помощью ОТ - ПЦР. а – электрофореграмма ПЦР-продукта в 1,5%-ной агарозе; б – относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip у проростков, обработанных DCMU; М – ДНК-маркеры («100 bp Ladder»). К – контроль. Таким образом, обработка DCMU, вызывающая окисление пула пластохинонов, приводит к существенному ингибированию транскрипции гена Elip. Заключение В настоящее время с помощью ингибиторного анализа и исследования мутантов обнаружены пять возможных путей передачи сигналов от хлоропластов к ядру (пять классов пластидных сигналов). Один из этих путей зависит от продукта (-ов) пластидного синтеза белков; второй – связан с синглетными формами кислорода; в третьем пути участвует перекись водорода, генерируемая хлоропластами; четвертый сигнальный путь контролируется редокс-состоянием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и в пятом участвуют интермедиаты биосинтеза тетрапирролов (Beck, 2005). Эти пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с ядром. В нашей работе мы попытались оценить участие трех классов пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов стрессовых хлоропластных белков (Elip и Hsp32). 18 Было исследовано участие промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов, продуктов синтеза пластидных белков и редокс-состояния хлоропластов в регуляции экспрессии этих генов у ячменя. На первом этапе исследований была изучена экспрессия генов Elip проростках ячменя, содержащих и Hsp32 в фотоповрежденные хлоропласты. Маркерными генами служили ядерные гены белков фотосинтеза (Lhcb, RbcS), для которых доказана регуляция экспрессии с помощью пластидного сигнала. Показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов, вызванной норфлуразоном, ингибитором фитоиндесатуразы, в пластидах отсутствуют фотосинтетическая активность, тилакоидные мембраны и рибосомы. Однако ДНК и оболочка органелл повреждаются сравнительно мало. При сравнении экспрессии четырех ядерных генов - генов стрессовых белков пластид Elip и Hsp32 и генов белков фотосинтеза Lhcb и RbcS, в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, было обнаружено, что транскрипция генов белков фотосинтеза наиболее чувствительна к пластидному сигналу. На экспрессию ядерного гена хлоропластного белка теплового шока Hsp32 пластидный сигнал не оказывает действия: его транскрипция практически не отличается у норфлуразон-обработанных и контрольных растений. Поэтому можно говорить о том, что Hsp32 является геном, экспрессия которого относительно нечувствительна к пластидному сигналу. Уровень транскрипции гена Elip снижен у фотоповрежденных растений. Это указывает на то, что хлоропласты контролируют экспрессию данного гена. Elip Наши результаты о регуляции экспрессии гена согласуются также с представлением о том, что экспрессия ядерных генов регулируется функциональным состоянием пластид скорее непрерывно, чем дискретно по принципу «open-shut gate» (McCormac, Terry, 2004). Возможно, что различная чувствительность транскрипции изученных четырех генов к фотодеструкции хлоропластов отражает различия в регуляторных элементах промоторов соответствующих генов. Таким образом, хлоропласты принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip. Обнаружено, что при фотодеструкции в хлоропластах ячменя кроме зрелых форм белков Elip и Hsp32 наблюдается накопление их предшественников. В этих условиях не обнаруживаются предшественники хлоропластных белков периферической антенны ФСII (Lhcb1) и малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (RbcS). Как показали результаты нашей работы, это может объясняться тем, что транскрипция генов стрессовых белков продолжается, а транскрипция генов белков фотосинтеза заблокирована. При окислительном стрессе, вызванном недостатком каротиноидов, частично нарушается импорт белков в хлоропласты, при этом предшественники белков накапливаются в 19 оболочке пластид. Такой вывод следует из опытов по обработке изолированных пластид экзогенными протеазами (трипсином). По-видимому, N-конец стрессового белка находится в оболочке пластид, в то время как С-конец экспонирован снаружи и поэтому подвержен действию протеаз. У NF-обработанных и контрольных растений предшественники стрессовых белков связываются с сайтами транслокации оболочки хлоропластов, но у NFобработанных растений реакция переноса частично нарушена. Чтобы обнаружить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса Elip и содержанием тетрапирролов – предполагаемых сигнальных молекул, биосинтез которых локализован у высших растений в хлоропластах, использовали 2,2’дипиридил. Обнаружено, что повышение содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me коррелирует с понижением экспрессии гена Elip . Это указывает на зависимость экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. от внутриклеточного содержания В нашей работе впервые показано, что в регуляции транскрипции гена Elip у ячменя участвуют тетрапирролы, частично ингибируя экспрессию этого гена (на ~ 50%). Отсюда следует, что пластидный сигнал, медиаторами которого являются транскрипцию Mg-протопорфирин IX и Mg-протопорфирин IX-Me, подавляет данного гена, что позволяет говорить о негативной регуляции тетрапирролами экспрессии Elip. Сходные результаты получены при оценке содержания транскриптов гена Elip методом нозерн-гибридизации и OT-ПЦР. Для выявления корреляции между уровнем экспрессии гена белка светового стресса и редокс-состоянием хлоропластов использовали специфический ингибитор ФСII – DCMU. Как известно, ингибирование ФСII приводит к окислению пула пластохинонов, который, в основном, и определяет редокс-состояние хлоропластов. Показано, хлоропластного что в белка регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного светового стресса Elip участвует редокс-состояние электрон- транспортной цепи фотосинтеза. Изменение редокс-состояния хлоропластов, вызванное обработкой проростков ячменя DCMU (специфический ингибитор ФСII), приводит к снижению транскрипции гена Elip (на ~ 80%). Таким образом, в регуляции экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса у ячменя участвуют не только тетрапирролы, но и другой класс пластидного сигнала, который индуцируется окисленным пулом пластохинонов. Тот факт, что экспрессия ядерного гена белка Elip регулируется разными классами пластидных сигналов, свидетельствует о том, что экспрессия одного и того же гена может кооперативно регулироваться несколькими пластидными сигналами. 20 На основании вышеизложенного, нами предложена схема регуляции хлоропластами экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip (рис. 10). Накопление промежуточных соединений биосинтеза хлорофилла (Mg-прото IX и его монометилового эфира) в оболочке хлоропластов приводит к снижению уровня экспрессии гена Elip. По-видимому, Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me поступают в цитозоль, и в ходе ряда последовательных реакций блокируют активатор/активирует репрессор транскрипции, что приводит к снижению уровня экспрессии этого гена. Возможна и регуляция экспрессии этого гена с участием редокс-равновесия электрон-транспортной цепи фотосинтеза. При блокировании транспорта электронов от ФСII к пулу пластохинонов происходит окисление пула пластохинонов, что коррелирует с падением уровня экспрессии гена Elip на 80%. Таким образом, можно говорить о функционировании при регуляции экспрессии гена Elip двух классов пластидно-ядерного взаимодействия. Первый класс предполагает участие Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me в инициации процессов, приводящих к изменению транскрипции этого гена. Поскольку в настоящее время не обнаружены последующие этапы пластидно-ядерного взаимодействия с участием Mg-прото IX и Mgпрото IX-Me (транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с данными соединениями), эти тетрапирролы можно считать «медиаторами» пластидного сигнала. ХЛОРОПЛАСТ свет тилакоиды DCMU ALA ФС II PQ ФСI Синтез белка PQH2 Прото Ре докс-состояние эле ктронтранспортной це пи Mg-прото Mg-прото Me рецепторы света клетка ЯДРО Elip Hsp32 Рис. 10. Схема участия разных классов пластидных Рис. 10. Схема участияядерных разных классов сигналов в регуляции экспрессии геновпластидных стрессовых сигналов врегуляции экс прессии ядерных белков хлоропластов. геновстрессовых белков хлоропластов. 21 Второй класс пластидно-ядерного взаимодействия осуществляется при непосредственном участии электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Ингибирование транспорта электронов от ФСII к пулу пластохинонов в хлоропластах ячменя, в результате чего пул остается окисленным, вызывает понижение уровня транскриптов гена Elip. Функционирование указанных двух классов пластидно-ядерного взаимодействия, приводящее к снижению уровня экспрессии ядерного гена белка светового стресса Elip, позволяет говорить о негативной регуляции экспрессии данного гена этими классами сигналов. Выводы 1. Изучено влияние сигналов, генерируемых хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы) на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид (Elip, Hsp32) и генов белков фотосинтеза (Lhcb1, RbcS) в условиях фотодеструкции. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков Lhcb1 и Elip. 2. При фотодеструкции хлоропластов происходит накопление предшественников белков Elip и Hsp32 в оболочке пластид, что свидетельствует о нарушении импорта стрессовых белков в хлоропласты. 3. Показано, что в регуляции транскрипции гена Elip участвуют тетрапирролы, которые частично (на ∼50%) ингибируют экспрессию этого гена. Медиаторами пластидного сигнала служат промежуточные продукты биосинтеза тетрапирролов – Mgпротопорфирин IX и монометиловый эфир Mg-протопорфирина IX, которые подавляют экспрессию данного гена. 4. Показано, что неполное ингибирование диуроном восстановления пула пластохинонов приводит к существенному снижению уровня транскриптов Elip, что указывает на зависимость экспрессии ядерного гена белка светового стресса пластид от редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза. 5. На основании полученных данных предложена схема регуляции экспрессии ядерного гена пластидного белка Elip, согласно которой ген белка светового стресса Elip регулируется, по крайней мере, двумя сигналами: с помощью участия интермедиатов биосинтеза тетрапирролов и редокс-состоянием компонентов электрон-транспортной цепи. 22 По-видимому, пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с экспрессией ядерных генов. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Юрина Н.П., Погульская Е.Н., Олескина Ю.П., Белкина Г.Г. Участие хлоропластов в регуляции экспрессии ядерных генов, кодирующих пластидные белки. V Съезд Общества Физиологов растений России. Пенза, 15-21 сентября 2003. С. 475-476. 2. Белкина Г.Г., Погульская Е.Н., Юрина Н.П. Выделение и частичная характеристика ДНК-топоизомеразы I из нуклеоидов хлоропластов горчицы. Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т.40. №3. С. 276-281. 3. Погульская Е.Н., Юрина Н.П. Изучение роли пластидного сигнала в регуляции экспрессии ядерных генов, кодирующих белки хлоропластов. Тезисы Международной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, 2004. С. 308-309. 4. Юрина Н.П., Погульская Е.Н., Одинцова М.С. Влияние хлоропластов на экспрессию ядерных генов пластидных белков. Труды III Сисакяновских чтений, Дубна, 2005. С. 231-238. 5. Погульская Е.Н., Юрина Н.П. Экспрессия ядерных генов, кодирующих стрессовые белки пластид, в растениях с дефицитом каротиноидов. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 2005. С. 71. 6. Погульская Е.Н., Юрина Н.П. Фотодеструкция пластид и экспрессия ядерных генов стрессовых белков хлоропластов. 9-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология- наука ХХI века», Пущино, 2005. С.44-45. 23 7. E.N. Pogulskaya, N.P. Yurina. Expression of genes for early light inducible proteins under oxidative stress in barley. 11th Congress European Society for Photobiology. Aix-les-bains, France, 2005. P. 160. 8. Погульская Е.Н., Олескина Ю.П., Белкина Г.Г., Юрина Н.П. Транскрипция ядерных генов стрессовых белков пластид в условиях фотодеструкции хлоропластов. Материалы III съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 25-27 октября 2005. С. 122-123. 9. Юрина Н.П., Погульская Е.Н., Карапетян Н.В. Действие фотодеструкции пластид из норфлуразон-обработанных проростков на экспрессию ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов ячменя. Биохимия. 2006, Т. 71. № 4, С. 533-540. 10. Погульская Е.Н., Юрина Н.П., Карапетян Н.В. Участие тетрапирролов в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного пластидного белка ELIP. Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №3. С. 390-395. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН. 24
