определение аминокислот в лекарственных препаратах

23
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
УДК 543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ
МЕТОДОМ ОБРАЩЕННОФАЗОВОЙ ВЭЖХ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ
ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
© М. Г. Чернобровкин, М. В. Шунина, И. А. Ананьева, Е. Н. Шаповалова,
О. А. Шпигун1
Статья поступила 11 апреля 2006 г.
Показана возможность амперометрического детектирования дансильных производных
четырнадцати наиболее важных аминокислот после разделения методом обращенно-фазовой
ВЭЖХ. Найдены оптимальные условия хроматографического разделения и амперометрического детектирования дансильных производных исследованных аминокислот.
Проведено определение аминокислотного состава препарата “Долголет”.
Аминокислоты являются основным “строительным
материалом” для синтеза специфических тканевых
белков, ферментов, пептидных гормонов и других
физиологически активных соединений. Свободные
аминокислоты имеют большое функциональное
значение для многих метаболических процессов в
организме человека и выполняют роль биорегуляторов [1].
Аминокислоты широко используются в современной фармакологии. Некоторые из них (глутаминовая, γ-аминомасляная, метионин, глицин и др.)
нашли самостоятельное применение в качестве
лекарственных средств. Широко применяются
препараты на основе комбинации аминокислот и
лекарственных трав (препараты “Нео-потенциале”,
“Долголет”). В настоящее время расширяется круг
новых лекарственных препаратов, синтезируемых с
использованием аминокислотных остатков пептидов
(препараты “Даларгин”, “Каптоприл”, “Тимоген”).
Специальное значение имеют смеси аминокислот,
используемые в качестве средств для парентерального питания.
Для определения аминокислот в лекарственных
препаратах перспективным методом является
обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная
хроматография (ВЭЖХ) с предварительным переводом аминокислот в активные соединения различными органическими реагентами [2, 3].
Одним из самых популярных реагентов для
предколоночной дериватизации аминокислот является
1
Московский государственный университет
им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия.
5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид
(дансилхлорид) [4]. Образование дансильных
производных аминокислот происходит по следующей
схеме:
CH3
CH3
N
R
+
O
S
O
HC
C
OH
H2N
Cl
O
CH3
N
CH3
OH
O
S
O
N
H
H
C
C
O
R
Образующиеся производные аминокислот
чрезвычайно устойчивы и могут быть разделены
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с хорошей
селективностью и эффективностью. Дансильные
производные аминокислот обладают высоким
светопоглощением и превосходной флуоресценцией,
поэтому для их определения обычно используют
спектрофотометрический или флуориметрический
детектор.
24
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
Последнее время все больше внимания уделяют
использованию в ВЭЖХ амперометрического детектора благодаря его простоте, дешевизне, высокой
чувствительности и селективности. В литературе отсутствуют данные по электрохимическому детектированию дансильных производных аминокислот, между
тем наличие электроактивных групп (аминогруппы и
нафтильного фрагмента) в структуре дансильных
производных делает возможным их окисление и
последующее амперометрическое детектирование на
твердых электродах по току окисления.
Цель настоящего исследования — изучение
электрохимических свойств дансильных производных аминокислот, а также определение дансилированных аминокислот в лекарственном препарате
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.
В работе использовали жидкостный аналитический малогабаритный хроматограф “Цвет-Яуза”
(Россия) с амперометрическим детектором и насосом
для ВЭЖХ “Марафон-2”. Управление режимом и
обработка выходной информации проводилась с
помощью программы “Экохром”. Электрохимическая ячейка — “стенка — сопло”. Рабочий электрод
— стеклоуглеродный, вспомогательным электродом
служил корпус ячейки. Объем петли дозатора —
20 мкл. Метрологические характеристики амперометрического детектора сравнивали с характеристиками флуориметрического детектора RF-10Axl и
спектрофотометрического детектора SPD-10AV
фирмы Shimadzu.
Разделение дансильных производных аминокислот проводили на колонке Hypersil BDS-C18
(125 × 4 мм), диаметр частиц сорбента — 5 мкм.
Скорость потока элюента составляла 0,6 мл/мин.
Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил квалификации осч (Криохром,
Россия), гидрофосфат натрия, ортофосфорную
кислоту квалификации чда, бидистиллированную
воду. Для получения боратного буферного раствора
применяли тетраборат натрия (чда).
Для приготовления стандартных растворов D, Lаминокислот (серина, валина, лейцина, фенилаланина,
триптофана, изолейцина, метионина, аспарагина,
аргинина, глицина, тирозина, цистина, гистидина,
треонина, лизина, глутаминовой кислоты) и β-аланина
использовали аминокислоты (Serva, Германия), растворы с концентрацией аминокислот 6,8 ммоль/мл
готовили растворением точных навесок в бидистиллированной воде. Тирозин растворяли в дистиллированной воде с добавлением NaOH (0,1 моль/л).
Растворы хранили в течение двух недель в холодильнике при +4 °С. Рабочие растворы получали разбавлением стандартных непосредственно перед анализом.
Стандартный раствор (0,75 мг/мл) 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида (Sigma, 95 %)
готовили по точной навеске растворением в ацетонитриле на ультразвуковой бане УЗВ-4,0 (Сапфир,
Россия). Затем добавляли дистиллированную воду
до необходимого объема таким образом, чтобы
соотношение ацетонитрил: вода в приготовленном
растворе дансилхлорида составляло 7:3. Полученный
раствор использовали в день приготовления.
Согласно литературным данным полнота образования дансильных производных аминокислот
зависит от рН, температуры и времени проведения
реакции [5, 6]. В работе [7] было исследовано влияние
данных факторов на образование дансильных
производных серина, валина и лейцина. Следует
отметить, что при повышении температуры и в
микроволновом поле дансильные производные
образуются быстрее, но с меньшим выходом, чем
при комнатной температуре. Получение дансильных
производных аминокислот лучше проводить при
комнатной температуре в затемненном месте.
Несмотря на продолжительность дериватизации,
выход продуктов реакции в этом случае значительно
выше. Получение дансильных производных в
микроволновом поле может быть полезно для
автоматизации процесса, для on-line получения этих
производных, поскольку для дериватизации требуется
лишь пять минут.
Дансильные производные готовили непосредственно перед проведением эксперимента и использовали для анализа в течение суток по следующей
методике. В виалу вносили последовательно 100 мкл
аминокислоты с концентрацией 6,8 ммоль/л, 400 мкл
раствора дансилхлорида с концентрацией 0,75 мг/мл
и доводили объем раствора до 5 мл боратным
буфером с рН 9,6. Реагент добавляли в полуторном
молярном избытке по отношению к аминокислоте.
Реакцию проводили при комнатной температуре в
течение 50 мин в затемненном месте, затем
реакционную смесь вводили в колонку.
Для успешного определения дансильных
производных аминокислот методом обращеннофазовой ВЭЖХ с электрохимическим детектированием важно изучить электрохимические свойства
дансилхлорида, так как пик реагента может мешать
определению аминокислот. Методом вольтамперометрии с быстрой циклической разверткой потенциала
установлено, что дансилхлорид необратимо окисляется на углеситаловом электроде. Наибольший отклик
был получен при потенциале ячейки, равном
1200 мВ.
Окисление дансилхлорида на поверхности электрода возможно из-за наличия в его структуре электроактивной аминогруппы. После дансилирования
25
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
25000
а
1
Площадь пика
20000
2
15000
3
10000
4
5
5000
6
0
700
800
900 1000 1100 1200 1300
Потенциал, мВ
7000
6000
б
1
5000
Площадь пика
аминокислот аминогруппа переходит в молекулу
производного без изменения степени окисления, что
делает возможным детектирование дансильных
производных аминокислот по току окисления.
В работе изучено электрохимическое поведение
дансильных производных семнадцати аминокислот:
серина, валина, лейцина, фенилаланина, триптофана,
изолейцина, метионина, аспарагина, аргинина,
глицина, β-аланина, тирозина, цистина, гистидина,
треонина, лизина, глутаминовой кислоты. Из них
только четырнадцать дали отклик: производные
гистидина, цистина и глутаминовой кислоты
детектировать не удалось.
Для выбора оптимальных условий детектирования исследовано влияние величины потенциала
рабочего электрода (стеклоуглеродного) на величину
аналитического сигнала дансилхлорида и производных аминокислот. Величину потенциала варьировали в диапазоне 700 – 1300 мВ. На рис. 1
представлена зависимость интенсивности отклика
(площади хроматографического пика) дансильных
производных аминокислот от величины приложенного потенциала.
Из представленных зависимостей видно, что при
значении потенциала меньше 800 мВ на поверхности
стеклоуглеродного электрода окисляются только
дансильные производные триптофана, тирозина и
аргинина. При более высоком значении потенциала
происходит окисление и других производных
аминокислот. Интенсивный аналитический сигнал
дают производные триптофана, фенилаланина,
метионина и тирозина. Следует отметить, что
вышеперечисленные аминокислоты и в несвязанном
состоянии обладают электрохимической активностью.
Можно предположить, что окисление дансильных
производных этих аминокислот на поверхности
электродов связано с окислением как дансильного
остатка, так и электроактивных групп самих
аминокислот. Однако для более четкого представления о механизме окисления этих производных
необходимы дополнительные исследования.
Из рис. 1 видно, что для большинства изучаемых
аминокислот возможно амперометрическое детектирование и оптимальное значение потенциала
рабочего электрода составляет 1100 или 1200 мВ. Так
как шум базовой линии был меньше, а величина
отклика детектора для большинства аминокислот
была больше при 1100 мВ, именно этот потенциал
использовали для детектирования.
На примере метионина, лейцина, триптофана,
фенилаланина, треонина, аргинина проведено
сравнение чувствительности трех видов детектирования дансильных производных аминокислот:
амперометрического (“Цвет-Яуза”, Россия), спектро-
2
4000
3
3000
4
2000
6
1000
7
5
0
700
800
900 1000 1100 1200 1300
Потенциал, мВ
Рис. 1. Зависимо сти площадей пиков дансильных
производных аминокислот от потенциала рабочего
электрода: а — 1 — дансил-триптофан; 2 — дансилфенилаланин; 3 — дансил-лейцин; 4 — дансил-валин;
5 — дансил-аргинин; 6 — дансил-серин; б — 1 — дансилметионин; 2 — дансил-тирозин; 3 — дансил-глицин;
4 — дансил-изолейцин; 5 — дансил-аланин; 6 — дансилтреонин; 7 — дансил-аспарагин. Исходная концентрация
аминокислоты 0,15 мМ
фотометрического (λ = 325 нм) и флуориметрического (λвозб = 365 нм; λрегистр = 510 нм) (Shimadzu,
Япония). Для этого исследована зависимость
площади пика от концентрации аминокислоты в
диапазоне концентраций 0,05·10–8 – 1,36·10–4 М для
трех детекторов. Установлено, что во всех случаях
взаимосвязь между площадью хроматографического
пика дансилированных аминокислот и концентрацией
аминокислоты в растворе хорошо описывается
линейной зависимостью (R ≥ 0,995). Пределы
обнаружения, рассчитанные по 3s-критерию,
приведены в табл. 1. Полученные результаты
свидетельствуют о том, что чувствительность
амперометрического детектора на два порядка выше,
чем спектрофотометрического, и близка к чувствительности флуориметрического детектора. Сравнение
характеристик амперометрического и флуоресцентного детекторов показывает, что амперометрический
26
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
Таблица 1. Пределы обнаружения сmin, М производных аминокислот (3s-критерий; n = 3; р = 0,95)
Дансил-треонин
Дансил-аргинин
Дансил-метионин
Дансил-лейцин
Дансил-триптофан
Дансил-фенилаланин
спектрофотометрический
Детектор
амперометрический
3,0·10–7
9,8·10–9
2,1·10–7
2,9·10–9
2,2·10–7
2,1·10–7
9,4·10–8
1,3·10–7
8,0·10–10
1,0·10–9
8,7·10–10
7,4·10–10
детектор имеет ряд преимуществ: заметно более
низкую стоимость и менее жесткие требования к
реактивам, используемым при проведении анализа.
В фармацевтических препаратах на основе
комбинации аминокислот и лекарственных трав
наиболее часто содержатся следующие аминокислоты: треонин, глицин, лизин, аргинин, тирозин,
валин, метионин, изолейцин, лейцин, триптофан,
фенилаланин, поэтому авторами исследованы
условия разделения именно этих аминокислот.
Селективное и эффективное разделение дансильных
производных смеси более 10 аминокислот возможно
лишь в градиентном режиме элюирования, но это
затрудняет амперометрическое детектирование
разделяемых веществ. К преимуществам изократического элюирования относятся стабильность базовой
линии, что обеспечивает низкий уровень шумов, а
также лучшая воспроизводимость получаемых
результатов по сравнению с градиентным режимом.
В работе для разделения дансильных производных
аминокислот использовали изократический режим
подачи подвижной фазы.
Согласно литературным данным [8] для разделения дансилированных аминокислот используют
подвижные фазы, содержащие ацетонитрил и
фосфатный буферный раствор (pH 7,0). В варианте
обращенно-фазовой ВЭЖХ удерживание и селективность разделения определяют в основном гидрофобные взаимодействия сорбат — сорбент, поэтому
важным свойством сорбатов является гидрофобность. Для оценки гидрофобности дансильных
производных аминокислот использовали значения
коэффициентов распределения изучаемых молекул
между водой и октанолом (lgD), рассчитанные по
компьютерной программе ACDLabs (OAdvanced
Chemistry Development Inc., 1999 г.). Значения
коэффициентов распределения дансильных производных аминокислот в системе октанол — вода,
рассчитанные для pH 7,0, приведены ниже:
Производное аминокислоты
Дансил-глицин
Дансил-аргинин
lgD
–1,25
–0,96
флуориметрический
4,8·10–9
5,2·10–9
7,6·10–10
8,8·10–10
6,8·10–10
8,0·10–10
Производное аминокислоты
Дансил-лизин
Дансил-валин
Дансил-метионин
Дансил-тирозин
Дансил-треонин
Дансил-лейцин
Дансил-изолейцин
Дансил-фенилаланин
Дансил-триптофан
lgD
–0,14
0,0095
0,054
0,21
0,47
0,55
0,56
0,77
0,90
Зависимость фактора емкости производных
аминокислот от содержания ацетонитрила в подвижной фазе изучали на примере дансильных
производных валина, метионина, аргинина, тирозина,
триптофана и фенилаланина, которые заметно
отличаются по гидрофобности. Из рис. 2 видно, что
удерживание сорбатов зависит от их гидрофобности,
но в ряде случаев порядок элюирования отличается
от ряда гидрофобности. Например, удерживание
дансильного производного тирозина заметно меньше,
чем производных валина и метионина, имеющих
меньшую гидрофобность. Авторы полагают, что это
связано с наличием в структуре амино- и гидроксогрупп, которые при pH 7,0 могут образовывать
60
50
Фактор емкости k
Производное
аминокислоты
40
30
20
1
3
4
2
5
6
10
0
15
20
25
30
Концентрация ацетонитрила в элюенте, % объемн.
Рис. 2. Зависимость фактора емкости дансильных
производных аминокислот от содержания ацетонитрила
в подвижной фазе: 1 — дансил-фенилаланин; 2 — дансилтриптофан; 3 — дансил-метионин; 4 — дансил-валин;
5 — дансил-тирозин; 6 — дансил-аргинин. Концентрация
фосфатного буферного раствора 2 мМ (рН 7)
27
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
Таблица 2. Хроматографические параметры разделения дансильных производных аминокислот
Производное
аминокислоты
Фактор
емкости
Число теоретических
тарелок на метр
Коэффициент
селективности
Разрешение
Подвижная фаза — 17 % ацетонитрила, 83 % фосфатного буферного раствора (2·10–3 М)
Дансил-треонин
12,8
19400
1,12
Дансил-глицин
14,4
9590
1,12
Дансил-лизин
17,2
13260
1,08
Дансил-аргинин
18,5
19130
1,02
Дансил-тирозин
18,8
17500
Подвижная фаза — 25 % ацетонитрила, 75 % фосфатного буферного раствора (2·10–3 М)
Дансил-валин
6,2
5500
1,19
Дансил-метионин
7,4
5710
1,24
Дансил-изолейцин
10,1
6900
1,10
Дансил-лейцин
11,0
8900
1,30
Дансил-триптофан
14,0
8740
1,11
Дансил-фенилаланин
15,4
8620
внутримолекулярные водородные связи. В соответствии со значениями факторов емкости аминокислоты
разделили на слабоудерживаемые и сильноудерживаемые. К слабоудерживаемым отнесли треонин,
глицин, лизин, аргинин, тирозин, к сильноудерживаемым — валин, метионин, изолейцин, лейцин, триптофан, фенилаланин. Показано, что при содержании
в элюенте 17 % ацетонитрила достигается наилучшее
разрешение менее удерживаемых и гидрофобных
дансильных производных аминокислот, для разделения более гидрофобных оптимальной является
подвижная фаза (25:75) ацетонитрил – фосфатный
буферный раствор. Хроматографические параметры
разделения стандартных смесей аминокислот приведены в табл. 2. Разделение смеси всех аминокислот
целесообразно проводить в два этапа, используя два
элюента.
Установлено, что концентрация (2 – 10 мМ)
фосфатного буферного раствора в подвижной фазе
незначительно влияет на удерживание и селективность
изучаемых соединений. Для разделения использовали
подвижную фазу с концентрацией фосфатного
буферного раствора 2 мМ.
Проведенные исследования показали, что
сочетание обращенно-фазовой ВЭЖХ и амперометрического детектирования позволяет успешно
анализировать смеси аминокислот в виде дансильных
производных. Разработанная методика была использована для определения аминокислот в препарате
“Долголет”. Долголет — биологически активная
добавка, которая нормализует обменные процессы,
регулирует углеводный обмен, предупреждает
развитие сахарного диабета. Таблетка “Долголет”
содержит минералы и микроэлементы, аминокислоты
(аргинин, фенилаланин, триптофан, лейцин, изолейцин, метионин, валин, треонин, гистидин и лизин),
1,08
1,01
0,80
0,60
1,12
1,33
0,67
1,97
0,80
витамины (В1, В2, В6, С, РР), инулин, пептин, липиды,
органические кислоты.
На примере искусственной смеси аминокислот,
соответствующей по составу препарату, проведена
оценка правильности (методом “введено-найдено”)
и воспроизводимости результатов определения
аминокислот в смеси (табл. 3). Полученные данные
свидетельствуют о хорошей воспроизводимости
предлагаемой методики и подтверждают правильность
результатов анализа.
Таблица 3. Результаты определения аминокислот
в искусственной смеси (n = 3; р = 0,95), мг/л
Аминокислота
Лизин
Аргинин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Триптофан
Фенилаланин
Добавлено
Найдено
sr
9,6 ± 0,5
9,1 ± 0,4
11,1 ± 0,7
4,1 ± 0,3
7,9 ± 0,5
10,7 ± 0,6
7,4 ± 0,4
10,0 ± 0,5
8,9 ± 0,4
10,7 ± 0,5
4,3 ± 0,2
8,1 ± 0,5
10,5 ± 0,7
7,8 ± 0,5
0,03
0,02
0,02
0,02
0,03
0,04
0,03
Анализ препарата “Долголет” включает в себя
пробоподготовку, получение производных аминокислот и их хроматографическое разделение и
определение.
Пробоподготовку образца проводили следующим
образом: навеску порошка растертых таблеток
препарата (масса 2 г) помещали в кювету для
центрифугирования. Образец растворяли в 10 мл
дистиллированной воды, перемешивали на ультразвуковой бане в течение 10 мин, затем центрифугировали в 5 мин на центрифуге с ускорением 8000g.
Жидкость аккуратно декантировали и центрифугировали повторно в течение 30 мин. Полученный
28
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» № 4. 2007. Том 73
раствор фильтровали через мембранный фильтр Millex
HV (Millipore) с диаметром пор 0,45 мкм. Из
прозрачного раствора отбирали аликвоту 1 мл и
проводили реакцию дериватизации дансилхлоридом
в боратном буферном растворе с рН 9,6. После
дериватизации полученный раствор (20 мкл) вводили
в хроматограф.
Идентификацию аминокислот осуществляли по
временам удерживания индивидуальных соединений,
достоверность результатов подтверждали методом
“введено-найдено”. Определение проводили методом
внешнего стандарта. Правильность результатов была
подтверждена независимым методом: ВЭЖХ после
дериватизации аминокислот препарата органическим
реагентом орто-фталевый альдегид/N-ацетил-Lцистеин (ОФА/НАЦ) с последующим разделением в
режиме градиентного элюирования с флуориметрическим детектором [9]. Результаты определения
аминокислот в препарате “Долголет” приведены в
табл. 4. Хроматограммы образца представлены на
рис. 3. Разделение аминокислот проводили на колонке
Hypersil BDS-C18 (125 × 4 мм). Подвижные фазы:
25 % ацетонитрил, 75 % 2 мМ фосфатный буферный
раствор (рН 7,0) (см. рис. 3, а); 17 % ацетонитрил,
83 % 2 мМ фосфатный буферный раствор (рН 7,0)
(см. рис. 3, б).
Таблица 4. Результаты определения аминокислот
в лекарственном препарате “Долголет” (n = 3; р = 0,95)
Аминокислота
Найдено,
мг/табл
Содержание,
мг/табл
(независимый
метод)
Лизин
Аргинин
Изолейцин
Лейцин
Фенилаланин
Триптофан
Валин
Гистидин
Треонин
Метионин
0,05 ± 0,01
2,8 ± 0,2
0,04 ± 0,01
0,08 ± 0,02
0,19 ± 0,05
0,08 ± 0,03
0,05 ± 0,01
Не детектируется
Не обнаружен
"
"
0,04 ± 0,01
3,0 ± 0,3
0,06 ± 0,01
0,10 ± 0,02
0,23 ± 0,06
0,13 ± 0,02
0,06 ± 0,01
0,17 ± 0,03
0,020 ± 0,003
0,005 ± 0,002
Из заявленных аминокислот в исследованном
образце БАД “Долголет” не найдены гистидин (дансил-гистидин не детектируется амперометрически),
метионин и треонин. Эти аминокислоты содержатся
в таблетке в малом количестве и обнаруживаются
лишь при использовании более чувствительного
флуориметрического детектора (см. табл. 4).
Достоинствами методики определения дансилированных аминокислот методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием являются высокая
а
б
Рис. 3. Хроматограммы образца препарата “Долголет”:
а — 1 — дансилхлорид; 2 — дансил-валин; 3 — дансилизолейцин; 4 — дансил-лейцин; 5 — дансил-триптофан;
6 — дансил-фенилаланин; б — 1 — дансилхлорид; 2 —
неиндентифицированное соединение; 3 — дансил-лизин;
4 — дансил-аргинин. Скорость потока — 0,6 мл/мин,
амперометрический детектор (Е = 1100 мВ)
чувствительность и отсутствие мешающего влияния
витаминов, которые также входят в состав препарата.
Витамины элюируются вместе с системным пиком,
так как гидрофобность этих молекул гораздо меньше,
чем дансильных производных аминокислот. Разработанная методика аминокислотного анализа может
быть легко внедрена в медицинских и фармацевтических лабораториях, которые, как правило,
оснащены жидкостными хроматографами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. — В кн.:
Биохимия человека. — М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 21.
2. Moodie I.M., Shephard G.S., Labadarios D. / J. High
Resolut. Chromatogr. B. 1989. V. 12. P. 509 – 516.
3. Schuster R. / J. Chromatogr. 1988. V. 431. P. 271 – 284.
4. Fekkes D. / J. Chromatogr. B. 1996. V. 682. P. 3 – 22.
5. Bayer E., Grom E., Kaltenegger B. / Anal. Chem. 1976.
V. 48. P. 1106 – 1109.
6. Zhou J., Lunte S.M. / Anal. Chem. 1995. V. 67. P. 13 – 16.
7. Шунина М.В., Чернобровкин М.Г., Башилов А.В.,
Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А. / Вестник МГУ.
Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. № 4. С. 262 – 265.
8. Sanz M.A., Gastillo G., Hernandez A. / J. Chromatogr.
A. 1996. V. 719. P. 195 – 201.
9. Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н.,
Шпигун О.А. / ЖАХ. 2004. Т. 59. № 1. С. 64 – 72.