Trichoderma koningii, A-1 Basidiomycetes, 12

VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ
МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ФУЗАРИОЗА СОИ НА ФОНЕ
ИСКУССТВЕННОГО ЗАРАЖЕНИЯ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ
Курилова Д.А.
350038, Краснодар, ул. Филатова, 17
ГНУ ВНИИ масличных культур им. В.С. Пустовойта Россельхозакадемии
biometod@yandex.ru
Представлены результаты изучения защитного эффекта и колонизирующей
активности перспективных штаммов антагонистов фузариоза сои на жестком фоне
искусственного заражения в лабораторных условиях. Установлены оптимальные
нормы расхода опытных образцов микробиопрепаратов на основе эффективных
штаммов-продуцентов.
Введение. Успешность микробиологического метода во многом определяется
выбором микроорганизмов-антагонистов, способных обеспечить эффективную защиту
в течение вегетационного периода.
При разработке микробиопрепаратов полифункционального типа действия следует учитывать, что потенциальный штамм-продуцент должен не только проявлять
антифунгальные свойства in vitro, а также оказывать положительное влияние на рост
и развитие культуры, но и обеспечивать эффективную защиту семян и проростков в
лабораторных и полевых условиях.
Согласно концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов [1],
осуществлён ступенчатый скрининг штаммов грибов и бактерий-антагонистов из
коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к наиболее патогенному изоляту возбудителя фузариоза сои Fusarium sporotrichiella var. рoae в лабораторных условиях. По
результатам первичного скрининга было отобрано 7 наиболее активных штаммов не
токсичных к культуре сои: Хk-1 Chaetomium olivacium, Sm-1 Sordaria macrospora, Tk-1
Trichoderma koningii, A-1 Basidiomycetes, 12-2 Pseudomonas sp., 14-3 Pseudomonas
chlororaphis и Б-5 Bacillus licheniformis, которые проявили высокую активность in vitro,
а также оказали явное ростостимулирующее влияние на проростки сои [2, 3].
Целью данной работы было выявление среди выделенных на первом этапе
скрининга перспективных штаммов антагонистов наиболее активных агентов биологической защиты сои от фузариоза на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях.
Материалы и методы. Объектом исследований служили штаммы грибов и
бактерий антагонистов: Хk-1 Chaetomium olivacium, Sm-1 Sordaria macrospora,
Tk-1 Trichoderma koningii , A-1 Basidiomycetes , 12-2 Pseudomonas sp ., 14-3
P. chlororaphis, Б-5 Bacillus licheniformis; возбудитель фузариоза сои
F. sporotrichiella var. poae; соя сорта Ника и Вилана.
Защитный эффект опытных образцов микробиопрепаратов прорастающего
семени сои и подбор оптимальных норм их применения определяли на фоне искусственного заражения F. sporotrichiellavar. poae в лабораторных условиях во влажной
камере методом агаровых блоков [4]. Для опытных образцов микробиопрепаратов на
основе бактериальных штаммов испытывались нормы от 0,5 до 3,0 л/т, на основе
грибных – от 2,0 до 4,0 л/т. Контроль – чистые семена с нанесением инфекции. Опыт
проводили при температуре 25 °С. Титр опытных образцов микробиопрепаратов
(число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл) определяли методом Коха [5], состоящего из трёх этапов: приготовление разведений, посев суспензии из соответствующего разведения на питательную среду в чашки Петри (ЧП) и подсчет выросших
колоний. Для этого 1,0 мл ЖК стерильной пипеткой переносили в колбу с 99,0 мл сте109
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
рильной воды и ставили на качалку на 10-15 минут. Из полученной суспензии готовили разведение от 1 : 10 до 1 : 1000000000. Суспензию из соответствующего разведения закапывали по 1,0 мл в 3 чашки Петри (ЧП). Затем заливали в чашки по
15,0-20,0 мл агаризированной среды, остуженной до 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями. ЧП ставили
в термостат с оптимальной температурой и через 5-7 дней считали среднее число
колоний в трёх ЧП по формуле:
Т
, где
Т – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл;
а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева;
10n – коэффициент разведения.
Биологическую эффективность опытных образцов микробиопрепаратов определяли по формуле [6]:
С
х
, где
C – биологическая эффективность, %;
a – количество больных проростков в контроле;
b – количество больных проростков в варианте.
Для определения колонизирующей активности и защитного эффекта штаммов антагонистов корней проростков сои использовали модифицированные нами
методические рекомендации по оценке и отбору растений подсолнечника на устойчивость к фузариозной корневой гнили [7]. Для этого двухдневные проростки сои,
полученные при проращивании семян, обработанные опытными образцами микробиопрепаратов, размещали в отверстия перфорированных чашек Петри так, чтобы
кончики корней касались колонии патогенного изолята (время выдержки шесть часов при температуре 22-25 ºС). В контрольном варианте кончики корней сои касались фильтровальной бумаги, увлажнённой стерильной водой. Затем инфицированные и контрольные проростки выдерживали в условиях влажной камеры. Оценку
степени поражения проростков возбудителем фузариоза проводили согласно разработанной нами шкале:
«0» – здоровые проростки;
«1» – образование утолщения на главном корне с последующим нормальным ростом, боковые корни развиты хорошо;
«2» – потемнение кончика и замедление роста главного корня, интенсивное развитие боковых корней;
«3» – образование утолщения на главном корне, дальнейший рост слабый, боковые
корни развиты слабо;
«4» – загнивание главного корня на половину, дальнейшего роста нет, боковые
корни развиты слабо;
«5» – полное загнивание главного корня, дальнейшего роста нет, боковые корни
отсутствуют.
1-3 балла – жизнеспособные проростки;
4-5 баллов – нежизнеспособные проростки.
Результаты и обсуждение. На фоне поражения фузариозом в контроле
58,6% все штаммы показали защитный эффект (табл. 1).
Максимальная биологическая эффективность установлена у штаммов: 12-2
Pseudomonas sp. с нормой расхода 1,0 л/т (65,9%), Хk-1 Ch. olivaceum с нормой
расхода 3,0 л/т (59,0%), 14-3 P. chlororaphis с нормой расхода 2,0 л/т (52,2%).
110
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
Также высокая эффективность отмечена у Tk-1 Tr. koningii с нормой расхода
4,0 л/т (49,8%), Sm-1 S. macrospora с нормой расхода 4,0 л/т и Б-5 B.
licheniformis с нормой расхода 4,0 л/т (47,6%).
Таблица1 – Биологическая эффективность обработки семян сои сорта Ника
опытными образцами биопрепаратов на основе
штаммов антагонистов на фоне искусственного заражения
F. sporotrichiella var. poae в лабораторных условиях,
в зависимости от нормы расхода биопрепаратов
Вариант
Контроль + инфекция
ТМТД, ВСК, эталон
Xk-1Chaetomium olivaceum, ВС
Sm-1 Sordaria macrospora, ВС
Tk-1 Trichoderma koningii, ЖК
A-1 Basidiomycetes, ВС
Б-5B. licheniformis, ЖК
12-2 Pseudomonas sp., ЖК
14-3 P. chlororaphis, ЖК
Норма расхода,
л/т
6,0
2,0
3,0
4,0
2,0
3,0
4,0
2,0
3,0
4,0
2,0
3,0
4,0
1,0
2,0
3,0
0,5
1,0
2,0
1,0
2,0
3,0
Поражено фуза- Биологическая
риозом, % эффективность, %
58,6
20,0
65,9
43,4
25,9
24,0
59,0
40,0
31,7
51,7
11,8
36,0
38,6
30,7
47,6
38,7
34,0
32,0
45,4
29,4
49,8
44,0
24,9
48,0
18,1
38,7
34,0
36,0
38,6
32,0
45,4
30,7
47,6
41,4
29,9
20,0
65,9
54,7
6,6
29,4
49,8
28,0
52,2
46,7
20,3
Эффективность биологического агента во многом определяется не только
его способностью обеспечивать защиту семян, но и колонизировать растущий
корень. Продвижение ризосферной микрофлоры в более глубокие слои почвы
связано с тем, что она следует за растущим корнем, выделяющим питательные
вещества, одновременно стимулируя выделение экзометаболитов растений [5].
Установлена колонизирующая активность перспективных штаммов антагонистов против возбудителя фузариоза (рис.) (табл. 2).
111
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
а
в
б
Рисунок – Колонизирующая активность штаммов антагонистов корней
проростков сои на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза
F. sporotrichiella var. poae во влажной камере (ориг.)
a – контроль с инфекцией;
б – контроль без инфекции;
в – вариант (инфицированные проростки, полученные из семян, обработанных ЖК штамма 14-3 P. chlororaphis).
Таблица 2 – Биологическая эффективность обработки семян сои
сорта Вилана опытными образцами биопрепаратов
на основе штаммов антагонистов на фоне искусственного
заражения F. sporotrichiellavar. рoae в лабораторных условиях
во влажной камере
Вариант
Контроль без инфекции
Контроль с инфекцией
12-2Pseudomonas sp., ЖК
14-3 P. chlororaphis, ЖК
Б-5B. licheniformis, ЖК
Tk-1Trichoderma koningii, ЖК
A-1Basidiomycetes, ВС
Sm-1Sordaria macrospora, ВС
Xk-1Chaetomium olivaceum, ВС
Здоровые
проростки,
%
100
0
0
20,0
15,0
0
0
20,0
5,0
Поражено проростков, %
жизнеспособные
нежизнеспособные
0
0
40,0
60,0
40,0
20,0
0
20,0
35,0
0
100
60,0
20,0
45,0
80,0
100
60,0
60,0
Биологическая эффективность, %
40,0
80,0
55,0
20,0
0
40,0
40,0
Максимальную колонизирующую активность и одновременно защитный эффект на жестком (100%) фоне заражения F. sporotrichiella var. poae проявили штаммы бактерий 14-3 P. chlororaphis и Б-5 B. licheniformis. Также высокую колонизирующую активность проявили штаммы Sm-1 S. macrospora и Xk-1 Ch. olivaceum. В этих
вариантах от 40,0 до 80,0% проростков оказались жизнеспособны (степень поражения корня 0-3 балла), тогда как в контрольном варианте жизнеспособных проростков не обнаружено (степень поражения корня 4-5 баллов).
Заключение. В результате проведённых исследований был определён защитный эффект прорастающих семян сои от фузариоза и колонизирующая активность
112
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
перспективных штаммов антагонистов, а также установлены оптимальные нормы
расхода опытных образцов микробиопрепаратов на основе изучаемых штаммов.
Максимальный защитный эффект сои от фузариоза установлен у штаммов:
12-2 Pseudomonas sp. с нормой расхода 1,0 л/т (65,9%), Хk-1 Ch. olivaceum с нормой
расхода 3,0 л/т (59,0%), 14-3 P. chlororaphis с нормой расхода 2,0 л/т (52,2%). Максимальную колонизирующую активность и одновременно защитный эффект на жестком фоне заражения сои F. sporotrichiella var. poae проявили штаммы бактерий
14-3 P. chlororaphis и Б-5 B. licheniformis. Также высокую колонизирующую активность проявили штаммы Sm-1 S. macrospora и Xk-1 Ch. olivaceum.
Благодарности. Работа выполнена под руководством доктора биологических наук Маслиенко Л.В., при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-0800726-а и программы У.М.Н.И.К., государственный контракт №14046.
Литература
1. Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода
борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. … док.биол. наук. / Маслиенко
Любовь Васильевна. – Краснодар, 2005. – 49 с.
2. Маслиенко Л.В., Курилова Д.А., Асатурова А.М., Шипиевская Е.Ю. Первичный
скрининг штаммов грибов и бактерий антагонистов к возбудителю фузариоза сои //
Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИ маслич. культур. – Краснодар, 2009. –
Вып. № 1 (140). – С. 114-119.
3. Маслиенко Л.В., Курилова Д.А., Асатурова А.М., Шипиевская Е.Ю. Влияние
лабораторных образцов биопрепаратов на основе перспективных штаммов антагонистов фитопатогенов на проростки сои // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИ
маслич. культур. – Краснодар, 2010. – Вып. № 1 (142-143). – С. 104-108.
4. Зайчук В.Ф. Об устойчивости подсолнечника к гнилям // Маслич. культуры. –
1983. – № 1. – С. 16-17.
5. Практикум по микробиологии / Ф.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук
[и др.]. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 608 с.
6. Груздев Г.С. Практикум по химической защите. – М.: Колос, 1983. – 230 с.
7. Антонова Т.С., Саукова С.Л. Методические рекомендации по оценке и отбору
растений подсолнечника на устойчивость к фузариозной корневой гнили, вызываемой Fusarium sporotrichiella var. sporotrichioides Sherb // ВНИИ маслич. культур. –
Краснодар, 2005. – 20 с.
THE EFFICIENCY OF PERSPECTIVE PRODUCER STRAINS
OF MICROBIOLOGICAL PRODUCTS AGAINST SOYBEAN FUSARIUM
IN THE LABORATORY CONDITIONS OF ARTIFICIAL INFECTION
Kurilova D.A.
The article presents the results of study of the protective effect and the colonizing
activity of perspective antagonist strains of soybean Fusarium in the laboratory conditions
of artificial infection. In addition, the optimum consumption rates of check samples of microbiological products were determined on the basis of effective producer strains.
113