Л.В. Маслиенко, Д.А. Курилова, Е.Ю. Шипиевская, А

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
___________________________________________
Л.В. Маслиенко,
доктор биологических наук
Д.А. Курилова,
младший научный сотрудник
Е.Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
А.М. Асатурова,
кандидат биологических наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17,
тел. (861)275-85-19, факс (861)259-44-23
e-mail:biometod@yandex.ru
ВЛИЯНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ОБРАЗЦОВ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ
ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕНОВ
НА ПРОРОСТКИ СОИ
Ключевые слова: соя, скрининг, штаммы, грибы, бактерии, антагонисты, фитотоксичность,
ростостимуляция, фузариоз
УДК 632.937:633.853.52
Введение. Соя является ценной белково-масличной культурой. В мировом производстве
растительного масла эта культура занимает первое место среди всех масличных растений [1]. Осо-
бую опасность для сои представляет фузариоз, поражение которым приводит к существенному снижению урожая и качества масла. Для снижения вредоносности фузариоза на сое необходимо проведение комплексных мероприятий, включающих применение микробиопрепаратов. Преимуществом
микробиопрепаратов является их экологичность, специфичность действия, способность восстанавливать природные регуляторные механизмы в агробиоценозах, возможность решения проблем резистентности популяций фитопатогенов к пестицидам. Кроме того, на сое это приобретает ещѐ
большее значение, так как биоагенты – продуценты микробиопрепаратов не подавляют жизнедеятельность азотфиксирующих бактерий. При этом использование микробиопрепаратов может преследовать различные цели: защиту растений и урожая от фитопатогенов, стимуляцию прорастания
семян и роста растений, улучшение питания растений, получение компостов, супрессирующих возбудителей корневых гнилей растений и т.д. [2, 3].
С целью разработки микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на сое была протестирована коллекция перспективных штаммов грибов и бактерий-антагонистов лаборатории биометода ВНИИМК, включающая 24 штамма грибов и 26 штаммов бактерий антагонистов [4,
5, 6]. В результате ступенчатого скрининга было отобрано 10 перспективных биоагентов, среди которых 6 штаммов грибов родов Trichoderma, Sordaria, Penicillium, Chaetomium и класса
Basidiomycetes, а также 4 штамма бактерий родов Pseudomonas и Bacillus [7, 8].
Создание эффективных биологических средств защиты растений предполагает исследование на
возможное фитотоксическое действие и выявление рострегулирующих свойств потенциальных агентов
биоконтроля фитопатогенов. Поэтому целью настоящей работы являлось определение фитотоксичности
и ростостимулирующей активности к проросткам сои перспективных штаммов антагонистов.
Материалы и методы. Объектами исследования являлись активные штаммы грибов и бактерий антагонистов: Tk-1 Trichoderma koningii, Tv-2 Trichoderma viride, Sm-1 Sordaria macrospora,
A-1 Basidiomycetes, Pv-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium, Хk-1 Chaetomium olivacium, 12-2
Pseudomonas sp., 14-3 Pseudomonas sp., Sgrc-1 P. fluorescens и Б-5 Bacillus licheniformis.
Микробы-антагонисты, а так же лабораторные образцы биопрепаратов на их основе, культивировали на жидких и твердых питательных средах (картофельно-сахарозном агаре, Кинга В, Тайлона-3, Рудакова, стерильных семянках подсолнечника) при оптимальных условиях [4, 5, 6].
У всех лабораторных образцов биопрепаратов определяли титр – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл. Для этого 1,0 мл препарата стерильной пипеткой переносили в колбу с 99,0 мл стерильной воды и ставили на качалку на 10 минут. Из полученной суспензии готовили
разведение от 1 : 10 до 1 : 1000000000. Суспензию из соответствующего разведения закапывали по
1,0 мл в 3 чашки Петри (ЧП). Затем заливали в чашки по 15-20 мл среды, расплавленной и остуженной до + 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями. ЧП ставили в термостат с оптимальной температурой и через 5-7 дней считали
среднее число колоний в 3 ЧП. Титр вычисляли по формуле:
Т = a х 10n ,
V
где
Т – количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1,0 мл;
а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева;
10n – коэффициент разведения.
Титр лабораторных образцов бактериальных биопрепаратов составлял 1010-12 КОЕ/мл, грибных – 103-8 КОЕ/мл.
Определение фитотоксичности проводили методом обработки семян. Семена сои обрабатывали жидкими культурами (ЖК) и водными суспензиями (ВС) лабораторных образцов биопрепаратов с подобранными ранее оптимальными нормами расхода и ставили на проращивание в рулоны из
фильтровальной бумаги при температуре + 25 °С. Контроль – семена, обработанные стерильной
водой. Учѐт проводили на 10-е сутки проращивания. По количеству проросших семян в контроле и
в вариантах судили о фитотоксичности штаммов.
Для изучения влияния антагонистов на увядание проростков сои активные штаммы антагонистов выращивали на агаризированной питательной среде 10 суток. Суспензию готовили путѐм
смыва стерильной водой из расчѐта 100 мл воды на одну ЧП. Титр бактериальной водной суспензии
составлял 1010-12 КОЕ/мл, грибной – 103-8 КОЕ/мл. В химические стаканы с водной суспензией
штаммов антагонистов помещали здоровые семидневные проростки сои с подрезанной корневой
системой. Контроль – проростки сои с подрезанной корневой системой, помещенные в стерильную
воду. Учѐт проводили на 5-е сутки. По количеству увядших растений в контроле и вариантах судили
о фитотоксичности активных штаммов антагонистов.
С целью определения ростостимулирующего влияния перспективных штаммов на проростки
сои семена обрабатывали микробиопрепаратами и помещали на проращивание в рулоны из фильтровальной бумаги на 7 суток при температуре + 25 ºС. Параметрами для последующего анализа
служили длина и масса корня и побега.
Результаты и обсуждение. Установлено, что обработка семян лабораторными образцами
биопрепаратов на основе тестируемых штаммов не оказывает негативного влияния на всхожесть.
Более того, во всех вариантах отмечено повышение всхожести семян по сравнению с контролем на
9-20 %.
При изучении фитотоксичности перспективных штаммов грибов и бактерий-антагонистов к
проросткам сои отмечено активное развитие побегов и предварительно поврежденных корней как в
вариантах, так и в контроле. Подрезанные боковые корни оставались здоровыми. В течение 10 суток
не отмечено гибели ни одного проростка. Таким образом, исследование возможного токсического
воздействия водных суспензий активных штаммов антагонистов показало, что тестируемые штаммы
не вызывают гибели или увядания проростков. Кроме того, в процессе определения фитотоксичности грибов и бактерий антагонистов замечено, что некоторые из штаммов обладают стимулирующим воздействием. Выявлено, что в вариантах с Tv-2 Trichoderma viride, Tk-1 T. koningii, Xk-1
Chaetomium olivacium, A-1 Basidiomycetes, 12-2 Pseudomonas sp., 14-3 Pseudomonas sp. и Sgrc-1 P.
fluorescens по сравнению с контролем побеги были более длинные и развитые, крепче и толще у
основания. В вариантах Xk-1 Chaetomium olivacium, Tk-1 T. koningii и 14-3 Pseudomonas sp. на 5-е
сутки у большинства проростков наблюдалось формирование первого тройчатосложного листа.
а
б
в
Рисунок 1 – Влияние водных суспензий перспективных штаммов грибов и бактерийантагонистов на проростки сои
а – контроль (проростки в стерильной воде);
б – проростки в грибной суспензии ТК-1 Trichoderma koningii;
в – проростки в бактериальной суспензии 14-3 Pseudomonas sp.
Изучение ростостимулирующего действия перспективных штаммов антагонистов на проростки сои при обработке семян показало, что наиболее сильное влияние штаммы оказывали на длину
и массу корня (табл. 1).
Таблица 1 – Влияние обработки семян лабораторными образцами биопрепаратов
на основе перспективных штаммов антагонистов на проростки сои
Длина корня
Контроль
12-2 Pseudomonas sp., ЖК
Sgrc-1 P. fluorescens, ЖК
14-3 Pseudomonas sp., ЖК
Б-5 Bacillus licheniformis, ЖК
Tk-1 Trichoderma koningii, ЖК
Tv-2 Trichoderma viride, ЖК
Xk-1 Chaetomium olivacium, ВС
Sm-1 Sordaria macrospora, ВС
A-1 Basidiomycetes, ВС
8,35
8,99
8,71
9,81
9,36
10,19
10,20
10,45
9,08
10,01
в%к
контролю
7,7
4,3
17,5
12,1
22,0
22,2
25,2
8,7
19,9
Pv-3 Penicillium verrucosum var. cyclopium, ЖК
8,35
0
НСР05
1,35
Вариант
см
Масса корня
0,15
0,18
0,15
0,17
0,15
0,16
0,15
0,18
0,14
0,16
в%к
контролю
20,0
0
13,3
0
6,7
0
20,0
0
6,7
0,14
0
г
0,01
Длина побега
Масса побега
9,13
9,88
8,93
9,37
9,69
10,18
9,17
9,76
5,21
9,12
в%к
контролю
8,2
0
2,6
6,1
11,5
0,4
6,9
0
0
0,82
0,90
0,83
0,87
0,88
0,86
0,85
0,89
0,72
0,84
в%к
контролю
9,8
1,2
6,1
7,3
4,9
3,7
8,5
0
2,4
7,67
0
0,78
0
см
1,27
г
0,06
Также существенное увеличение длины корня проростков наблюдалось при обработке семян
сои биопрепаратами на основе штаммов грибов Tv-2 Trichoderma viride и Tk-1 T. koningii (на 22,0 и
22,2 % соответственно). Существенное увеличение массы корня проростков установлено при обработке семян биопрепаратами на основе бактериальных штаммов 12-2 и 14-3 Pseudomonas sp. (на
13,3 и 20,0 % соответственно) (табл. 1). Увеличение массы корня проростков происходило за счет
интенсивного развития главного и боковых корней (рис. 2).
Рисунок 2 – Ростостимулирующее влияние перспективных штаммов антагонистов на проростки сои
а – контроль; б – вариант (на примере
штамма Xk-1 Chaetomium olivaceum)
Существенного влияния штаммов антагонистов на длину и массу побегов сои не отмечено.
Выводы. 1. Все испытанные лабораторные образцы биопрепаратов на основе
активных штаммов грибов и бактерийантагонистов не оказывали фитотоксичеа
б
ского влияния на семена и проростки сои.
2. Установлено ростостимулирующее влияние перспективных штаммов антагонистов на
проростки сои. Максимальное увеличение длины и массы корня отмечено у штаммов Xk-1 Chaetomium
olivacium, Tv-2 Trichoderma viride, Tk-1 T. koningii, 12-2 Pseudomonas sp. и 14-3 Pseudomonas sp.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-08-00726-а.
Список литературы
1. Соя: биология и технология возделывания / Под ред. В. Ф. Баранова, В. М. Лукомца. –
Краснодар: Изд-во «Советская Кубань», 2005. – 433 с.
2. Боронин, А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений / А.М. Боронин // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 10. – С. 25-31.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
___________________________________________
3. Соколов, М.С. Биологизация и биобезопасность защиты растений в ХХI веке в России /
М.С. Соколов // Актуальные вопросы биологизации защиты растений: Сборник трудов, посвящѐнный 40-летию института ВНИИ биологической защиты растений. – Пущино, 2000. – С. 28.
4. Маслиенко, Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дис. … док. биол. наук / Любовь Васильевна Маслиенко. – Краснодар, 2005. – 49 с.
5. Шипиевская, Е.Ю. Разработка биологического метода защиты подсолнечника от фомопсиса: автореф. дис. … канд. биол. наук. / Елена Юрьевна Шипиевская. – Краснодар, – 2006. – 26 с.
6. Асатурова, А.М. Перспективные штаммы бактерии – продуценты микробиопрепаратов
для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике: автореф. дис. … канд. биол. наук / Асатурова Анжела Михайловна. – СПб, – 2009. – 22 с.
7. Маслиенко, Л. В. Первичный скрининг штаммов грибов и бактерий антагонистов к возбудителю фузариоза сои / Л.В. Маслиенко, Д.А. Курилова, Е.Ю. Шипиевская и др. // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИ маслич. культур. – Краснодар, 2009. – Вып. № 1 (140).– С. 114-119.
8. Маслиенко, Л.В. Скрининг штаммов грибов и бактерий – антагонистов возбудителей фузариоза
сои / Л.В. Маслиенко, Д.А. Курилова, А.М. Асатурова и др. // XII съезд товарищества микробиологов
Украины им. С.М. Виноградского: тезисы докладов (25-30 мая 2009 г.). – Ужгород, 2009. – С. 389.