Реакция транскрипционной амплификации NASBA в алгоритме р

Реакция транскрипционной
амплификации
NASBA в алгоритме
р
обследований пациентов на
ИППП
Гущин А.Е.
Лаборатория молекулярной диагностики и
эпидемиологии инфекций органов
репродукции
ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
г. Москва
ос а
Возбудители ИППП, выявление которых
является основанием для назначения
лечения
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Trichomonas vaginalis
Mycoplasma genitalium
Возбудители ИППП и наиболее
частые клинические синдромы
Уретрит
N.gonorrhoeae
Эпидидимит
Ct
C.trachomatis
h
ti
Цервицит
T.vaginalis
M.genitalium
Э
Эндометрит
Сальпингит
Вагинит
Конъюнктивит
Фарингит
Проктит
Общая характеристика
урогенитальных инфекций
Отсутствие специфических клинических
признаков;
Стертая клиническая симптоматика,
высокая частота бессимптомного течения;;
Разнообразие клинических форм;
Риск развития осложнений на фоне
бессимптомного течения;;
Диагноз инфекции устанавливается
только на основании результатов
лабораторных исследований;
Прямое обнаружение возбудителя –
наиболее бесспорное
доказательство инфекции;
«Классические» методы идентификации
возбудителей ИППП
Возбудитель
у
Лабораторные тесты
N.gonorrhoeae
Микроскопия, бактериологическое иссл.
C.trachomatis
T.vaginalis
ПИФ, бактериологическое исследование,
ИФА
Микроскопия, культуральное иссл.
M
M.genitalium
it li
отсутствуют
Ни один из методов не обладает 100%100%чувствительностью и 100%
специфичностью
Из--за ограничений самого метода
Из
(
(аналитическая
чувствительность/специфичность);
Из--за вероятности внутри
Из
лабораторных ошибок;
Из--за той или иной степени
Из
субъективности интерпретации
результатов;
Ложно-положительные результаты –
Ложноположительные результаты теста у НЕНЕинфицированных лиц =
необоснованный диагноз
Ложно--отрицательные результаты –
Ложно
отрицательные результаты теста у
инфицированный лиц =
не установленная этиология
инфекции (и/или необоснованный
диагноз)
И
Использование
комбинации
б
методов
повышает надежность результата
Какой метод использовать в
дополнении к ПЦР?
Ц
Выявление C.trachomatis разными методами
Тесты с аналитической
чувствительностью меньшей,
чем у метода ПЦР (ПИФ
(ПИФ, Бак
Бак.
посев)
осе ) не
е корректно
орре
о
использовать для
подтверждения его
результатов!
Интерпретация результатов ПИФ на
C trachomatis разными
C.trachomatis
специалистами
Screening Tests
To Detect Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae
Infections --- 2002
… Because of the greater sensitivity of NAATs, a NAAT is the only
recommended additional test to verify a result from another NAAT…
… В связи с более высокой чувствительностью
МАНК верификацию их результатов
МАНК,
результатов, следует
проводить на основе альтернативных МАНКтестов…
Методы амплификации
нуклеиновых кислот (МАНК)
(
)
1983-1989 – Polymerase Chain Reaction (PCR)
19831989 – Ligase Amplification Reaction (LCR)
1989 –Transcription
Transcription--Based Amplification
(TMA
TMA,, NASBA)
1992 -Strand Displacement Amplification (SDA)
1996 – Real
Real--Time PCR
1998-- NASBA
1998
NASBA--RealReal-Time
«Новый» метод диагностики
инфекций
ф
й - НАСБА
NASBA – Nucleic Acid
Sequence
equence--Based
d Amplification
lifi ti
NASBA-Real-Time
L
Leone
G.,
G ett al,
l 1998
РНК-мишень
10-100 копий
6
5
4
3
2
Линейная фаза
(получение первых
РНК-ампликонов)
1
РНК-ампликоны
109-1012копий
Фаза амплификации
(экспоненциальное
Нарастание количества
РНК-ампликонов))
0
0
20
40
60
80
100
Мишени для амплификации в клетках
бактерий
б
й и простейших
й
ПЦР
Плазмиды, ДНК
Хромосома, ДНК
рибосомная
РНК
NASBA
1-100*
копий/клетка
5-20 копий/клетка
* - для клеток простейших
103-10
104 копий/клетка
Предел детекции ПЦР и НАСБА
Клинический
образец
+ + – – – –
10-кратные разведения
+ + + + – –
NASBA
ПЦР
Достоверность
Д
остоверность
лабораторного диагноза
Выявление C.trachomatis разными методами
Сравнение методов диагностики
гонореи у мужчин и женщин
Диагн. Чувст.
Д
у
%
Собственные
данные
Диагн. Чувст.
Д
у
%
Зарубежн. Данные
((Ching,
g, 1995))
Муж.
N=156
N
156
92.6
Жен.
N=213
N 213
36.6
Муж.
N=808
N
808
95**
95
Жен.
N=1539
N
1539
<50*
Посев
97.9
87.4
96.5
83.9
МАНК
99.8
99.7
97.3
98.
98.5
5
Микроск.
* Mandell, Douglas, and Bennett, 2005
N= 213
Выявление N.gonorrhoeae
n=51
«положительные»
n=10
«?»
Совместно с С.В. Сехиным и соавт., 2005
N.gonorrhoeae: ПЦР, посев + NASBA
N 213
N=
n= 59
Истинно
положительные
результаты
Совместно с С.В. Сехиным и соавт., 2005
Гонококковая инфекция:
Бак Посев *
МАНК 1 + МАНК 2 ≈ Бак.
… Two positive NAATs, each targeting a different nucleic acid
sequence, may be substituted for culture of the cervix or the
urethra as legal evidence of infection
infection...
Harrison`s Principles of Internal Medicine 16th Edition, 2006
* Кроме случаев обследования детей и
образцов экстрагенитальной локализации
–
NASBA
Ранний контроль
результатов терапии
Оценка эффективности лечения
Положительный клинический
фф
– отсутствие
у
симптомов и
эффект
клинических признаков заболевания
Положительный
микробиологический эффект –
б
отсутствие возбудителя
Использование ПЦР в контроле
лечения
Chlamydia trachomatis
Полная элиминация
ц Д
ДНК происходит
р
д
в период
р д от
2 до 3 недель. ( Workowski K.M., 1993; Bianchi A., 1998;
Gaydos C.A., 1998)
Neisseria gonorrhoeae
В 90% случаев ДНК исчезает в первые 6 дней
после окончания лечения. Полное исчезновение
наблюдается на 15 день. (Bachmann L.H., 2002)
РНК – маркер
жизнеспособности
микроорганизмов
р р
К
б
( РНК) отражает
Количество
рибосом
(рРНК)
степень активности (жизнеспособности)
клетки
При разрушении клеток деградация
РНК происходит значительно быстрее
ДНК
Особенности эрадикации C.trachomatis
при терапии разными препаратами
Окончание
О
приема
Окончание
О
приема
Джозамицин
Доксициклин
A.Savicheva et al., 2006г.
NASBA – метод диагностики
присутствующей инфекции !
Если микроорганизмов мало, но ни живые
(хроническая инфекция
инфекция, персистенция
неэффективное лечение) - результат NASBA
положительный
В случае гибели микроорганизмов (результат
действия антибактериальных препаратов) –
результат NASBA - отрицательный даже
при избытке ДНК погибших клеток
NASBA-RT – включает достоинства
NASBAкультурального теста и ПЦР
Культуральный тест
Выявление
жизнеспособных
микроорганизмов
Контроль лечения
ПЦР
Высокая
аналитическая
чувствительность
у
Скорость получения
результатов
Упрощенные
условия хранения и
транспортировки
материала
Материал для исследования:
Первая порция мочи
Отделяемое уретры
Секрет предстательной
железы
Эякулят
Материал для исследования:
Отделяемое влагалища
Отделяемое
цервикального канала
Отделяемое уретры
Среда для транспортировки
клинического материала
Содержит компоненты:
Для растворения слизи
Для угнетения роста микроорганизмов
Для сохранения не только ДНК, но и РНК
б
й (маркер
(
б
)
возбудителей
жизнеспособности)
Обеспечивает
стабильность
клинического
Об
б
материала (ДНК и РНК микроорганизмов)
при при хранении образцов 28 суток при
+250 С !
НАСБА – автоматизированный метод
лабораторного исследования
Сокращение доли ручного труда и
вероятности ошибок лаборантами;
Увеличение объективности интерпретации
результатов;
Сокращение времени исследования до 2.5ч.
Стандартизация процедур исследования;
Автоматическая экстракция
нуклеиновых кислот из
клинического материала
Амплификация и
автоматический
анализ р
результатов
у
Полож.
пробы
Контроль
теста
Отриц.
пробы
НАСБА в алгоритме
лабораторного
исследования на ИППП
Лица с клинико
клинико--лабораторными
признаками урогенитальной инфекции
ДНК «…»
НЕ обнаружена
ру
Синдромальная
р
терапия
ПЦР –мулитипрайм:
N
N.gonorrhoeae
h
C.trachomatis
T.vaginalis
M genitalium
M.genitalium
ДНК «…»
обнаружена
Этиотропная
терапия
НАСБА-исследование не требуется
Половые партнеры (без клинических
проявлений) лиц с установленной
урогенитальной инфекцией
ДНК «…»
НЕ обнаружена
НАСБАисследование
РНК «…»
НЕ обнаружена
ПЦР –мультипрайм:
N.gonorrhoeae
C trachomatis
C.trachomatis
T.vaginalis
M.genitalium
РНК «…»
обнаружена
Лечение
по показаниям
ДНК «…»
обнаружена
Этиотропная
терапия
Лица без клинических проявлений
урогенитальной инфекции после
сомнительных половых контактов
ДНК «…»
НЕ обнаружена
НАСБАд
исследование
(N.gonorrhoeae,
C.trachomatis)
РНК «…»
НЕ обнаружена
Инфекция
Не установлена
ПЦР –мультипрайм:
N.gonorrhoeae
C.trachomatis
T.vaginalis
M.genitalium
РНК «…»
обнаружена
Этиотропная
терапия
ДНК «…»
обнаружена
НАСБАисследование
РНК «…»
НЕ обнаружена
Инфекция
Не установлена
Лица без клинических проявлений –
постоянные половые партнеры,
партнеры
семейные пары, прегравидарная подготовка
ДНК «…»
НЕ обнаружена
Инфекция
Не установлена
ПЦР –мультипрайм:
N.gonorrhoeae
C.trachomatis
T.vaginalis
M.genitalium
РНК «…»
НЕ обнаружена
Этиотропная
терапия
ДНК «…»
обнаружена
НАСБАисследование
РНК «…»
ру
обнаружена
Лица после проведенной
этиотропной терапии
(контроль лечения)
ДНК «…»
НЕ обнаружена
Эрадикация
ПЦР – «…»:
« »:
N.gonorrhoeae
C.trachomatis
T.vaginalis
M.genitalium
РНК «…»
НЕ обнаружена
≤ 1 недели – не полная элиминация
≥ 1-2 недель – рецидив инфекции
≥ 1-3 мес.
мес – рецидив инфекции-?,
инфекции-?
реинфекция-?
ДНК «…»
обнаружена
НАСБАисследование
РНК «…»
ру
обнаружена
Дополнительные условия
применения НАСБА в алгоритме
обследования:
Ретроспективное исследование
б
исходного клинического образца;
Повторное взятие клинического
материала не позже 33-5 дней после
результатов ПЦР при условии
отсутствия приема антибактериальных
препаратов;