Гинаятов Н.С., Абсатиров Г.Г., IN VITRO Аннотация
advertisement
Гинаятов Н.С., Абсатиров Г.Г., д-р вет.наук, Сариев Б.Т., канд.биол.наук Западно-Казахстанский аграрно-технический университет им. Жангир хана, г. Уральск, РК МИКРОБНЫЙ ПЕЙЗАЖ В УЗВ И ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ IN VITRO Аннотация В данной статье приведены результаты изучения микробного пейзажа в бассейнах УЗВ и проведенного сравнительного анализа чувствительности к антибиотикам in vitro. А также выбран из испытуемых образцов (антибиотиков) наиболее эффективный препарат в отношении микрофлоры, способной к накоплению и спонтанному возникновению инфекционных заболеваний. Ключевые слова: аквакультура, УЗВ, патоген, антибиотики, чувствительность, in vitro. Изменения в индустриальной аквакультуре, происходящие в последние годы, отразились не только на возросшей производительности продуктов рыбодства, но и на ее восприимчивости к заболеваниям. Рыбоводы все чаще сталкиваются со сложными заболеваниями рыб, что можно объяснить только эволюцией различных патогенов, их приспособляемости к лекарственным препаратам. По данным различных источников, потери от бактериальных болезней составляют более 70% падежа от зарегистрированных заболеваний рыбы. Последние годы характеризуются как беспрецедентным ростом новых инфекций, так и активизацией старых, хорошо изученных форм инфекционной патологии. Приходится сталкиваться с огромным спектром сложных заболеваний и синдромов, что затрудняет как диагностику заболеваний, так и лечение. Эти заболевания имеют широкое распространение и наносят значительный экономический ущерб [1]. Высокая концентрация рыб на ограниченном территориальном пространстве УЗВ таит в себе серьезные опасности, накоплению и спонтанному пассажированию микрофлоры через восприимчивый организм, способствующий возникновение и распространение инфекционных заболеваний [2]. На сегодняшний день основным сдерживающим фактором интенсивного развития данной отрасли являются различные кормовые добавки, антибиотикики, пробиотики, позволяющие сыграть важную роль в профилактике болезней инфекционной этиологии. В настоящее время рынок представлен антибиотиками различных групп, ассортимент которых очень широк, поэтому возрастает роль изучения микробной обсемененности и определения их чувствительности к антибиотикам in vitro. Основные требования, предъявляемые при выборе антибиотика: – обладание высоким уровнем воздействия на микроорганизмы при низкой дозе препарата; – низкая токсичность на организм рыб. В связи с этим целью наших исследований является изучения микробного фона в объектах УЗВ, оборудований, инвентаря и предметов ухода за рыбами и др. Провести сравнительный анализ их чувствительности к антибиотикам in vitro. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: – изучение микрофлоры в абиотических субъектах аквакультуры; –проведение бактериологических и бактериоскопических исследовании; – определение чувствительности к антибиотикам in vitro. Материалы и методы исследований. Практический и производственный опыт производился в НИИ ветеринарии и аквакультуры Западно-Казахстанского аграрно-технического университета имени Жангир хана. Образцы взяты с различных участков УЗВ, рабочего инвентаря по уходу за рыбами, а также кормовых гранул разной величины, стерильными ватными тампонами, смоченными в нейтрализующем растворе (физиологический раствор) по 3 пробы (смыва) с каждого объекта. Пробы отбирали стерильными увлажненными ватно-марлевыми тампонами, закрепленными на стержне (прим. не рекомендуется для тампонов использовать синтетическую вату из-за ее бактерицидных свойств). Перед непосредственным взятием смывов в пробирки наливается по 10 см³ транспортной среды. Зафиксированные мазки окрасили по Грамму. Бактериоскопия мазков была осуществлена с помощью тринокулярного микроскопа МС-300 (Австрия). При бактериологическом исследовании использовалась общеупотребительная питательные среды МПА, селективные среды Эндо и Сабуро. В случае помещения тампона в смывную жидкость она является после тщательного перемешивания исходным материалом для посева на среду МПА для определения общего микробного числа, среду Эндо для выделения БГКП, среду Сабуро – для культивирования плесневых грибов и дрожжей. Посевы культивируют в термостате в течение 24 часов при температуре 37оС. Идентификацию микроорганизмов проводили после выявления культуральных свойств на селективных и дифференциально-диагностических средах по стандартным методикам и определителю Берджи [3]. Чувствительность бактерий к антибиотикам in vitro определяли диффузионным методом с использованием дисков с антибиотиками. Результаты исследований При культивирование на обычных и селективных питательных средах получен рост различных микроорганизмов (Рисунки 1, 2, 3). Рисунок 1 – Рост культур на Рисунок 2 – Рост культур на Рисунок 3 – Рост культур на МПА среде Эндо среде Сабуро При микроскопии мазков из культур идентифицированы микроорганизмы различных форм. В культурах из биофильтров преобладают палочковидные бактерии (E.coli), со стенок бассейна преобладают коковидные формы микроорганизмов (Рисунок 4). Рисунок 4 - Бактерии кишечной палочки и стафилококков Произведен подсчет КОЕ [3, 4] чтобы результаты выразить количеством микробов в1 см3 исследуемого объекта или продукта, число выросших на чашке колоний умножают на степень разведения пробы и вычисляют среднее арифметическое количество колоний, подсчитанных на двух чашках. Результаты исследований приведены в таблице 1. Таблица 1 - Показатели микробного обсеменения субъектов УЗВ Образцы с объектов Биофильтр бассейна № 639 Биофильтр бассейна № 638 Биофильтр бассейна № 643 Рабочий инвентарь (сачок) Питательная среда Количество КОЕ E.coli МПА Эндо Сабуро МПА Эндо Сабуро МПА Эндо Сабуро МПА Эндо Сабуро 0,46 х 10 ³ 0,18 х 10 ³ 0,23 х 10 ³ 0,46 х 10 ³ 0,16 х 10 ³ 0,15 х 10 ³ 0,55 х 10 ³ 0,28 х 10 ³ 0,21 х 10 ³ 0,9 х 10 ¹ 0,5 х 10 ¹ 0,4 х 10 ¹ + + + + + + + + – Наличие/отсутствие микроорганизмов СтафилоПатогенная Грибы кокки микрофлора + + + + – – – – – + + – – + Данные таблицы свидетельствуют, что в субъектах УЗВ отсутствует патогенные формы микроорганизмов, из условно патогенной – преобладает кишечная палочка и в равной степени стафилококки и дрожжеподобные грибы. Распределение микроорганизмов по субъектам также неравномерно, наиболее загрязненными являются рабочий инвентарь и биофильтр бассейна № 643. Учитывая, то что рабочий инвентарь, не всегда подвергается должной обработке, при постоянном использовании – возможна интенсификация переноса микроорганизмов между бассейнами их пассаж и трансформация в агрессивные формы. При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность среды АГВ в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления рос роста микроорганизмов вокруг дисков (рисунок 5). После инкубации чашек в термостате при температуре 370С в течение 24 часов учитывают результаты результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах. Интерпретация результатов исследований. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг диска указывают на то, что испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации антибиотика. Рисунок 5 – Зоны чувствительности к различным антибиотикам Наличие зон диаметром до 10 мм свидетельствует о малой чувствительности культуры к данной концентрации антибиотика. Диаметр зоны более 10 мм – испытуемая культура чувствительна к данной концентрации антибиотика. Чем больше зона задержки роста испытуемой культуры, тем выше ее чувствительность к данной концентрации антибиотика. Результаты исследований приведены в таблице 2. Таблица 2 - Определение чувствительности к антибиотикам in vitro Образцы Наименование Антибиотика Доксициклин Амоксициллин Энрофлоксацин Sulphamethoxazole Trimethoprim ColistinSulphate Ципрофлоксацин Биофильтр бассейна № 639 14 – – 14 Биофильтр бассейна № 638 20 24 15 11 Биофильтр бассейна № 643 12 23 23 33 Биофильтр бассейна № 641 15 20 16 23 Рабочий инвентарь (сачок) 22 9 25 31 13 13 9 19 20 22 8 13 14 25 Результаты изучения чувствительности различных форм микроорганизмов симбионтов в бассейнах УЗВ к антибиотикам показывает, что наиболее приемлимы для профилактического применения будут доксициклин, сульфаметазол и ципрофлоксацин. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1 Мирзоева Л. М. /Болезни рыб при индустриальном выращивании // Л. М. Мирзоева. Обзорная информация. Рыбное хозяйство. Серия Болезни гидробионтов в аквакультуре. ВНИЭРХ - 2000. - Вып.1. С - 58. 2 Жезмер В. Ю. Контроль санитарно-бактериологического состояния водной среды в УЗВ / В. Ю.Жезмер, Е. А. Галдина, К. В. Кутищева, Н. С. Лаврова // Сб. науч. тр. ВНИИПРХ. Индустриальное рыбоводство в замкнутых системах. -М.: ВНИИПРХ. 1991 - Вып. 64. - С.14-15. 3 Берджи. Определитель бактерий. - М.: Мир, 1997. С - 799. 4 Смирнова Л.И. /Микробиологическая безопасность объектов внешней среды и пищевых продуктов. // Л. И. Смирнова, А. А. Сухинин, Е. И. Приходько. Учебное пособие по санитарной микробиологии, – СПб, 2013. С – 12-18. 5 Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие // А. С. Лабинская, Л. П. Блинковая, А. С. Ещина. – М.: Медицина, 2004. - С – 576. ТҮЙІН Аталған мақалада ТЖСҚЕҚ-дағы бассейндердегі микроорганизмдердің in vitro антибиотиктеріне сезімталдығының салыстырмалы талдау нәтижелері келтірілген. Сонымен қатар (антибиотиктер) ішінен микрофлораға қатысты, індеттік аурулардың көбейіп, кенеттен пайда болуына қабілетті ең тиімді препарат таңдалынған. RESUME To this article the results of study of microbal landscape are driven in the pools of RAS and conducted comparative analysis of sensitiveness to the antibiotics of in vitro. And also the most effective preparation is chosen from examinee standards (antibiotics) in regard to a microflora apt at an accumulation and spontaneous origin of infectious diseases.
