УДК 633.18:632.488.42:575

УДК 633.18:632.488.42:575
П.И. Костылев1, доктор сельскохозяйственных наук, профессор;
А.А. Редькин1, кандидат сельскохозяйственных наук;
Е.В. Краснова1, кандидат сельскохозяйственных наук;
А.В. Усатов2, доктор биологических наук, профессор;
М.С. Макаренко2, аспирант,
1
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт
зерновых культур им. И.Г. Калиненко (347740,
г. Зерноград, Научный городок, 3; p-kostylev@mail.ru)
2
Академия биологии и биотехнологии, Южный федеральный университет,
(344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки 194/1, mcmakarenko@yandex.ru)
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УСТОЙЧИВОГО К
ДЛИТЕЛЬНОМУ ЗАТОПЛЕНИЮ РИСА С ГЕНОМ SUB1 В
СЕЛЕКЦИИ РОССИЙСКИХ СОРТОВ
Эффективным способом защиты риса от сорных растений без гербицидов является
выращивание сортов, устойчивых в фазу прорастания к большому слою воды. Для
создания таких сортов необходимо объединение в одном генотипе генов повышенной
энергии начального роста, устойчивости к анаэробному прорастанию, длительному
затоплению и полеганию. Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с генами
устойчивости к этим факторам, облегчает селекционную работу. Поэтому актуальным
является создание с помощью маркирования сортов риса для безгербицидных технологий.
Локус Sub1 регулирует реакцию на этилен и гиббереллин, что приводит к ограничению в
потреблении углеводов и покою побегов под водой и способствует толерантности к
погружению. В качестве доноров переносимого гена устойчивости Sub 1 использовали
сорта с геном Sub 1: BR-11, CR-1009, Inbara-3, TDК-1. В качестве реципиента был взят
скороспелый сорт Новатор. В работе использованы микросателлитные маркеры на ген Sub
1. Идентификацию гена Sub1A проводили методом молекулярного маркирования на
основе ПЦР с использованием специфичных праймеров. В процессе работы в 2013-2014
годы проведены скрещивания и получены гибриды F 1 -F 2 сорта Новатор с четырьмя
азиатскими сортами риса, несущими ген Sub 1. В результате проведенных исследований с
помощью современных биотехнологических методов в сочетании с традиционной
селекцией выделены скороспелые линии риса с геном Sub 1, пригодные для выращивания
в Ростовской области.
Ключевые слова: рис, гибрид, донор, устойчивость к затоплению, молекулярный
маркер, ПЦР-анализ
P.I. Kostylev1, Doctor of Agricultural Sciences, professor;
A.A. Redkin1, Candidate of Agricultural Sciences;
E.V. Krasnova1, Candidate of Agricultural Sciences;
A.V. Usatov2, Doctor of Biological Sciences, professor;
M.S. Makarenko2, post-graduate student,
1
FSBSI All-Russian Research Institute of Grain Crops after I.G. Kalinenko
(347740, Zernograd, Nauchny Gorodok, 3; p-kostylev@mail.ru) 2
Academy of Biology and Biotechnology, Southern Federal University
(344090, Rostov-on-Don, Stachki Av, 194/1; mcmakarenko@yandex.ru)
PROSPECTS OF USE OF RICE VARIETY WITH GENE SUB 1
TOLERANT TO DEEPWATER IN THE BREEDING OF RUSSIAN
VARIETIES
Growing of varieties tolerant to deepwater during germination is an effective method of rice
protection from weeds without use of herbicides. To develop such varieties it’s necessary to
combine genes of great energy of early germination, genes resistant to anaerobic germination,
deepwater and lodging into one geno type. Identification of molecular markers, connected with
genes resistant to these stresses, makes breeding work easier. That’s why development of rice
varieties with the help of marking is of great importance for non-herbicide technologies. The
locus Sub 1 regulates response to ethylene and gibberellin which results in reduce of
carbohydrates consumption and sprouts’ peace under water and promotes tolerance to deep
watering. As donors of resistant genes Sub 1 we used such varieties with the gene Sub 1 as ‘BR11’, ‘CR-1009’, ‘Inbara-3’ and ‘TDК-1’. As a recipient we took an early maturing variety
‘Novator’. We also used micro satellite markers on the gene Sub 1 . The identification of the gene
Sub 1 was carried out by the method of molecular marking with the use of specific primers on the
basis of PCR. During the work in 2013-2014 we carried out hybridization and received hybrids
F 1 -F 2 of the variety ‘Novator’ with four Asian rice varieties carrying the gene Sub 1 . Due to
studies with the help of present biotechnologies together with traditional breeding methods we
developed early maturing rice varieties with the gene Sub 1 , suitable for growing in the Rostov
region.
Keywords: rice, hybrid, donor, tolerance (resistance) to deep watering, molecular marker,
PCR-analysis.
Введение. Рис – наиболее распространенная крупяная культура на земном шаре,
основной продукт питания более чем для трети населения Земли. Крупа риса – ценный
диетический продукт, обладает высокими питательными свойствами. По данным FAO,
рис в 2014 г. возделывался в 108 странах мира на площади 163 млн га, его урожайность в
среднем составляла 4,55 т/га, валовой сбор – 741,3 млн т [1]. В России урожайность риса
в среднем составляет около 5 т/га. Однако такой уровень урожайности не покрывает
потребность населения нашей страны в данной культуре. Поэтому внедрение в
производство новых более урожайных, устойчивых к стрессам сортов риса является
одним из факторов, способствующих увеличению сборов зерна.
В настоящее время уделяется все больше внимания экологизации процессов
сельскохозяйственного производства. Сорные растения конкурируют с рисом за элементы
питания, свет и другие факторы, вследствие чего недобор урожая может составлять 2050%. Химическая защита растений в ряде случаев или неэффективна, или нерентабельна.
Наиболее экологически чистой в производстве риса считается технология получения
всходов из-под слоя воды, при которой погибают просянки. Ее использование вызывает
ряд проблем, связанных, в первую очередь, с высокой гибелью проростков из-за
недостатка кислорода, вызванного повышением уровня воды для борьбы с сорно полевой
растительностью. Поэтому эффективным способом защиты риса без гербицидов является
выращивание
сортов,
устойчивых
к
анаэробному
прорастанию
и
длительному
затоплению.
Идентификация молекулярных маркеров, сцепленных с генами, обеспечивающими
устойчивость растений к этим факторам, облегчает селекционную работу в данном
направлении. В связи с этим актуальным является создание с помощью маркирования
сортов риса для безгербицидных технологий. Существует два типа растений риса,
которые в фазе кущения могут справиться со стрессом, вызванным наводнениями или
длительным затоплением: 1) впадающие в покой (ген Sub 1), 2) энергично растущие (гены
SK1/SK2) (рис. 1).
Рис. 1. Различные типы роста риса при затоплении: 1 – обычное орошение, 2-3 –
быстрое затопление водой, 4 – медленный подъем воды.
При быстром затоплении, которое случается при наводнении, растения риса с
геном Sub 1 останавливаются в росте и находятся под водой до 20 дней (рис.1/2), растения
без генов устойчивости удлиняются, расходуют питательные вещества и, не достигнув
поверхности, погибают (рис.1/3), при медленном подъеме воды растения с генами
SK1/SK2 быстро растут и их верхние листья поднимаются над водой (рис.1/4) [2].
Самый важный признак для выживания глубоководных форм риса – быстрое
удлинение междоузлий, позволяющее гарантировать, что верхние листья будут
эффективно поддерживать фотосинтез [3]. Данный механизм основан на активации
накопления этилена, который уменьшает количество абсцизовой кислоты и повышает
уровень гибберелиновых кислот [4, 5]. Отмечено, что удлинение стебля у глубоководных
сортов может достигать 25 см в день.
В различных исследованиях на хромосомах 1, 3 и 12 были обнаружены QTL для
таких признаков, как удлинение междоузлий и число удлиненных междоузлий. QTL на 12
хромосоме вызывает наиболее быстрое удлинение междоузлий в условиях воздействия
стресса [6]. С помощью позиционного клонирования Hattori и др. [5] идентифицировали
гены в пределах этого QTL: Snorkel 1 (SK1) и Snorkel 2 (SK2).
Толерантность растений риса к затоплению водой контролируется локусом Sub1
(Submergence) в 9-й хромосоме. Локус Sub1 регулирует реакцию на этилен и гиббереллин,
что приводит к ограничению в потреблении углеводов и покою побегов под водой и
способствует толерантности к погружению. Экспрессия этого гена увеличивается при
повышенной концентрации этилена (при затоплении), что приводит к снижению
гиббереллин индуцированного роста растений.
Важным этапом в селекции устойчивости к затоплению стала идентификация
главного локуса количественного признака Sub1, который контролирует данный признак.
Используя популяцию, полученную от скрещивания устойчивой к затоплению линии
подвида indica (IR40931-26) и восприимчивой линии подвида japonica (P154385), Xu K. и
Mackill D.J. точно картировали основной QTL на 9 хромосоме между RLFP маркерами
С1232 и RZ698 и дали ему обозначение Sub1 (рис. 2) [7].
Рис. 2. Локализация гена Sub 1 в 9-й хромосоме
Xu и др. [8] картировали локус Sub1 на интервале размером 0,06 морганид в 9
хромосоме, используя для составления генетической карты популяцию из 4022 растений,
полученную от скрещивания устойчивого сорта подвида indica FR13A (IR40931-26) и
неустойчивого сорта подвида japonica М.202. Регион Sub1 ограничен маркерами CR25K и
SSR1A и охватывает более 182 тысяч пар оснований (т.п.о.). Этот интервал кодирует три
гена факторов этиленового ответа, обозначенных Sub1A, Sub1B и Sub1C.
Работы по созданию сортов для длительного затопления проводились несколько
десятилетий в IRRI [9]. Недавно было выполнено объединение разных генов устойчивости
к длительному затоплению, включая Sub1. Это особенно важно для низкорослых сортов
риса, например, Swarna. Один сорт был районирован на Филиппинах как PSB Rc68 [10].
На основе сиквенса SUB1 были разработаны специфические молекулярные
маркеры, что облегчило систему маркер-опосредованного беккросcирования (MABC),
которая теперь успешно развертывается для интрогрессии гена SUB1 в широко
возделываемые "мегасорта" на юге и юго-востоке Азии, а также в Африке [10]. Вместо
использования первоначального донора FR13A в качестве доноров были использованы
две улучшенные линии, полученные с участием FR13A: IR49830-7 и IR40931-33 [11]. Это
привело к успешной интрогрессии локуса SUB1 в несколько популярных сортов в Индии,
Бангладеш, Индонезии, Лаосе и Филиппинах. Благодаря MABC были сохранены высокая
продуктивность, потребительские и пищевые качества этих мегасортов [10], что
стимулирует спрос производителей. Первым мегасортом с локусом SUB1 был Swarna
(Swarna-Sub1). К 2011 году было создано восемь таких сортов.
Целью работы являлось создание скороспелых линий риса с генами устойчивости
к затоплению с использованием метода молекулярного маркирования.
Материалы и методы. В качестве доноров переносимого гена устойчивости Sub 1
использовали сорта подвида indica с геном Sub 1: BR-11, CR-1009, Inbara-3, TDК-1. Сорт
Inbara-3 имел также гены SK1 и SK2. В качестве реципиента (отцовская форма) был взят
скороспелый российский сорт подвида japonica Новатор (Шиловский В.Н., Рубан В.Я. и
др., ВНИИ риса).
В работе использованы микросателлитные маркеры на ген Sub 1. Идентификацию
гена Sub1A в растительных образцах проводили методом ПЦР с использованием
праймеров,
специфичных
к
последовательности
гена
Sub1A
(база
данных
www.ncbi.nlm.nih.gov). Визуализацию результатов проводили с помощью полимеразной
цепной реакции (ПЦР) и электрофореза [10]. Для анализа ДНК использовали отрезки
флаговых листьев в начале сентября.
Результаты. В процессе работы в 2013 году были получены гибриды от
скрещивания сорта Новатор с донорами гена Sub 1. Азиатские сорта оказались
позднеспелыми, фоточувствительными и в наших условиях не зацветали. Гибридизацию
удалось провести лишь с помощью установок искусственного климата. Первое поколение
в 2013 году характеризовалось высокой степенью стерильности (90-95%) и бурой
окраской цветковых чешуй при созревании, что свидетельствует о значительных
генетических различиях между родительскими формами.
Во втором поколении в 2014 году наблюдали огромный спектр расщепления по
вегетационному периоду, высоте растений, длине и форме метелки, количеству колосков,
остистости (табл. 1).
1. Варьирование количественных признаков у гибридов F 2 от скрещивания
глубоководных образцов с сортом Новатор (2014 г.)
Комбинации скрещивания
Признак
BR 11 x
CR-1009 x
Inbara 3 x
TDK-1 x
Новатор
Новатор
Новатор
Новатор
Высота растения, см
71-129
57-131
60-149
45-138
Длина метёлки, см
11,5-27
10-26
9,5-32
9-27
Число зёрен, шт.
10-220
2-201
4-343
4-180
Число колосков, шт.
57-322
38-273
18-411
17-261
Длина колоска, мм
6,1-10,1
6,8-9,8
6,1-11,9
7,2-11,3
Ширина колоска, мм
2,3-3,8
2,5-4,0
2,1-3,8
2,3-3,9
Масса 1000 зёрен, г
11-38
10-35
12-37
13-39
Масса зерна с метёлки, г
0,72-5,54
0,03-5,90
0,06-5,42
0,07-6,09
Такого большого размаха изменчивости не наблюдается у других культур [12]. Это
обусловлено генетической и эколого-географической удаленностью скрещиваемых форм.
В каждой комбинации отобрали по 400 растений для биометрического и генетического
анализа. Среди гибридов удалось отобрать лучшие растения по многим признакам,
совмещающие в себе скороспелость, оптимальную высоту растений, озерненность
метелок, неосыпаемость и фертильность колосков. По 100 лучших метелок из каждой
комбинации направлено в посев 2015 года.
В Академии биологии и биотехнологии ЮФУ был проведен ПЦР-анализ листьев из
20 растений каждого гибрида и выделены формы с аллелями устойчивости к затоплению
Sub 1 [13].
Из проанализированных гибридных растений BR-11 x Новатор ген Sub 1A (в гомои гетерозиготном состоянии) присутствовал у девяти: №4, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 18, 19 (рис. 3),
т.е. в соотношении 9:11, хотя при моногибридном расщеплении оно должно было быть
15:5.
а)
б)
Рис. 3. Электрофореграмма ДНК-маркеров гибрида BR-11 x Новатор, на которой
полосками отмечены формы с геном Sub 1 (а), и метелки выделенных растений (б)
В гибридной комбинации CR-1009 × Новатор расщепление F 2 прошло в
соотношении 18:2, т.е. почти все отобранные растения имели ген Sub 1 (рис.4). У
гибридов Inbara-3 × Новатор и TDК-1 × Новатор расщепление прошло в соотношении
14:6, или примерно 3:1, т.е. близко к менделевскому (рис.5-6).
Рис. 4. Электрофореграмма ДНК-маркеров гибрида CR-1009 × Новатор Рис. 5. Электрофореграмма ДНК-маркеров гибрида Inbara-3 × Новатор
Рис. 6. Электрофореграмма ДНК-маркеров гибрида TDК-1 × Новатор
Отклонения в расщеплениях двух комбинаций можно объяснить влиянием отбора
и сцеплением генов. Из 80 растений четырех гибридов выделили 55 растений с целевым
геном.
Отобранные образцы в 2015 году высеяны в поле в ФГУП «Пролетарское»
Ростовской области для проверки устойчивости к длительному затоплению водой. На
следующем этапе работы планируются скрещивания полученных гибридов, несущих ген
Sub 1 в гомозиготном состоянии, с энергично растущими сортами Кубань 3, Бахус,
линиями Бахус х Боярин, Бахус х Дончак для объединения генов. В результате будут
созданы сорта риса для безгербицидных технологий, энергично преодолевающие в фазе
всходов глубокий слой воды при минимальных потерях семян, пригодные для
выращивания в России.
Выводы
1.
Проведены скрещивания и получены гибриды сорта Новатор с четырьмя
азиатскими сортами риса, несущими ген устойчивости к длительному затоплению водой
Sub 1.
2.
В
результате
проведенных
исследований
с
помощью
современных
биотехнологических методов (молекулярное маркирование на основе ПЦР) в сочетании с
традиционной селекцией выделены скороспелые линии риса с геном Sub 1.
Литература
1.
FAOSTAT, 2014 http: // faostat3.fao.org / browse / Q / QC / E
2.
Catling, H.D. Rice in deep water / International Rice Research Institute, Manila,
Philippines // Macmillan, London, 1992. – 542 pp.
3.
Vergara, B.S., Jackson M.B., De Datta S.K. Deepwater rice and its response to
deep-water stress // In: Climate and Rice. International Rice Research Institute, Los Banos,
Philippines, 1976. – P.301.
4.
Kende, H., Knaap E., Cho H.T. Deepwater Rice: A Model Plant to Study Stem
Elongation // Plant Physiology, 1998. – V.118. – №4. – P.1105-1110.
5.
Hattori, Y., Nagai K., Furukawa S., Song X.J., Kawano R., Sakakibara H., Wu J.Z.,
Matsumoto T., Yoshimura A., Kitano H., Matsuoka M., Mori H., Ashikari M. The ethylene
response factors Snorkel1 and Snorkel2 allow rice to adapt to deep water // Nature, 2009. – 460.
– P.1026-1031.
6.
Hattori, Y., Nagai K., Mori H., Kitano H., Matsuoka M., Ashikari M. Mapping of
three QTLs that regulate internode elongation in deepwater rice // Breeding Science, 2008. – 58.
– P.39-46.
7.
Xu, K., Mackill D.J. A major locus for submergence tolerance mapped on rice
chromosome 9 // Molecular Breeding, 1996. – 2. – P.219-224.
8.
Xu, K., Xu X., Fukao T., Canlas P., Maghirang-Rodriguez R., Heuer S., Ismail
A.M., Bailey-Serres J., Ronald P.C., Mackill D.J. Sub1A is an ethylene-response-factor like gene
that confers submergence tolerance to rice // Nature, 2006. – 442. – P.705-708.
9.
HilleRisLambers, D., Seshu D.V. Some ideas on breeding procedures and
requirements for deepwater rice improvement // In: Proceedings of the 1981 International
Deepwater Rice Workshop. International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines, 1982.
– P.29-44.
10.
Septiningsih, E.M., Pamplona A.M., Sanchez D.L., Neeraja C.N., Vergara G.V.,
Heuer S., Ismail A.M., Mackill D.J. Development of submergence-tolerant rice cultivars: The
Sub1 locus and beyond // Annals of Botany, 2009. –103. – P.151-160.
11.
Mackill, D.J., Amante M.M., Vergara B.S., Sarkarung S. Improved semidwarf rice
lines with tolerance to submergence of seedlings // Crop Science, 1993. – 33. – P.749-753.
12.
Марченко, Д.М. Типы наследования высоты растений, длины колоса, числа и
массы зерна с колоса у гибридов F 2 озимой пшеницы / Д.М. Марченко, П.И. Костылев,
Т.А. Гричаникова // Зерновое хозяйство России. – 2013. – №1(25). – С.17-26.
13.
Костылев, П.И. Получение линий риса с генами устойчивости к длительному
затоплению / П.И. Костылев, А.А. Редькин, А.В. Усатов, М.С. Макаренко // Материалы
VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы
развития», 17-20 марта 2015 г. – М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2015. – С.35-36.
Литература
1.
FAOSTAT, 2014 http: // faostat3.fao.org / browse / Q / QC / E
2.
Catling, H.D. Rice in deep water / International Rice Research Institute, Manila,
Philippines // Macmillan, London, 1992. – 542 pp.
3.
Vergara, B.S., Jackson M.B., De Datta S.K. Deepwater rice and its response to
deep-water stress // In: Climate and Rice. International Rice Research Institute, Los Banos,
Philippines, 1976. – P.301.
4.
Kende, H., Knaap E., Cho H.T. Deepwater Rice: A Model Plant to Study Stem
Elongation // Plant Physiology, 1998. – V.118. – №4. – P.1105-1110.
5.
Hattori, Y., Nagai K., Furukawa S., Song X.J., Kawano R., Sakakibara H., Wu J.Z.,
Matsumoto T., Yoshimura A., Kitano H., Matsuoka M., Mori H., Ashikari M. The ethylene
response factors Snorkel1 and Snorkel2 allow rice to adapt to deep water // Nature, 2009. – 460.
– P.1026-1031.
6.
Hattori, Y., Nagai K., Mori H., Kitano H., Matsuoka M., Ashikari M. Mapping of
three QTLs that regulate internode elongation in deepwater rice // Breeding Science, 2008. – 58.
– P.39-46.
7.
Xu, K., Mackill D.J. A major locus for submergence tolerance mapped on rice
chromosome 9 // Molecular Breeding, 1996. – 2. – P.219-224.
8.
Xu, K., Xu X., Fukao T., Canlas P., Maghirang-Rodriguez R., Heuer S., Ismail
A.M., Bailey-Serres J., Ronald P.C., Mackill D.J. Sub1A is an ethylene-response-factor like gene
that confers submergence tolerance to rice // Nature, 2006. – 442. – P.705-708.
9.
HilleRisLambers, D., Seshu D.V. Some ideas on breeding procedures and
requirements for deepwater rice improvement // In: Proceedings of the 1981 International
Deepwater Rice Workshop. International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines, 1982.
– P.29-44.
10.
Septiningsih, E.M., Pamplona A.M., Sanchez D.L., Neeraja C.N., Vergara G.V.,
Heuer S., Ismail A.M., Mackill D.J. Development of submergence-tolerant rice cultivars: The
Sub1 locus and beyond // Annals of Botany, 2009. –103. – P.151-160.
11. Mackill, D.J., Amante M.M., Vergara B.S., Sarkarung S. Improved semidwarf rice
lines with tolerance to submergence of seedlings // Crop Science, 1993. – 33. – P.749-753.
12. Marchenko, D.M. Types of inheritance of plant height, ear length, number and mass
of grain of winter wheat hybrids F 2
/ D.M. Marchenko, P.I. Kostylev, T.V. Grichanikova //
Grain Economy of Russia. – 2013. – №1(25). – P. 17-26.
13. Kostylev, P.I. Selection of rice lines with genes tolerant to deep water / P.I. Kostylev,
A.A.
Redkin, A.V. Usatov, M.S. Makarenko // Materials of the VII Moscow International
Congress “Biotechnologies: state and perspectives of development”, 17-20 of March, 2015. –
M.: ZAO “Expo-BioChem-Technologies”, 2015. – P. 35-36.