План Этиология………………………………………………….…..3 Эпидемиология………………………………….………..…..5 Патогенез и патологическая анатомия……………….….….8

План
Этиология………………………………………………….…..3
Эпидемиология………………………………….………..…..5
Патогенез и патологическая анатомия……………….….….8
Диагностика……………………………………………….…11
Методы лабораторной диагностики лептоспирозов….…...13
Профилактика………………………………………………..25
Литература……………………………………………………26
2
Этиология
Возбудители
лептоспироза
относятся к семейству
Spirochaetaceae, роду
Leptospira,
который
подразделяется на два
вида: паразитический
Interrogans
и
сапрофитический Biflexa.
Лептоспиры: мазок из культуры (импрегнация серебром)
Лептоспиры являются гидробионтами и этим во многом обусловлены
эпидемиологические особенности заболевания.
Морфологически они характеризуются наличием многочисленных
(15—20) мелких завитков (от лат. leptos — мелкий, spira—завиток).
Длина лептоспир 6—15 мкм, толщина — 0.25
мкм. Лептоспиры подвижны. У них наблюдается
поступательное, вращательное и сгибательное
движение. Лептоспиры грамотрицательны, по
Романовскому—Гимзе
окрашиваются в розовый цвет, при серебрении
— в коричневый. Культивируются в анаэробных
условиях на специальных средах при темЛептоспиры в печени: гистологический препарат
пературе 25—35 °С и рН среды
7,2—7,4. Рост лептоспир обнаруживается лишь на 8—10-Й день
культивирования. При разрушении микробов выделяется эндотоксин.
В зависимости от антигенной структуры лептоспиры подразделяют на
серологические группы и варианты.
3
Лептоспиры устойчивы к действию низких температур, длительно
выживают в воде, что обеспечивает их сохраняемость в природных
условиях.
В
естественных
водоемах
они
могут
сохраняться
жизнеспособными 2—3 нед. в почве — до 3 мес. на пищевых
продуктах — несколько дней. Лептоспиры малоустойчивы к
действию
ультрафиолетового
облучения,
кислот,
щелочей,
дезинфицирующих веществ, нагреванию. Из лабораторных животных
к лептоспирам наиболее восприимчивы морские свинки.
4
Эпидемиология
Источниками лептоспирозной инфекции человека являются
больные и переболевшие дикие и домашние животные, заражающие
воду
и
почву,
образующие
природные,
антропоургические
(хозяйственные) и смешанные очаги.
Природные очаги лептоспироза обусловлены наличием инфекции
среди диких животных. Они расположены преимущественно в
лесной, лесостепной и лесотундровой зонах. Природные очаги могут
быть обнаружены в приозерных котловинах, зарослях тростника,
заболоченных травяных участках лесов, на сырых вырубках н
опушках леса. Основными носителями в природных очагах являются
мелкие влаголюбивые грызуны и насекомоядные: полевки, полевые
мыши, серые крысы, землеройки, ежи.
Ангропоургические очаги могут возникать как в сельской
местности, так и в городах, В связи с непрерывным ростом поголовья
сельскохозяйственных животных они играют наиболее важную роль.
В антропоургических очагах резервуаром инфекции служат крупный
рогатый
скот,
свиньи,
собаки,
а
также
крысы.
Главное
эпидемиологическое значение в распространении инфекции имеют
антропоургические
очаги,
возникающие
в
животноводческих
хозяйствах и ив производствах по убою и первичной обработке
животного сырья. У животных-носителей лептоспиры длительное
время сохраняются в извитых канальцах почек и выделяются с мочой
в течение нескольких месяцев.
Больной человек не является источником инфекции.
Основное значение в заражении лептоспирозом имеют алиментарный путь и контактный механизм передачи инфекции.
5
Заряжение
лептоспирозом
происходит
при
купании
и
употреблении воды из естественных и искусственных водоемов,
пищевых
продуктов,
через
предметы
быта
и
производства,
загрязненные инфицированной мочой.
Чаще лептоспирозом болеют лица, работающие на заболоченных
лугах, рисоводческих и животноводческих хозяйствах, на мясокомбинатах. Возможно заражение лептоспирозом работников собачьих
питомников и владельцев собак.
Основные проявления
6
Лептоспирозу свойственна летне-осенняя сезонность. Однако
спорадические заболевания лептоспирозом регистрируются круглый
год. К лептоспирозу восприимчивы люди любого возраста, но чаще
болеют подростки и взрослые.
Перенесенное заболевание вызывает гомологичный стойкий
иммунитет, не препятствующий, однако, заражению другими
сероварами лептоспир.
7
Патогенез и патологическая анатомия
Лептоспироз — острая циклически протекающая генерализованная
инфекция. Различают пять фаз инфекционного процесса.
Первая
фаза
(1-я неделя после заражения) —внедрение и
размножение лептоспир. Из области входных ворот (кожа,
слизистые оболочки), не вызывая воспалительных изменений в
месте
внедрения,
лептоспиры
гематогенно
проникают
во
внутренние органы (преимущественно в печень, почки, селезенку,
легкие), где происходит размножение возбудителей. Отмечается
проникновение лептоспир через гематоэнцефалический барьер,
развивается генерализованная гиперплазия лимфатических узлов.
Эта фаза соответствует инкубационному периоду болезни.
Вторая фаза (2-я неделя болезни) — вторичная лептоспиремия и
генерализация инфекции, обусловливающая накопление токсических
метаболитов,
проникновение
лептоспир
в
межклеточные
пространства органов и тканей, в особенности в печени, почках,
нервной системе. Клинически эта фаза соответствует начальному
периоду болезни.
Т р е т ь я фаза (3-я неделя болезни) — развитие максимальной
степени
токсинемии
и
органных
нарушении.
В
результате
повреждения эндотелия и повышения проницаемости сосудов
развиваются
геморрагии.
некротические
изменения
в
Возникают
дегенеративные
гепатоцитах.
эпителии
и
почечных
канальцев с нарушением функции органов, появлением желтухи,
признаков почечной недостаточности ренального типа. Характерно
развитие гемолиза. У ряда больных отмечается менингит. При
тяжелом течении болезни наблюдается шок с возможным летальным
8
исходом.
Конъюнктива при лептоспирозе (крупный план)
У
погибших
от
лептоспироза
отмечаются
признаки
распространенного геморрагического синдрома, увеличение печени,
ткань которой легко рвется. Характерны жировая и белковая
дистрофия гепатоцитов, накопление в ней желчных пигментов,
некроз отдельных печеночных клеток. Выявляется увеличение
селезенки и лимфатических узлов, в которых отмечается гиперплазия
лимфоидных элементов, увеличение количества плазматических и
полиморфно-ядерных клеток, признаки
значительные,
изменения
эритрофагии. Наиболее
обнаруживаются
в
почках,
размеры
которых увеличены, в корковом и мозговом слое выявляются
кровоизлияния. Характерны дистрофия и некроз эпителия извитых
канальцев, клубочки поражаются в меньшей степени. В просвете
канальцев часто обнаруживают лептоспиры. Нередко определяют
отек вещества и оболочек головного мозга, очаговые кровоизлияния в
мозг.
У
ряда
больных
отмечают
9
признаки
миокардита,
дистрофические изменения в скелетных мышцах
(икроножных,
поясничных и др.).
Ч е т в е р т а я фаза (3—4-я неделя болезни) — при благоприятном
течении болезни, в ходе которой формируется нестерильный
иммунитет, нарастают титры различных антител (агглютининов,
опсонинов,
компле-ментсвязывающих
и
др).
активизируется
фагоцитоз лептоспир звездчатыми эндотелиоцитами в печени,
моноцитами,
полиморфно-ядерными
клетками
и
др..
однако
лептоспиры еще могут сохраняться в межклеточных пространствах,
особенно в почках (до 40-го дня болезни). Наряду с этим наблюдается
обратное развитие органных н функциональных расстройств. Эта
фаза соответствует периоду
угасания
клинических
проявлений.
П я т а я фаза (5 —6-я неделя
болезни)
—
стерильный
формируется
иммунитет
гомологичному
лептоспир,
к
серовару
происходит
восстановление нарушенных
функций,
выздоровление.
Лицо при болезни Вейля
10
наступает
Диагностика
Распознавание лептоспироза основано на тщательном анализе
данных эпидемиологического анамнеза (прежде всего указания на
купание или работу в малопроточных водоемах, контакт с
животными и др.), правильной оценке результатов клиниколабораторного
обследования
(циклическое
течение
болезни
с
признаками генерализации инфекции, печеночно-почечные нарушения, нейтрофильный лейкоцитоз к повышение СОЭ и др.)
Специфическая
диагностика
включает
методы
обнаружения
возбудителя и серологические тесты.
В начальный период болезни лептоспиры могут быть обнаружены в
крови или иногда в ликворе при исследовании по методу
«раздавленной капли» в темнопольном микроскопе или при посеве
0.2 0.5 мл крови на 5—10 мл питательной среды (фосфатносывороточная и другие среды) при температуре 30 "С, а также путем
заражения лабораторных животных, в органах которых обнаруживают возбудителей прн окраске азотнокислым серебром.
В период разгара болезни лептоспиры могут быть выделены из
крови. мочи и ликвора, в более поздние сроки — из мочи. В органах
погибших от лептоспироза возбудители обнаруживаются наиболее
часто в почках.
Для серологической диагностики применяют преимущественно
реакцию микроагглютинации и лизиса, диагностические титры
которой (I : 100 и более) выявляются в парных сыворотках крови,
взятой в период разгара и в более поздние сроки болезни
(диагностическим является нарастание титра в 4 и более раз). Могут
использоваться реакция связывания комплемента (РСК) и реакция
11
непрямой гемагглютинации (РИГА).
Лептоспироз следует дифференцировать с большой группой
инфекционных и неинфекционных болезней.
В
начальный
период
проводят дифференциальный диагноз с
гриппом, тифо-паратифозными заболеваниями, геморрагическими
лихорадками.
В период разгара лептоспироз следует дифференцировать от
желтушных форм вирусных гепатитов, малярии, желтой лихорадки,
боррелиозов.
Схема диагностики лептоспироза
12
Методы лабораторной диагностики лептоспирозов
Все больные
с
клиническим
диагнозом
"лептоспироз"
или подозреваемые в заражении этой инфекцией в обязательном
порядке должны быть
обследованы лабораторными методами в
соответствии с действующими рекомендациями. В связи с тем, что
клиническая
дифференциальная
представляет
значительные
клинической
являются
картины,
диагностика
трудности
результаты
решающими
для
лептоспирозов
из-за
полиморфизма
лабораторного обследования
подтверждения
лептоспирозной
этиологии заболевания.
Кроме того, установление серогруппы
лептоспир, вызывавших
заболевание,
важно
для
проведения
эпидемиологического обследования и целенаправленного поиска
источника инфекции.
Современная лабораторная
диагностика
лептоспирозов
основана на комплексе микробиологических и иммунологических
методов,
которые используются в различных комбинациях в
зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей
лаборатории.
Материалом
для
исследования
являются
спинномозговая жидкость (СМЖ) больного,
кровь,
моча,
а при летальных
исходах - паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.
В период
обнаружения
лептоспиремии
лептоспир
(1-я
можно
неделя
использовать
болезни)
для
микроскопию
цитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК
лептоспир в крови методом ПЦР
и заражение лабораторных
животных.
С конца 1-й, начала 2-й недели в крови больных появляются
13
специфические
антитела,
которые
помощью серологических
лептоспир
можно
реакций:
определить
с
микроагглютинации
(РМА), макроагглютинации
на стекле (РА),
иммуноферментного анализа и других методов.
Начиная со 2-й недели исследуют ликвор, с 3-й недели - мочу.
В случае летальных
исходов
паренхиматозные
-
органы
на
присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопробы).
Метод прямой микроскопии
Лептоспиры плохо
воспринимают
окраску,
поэтому
наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном
все
поле
зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного
поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.
Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты
"раздавленная капля":
небольшую каплю исследуемого материала
наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не
более 1,0 - 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм.
На
верхнюю
линзу конденсора микроскопа помещают каплю
дистиллированной воды.
Ввиду значительной величины микроба для
пользуются сухими системами:
объектив - X40,
исследования
окуляр - X10.
Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу или ликвор
больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.
Для приготовления цитратной крови смешивают 2 объема крови
и один объем 1,5%-ного раствора лимоннокислого натрия; смесь
отстаивают при комнатной температуре
Микроскопируют
надосадочную жидкость.
в
течение
Более
2
ч.
эффективна
подготовка материала способом двойного центрифугирования. На
14
первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 3000 об./мин. в
течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную
жидкость
центрифугируют
Полученный
осадок
30
мин.
микроскопируют.
при
10000
Метод
об./мин.
микроскопии
цитратной крови - простой и доступный метод ранней диагностики
лептоспироза.
Однако следует помнить, что ввиду его
чувствительности
лептоспиремии
(10 клеток/мл) и кратковременности периода
(около
1
недели)
отрицательные
микроскопии цитратной крови не дают основания для
диагноза
низкой
лептоспироз.
На
диагностическая
эффективность
резко снижается.
Для
фоне
результаты
исключения
антибиотикотерапии
микроскопического
метода
подтверждения диагноза и определения
серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить
серологические
и бактериологические
исследования.
Мочу
(средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии или
методом центрифугирования.
Микроскопия мочи
используется
также
с
целью
прижизненного обследования животных (в т.ч. свиней, собак и
др.) на лептоспироносительство.
Ткань паренхиматозных органов
(печень,
почки
и
др.)
забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном
стекле
с каплей физиологического раствора.
Через 2 - 3 мин.
частицы ткани удаляют, каплю накрывают покровным стеклом и
тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой.
При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, где
локализуются лептоспиры.
Сходным образом готовят препараты для микроскопии из
15
почек грызунов
и
других
животных
при
их
исследовании
на лептоспироносительство.
При микроскопических
исследованиях
следует
учитывать
следующие возможные ошибки:
- наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по
морфологии отдаленно напоминающих лептоспир, - нитей фибрина,
стромы эритроцитов и т.д. От лептоспир их отличает отсутствие
концевых крючков и активной подвижности;
- наличие
в
микроорганизмов,
обнаруживаемых
препарате
например
при
других
спирилл,
извитых
особенно
форм
часто
исследовании несвежего патологического
материала;
- дефекты покровного стекла при неправильной настройке
микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;
- плохое освещение препарата: при правильном освещении
всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.
Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и
тканях используют
окраску
мазков-отпечатков
по
Романовскому-Гимза, импрегнацию серебром гистологических срезов
по Вартину-Стерри. С этой же целью можно также использовать
метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода.
В
основе
многократное копирование
фрагмента
данного
(амплификация)
ДНК-мишени, который
вида.
термостабильной
Такое
метода
ПЦР
лежит
специфического
является
маркерным
для
копирование осуществляется ферментом
ДНК-полимеразой
16
в
присутствии
дезоксирибонуклеозид-трифосфатов
(дНТФ)
синтетических олигонуклеотидных
затравок
называемых праймерами. Праймеры
комплементарны
последовательностям
и
синтеза
ДНК,
концевым
ДНК специфического фрагмента и
ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только
между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение
числа копий специфического фрагмента по формуле 2 , где n - число
циклов амплификации.
Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых
соответствует определенный температурный режим.
1) Расплетение двойной спирали ДНК (денатурация
ДНК)
происходит при 93 - 95 ЬC.
2)
Присоединение
(отжиг)
праймеров
происходит
комплементарно при температуре, специфической для данной пары
праймеров.
3) Синтез новых цепей ДНК протекает при
72
ЬC
путем
удлинения праймера в направлении 5` - 3`. В результате 30 - 35
циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента,
делает
возможным
визуальный
учет
результатов
что
после
электрофореза в агарозном геле.
Необходимое оборудование и реактивы
1. Микропипетки полуавтоматические на 1 - 10, 5 - 40, 40 - 200,
200 - 1000 мкл.
2. Микроцентрифуга на 8 - 12 тыс.
об./мин.
для пробирок
объемом 1,5 и 0,5 мл.
3. Прибор для горизонтального электрофореза.
4. Программируемый термостат (ДНК-амплификатор).
17
5. Термостат на 45 - 55 ЬC для пробирок объемом 1,5 мл.
6. Ультрафиолетовый трансиллюминатор.
7. СВЧ-печь или водяная баня на 95 - 100 ЬC.
8. Встряхиватель для микропробирок (типа "Вортекс").
9. Тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans
методом ПЦР.
Техника обработки клинического
анализа
изложены
в
материала
инструкциях
и
по
проведения
применению
амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.
В качестве исследуемого клинического материала используют
кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.
ПЦР-анализ характеризуется
высокой
специфичностью,
чувствительностью (от 10 до 1000 клеток в пробе) и высокой
диагностической эффективностью на первой неделе заболевания
(начиная с первых суток),
Поэтому
его
даже на фоне
антибиотикотерапии.
можно рекомендовать как метод ранней экспресс-
диагностики лептоспирозов. При тяжелом течении инфекции на фоне
отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть
отнесена
к
методам
выбора
для
быстрого лабораторного
подтверждения клинического диагноза.
Вместе с тем отрицательный результат ПЦР-анализа не должен
быть основанием для прекращения диагностического поиска,
т.к.
день начала болезни не всегда точно известен. Диагностическая
чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может
быть значительно повышена за счет параллельного использования
серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы
заболевания.
18
Бактериологический метод
Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в
те же сроки,
что
и при использовании метода микроскопии.
Лептоспиры относятся
поэтому
к
медленнорастущим
выделение культуры
ретроспективного
имеет
подтверждения
микроорганизмам,
значение
только
клинического
для
диагноза
"лептоспироз" и более детальной расшифровки этиологии случая
или вспышки.
Исследуемый материал от больного - кровь,
мочу, СМЖ в
количестве 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой
или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели
больного.
При посеве
из
органов
трупа
человека
или павшего
сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия
брюшной полости
во избежание загрязнения посевов шпателем
осторожно прижигают поверхность органа.
Затем в этом месте
производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,50 см
и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с
соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу
с питательной средой.
Трупы грызунов в связи с быстрым развитием
обсеменения исследуют
в первые часы (не позднее 12 ч в
зависимости от температуры воздуха)
Грызунов
вскрывают
трупного
при
после
гибели
строгом соблюдении
зверька.
асептики.
Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода.
Стерильными
инструментами
производят
вскрытие
брюшной
полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри.
19
Затем небольшие кусочки ткани почки,
взятые пастеровской
пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе
вскрытия обжигаются.
Посевы следует производить в несколько (3 - 5) пробирок или
ампул со
средой,
которые
затем
помещают
в
термостат и
культивируют при температуре 28 - 30 ЬC.
Для культивирования
лептоспир
используют
жидкие
сывороточные питательные среды, основным компонентом которых
является сыворотка кролика
или барана (Терских, Фервоорта-
Вольфа и др.), а также полусинтетические твин-альбуминовые
среды.
Среда Терских.
Наиболее
практического использования
простой и оптимальной для
является
фосфатно-сывороточная
среда Терских. Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл
фосфатного буфера (pH = 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной
воды. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный
фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве
при 120 ЬC в течение 20 мин.; пробирки с выпавшим после
автоклавирования
кристаллическим
или
аморфным
осадком
выбраковывают.
В серии
пробирок с прозрачным содержимым выборочно
проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В
каждую
пробирку
добавляют
в
стерильных
условиях
инактивированную в течение 30 мин. При температуре 56 ЬC
нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на
5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть
использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане
20
при 56 ЬC
в
течение 1 ч.
После каждого прогревания среда
контролируется на стерильность (при 37 ЬC в течение суток).
В основу
среды
Фервоорта-Вольфа помимо компонентов,
входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и
NaCl (0,5 г на 1 л основы).
Твин-альбуминовая среда.
Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в
100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl - 25 г; ZnSO4 x
7H2O - 0,4 г; MgCl2 x 6H2O и CaCl2 x 2H2O по 1,5 г каждый;
FeSO4 x 7H2O - 0,5 г; пируват натрия - 10,0 г; глицерин - 10,0 г;
твин-80 - 10,0 г; тиамин HCl - 0,5 г и цианкобаламин - 0,02 г.
Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.
Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50
мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке,
добавляя следующие растворы: CaCl2 - MgCl2 - 1 мл; FeSO4 - 10 мл;
цианкобаламин - 1 мл; твин-80 - 12,5 мл. Доводят PH до 7,4 и
добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл.
Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.
Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной
воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный)
- 1 г; K2HPO4
(обезвоженный) - 0,3 г и NaCl - 1 г. Затем добавляют следующие
растворы: NH4Cl - 1 мл; тиамин - 1 мл; пируват натрия - 1,0 мл и
глицерин - 1 мл. PH основы среды доводят до 7,4, а затем
стерилизуют автоклавированием при 121 ЬC в течение 20 мин.
Для приготовления
жидкой
твин-альбуминовой
среды
1
объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы
среды при соблюдении асептики.
21
Селективные среды. В качестве селективных могут быть
использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды
после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.
Обработка посуды.
При
культивировании
лептоспир
следует пользоваться посудой из нейтрального или химического
стекла. Обработка новой
производится
в
или
бывшей
посудомоечной
в употреблении посуды
машине
с
использованием
специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной
обработки пробирок состоит из следующих этапов:
- погружение на 24 ч в 1 - 2%-ный раствор соляной кислоты;
- многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной
водопроводной воде;
- обработка ершами в горячем мыльном растворе;
- повторное многократное (12 - 15
раз)
промывание
в
Лептоспиры размножаются
в
проточной водопроводной воде;
- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;
- сушка и стерилизация.
Контроль роста культуры.
питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается
прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода
наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10
дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят
"раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле.
При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое
засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей
питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 - 10
дней при температуре 28 - 30 ЬC.
22
В случае получения хорошего роста (50 - 100 лептоспир в
поле зрения
при увеличении x 400) культуры используют как
рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и
составляют на них паспорт.
Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают
в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней.
отсутствии
роста
в
отрицательными.
течение
трех
месяцев
Рост лептоспир
в
посевы
жидких
При
считают
питательных
средах контролируют микроскопией, а также макроскопически просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При
осторожном
встряхивании
в
питательной
среде
четко
просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые
выросшей культурой.
При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой
(0,2% агара) на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные
плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно
расположенные колонии. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри
лептоспиры образуют субповерхностные колонии.
Штаммы хранят в соответствии с
инструкцией
хранения
патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один
раз в месяц.
Аналогичным способом контролируют рост культур
диагностических штаммов, предназначенных для серологических
исследований.
Хранение культур
постоянно поддерживаемые
пробирках
Лептоспиры
лептоспир.
в
Штаммы
лаборатории,
можно
под вазелиновым маслом или в запаянных
лептоспир,
хранить в
ампулах.
консервируют после выращивания в сывороточной
23
среде до максимального накопления.
В пробирку на культуру
наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла
или культуру разливают в стерильные ампулы (1 – 5 мл) из
нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в
темном
месте
при комнатной температуре.
В таких условиях
лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев.
Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие
среды, содержащие 0,2% агара.
При необходимости
длительного сохранения лептоспир их
помещают в паровую (-168 ЬC) или жидкую фазу (-196
жидкого
азота.
Предварительно
культуру с
ЬC)
добавленным
стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10%
охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин. (от 0 до 130 ЬC).
Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 ЬC. В этом
случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.
24
Профилактика
Предупреждение
лептоспироза
у
людей
предусматривает
проведение комплекса гигиенических и ветеринарных мероприятий.
Запрещается употребление сырой воды из открытых водоемов,
купание
в
малопроточных
сельскохозяйственным
животным.
водоемах,
доступных
Необходимо
пользоваться
защитной одеждой и обувью прн мелиоративных н гидротехнических
работах.
В антропоургических очагах водоемы защищают от грызунов и
сельскохозяйственных животных,
должны
пользоваться
ветеринары и животноводы
спецодеждой.
Необходимо
постоянно
проводить дератизационные мероприятия. Осуществляют изоляцию и
лечение больных животных.
Контингенты
высокого
риска
заражения
(животноводы,
ветеринары, рабочие мясокомбинатов, ассенизаторы, дератизаторы и
др.) подлежат вакцинации убитой лептоспирозной накипной.
Эффективна вакцинация сельскохозяйственных животных.
25
Литература
 Д.И. Дранкин, М.В. Годлевская. Лептоспироз. Саратов, 1988.
 Лептоспироз. Под редакцией В.С. Киктенко. М., 1985.
 Лептоспироз. Бернасовская Е.П., Угрюмов Б.Л., Вовк А.Д. и
др. Киев, 1989.
 В.И. Терских, И.Л. Коковин. Лептоспирозные заболевания
людей. М., 1964.
 Е.П. Шувалова Инфекционные болезни. М., 2005.
26