На правах рукописи ЛЕМЗА Анна Евгеньевна РОЛЬ
advertisement
На правах рукописи ЛЕМЗА Анна Евгеньевна РОЛЬ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТРЕСПОНСИВНОГО ЭЛЕМЕНТА В МЕХАНИЗМАХ МОДУЛИРОВАНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫМИ АНТИОКСИДАНТАМИ 14.03.03 – патологическая физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск) Научный руководитель: доктор медицинских наук Меньщикова Елена Брониславовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, Колпаков Аркадий Ростиславович профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России доктор биологических наук, Сорокина Ирина Васильевна в.н.с. лаборатории фармакологических исследований ФГБУН Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН Ведущая организация: ГБОУ ВПО "Сибирский медицинский университет" Минздрава России (Томск) государственный Защита состоится «27» мая 2014 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 001.048.01 в ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН и на сайте http://centercem.ru Автореферат разослан «__» ______________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Пальчикова Наталья Александровна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одним из неотъемлемых признаков воспалительной реакции является активация фагоцитирующих клеток, микробицидную функцию которых обусловливают генерируемые ими активированные кислородные метаболиты (АКМ), сдвигающие окислительно-восстановительное равновесие клеток в сторону прооксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса и может способствовать повреждению окружающих тканей. Наряду с этим большинство исследователей считает АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток [Brüne B. et al., 2013], , в том числе посредством изменения активности редокс-чувствительных транскрипционных факторов [Ляхович В.В. и др., 2006]. Особое место среди редокс-чувствительных систем клетки занимает сигнальный путь Keap1/Nrf2, активирующий экспрессию генов за счет взаимодействия транскрипционного фактора Nrf2 с цис-регуляторным антиоксидантреспонсивным элементом (ARE). Главным назначением регуляторной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание внутреннего гомеостаза при апоптозиндуцирующих, проканцерогенных и стрессовых воздействиях [Ляхович В.В. и др., 2006; Турпаев К.Т., 2013]. Исследования, проведенные на нокаутных по Nrf2 животных, выявляют важность ARE в процессах воспаления, канцерогенеза, фиброза, а также защиты от различных стрессовых воздействий [Меньщикова Е.Б и др., 2010]. Так, у мышей с выключенным геном Nrf2 более выражен воспалительный ответ на различные стимулы [Ma Q. et al., 2006], кроме того, Nrf2 способствует разрешению острых воспалительных процессов, препятствуя их хронизации [Reddy N.M. et al., 2009]. Биологическая важность ARE определяется тем, что от его активности зависит функционирование многих других редокс-чувствительных элементов, в том числе транскрипционных факторов NF-κB и АР-1, регулирующих развитие воспалительного процесса [Hayes J.D. et al., 2010; Wakabayashi N. et al., 2010], поэтому сигнальная система Keap1/Nrf2/ ARE считается перспективной мишенью при разработке новых противовоспалительных препаратов [Hybertson B.M. et al., 2011]. В научной литературе описан широкий спектр различных индукторов транскрипции генов, регулируемых ARE [Xiao H. Parkin K.L., 2006; Garbin U. et al., 2009], прежде всего это фенолы и хиноны, акцепторы Михаэля, серо- и селенсодержащие соединения. Большое внимание при исследовании новых стимуляторов ARE уделяется зависимости индуцирующей способности от структуры соединений: для фенолов существенно расположение ОН-групп [Prestera T. et al., 1993; Magesh S. et al., 2012] и степень их экранирования ортозаместителями [Takabe W. et al., 2006], для серо- и селен-содержащих соединений показана высокая активность диатомарной структуры –S-S- или -Se-Se[Xiao H. et al., 2006]. Кроме того, важен вопрос биодоступности антиоксидантов, многие из которых липофильны. В отличие от гидрофильных веществ, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их 3 всасывание в кишечнике происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет подбор дозировки и интервалов приёма. Для жирорастворимых соединений даже с доказанной высокой антиоксидантной активностью ведутся поиски водорастворимых аналогов или форм с целью повышения биодоступности [Yu H., 2011; Neves A.R. et al., 2013; Xiao Y. et al., 2013]. Ранее в системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная активность серосодержащих водорастворимых фенольных соединений, синтезированных в НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический университет" и представляющих собой экранированные трет-бутильными группами монофенолы с парапропильным заместителем сульфонатным или тиосульфонатным заместителем [Просенко А.Е. и др., 2001]. Антиоксидантный эффект соединений прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных систем, то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тест-системам, связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной, что, в частности, объяснялось их непрямым действием на регуляторную систему Keap1/Nrf2/ARE [Зенков Н.К. и др., 2007]. В соответствии с изложенным выше была сформулирована цель работы – изучить противовоспалительную активность новых синтетических водорастворимых фенольных антиоксидантов и исследовать ее возможную связь со способностью соединений индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи. 1. Изучить влияние структурно подобных фенольных антиоксидантов на жизнеспособность моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro. 2. Изучить особенности и специфичность активации антиоксидантных ферментов и ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом, in vitro с помощью 5 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов с выявлением наиболее эффективного соединения. 3. В условиях целого организма на модели острого локального воспаления путем скрининга 10 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов выявить соединение с наиболее выраженным противовоспалительным действием. 4. Исследовать способность наиболее активного соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента in vitro, изучив его влияние на внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в макрофагоподобных клетках линии J774 и фибробластах линии FLECH. 5. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие и течение воспалительного процесса на моделях острого воспаления (внутривенное введение зимозановых частиц, эндотоксиновый шок). 4 6. Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие воспалительного процесса на моделях хронического воспаления ("воздушный мешок", коллаген-индуцированный артрит). Научная новизна работы На клетках линии U937 показано, что все соединения нового ряда структурно зависимых водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов малотоксичны, за исключением селенсодержащего аналога, а 3-(3'трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в малых концентрациях увеличивает жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза. На клетках линии U937 показана способность новых синтетических монофенольных антиоксидантов активировать контролируемые антиоксидантреспонсивным элементом ферменты NAD(P)H:хиноноксидоредуктазу 1 и глутатион-S-трансферазы, выявлена зависимость индуцирующего эффекта от структуры соединений: для реализации биологической активности исследуемых соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома двухвалентной серы и степень экранирования ОН-группы. Наибольшим эффектом обладает ТС-13, для которого на клеточных линиях J774 и FLECH получено прямое доказательство способности активировать редокс-чувстви– тельную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, а именно дозозависимая индукция транслокации транскрипционного фактора Nrf2 из цитоплазмы в ядро. Впервые на модели острого каррагинан-индуцированного локального воспаления у крыс выявлена зависимость между химической структурой водорастворимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов и способностью ингибировать развитие отёка лапы, максимальная противовоспалительная активность показана для ТС-13. Установлено, что ТС-13 обладает выраженным протективным действием в отношении острого системного воспаления, способствуя угнетению генерации гранулоцитами крови АКМ. Однако применение ТС-13 при моделировании хронического воспаления (индуцированный гетерологичным коллагеном полиартрит) и его обострения (модель "воздушного мешка") способствовало снижению выраженности клинических признаков воспалительной реакции лишь на ранних стадиях, в то время как на более поздних стадиях его эффект проявлялся лишь в уменьшении активности и снижении праймированности к наработке АКМ нейтрофилов и моноцитов. Использование ТС-13 как индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE впервые показало, что ее активация обладает выраженным протективным действием в отношении проявлений острого, но не хронического воспаления. Теоретическая и практическая значимость работы Результаты исследования существенно дополняют представления о механизмах патогенеза воспалительных процессов данными об участии в них редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE. Полученные в ходе исследования структурно зависимого ряда водорастворимых монофенольных антиоксидантов данные позволяют рекомендовать 35 (3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в качестве перспективного средства дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, благодаря выявленному значимому противовоспалительному действию в отношении острых воспалительных процессов в сочетании с высокой скоростью развития данного эффекта. При этом результаты настоящего исследования свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к противовоспалительной терапии с учётом фазы, стадии и степени выраженности процесса, в том числе в связи с большей эффективностью индукторов редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE на ранних этапах развития воспаления. Положения, выносимые на защиту 1. Синтетические водорастворимые структурно подобные фенольные антиоксиданты способны индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE, выраженность эффекта зависит от химической структуры соединений. Наибольшую активность среди исследованных соединений проявляет частично экранированный 3(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13). 2. Эффективный индуктор сигнальной системы антиоксидантреспонсивного элемента ТС-13 обладает наиболее выраженной противовоспалительной активностью на модели острого локального воспаления по сравнению с другими исследованными структурно подобными соединениями. 3. Противовоспалительное действие эффективного индуктора сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 более выражено в отношении острых, чем хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов. Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Шестой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2010), VIII международной конференции "Биоантиоксидант" (Россия, Москва, 2010), 17-й Ежегодной конференции общества свободнорадикальной биологии и медицины (SFRBM's 17th Annual Meeting), (США, Орландо, 2010), 7-й научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011), Седьмой международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина, Судак, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодежи "Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитозоны" (Якутск, 2011), Шестой Всероссийской научно-практической конференции "Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов" (Новосибирск, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав (включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, 6 изложение собственных результатов и их обсуждение) заключения, выводов и списка 375 источников цитируемой литературы (31 отечественный и 344 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 7 таблицами, 36 рисунками и 1 схемой. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-00600) с использованием оборудования ЦКП "Современные оптические системы". Автор глубоко признательна В.О. Ткачёву за неоценимую помощь в работе, сотрудникам НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО НГПУ Н.В. Кандалинцевой, А.Е Просенко за предоставленные оригинальные соединения. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты in vitro выполнены на макрофагоподобных клетках гистиоцитарной лимфомы человека U937, гистиоцитарной саркомы мыши J774 и фибробластах легкого эмбриона человека FLECH, полученных из ФГБУН Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). В экспериментах in vivo использовали крыс линии Вистар массой 200–300 г и 6-недельных мышей (C57Bl6xDBA/2)F1 массой 18–24 г, полученных из Экспериментальнобиологической клиники лабораторных животных СО РАМН (г. Новосибирск). Все спектрофотометрические исследования проводили на планшетном фотометре BioTek ELx808 (BioTek, США), проточную цитофлуориметрию выполняли на приборе FACSCalibur (Becton-Dickinson, США), анализ иммунофлуоресцентного окрашивания осуществляли на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss, Германия), для хемилюминесцентных исследований применяли прибор ХЛМЦ-01 (г. Новосибирск). Жизнеспособность клеток U937 под воздействием исследуемых соединений определяли спектрофотометрически в МТТ-тесте через 24 ч инкубации. Выраженность апоптоза и некроза при окислительном стрессе, индуцированном Н2О2, оценивали с помощью проточной флуориметрии по величине трансмембранного митохондриального потенциала (с использованием красителя DiOC6) и по проницаемости клеточной мембраны для PI соответственно. Активность ферментов измеряли спектрофотометрически в лизатах клеток U937, приготовленных через 24 ч инкубации с исследуемыми соединениями: NQO1 – по скорости реакции NADPH-зависимого окисления дихлориндофенола, GST – по скорости образования конъюгатов глутатиона с динитрохлорбензолом, GR – по скорости окисления NADPH, расходующегося на восстановление GSSG. Изменение оптической плотности пересчитывали в изменение концентрации продукта, используя коэффициент экстинкции. После измерения количества белка по Брэдфорду в клеточном лизате активность фермента нормировали на общее количество белка, на основании чего делали вывод об изменении активности фермента. Суммарное содержание глутатиона (GSH и GSSG) в лизатах клеток U937, приготовленных через 24 ч инкубации с исследуемыми соединениями, определяли спектрофотометрически по скорости его взаимодействия с 5,5’7 дитиобис-2-нитробензойной кислотой, для измерения содержания GSSG каждую пробу предварительно инкубировали с 2,5% 2-винилпиридина для необратимой конъюгации GSH. Концентрацию GSH определяли как разность содержания суммарного и окисленного глутатиона. Для определения локализации транскрипционного фактора Nrf2 клетки линий J774 и FLECH окрашивали с помощью поликлональных кроличьих антител к Nrf2 и вторичных антител к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных с флуорохромом Texas Red, клеточные ядра контрастировали DAPI. Продукцию АКМ лейкоцитами определяли в образце крови из хвостовой вены либо в образце воспалительного экссудата. цитофлуориметрических исследованиях использовали дихлородигидрофлуоресцеин и дигидроэтидин, окисляющиеся соответственно H2O2 до флуоресцентного дихлорфлуоресцина и супероксид-анионом до флуоресцентного этидина, дыхательный взрыв стимулировали PMA. При хемилюминесцентных исследованиях использовали люминол, дыхательный взрыв стимулировали частицами зимозана; одновременно определяли общее содержание лейкоцитов, на мазках крови подсчитывали лейкоцитарную формулу и выполняли расчет удельной интенсивности дыхательного взрыва. Острое локальное воспаление (модель 1) индуцировали введением крысам линии Вистар интраплантарно в правую заднюю лапу 0,1 мл 10% раствора каррагинана λ, выраженность отека лапы определяли плетизмометрически через 5 ч. Тестируемые соединения вводили за 1 ч до инъекции каррагинана. В этой и последующих экспериментальных моделях использовали внутрижелудочное введение 1 мл растворов соединений в дозе 100 мг/кг массы тела животного (за исключением модели 3) с помощью зонда, контрольные животные аналогичным образом получали растворитель (дистиллированную воду). Неспецифическое острое системное воспаление (модель 2) индуцировали однократным введением в латеральную хвостовую вену крысам линии Вистар 1 мл суспензии частиц зимозана (20 мг/мл) в 0,89% растворе NaCl. За 2 ч до этого и через 5 ч после животным опытной группы вводили раствор ТС-13, в последующем – дважды в день; на 2-й и 3-й день получали кровь из хвостовой вены и определяли продукцию АКМ (в диссертацию продублировать). Эндотоксиновый шок (модель 3) вызывали внутрибрюшинным введением мышам (C57Bl6xDBA/2)F1 липополисахарида E. coli 055:B5, растворенного в 0,89% растворе NaCl, в дозе 1 мг на мышь, за 3 часа до инъекции животные опытной группы получали 0,1 мл раствора ТС-13 (200 мг/кг массы тела). Для индукции обострения хронического воспаления использовали модель «воздушного мешка» ("air pouch") (модель 4): крысам линии Вистар 3 раза в течение 7 дней вводили от 20 до 10 мл стерильного воздуха под кожу в межлопаточной области, после чего в образовавшуюся воздушную полость делали инъекцию 2 мл 1% водного раствора каррагинана λ, через сутки исследовали воспалительный экссудат. Раствор ТС-13 вводили за 1 сутки, за 1 час до инъекции каррагинана и через 5 часов после. Неспецифическое воспаление суставов лап самцов крыс Вистар (мо8 дель 5, ревматоидный полиартрит) индуцировали путем внутрикожной инъекции раствора гетерологичного бычьего коллагена типа II в смеси с адъювантом Фрейнда. Раствор ТС-13 вводили в день иммунизации и в последующем через день. Через каждые 7 суток после иммунизации плетизмометрически измеряли объем задних лап, начиная с 15 суток каждые 2–3 дня по 5балльной системе определяли визуальные стадии артрита, на 32-й день животных умерщвляли и забирали кровь для определения количества и функциональной активности лейкоцитов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05. Для определения достоверности различий между кривыми выживаемости животных опытной и контрольной групп, построенными по методу Каплана Майера, применяли логранговый тест. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В настоящей работе исследован ряд структурно взаимосвязанных водорастворимых фенольных соединений, в различной степени оказывающих, как показано в более ранних работах [Зенков Н.К. и др., 2007], антиоксидантный эффект (за исключением незамещённого метоксилированного фенола С-10), зависящий от наличия атома двухвалентной серы и степени экранирования ОНгруппы. Таким образом, это группа соединений, одновременно проявляющих антиоксидантные свойства и обладающих признаками сразу трёх классов индукторов системы антиоксидант-респонсивного элемента (фенолы, акцепторы Михаэля, серосодержащие соединения), что позволяет предполагать у них наличие ARE-индуцирующего действия. Наиболее перспективным представителем этого ряда соединений является ТС-13, проявляющий бифункциональное антиоксидантное действие, обусловленное наличием в пара-алкильном заместителе активной серы. Кроме того, частичное экранирование ОН-группы трет-бутильным заместителем увеличивает стабильность соединения при небольших пространственных затруднениях: природных соединений аналогичного строения не существует в связи с отсутствием в живых организмах трансфераз, способных переносить трет-бутильные группы на бензольное кольцо [Зенков Н.К. и др., 2003]. Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность клеток в культуре. Установлено, что, за исключением селенсодержащего аналога, все соединения представленного ряда структурно зависимых монофенольных серосодержащих антиоксидантов обладают невысокой токсичностью, а ТС-13 в малых концентрациях способен даже увеличивать жизнеспособность клеток как в нормальных условиях (рисунок 1), так и при развитии окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза рисунок 2). Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать ARE-зависимые ферменты в культуре клеток. Сравнительный анализ способности фенольных антиоксидантов представленного ряда инду9 цировать синтез ARE-зависимых ферментов II фазы детоксикации ксенобио Рисунок 1. Влияние ТС-13 на жизнеспособность клеток линии U937. Рисунок 2. Влияние ТС-13 на выживаемость клеток U937 через 24 ч после добавления цитотоксической концентрации H2O2 по результатам МТТ-теста. По оси абсцисс – концентрация ТС-13; обозначены статистически значимые отличия (p < 0,05) от величин соответствующих показателей: # – интактных клеток (культивируемых без H2O2), * – клеток, культивируемых с H2O2 в отсутствие ТС-13. тиков и антиоксидантных ферментов, оцененный на основе их влияния на активность GST и NQO1, показал, что способность к активации данных энзимов у исследуемых соединений существенно различается и зависит от их химической структуры. Наибольшим стимулирующим эффектом обладал ТС-13, в 10 концентрации 20 мкМ увеличивая активность GST и NQO1 в 1,86 и 2,31 раза соответственно, в то время как для соединений, отличающихся от него полным экранированием функциональной группы, укороченным на одно метиленовое звено пара-алкильным заместителем, отсутствием бивалентного атома серы или заменой его на атом селена (II), была характерна частичная (от умеренной до почти полной) потеря биологической активности. Эти данные свидетельствуют о том, что для реализации биологической активности исследуемых соединений важна степень экранирования ОН-группы и присутствие атома двухвалентной серы в структуре пара-алкильного заместителя. Предположение об индукции именно синтеза ферментов (т.е. экспрессии соответствующих генов) как механизма их активации основано на свойстве большинства представленных фенолов полностью гидролизироваться в водных растворах уже через сутки, что исключает возможность аллостерического влияния на сами ферменты. Способность же индуцировать экспрессию зависимых от антиоксидантреспонсивного элемента генов антиоксидантами, структура которых отвечает критериям индукторов ARE, косвенно подтверждает их активирующее влияние на сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, об этом же свидетельствует наличие тесной корреляции между NQO1- и GST-индуцирующими способностями тестируемых соединений. Влияние исследуемых фенольных антиоксидантов на развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1). В результате проведённого с целью выявления соединения с наиболее выраженными противовоспалительными свойствами скрининга синтезированных фенолов в модели каррагинаниндуцированного отёка лап крыс линии Вистар обнаружено, что хотя практически все тестируемые соединения обладают способностью оказывать достоверно значимый противовоспалительный эффект, выраженность её зависит от химического строения антиоксидантов: у соединений с укороченным параалкильным заместителем, инактивированной функциональной группой или заменой активного атома серы на селен способность ингибировать развитие отёка лапы практически отсутствовала (рисунок 3). Очевидно, что исследуемые соединения ингибируют лишь часть из множества процессов и реакций, протекающих в ходе развития такого многокомпонентного процесса как воспаление. В то же время многие из этих процессов находятся под контролем фактора NF-κB, провоспалительные эффекты которого способна подавлять система Keap1/Nrf2/ARE, что позволяет предложить способность синтезированных фенольных антиоксидантов индуцировать эту систему как основу их противовоспалительного действия. На основании полученных данных для дальнейшей работы был выбран частично экранированный ТС-13, обладающий максимально выраженными биологическими эффектами при умеренно выраженной токсичности. Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента Так как основным триггерным механизмом индукции системы Keap1/Nrf2/ARE является сдвиг редокс-баланса в биологических системах в 11 сторону прооксидантов, а наиболее адекватным его показателем служит соот Рисунок 3. Влияние фенольных антиоксидантов на выраженность воспалительной реакции. ношение восстановленных и окисленных SH-групп в белках, напрямую зависящее от системы глутатиона, было изучено влияние ТС-13 на эту систему. Показано, что ТС-13 способен оказывать дозозависимое стимулирующее действие на глутатионредуктазу (GR), проявляя при этом характерный для многих индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE горметический эффект и увеличивать содержание общего глутатиона в клетках (в основном за счёт его восстановленной формы GSH), тем самым формируя тенденцию к увеличению соотношения восстановленного и окисленного глутатиона (GSSG) (рисунок 4). Все полученные в ходе исследования данные косвенно свидетельствовали о способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента, для подтверждения которой была изучена способность ТС-13 инициировать ядерную транслокацию молекулы Nrf2, являющуюся ключевым моментом активации системы Keap1/Nrf2/ARE. Было показано, что под действием ТС-13 происходит перераспределение внутриклеточного пула Nrf2 с преимущественным накоплением его в ядре, эффект зависел от дозы. Полученные результаты, таким образом, подтверждают предполагавшуюся способность фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, которая, наиболее вероятно, и является основной его цитопротекторных свойств. Кроме того обнаруженная индуцирующая активность носит универсальный характер, хотя для разных типов клеток дозовая зависимость неоднозначна и наиболее явно проявляется в слу12 чае мононуклеарных фагоцитов (рисунок 5). Рисунок 4. Влияние ТС-13 на активность GR (А), внутриклеточное содержание общего глутатиона (Б), GSH (В) и соотношение GSH/GSSG (Г). Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2). Влияние индуцирующего систему Keap1/Nrf2/ARE действия ТС-13 на воспалительный процесс было рассмотрено в нескольких модельных системах in vivo, помимо уже опи13 санного эффекта на острое локальное воспаление. Рисунок 5. Влияние ТС-13 на изменение ядерно-цитоплазматического соотношения содержания Nrf2 в клетках J774 (А) и FLECH (Б). На модели зимозан-индуцированного острого системного асептического воспаления было установлено, что индукция ARE замедляла повышение до статистически значимого уровня общего содержания лейкоцитов в крови (которое в данной модели является основным показателем развития острого системного воспаления) и способствовала ускорению снижения концентрации гранулоцитов, которая уже на третьи сутки после индукции воспаления была ниже, чем у животных контрольной группы (рисунок 6). Рисунок 6. Влияние ТС-13 на количество лейкоцитов (А) и гранулоцитов (Б) периферической крови крыс в динамике острого системного воспалительного процесса. Здесь и на рис. 7–10 светлые символы – контроль, темные – ТС13; # – p < 0,05 по сравнению с исходным значением, принятым за 100%, * р < 0,05 – по сравнению с контролем. 14 Индуцирующее действие ТС-13 не влияло на показатели объёмной плотности таких деструктивных изменений как некроз и дистрофия, но способствовало значимому (на 47 %) снижению объёмной плотности инфильтратов в печени животных. Кроме того, индукция ARE фенольным антиоксидантом приводила к существенному снижению спонтанной продукции АКМ гранулоцитами крови и способности клеток к развитию индуцированного как корпускулярными (зимозан), так и растворимыми (РМА) стимуляторами дыхательного взрыва (рисунок 7). Рисунок 7. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (А, Б) и дыхательного взрыва (В, Г) гранулоцитов периферической крови крыс, определяемой с помощью хемилюминесценции (А, В) и проточной цитофлуориметрии (Б, Г), в динамике острого системного воспалительного процесса. Таким образом, флоголитический эффект ТС-13 в отношении острого системного воспаления реализуется как путём непосредственно подавления генерации АКМ гранулоцитами, являющимися основными эффекторами острого воспаления, так и вследствие угнетения провоспалительной активности мак15 рофагов/моноцитов и их способности праймировать гранулоциты к развитию дыхательного взрыва. Доказанная способность ТС-13 индуцировать систему Keap1/Nrf2/ARE и наличие сильной обратной корреляции между транскрипционной активностью NF-κB и Nrf2 в мононуклеарных фагоцитах позволяет предположить, что действие ТС-13 на циркулирующий пул гранулоцитов опосредовано снижением активности NF-κB в моноцитах и макрофагах, что сопровождается ингибированием синтеза провоспалительных цитокинов, праймирующих нейтрофилы. Хотя в данном случае исключать прямое влияние ТС13 на полиморфноядерные лейкоциты также нельзя. Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие острого системного септического воспаления in vivo (модель 3). На основании полученных на предыдущем этапе работы результатов было высказано предположение, что активация системы Keap1/Nrf2/ARE может оказывать протективное действие и при липополисахарид-индуцированном летальном эндотоксиновом шоке. Проведённое исследование подтвердило предполагаемый эффект: смертность животных, получавших ТС-13, была достоверно ниже, чем мышей контрольной группы (рисунок 8). Вероятнее всего, индукция сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE водорастворимым фенольным антиоксидантом ТС-13 обладает существенным защитным действием в отношении септического шока, индуцированного введением бактериального эндотоксина, за счет снятия эффектов, опосредуемых редоксчувствительным транскрипционным фактором NF-κB, и уменьшения выраженности дыхательного взрыва фагоцитов. Важно отметить высокую скорость наступления эффекта. Рисунок 8. Влияние приема раствора ТС-13 на выживаемость мышей после индукции эндотоксинового шока. 16 Таким образом, учитывая полученные ранее данные о способности индуктора системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 подавлять развитие каррагинан-индуцированного отёка лапы, можно сделать вывод о выраженном протективном действии редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных процессов in vivo, способствующем снижению продукции АКМ и выраженности окислительного стресса, осуществляемом, в том числе, через угнетение системы провоспалительного редокс-чувствительного фактора NF-κB. Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие обострения хронического воспаления (модель 4). На модели обострения хронического воспаления ("air pouch", "воздушный мешок") было установлено, что индукция системы Keap1/Nrf2/ARE фенольным антиоксидантом ТС-13 не влияет на объем воспалительного экссудата, содержание в нём белка и клеточных элементов, но статистически значимо снижает способность этих клеток к наработке АКМ, как спонтанной, так и при развитии дыхательного взрыва под действием корпускулярных и растворимых стимуляторов (рисунок 9). Рисунок 9. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (1, левые оси ординат) и дыхательного взрыва (2, правые оси ординат) клеток экссудата, определяемой с помощью хемилюминесценции (А) и проточной цитфлуориметрии (Б), при моделировании воспаления в "воздушном мешке". Таким образом, функциональная активность лейкоцитов, мигрировавших в очаг воспаления, была закономерно снижена, тогда как проявления воспалительной реакции, зависящие от состояния эндотелиального барьера, оказались неизмененными, что позволяет считать основной мишенью противовоспалительного действия фенольных антиоксидантов, активирующих ARE, гранулоциты крови и, возможно, праймирующие их макрофаги. Влияние фенольного антиоксиданта ТС-13 на развитие неспецифического аутоиммунного воспаления суставов (полиартрит; модель 5). С целью оценки способности системы Keap1/Nrf2/ARE влиять на выраженность неспецифического воспаления суставов лап самцов крыс Вистар и генерацию АКМ клетками-эффекторами воспаления была использована модель индуцированного гетерологичным коллагеном ревматоидного артрита, степень тяже17 сти которого коррелировала с уменьшением прироста массы тела крыс, поскольку развитие данного поражения сопряжено с многократным усилением синтеза и секреции TNF-α (наиболее явно эта зависимость проявилась ближе к концу эксперимента). Была обнаружена тесная взаимосвязь между выраженностью прироста размеров обеих конечностей и стадией воспаления. Наиболее явные различия между крысами опытной и контрольной групп проявились на начальных стадиях патологического процесса, когда на 15 и 18 сутки после иммунизации показатель средней визуальной стадии воспаления на пораженную конечность был достоверно ниже в опытной группе, чем в контрольной (рисунок 10). Рисунок 10. Динамика изменения визуальных признаков воспаления в ходе развития ревматоидного артрита у крыс, получавших раствор ТС-13 ( ) и воду ( ). На 32-е сутки эксперимента крысы в опыте и контроле не различались по содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови, как не было различий и по способности лейкоцитов генерировать АКМ. Но интенсивность дыхательного взрыва гранулоцитов крови значимо коррелировала как с увеличением объемов обеих задних конечностей, так и со стадией воспаления, что подтверждает праймированность клеток в ходе развития артрита. При детальном рассмотрении отдельных компонентов АКМ-синтезирующей функции фагоцитов было установлено, что праймированность моноцитов к наработке H2O2 у животных, получавших ТС-13, достоверно ниже, чем в контроле (в 1,68 раза, p < 0,05), а активация и праймированность нейтрофилов имеет тенденцию к уменьшению (спонтанная генерация H2O2 снижена в 1,4 раза, индуцированная PMA – в 1,56 раза по сравнению с контролем (р = 0,062)). На основании полученных данных можно заключить, что на ранних стадиях развития аутоиммунного полиартрита индукция системы Keap1/Nrf2/ARE 18 оказывает защитное действие, проявляющееся в снижении выраженности воспалительной реакции. На более поздних стадиях противовоспалительный эффект активации редокс-чувствительной системы проявлялся в снижении активности и праймированности к генерации АКМ нейтрофилов и, в большей степени, моноцитов. Таким образом, в случае хронического воспаления клинические признаки воспаления (отек, покраснение, миграция гранулоцитов) практически не изменялись при активации ARE индуктором ТС-13, несколько уменьшаясь лишь на начальных этапах. И даже выявленное снижение окислительного метаболизма лейкоцитов, клеток-эффекторов и модуляторов воспаления, не влияет существенно на выраженность процесса. Полученные данные свидетельствуют о выраженном флоголитическом действии редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных процессов и её участии только в предупреждении заболевания при развитии хронического воспаления, когда иммунный компонент является преобладающим. ВЫВОДЫ 1. Исследованные структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают невысокой токсичностью (за исключением селенсодержащего аналога СС-13) при тестировании в культурах моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro, по степени увеличения токсичности располагаясь в ряд: ТС-13 > ТС-12 > ТС-17 = С-13 > СС-13. Единственное соединение из протестированных, 3-(3'-трет-бутил-4'гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), в низких концентрациях (100 и 200 мкМ) увеличивает жизнеспособность клеток, что, очевидно, связано с его способностью ингибировать апоптоз. 2. Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают различной способностью активировать ферменты, контролируемые системой антиоксидант-респонсивного элемента, выраженность эффекта в наибольшей степени определяется степенью экранирования фенольной группы и наличием атома двухвалентной серы в пара-алкильном заместителе. Максимальную эффективность из исследованных соединений проявляет 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС13) в концентрации 20 мкМ, увеличивая активность глутатион-S-трансфераз и NAD(P)H:хиноноксидоредуктазы 1 в 1,86 и 2,31 раза соответственно. 3. ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия) в моноцитарно-макрофагальной клеточной культуре J774 и культуре фибробластов FLECH дозозависимо (с максимальным эффектом при концентрации 20 мкМ) индуцирует транслокацию молекулы Nrf2 в ядро, что служит прямым доказательством его участия в индукции системы антиоксидантреспонсивного элемента. 4. Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты оказывают противовоспалительное действие в отношении остро19 го воспаления на модели отека лапы. Максимальной дозозависимой активностью из исследованных соединений обладает 3-(3'-трет-бутил-4'гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), ED50 = 26 мг/кг массы тела. ТС-13 также эффективен в отношении проявлений острого системного асептического воспаления и эндотоксинового шока при назначении в дозах 100 и 200 мг/кг массы тела животного соответственно. Очевидно, защитное действие ТС-13 в отношении исследованных проявлений острых воспалительных процессов связано со способностью соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента. 5. Протективный эффект индуктора системы антиоксидант-респонсивного элемента 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфоната натрия (ТС-13) в отношении визуальных проявлений клинических признаков хронического воспаления (модели "воздушного мешка" и коллагениндуцированного артрита) менее выражен, чем при остром воспалении, при этом применение этого соединения в дозе 100 мг/кг массы тела сопровождалось снижением продукции активированных кислородных метаболитов фагоцитирующими клетками. 6. ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия) может служить перспективным средством дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих клеток, за счет выраженной активности при острых воспалительных процессах и высокой скорости наступления эффекта. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Защитное действие ARE-индуцирующего фенольного антиоксиданта ТС-13 при хроническом воспалении / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, В.О. Ткачев, А.Е. Лемза, Н.В. Кандалинцева // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2013. - Т. 155, № 3. - С. 305-309. (Из списка ВАК). 2. Противовоспалительная активность индуцирующего систему антиоксидант-респонсивного элемента (ARE) фенольного антиоксиданта ТС-13 / Е.Б. Меньщикова, В.О. Ткачев, Н.К. Зенков, А.Е. Лемза, Т.В. Шаркова, Н.В. Кандалинцева // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2013. - Т. 155, № 3. - С. 344-348 (Из списка ВАК). 3. Водорастворимый фенольный антиоксидант ТС-13 обладает цитопротекторными свойствами при окислительном стрессе / В.О. Ткачев, А.Е. Лемза, Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, Н.В. Кандалинцева, С.Е. Ягунов // Кислород и антиоксиданты.– 2010.– вып. 2.– С. 9–10. 4. Влияние водорастворимого фенольного антиоксиданта ТС-13 на системное воспаление / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, В.О. Ткачев, А.Е. Лемза, Т.В. Шаркова, Н.В. Кандалинцева, С.Е. Ягунов // Кислород и антиоксиданты.– 2010.– вып. 2.– С. 67–68. 5. Связь противовоспалительных свойств водорастворимых фенольных антиоксидантов с активацией ими антиоксидант-респонсивного элемента ARE / В.О. Ткачев, Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, А.Е. Лемза, Н.В. Кандалинцева, 20 С.Е. Ягунов // Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: Тезисы Шестой междунар. конф., Судак, 20–29 сентября 2010 г.– Судак, 2010.– С. 43. 6. Исследование противовоспалительных свойств фенольных серосодержащих антиоксидантов на модели воздушного мешка / А.Е. Лемза, Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, В.О. Ткачев, Н.В. Кандалинцева, С.Е. Ягунов // Биоантиоксиданты: Тезисы докл. VIII междунар. конф., Москва, 4–6 октября 2010 г.– М., 2010.– С. 254–256. 7. Возможный механизм активации Nrf2/ARE фенольными серосодержащими антиоксидантами за счет образования дисульфидов / В.О. Ткачев, Н.К. Зенков, Е.Б. Меньщикова, А.Е. Лемза, Н.В Кандалинцева, С.Е. Ягунов // Биоантиоксидант: Тезисы докл. VIII междунар. конф., Москва, 4–6 октября 2010 г.– М., 2010.– С. 462–463. 8. Antioxidant response element activating sulfur-containing monophenols as novel anti-inflammatory agents / V. Tkachev, E. Menshchikova, N. Zenkov, N. Zaitseva, A. Lemza, T. Sharkova, N. Kandalintseva, S. Yagunov // Free Radic. Biol. Med. – 2010.– Vol. 49, Suppl. 1.– P. S149. 9. Antioxidant responsive element as molecular target of novel water-soluble phenolic antioxidants anti-inflammatory action / V. Tkachev, E. Menshchikova, N. Zenkov, N. Zaitseva, A. Lemza, T. Sharkova, N. Kandalintseva, S. Yagunov // Proc. Annual Meet. SFRR/EEMS, September 12–15, 2010.– Oslo, 2010.– P. 221–222. 10. Лемза А.Е. Окислительный стресс при воспалении и его коррекция фенольными антиоксидантами / А.Е. Лемза // Материалы XLIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» Биология, 16-20 апреля 2011 г. – Новосибирск, 2011. – С. 24. 11. Selectivity of ARE-inducing phenolic antioxidant TS-13 anti-inflammatory effect / E.B. Menshchikova, N.K. Zenkov, V.O. Tkachev, A.E. Lemza, N.V. Kandalintseva // Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants and Human Health: proc. 7th Nat. Sci. Pract. Conf. Int. Particip., Smolensk, September 14–18.– Smolensk, 2011.– P. 176–177. 12. Возможность антиоксидантной терапии воспалительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К, Зенков, В.О. Ткачёв, А.Е. Лемза, Н.С. Зайцева, Н.В. Кандалинцева // Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии: Тезисы докл. Седьмой междунар. крымской конф., Судак, 22–30 сентября 2011 г.– М., 2011.– С. 27. 13. Противовоспалительный эффект индуктора редокс-чувствительной системы Nrf2/Keap1/ARE / Е.Б. Меньшикова, Н.К, Зенков, В.О. Ткачёв, А.Е. Лемза, Н.В. Кандалинцева // Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитзоны: Сб. трудов Всерос. научно-практич. конф. с элементами научной школы для молодежи, 11–12 ноября 2011 г. – Якутск, 2011. – С. 74–81. 14. Влияние непрямого антиоксидантного воздействия на развитие острого и хронического воспаления / А.Е. Лемза, Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков, Т.В. Шаркова, Н.В. Кандалинцева // Фундаментальные аспекты компенсаторно21 приспособительных процессов: Материалы Шестой Всерос. научно-практич. конф., 16–17 апреля 2013 г. – Новосибирск, 2013. – С. 92–93. АКМ ARE DAPI DiOC6 GR GSH GSSG GST MTT NQO1 PBS PI PMA tBHQ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ активированные кислородные метаболиты антиоксидант-респонсивный элемент 4',6-диамино-2-фенилиндол 3,3'-дигексилоксакарбоцианин йодид, глутатионредуктаза восстановленная форма глутатиона окисленная форма глутатиона глутатион-S-трансферазы бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия NAD(P)H:хиноноксидоредуктаза фосфатно-солевой буфер йодид пропидия форбол-12-миристат-13-ацетат трет-бутилгидрохинон Соискатель Лемза А.Е. 22
