РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
«НАУЧНЫЙ ЦЕНТР КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ»
На правах рукописи
ЛЕМЗА
Анна Евгеньевна
РОЛЬ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТ-РЕСПОНСИВНОГО
ЭЛЕМЕНТА В МЕХАНИЗМАХ МОДУЛИРОВАНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫМИ
АНТИОКСИДАНТАМИ
14.03.03 – патологическая физиология
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Меньщикова Елена Брониславовна
Новосибирск, 2014
2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AKR1c2
альдокеторедуктаза 1С2 человека
ARE
антиоксидант-респонсивный элемент
BSA
бычий сывороточный альбумин
COX
циклооксигеназа
DAPI
4',6-диамино-2-фенилиндол
DCF
дихлорфлуоресцин
DiOC6
3,3'-дигексилоксакарбоцианин йодид
DMSO
диметилсульфоксид
E+
этидин
ELAM
молекула адгезии лейкоцитов к эндотелию, Е-селектин
EpRE
электрофил-респонсивный элемент
GCLC
каталитическая субъединица глутаматцистеинлигазы
GCLM
регуляторная субъединица глутаматцистеинлигазы
GR
глутатионредуктаза
GSH
восстановленная форма глутатиона
GSSG
окисленная форма глутатиона
GST
глутатион-S-трансферазы
HO-1
гемоксигеназа-1
IFN
интерферон
IL
интерлейкин
IRES
внутренний участок посадки рибосом
LPS
липополисахарид
MTT
бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия
NES
сигнал ядерного экспорта
NLS
сигнал ядерной локализации
NO
оксид азота
NOS
синтаза оксида азота
NQO1
NAD(P)H:хиноноксидоредуктаза
PBS
фосфатно-солевой буфер
PI
йодид пропидия
PMA
форбол-12-миристат-13-ацетат
SOD
супероксиддисмутаза
tBHQ
трет-бутилгидрохинон
TNF
фактор некроза опухолей
3
TRE
сайт связывания АР-1
TRX
тиоредоксин
VCAM
молекула адгезии клеточного эндотелия
XRE
ксенобиотик-респонсивный элемент
АКМ
активированные кислородные метаболиты
МПО
миелопероксидаза
ПОЛ
перекисное окисление липидов
ЭПО
эозинофильная пероксидаза
4
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 6
1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................... 11
1.1.
Механизмы
респонсивного
функционирования
элемента
редокс-чувствительной
Keap1/Nrf2/ARE
и
ее
роль
в
системы
антиоксидант-
поддержании
окислительно-
восстановительного равновесия in vivo ............................................................................................. 11
1.1.1.
Гены с ARE-контролируемой экспрессией ......................................................................... 11
1.1.2.
Индукторы системы Keap1/Nrf2/ARE.................................................................................. 13
1.1.3.
Структура компонентов системы Keap1/Nrf2/ARE ............................................................ 16
1.1.3.1. Структура ARE ....................................................................................................................... 16
1.1.3.2. Структура Nrf2 ....................................................................................................................... 18
1.1.3.3. Структура Keap1 .................................................................................................................... 18
1.1.4.
Механизмы активации системы Keap1/Nrf2/ARE .............................................................. 19
1.1.5.
Механизмы инактивации системы Keap1/Nrf2/ARE .......................................................... 30
1.2.
Активированные кислородные метаболиты и их роль в развитии окислительного
стресса и воспаления ............................................................................................................................ 32
1.3.
Роль системы Keap1/Nrf2/ARE в воспалении ..................................................................... 47
1.4.
Синтез
и
исследование
антиоксидантных
и
биологических
свойств
новых
водорастворимых серосодержащих фенольных соединений .......................................................... 54
2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ..................................................................................................... 57
3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................................... 66
3.1.
Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность
клеток в культуре ................................................................................................................................. 67
3.2.
Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать ARE-
зависимые ферменты в культуре клеток ............................................................................................ 73
3.3.
Изучение
влияния
исследуемых
фенольных
антиоксидантов
на
способность
модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1) .................................. 78
3.4.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему
антиоксидант-респонсивного элемента ............................................................................................. 81
3.4.1.
Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на содержание глутатиона и
активность глутатионредуктазы ......................................................................................................... 81
3.4.2.
Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на активацию транскрипционного
фактора Nrf2 ......................................................................................................................................... 82
3.5.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2) ................................................. 89
5
3.6.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
острого системного септического воспаления in vivo (модель 3) ................................................... 92
3.7.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
хронического воспаления .................................................................................................................... 94
3.7.1.
Обострение хронического воспаления (модель 4) .............................................................. 94
3.7.2.
Неспецифическое аутоиммунное воспаление суставов (полиартрит; модель 5) ............ 96
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 102
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 109
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................... 111
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Одним из неотъемлемых признаков воспалительной реакции является активация
фагоцитирующих клеток, микробицидную функцию которых обусловливают генерируемые
ими активированные кислородные метаболиты, сдвигающие окислительно-восстановительное
равновесие клеток в сторону прооксидантов, что приводит к развитию окислительного стресса
и может способствовать повреждению окружающих тканей. Наряду с этим большинство
исследователей считает активированные кислородные метаболиты важными регуляторами
клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки,
пролиферации и апоптоза клеток [Brüne B. et al., 2013], в том числе посредством изменения
активности редокс-чувствительных транскрипционных факторов [Ляхович В.В. и др., 2006].
Особое место среди редокс-чувствительных систем клетки занимает сигнальный путь
Keap1/Nrf2, активирующий экспрессию генов за счет взаимодействия транскрипционного
фактора Nrf2 с цис-регуляторным антиоксидант-респонсивным элементом (ARE). Главным
назначением регуляторной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание внутреннего
гомеостаза при апоптоз-индуцирующих, проканцерогенных и стрессовых воздействиях
[Ляхович В.В. и др., 2006; Турпаев К.Т., 2013]. Исследования, проведенные на нокаутных по
Nrf2 животных, выявляют важность ARE в процессах воспаления, канцерогенеза, фиброза, а
также защиты от различных стрессовых воздействий [Меньщикова Е.Б и др., 2010]. Так, у
мышей с выключенным геном Nrf2 более выражен воспалительный ответ на различные
стимулы [Ma Q. et al., 2006], кроме того, Nrf2 способствует разрешению острых
воспалительных
процессов,
препятствуя
их
переходу
в
хроническую
форму
[Reddy N.M. et al., 2009]. Биологическая важность ARE определяется тем, что от его активности
зависит функционирование многих других редокс-чувствительных элементов, в том числе
транскрипционных факторов NF-κB и АР-1, регулирующих развитие воспалительного процесса
[Hayes J.D. et al., 2010; Wakabayashi N. et al., 2010], поэтому сигнальная система
Keap1/Nrf2/ARE
считается
перспективной
мишенью
при
разработке
новых
противовоспалительных препаратов [Hybertson B.M. et al., 2011].
В научной литературе описан широкий спектр различных индукторов транскрипции
генов, регулируемых ARE [Xiao H. Parkin K.L., 2006; Garbin U. et al., 2009], прежде всего это
фенолы и хиноны, акцепторы Михаэля, серо- и селенсодержащие соединения. Большое
внимание при исследовании новых индукторов ARE уделяется зависимости индуцирующей
способности от структуры соединений: для фенолов существенно расположение ОН-групп
[Prestera T. et al., 1993; Magesh S. et al., 2012] и степень их экранирования орто-заместителями
[Takabe W. et al., 2006], для серо- и селен-содержащих соединений показана высокая активность
7
диатомарной структуры –S-S- или -Se-Se- [Xiao H. et al., 2006]. Кроме того, важен вопрос
биодоступности антиоксидантов, многие из которых липофильны. В отличие от гидрофильных
веществ, жирорастворимые соединения при прохождении через желудочно-кишечный тракт
взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике
происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет
подбор дозировки и интервалов приёма, тогда как гидрофильные вещества усваиваются путём
активного транспорта. Для жирорастворимых соединений даже с доказанной высокой
антиоксидантной активностью ведутся поиски водорастворимых аналогов или форм с целью
повышения биодоступности [Yu H., 2011; Neves A.R. et al., 2013; Xiao Y. et al., 2013].
Ранее в системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная
активность серосодержащих водорастворимых фенольных соединений, синтезированных в
НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический
университет" и представляющих собой полностью или частично экранированные третбутильными группами монофенолы с пара-пропильным заместителем сульфонатным или
тиосульфонатным заместителем [Просенко А.Е. и др., 2001]. Антиоксидантный эффект
соединений прямо зависел от степени экранирования ОН-группы и наличия атома
двухвалентной серы в пара-пропильном заместителе. При этом если такая структурная
зависимость чётко прослеживалась в случае простых бесклеточных и неферментативных
систем, то при переходе к более сложным, в том числе клеточным и ферментативным тестсистемам, связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной, что, в
частности, объяснялось их непрямым действием на регуляторную систему Keap1/Nrf2/ARE
[Зенков Н.К. и др., 2007].
В соответствии с изложенным выше была сформулирована цель работы – изучить
противовоспалительную активность новых синтетических водорастворимых фенольных
антиоксидантов и исследовать ее возможную связь со способностью соединений индуцировать
редокс-чувствительную
сигнальную
систему
антиоксидант-респонсивного
элемента
Keap1/Nrf2/ARE.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи.
1.
Изучить влияние структурно подобных фенольных антиоксидантов на жизнеспособность
моноцито/макрофагоподобных клеток линии U937 in vitro.
2.
Изучить особенности и специфичность активации антиоксидантных ферментов и
ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, контролируемых антиоксидантреспонсивным элементом, in vitro с помощью 5 синтетических водорастворимых
структурно подобных фенольных антиоксидантов с выявлением наиболее эффективного
соединения.
8
3.
В условиях целого организма на модели острого локального воспаления путем скрининга
10 синтетических водорастворимых структурно подобных фенольных антиоксидантов
выявить соединение с наиболее выраженным противовоспалительным действием.
4.
Исследовать
способность
наиболее активного соединения индуцировать
систему
антиоксидант-респонсивного элемента in vitro, изучив его влияние на внутриклеточное
распределение транскрипционного фактора Nrf2 в макрофагоподобных клетках линии
J774 и фибробластах линии FLECH.
5.
Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие и течение воспалительного
процесса на моделях острого воспаления (внутривенное введение зимозановых частиц,
эндотоксиновый шок).
6.
Изучить влияние наиболее активного соединения на развитие воспалительного процесса
на моделях хронического воспаления ("воздушный мешок", коллаген-индуцированный
артрит).
Научная новизна работы
На клетках линии U937 показано, что все соединения нового ряда структурно зависимых
водорастворимых
монофенольных
исключением
серосодержащих
селенсодержащего
антиоксидантов
аналога,
а
малотоксичны,
за
3-(3'-трет-бутил-4'-
гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в малых концентрациях увеличивает
жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного
стресса за счёт ингибирования апоптоза.
На клетках линии U937 показана способность новых синтетических монофенольных
антиоксидантов
активировать
контролируемые
антиоксидант-респонсивным
элементом
ферменты NAD(P)H:хиноноксидоредуктазу 1 и глутатион-S-трансфераз, выявлена зависимость
индуцирующего эффекта от структуры соединений: для реализации биологической активности
исследуемых соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома
двухвалентной серы и степень экранирования ОН-группы. Наибольшим эффектом обладает ТС13, для которого на клеточных линиях J774 и FLECH получено прямое доказательство
способности активировать редокс-чувствительную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, а
именно
дозозависимая
индукция
транслокации
транскрипционного
фактора
Nrf2
из
цитоплазмы в ядро.
Впервые на модели острого каррагинан-индуцированного локального воспаления у крыс
выявлена зависимость между химической структурой водорастворимых монофенольных
серосодержащих антиоксидантов и способностью ингибировать развитие отёка лапы,
максимальная противовоспалительная активность показана для ТС-13. Установлено, что ТС-13
обладает выраженным протективным действием в отношении острого системного воспаления,
9
способствуя угнетению генерации гранулоцитами крови активированных кислородных
метаболитов. Однако применение ТС-13 при моделировании хронического воспаления
(индуцированный гетерологичным коллагеном полиартрит) и его обострения (модель
"воздушного мешка") способствовало снижению выраженности клинических признаков
воспалительной реакции лишь на ранних стадиях, в то время как на более поздних стадиях его
эффект проявлялся лишь в уменьшении активности и снижении праймированности к наработке
активированных кислородных метаболитов нейтрофилов и моноцитов.
Использование ТС-13 как индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE впервые
показало, что ее активация обладает выраженным протективным действием в отношении
проявлений острого, но не хронического воспаления.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты
исследования
существенно
дополняют
представления
о
механизмах
патогенеза воспалительных процессов данными об участии в них редокс-чувствительной
сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.
Полученные в ходе исследования структурно зависимого ряда водорастворимых
монофенольных
антиоксидантов
данные
позволяют
рекомендовать
3-(3'-трет-бутил-4'-
гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в качестве перспективного средства
дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной активацией фагоцитирующих
клеток, благодаря выявленному значимому противовоспалительному действию в отношении
острых воспалительных процессов в сочетании с высокой скоростью развития этого эффекта.
При
этом
результаты
настоящего
исследования
свидетельствуют
о
необходимости
дифференцированного подхода к противовоспалительной терапии с учётом фазы, стадии и
степени выраженности процесса, в том числе в связи с большей эффективностью индукторов
редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE на ранних этапах развития воспаления.
Положения, выносимые на защиту
1.
Синтетические водорастворимые структурно подобные фенольные антиоксиданты
способны индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидантреспонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE, выраженность эффекта зависит от химической
структуры соединений. Наибольшую активность среди исследованных соединений
проявляет частично экранированный 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат
натрия (ТС-13).
2.
Эффективный индуктор сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента ТС13 обладает наиболее выраженной противовоспалительной активностью на модели
острого локального воспаления по сравнению с другими исследованными структурно
подобными соединениями.
3.
Противовоспалительное
действие
эффективного
индуктора
сигнальной
системы
10
антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 более выражено в отношении острых, чем
хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Шестой
международной крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные
патологии" (Украина, Судак, 2010), VIII международной конференции "Биоантиоксидант"
(Россия, Москва, 2010), 17-й Ежегодной конференции общества свободнорадикальной
биологии и медицины (SFRBM's 17th Annual Meeting), (США, Орландо, 2010), 7-й научнопрактической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид
азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011), Седьмой международной
крымской конференция "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (Украина,
Судак, 2011), Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы
для молодежи "Живые системы и конструкционные материалы в условиях криолитозоны"
(Якутск, 2011), Шестой Всероссийской научно-практической конференции "Фундаментальные
аспекты компенсаторно-приспособительных процессов" (Новосибирск, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 2
статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов
диссертационных исследований.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор
литературы, описание материала и методов исследования, изложение собственных результатов
и их обсуждение; заключения; выводов и списка 376 источников цитируемой литературы
(31 отечественный и 345 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 134 страницах
машинописного текста. Работа иллюстрирована 7 таблицами, 36 рисунками и 1 схемой.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(грант № 09-04-00600) с использованием оборудования ЦКП «Современные оптические системы».
Благодарности.
Автор
сердечно
благодарит
своего
научного
руководителя,
д.м.н. Меньщикову Е.Б., за помощь на всех этапах работы, мудрые советы и терпение. Особо
автор благодарен к.б.н. Ткачёву В.О. за неоценимую помощь в работе, советы и полезные
рекомендации. Автор благодарит своих коллег, Зайцеву Н.С., Кожина П.М и Чечушкова А.В.,
за ответы на вопросы, помощь, поддержку и терпение. Свою признательность автор выражает
Зенкову Н.К. за полезные советы и рекомендации. За предоставленные для исследования
соединения автор благодарит Просенко А.Е., Олейник А.С., Кандалинцеву Н.В. из НИИ химии
антиоксидантов ФГБОУ ВПО "Новосибирский государственный педагогический университет".
11
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Механизмы функционирования редокс-чувствительной системы антиоксидантреспонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE и ее роль в поддержании окислительновосстановительного равновесия in vivo
В конце 80х годов ХХ века при изучении метаболизма действующих через ксенобиотикреспонсивный элемент (xenobiotic respons(iv)e element, XRE) ксенобиотиков-лигандов
рецептора ароматических углеводородов (aromatic hydrocarbon receptor, AhR) было выявлено,
что некоторые из них способны вызвать индукцию ферментов как первой, так и второй фазы
детоксикации ксенобиотиков (бифазные индукторы), тогда как другие вызывали только
индукцию ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков независимо от XRE
(монофазные
индукторы).
Последующие
исследования
воздействия
электрофильных
соединений на клетки позволили идентифицировать новую регуляторную структуру, которая, в
силу того что большая часть индуцирующих её соединений относилась к группе фенольных
антиоксидантов, была названа антиоксидант-респонсивным элементом (antioxidant respons(iv)e
element, ARE) [Prochaska H.J., Talalay P. 1988; Rushmore T.H. et al., 1991].
Позднее в химическом строении и свойствах индукторов XRE и ARE были выявлены
принципиальные различия: если для активаторов AhR характерна планарная структура, то для
вторых важны окислительно-восстановительные свойства молекул [Prochaska H.J. et al., 1985].
Особенности действия бифазных индукторов позднее были объяснены их способностью
запускать
опосредованно
через
XRE
синтез
монооксигеназных
ферментов
и
затем
метаболизироваться в клетках с образованием электрофильных соединений, активирующих
ARE [Prochaska H.J., Talalay P. 1988]. В настоящее время мотивы ARE выявлены в
промоторных участках множества генов, а среди транскрипционных факторов типа лейциновых
молний, связывающих и активирующих ARE, показана ведущая роль Nrf2 (NF-E2-related factor
2) семейства Cap’n’Collar (CNC) [Nguyen T. et al., 2003]. Вместе с репрессорным белком Keap1
(Kelch-like ECH associating protein 1) ARE и транскрипционный фактор Nrf2 объединяют в
единую редокс-чувствительную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE.
1.1.1. Гены с ARE-контролируемой экспрессией
ARE контролирует в клетках млекопитающих более двухсот генов. По данным,
полученным с использованием животных-нокаутов по Nrf2, двойных нокаутов по Nrf2 и Keap1
[Kwak M. et al., 2003; Cho H.Y. et al., 2005] и различных индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE
[Li J. et al., 2002; Thimulappa R.K. et al., 2002; Hu R. et al., 2004], редокс-чувствительная
сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE контролирует от 1 до 10% всех генов.
12
В соответствии с основной выполняемой функцией ферменты, регуляторные и
структурные белки, кодируемые ARE-регулируемыми генами, можно разделить на несколько
групп: ферменты детоксикации и экспорта из клеток ксенобиотиков и токсичных продуктов
метаболизма, а также ферменты репарации/утилизации поврежденных макромолекул;
ферменты,
контролирующие
редокс-состояние
клеток:
обладающие
непосредственной
антиоксидантной активностью или синтезирующие восстановители (в первую очередь,
глутатион (GSH)); регуляторы апоптоза, клеточного цикла и дифференцировки; шапероны и
белки теплового шока; белки межклеточной адгезии, цитоскелета и внутреннего транспорта;
регуляторы рибосомального синтеза белка; регуляторы иммунного ответа и воспаления; а
также довольно обширная группа ферментов, обеспечивающих обмен веществ в клетках
[Ляхович В.В. и др., 2006; Zhang D.D., 2006; Kensler T.W., Wakabayashi N., 2009] (таблица 1.1).
Таблица 1.1
Известные белки, экспрессия которых происходит через активацию ARE [Зенков Н.К и др., 2009]
Ферменты II фазы детоксикации ксенобиотиков
Антиоксиданты
Глутатион-S-трансферазы (GST) A1, A2, A4, A5, Каталитическая
и
субъединицы
M1, M2, M3, M4, P1
регуляторная
глутаматцистеинлигазы
(GCLC, GCLM)
NAD(P)H:хиноноксидоредуктаза 1 (NQO1)
Гемоксигеназа-1 (HO-1)
NRH:хиноноксидоредуктаза 2
Глутатионпероксидаза 2
УДФ-глюкуронозилтрансфераза 1А1, 1А6, 1А7,
Глутатионредуктаза
2B1, 2B3, 2B12
Синтаза тромбоксана А2
Альдокеторедуктаза 1C2 человека (AKR1c2)
H- и L-субъединицы ферритина
Металлотионеин 1, 2
Ферменты I фазы детоксикации ксенобиотиков
Индуцибельная NO-синтаза крыс
Цитохром P450 2A5
Тиоредоксин
Карбоксилэстераза 1A1
Тиоредоксинредуктаза (TrxR)
Пероксиредоксин 1
Сульфиредоксин
Супероксиддисмутаза 1, 3
Каталаза
Исследование функций белков, кодируемых Nrf2-индуцируемыми генами, показало, что
основной биологической ролью сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE является поддержание
внутриклеточного гомеостаза, защита клетки от потенциально опасных химических агентов и
физических
воздействий,
распознавание
поврежденных
макромолекул
и
их
13
репарация/утилизация в зависимости от возможности восстановления нормальной структуры, а
при значительном объеме повреждений – инициация апоптоза. За счет этого сигнальная
система Keap1/Nrf2/ARE препятствует злокачественному перерождению клеток и тормозит
процессы канцерогенеза [Kensler T.W., Wakabayashi N., 2009].
В то же время эффекты активации Nrf2 могут быть обусловлены его способностью
ингибировать транскрипцию различных генов. Так индукторы Nrf2 подавляют процесс
активации транскрипционного фактора NF-κB, тем самым угнетая экспрессию обширной
группы провоспалительных генов (например, 90% из 88 индуцируемых генов раннего ответа в
стимулированных липополисахаридом моноцитах человека являются NF-κB-зависимыми
[Carayol N. et al., 2006]), за счет чего активация сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE снижает
выраженность острых воспалительных реакций и усиливает процесс их разрешения,
препятствуя
переходу
патологического
процесса
в
хроническую
форму
[Меньщикова Е.Б. и др., 2010; Kim J. et al., 2010].
1.1.2. Индукторы системы Keap1/Nrf2/ARE
Среди природных и синтетических ксенобиотиков и продуктов метаболизма самого
организма
было
обнаружено
огромное
количество
индукторов
сигнальной
системы
Keap1/Nrf2/ARE, которые могут быть разделены на 10 основных категорий [Dinkova-Kostova
A.T. et al., 2004; Xiao H., Parking K.L., 2006]: дифенолы, фенилендиамины, хиноны природного
(флаваноиды, куркумин, ресвератрол) и синтетического (трет-бутилгидрохинон tBHQ, третбутилгидроксианизол, пробукол) происхождения, а также эндогенные (эстрадиол и его
метаболиты, дофамин) [Turan B. et al., 2012]; акцепторы Михаэля (кротоновый альдегид,
метаболиты фумаровой кислоты); изотиоцианаты (сульфорафан), тиокарбоматы и родственные
им серосодержащие соединения [Keum Y.S., 2011]; 1,2-дитиол-3-тионы, оксатиоленоксиды,
алк(ен)ил(поли)сульфиды; гидропероксиды; соединения трехвалентного мышьяка; ионы
тяжелых металлов (Cd, Co, Cu, Au, Hg, Pb); соседние димеркаптаны; каротиноиды, терпеноиды
и родственные им соединения [Hur W., Gray N.S., 2011; Dinkova-Kostova A.T. et al., 2004];
селенсодержащие соединения (особенно диселениды и селенолы). Кроме того, способностью
активировать транскрипцию ARE-регулируемых генов обладают гемовые комплексы,
сероводород,
продукты
перекисного
окисления
липидов
(гидроперекиси,
альдегиды,
нитрозированные жирные кислоты), прямое действие на клетки активированных кислородных
метаболитов (АКМ) (OH·, CO, NO·, ONOO-/ONOOH, O3, HOCl), вызывающих развитие
окислительного стресса, коротковолнового УФ-света, радиации, ишемии/реперфузии, гипоксии
и гипероксии, сдвигового стресса [Slocum S.L., Kensler T.W., 2011] (основные представители
этих групп индукторов представлены в таблице 1.2).
14
Таблица 1.2
Классы индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE
Класс индукторов
Дифенолы,
фенилендиамины,
хиноны
Примеры
Трет-бутилгидрохинон
(tBHQ), 2(3)-третбутил4-гидроксианизол
(BHA),
Структура
Акцепторы Михаэля Куркумин (турмерик),
зерумбон (имбирь),
цитраль (растительные
масла)
Изотиоцианаты,
сульфокситиокарбаматы
Тиокарбаматы
Сульфорафан,
бензилизотиоцианат
(овощи семейства
крестоцветных)
Пирролидиндитиокарбамат
1,2-дитиол-3-тионы Олтипраз (4-метил-5пиразинил-3Н-1,2,дитиол-3-тион),
(R)-липоевая кислота
Полиены
Хлорофилл,
порфирины
CH3
H3C
CH2
N
CH3
HN
NH
H3C
O
O
N
-
CH3
O
O
-
O
-
O
Каротиноиды
β-каротин, 3-гидроксиβ-дамаскон, ликопин
Гидропероксиды
Соединения
трехвалентного
мышьяка
Ионы тяжелых
металлов
Селенсодержащие
соединения
HO – OH
Пероксид водорода
Метиларсенит, оксиды
As (III)
Cd2+, Co2+, Cu2+, Au1+,
Hg2+, Pb2+
Эбселен,
диалкилдиселениды,
селениновые кислоты,
фенилселенол
15
Несмотря на структурные различия индукторов ARE, их обобщающими свойствами
являются электрофильность (поэтому ARE часто называют электрофил-респонсивным
элементом, EpRE, electrophile response element) и способность модифицировать SH-группы
белков посредством алкилирования, окисления или восстановления [Erlank H. et al., 2011]. ARE
индуцируют дифенолы с ОН-группами в орто- и пара-положениях, тогда как монофенолы и
дифенолы с ОН-группами в мета-положениях (аналогично – для фенилендиаминов)
активирующим эффектом не обладают [Prestera T., 1993, Rushmore T., 1991; DinkovaKostova A.T. et al., 2004; Magesh S. et al., 2012]. Такая зависимость от расположения
окисляющих групп позволяет предположить, что активация Keap1/Nrf2/ARE происходит в
результате двухэлектронной окислительно-восстановительной реакции, в которой могут
участвовать полифенолы со взаимным орто- и пара-, но не мета-расположением гидроксильных
групп.
Было
установлено,
что
способность
дифенолов
индуцировать
экспрессию
NAD(P)H:хиноноксидоредуктазу 1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase, NQO1) имеет обратную
зависимость от энергии их ионизации и прямо зависит от сродства к электрону
соответствующих хинонов [Bensasson D. et al., 2008]. Аналогичная зависимость способности
соединений индуцировать NQO1 от их вычисленного окислительно-восстановительного
потенциала была выявлена для большой группы растительных фенилпропаноидов, их
синтетических аналогов [Zoete V. et al., 2004] и флавоноидов [Lee-Hilz Y.Y. et al., 2006]. На
основании этого была предложена двухстадийная модель модификации репрессорного белка
Keap1, согласно которой на первой (лимитирующей) стадии, катализируемой ионами Cu2+,
происходит двухэлектронное окисление дифенолов до хинонов, окисляющих на второй стадии
SH-группы
остатков
цистеина
репрессорного
белка
[Bensasson
D.
et
al.,
2008;
Wang X.J. et al., 2010]. Это подтверждается высокой ARE-активирующей способностью 1,2- и
1,4-хинонов [Sumi D. et al., 2009; Wang X.J. et al., 2010; Dinkova-Kostova A.T., Wang X.J., 2011].
Усиление этой способности хинонов в присутствии ионов Cu2+ объясняется возможностью их
NQO1-зависимого восстановления в клетках. Активации Nrf2 способствует образование
супероксидного анион-радикала (О2) (в дальнейшем превращающегося в Н2О2), происходящее
на первой стадии этого процесса за счет регенерации Cu2+ и автоокисления семихинона
молекулярным кислородом [Bensasson D. et al., 2008; Wang X.J. et al., 2010]. Кроме того,
образующиеся хиноны являются акцепторами Михаэля и могут присоединяться к SH-группам
белка Keap1, снимая обусловленную им репрессию Nrf2 [Wang X.J. et al., 2010].
16
1.1.3. Структура компонентов системы Keap1/Nrf2/ARE
1.1.3.1. Структура ARE
Регуляторным цис-активирующим элементом ARE в составе ДНК служит участок,
содержащий
последовательность
5'-A/GTGAC/TnnnGCA/G-3'
нуклеотидов
(«ядро»)
[Wasserman W.W., Fahl W.E., 1997], с ним связывается ядерный фактор транскрипции Nrf2,
относящийся к семейству CNC. На сегодняшний день известны шесть характерных для
млекопитающих представителей этого семейства (составляющих подсемейство NF-E2): р45,
Nrf1, Nrf2, Nrf3, Bach1 и Bach2. Все факторы подсемейства NF-E2 могут образовывать
функционально-активные гетеродимеры, однако они усиливают или ингибируют экспрессию
ARE-зависимых генов в зависимости от способности связывать кофакторы транскрипции,
поэтому выключение или гиперпродукция каждого из них приводят к различным эффектам на
уровне клетки или организма [Sykiotis G.P., Bohmann D., 2010].
В ходе дальнейшего уточнения структуры ARE, расположенных в промоторах различных
генов, было обнаружено, что для индукции транскрипции важно наличие последовательности
ТА/СА, расположенной с 5'-конца на расстоянии двух пар нуклеотидов от «ядра». Из 16
нуклеотидов,
составляющих
ARE,
только
6
являются
строго
консервативными
[Wasserman W.W., Fahl W.E., 1997]. Часть ARE включает в себя сайт связывания
транскрипционного
фактора
responsive
TRE)
element,
AP-1
(рисунок
(5'-TGACTCA-3';
1.1),
12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate
поэтому в
индукции
транскрипции
ARE-
контролируемых генов могут принимать участие Jun- и Fos-белки [Трпаев К.Т., 2006], что
обусловливает возможность перекрестной регуляции генов-мишеней этими белками.
Все ARE могут быть разделены на четыре структурно-функциональных класса на
основании различий в нуклеотидной последовательности: содержащие 5'-триплет ТА/СА и TRE
в «ядре» (гены NQO1, AKR1C2 и легкой цепи ферритина человека); содержащие только
последовательность ТА/СА (гены глутатион-S-трансфераз (glutathione-S-transferase, GST)
GSTA1 мыши и GSTA2 крысы); содержащие только TRE (ген металлотионеина-II мыши) и не
содержащие ни одну из этих структур (ген множественной лекарственной устойчивости-2
мыши) [Ткачев В.О. и др., 2011]. Гены, промоторы которых содержат последовательности ARE
первого и второго классов, в ответ на активацию Nrf2 отвечают большей степенью индукции и
находятся под меньшим негативным контролем других транскрипционных факторов bZipсемейства. Гены с ARE первого и третьего классов, в силу содержания последовательности
TRE, отвечают также на активацию транскрипционного фактора AP-1 [Hayes J.D. et al., 2010].
Таким образом, вариабельность нуклеотидной последовательности ARE, а также тот факт,
что некоторые гены (например, ген гемоксигеназы человека и грызунов) содержат в
промоторах несколько последовательностей ARE, относящихся к разным классам, делает
17
возможной тонкую и гибкую регуляцию экспрессии подконтрольных генов ответ на стрессовые
воздействия [Hayes J.D. et al., 2010].
Рисунок 1.1. Структура антиоксидант-респонсивного элемента (а), человеческих белков
Nrf2 (б) и Keap1 (в) [Ткачев В.О. и др., 2011]. а) Представлены нуклеотидные
последовательности ARE и TRE; в ARE жирным шрифтом выделена последовательность
нуклеотидов, абсолютно необходимая для связывания Nrf2, подчеркиванием выделен участок,
потенциально содержащий сайт связывания транскрипционного фактора AP-1 (TRE), структура
которого представлена ниже; б, в) указано положение и функции доменов и локализация
чувствительных к окислению/модификации цистеиновых аминокислотных остатков и
ключевых сайтов фосфорилирования. Физиологически значимые остатки цистеина выделены
жирным шрифтом.
18
1.1.3.2.
Структура Nrf2
Nrf2 человека и мыши имеют практически одинаковую молекулярную массу (67,8 и
66,9 кДа
соответственно),
сходны
по
аминокислотной
последовательности
и
длине
полипептидной цепи (597 и 605 аминокислотных остатков соответственно). Они содержат
шесть высококонсервативных доменов Neh1–Neh6 (Nrf2-ECH homology; ECH – куриный аналог
Nrf2) (рисунок 1.1.3.1.1) [Zhang D.D., 2006; Carayol N. et al., 2006]. N-концевой домен Neh2
участвует в редокс-зависимой регуляции стабильности белка за счет связывания с Keap1
(Kelch-like ECH associating protein 1, см. ниже) и конъюгации с убиквитином [Zhang D.D., 2006].
Домен Neh3, расположенный в С-концевой части белка, и тандемные Neh4 и Neh5
обеспечивают трансактивирующее действие Nrf2, связываясь с гистонацетилтрансферазами
[Zhang J. et al., 2007; Ohta K., 2007]. Домен Neh6 содержит редокс-независимый дегрон,
ограничивающий время существования молекулы в стрессорных условиях, когда репрессорная
функция Keap1 подавлена [McMahon M. et al., 2004]. Neh1 представляет собой гидрофобный
домен типа лейциновой молнии bZip (basic region and leucine zipper), отвечающий за
димеризацию и связывание с ARE [Zhang D.D., 2006]. В структурах типа лейциновой застежкимолнии каждый седьмой аминокислотный остаток – лейцин. Эти остатки лейцина образуют
гидрофобную область, позволяющую формировать димеры. При этом, благодаря структуре
bZip-домена, Nrf2 образует только гетеродимеры, что приводит к необходимости в bZipсодержащих вспомогательных белках для связывания с ARE. Из них в индукции AREзависимых генов наиболее изучено участие транскрипционных факторов семейства малых Maf(musculoaponeurotic fibrosarcoma) и Jun-белков, способных связываться с ARE своим
собственным bZip-участком [Hayes J.D. et al., 2010]. Кроме того, белок Nrf2 содержит
несколько сигналов ядерной локализации NLS (nuclear localisation signal) и ядерного экспорта
NES (nuclear export signal), ответственных за перемещение транскрипционного фактора в
клеточное ядро или цитоплазму, соответственно [Jain A.K. et al., 2005; Li W. et al., 2006]. В
своем составе молекулы Nrf2 содержат несколько цистеиновых аминокислотных остатков (6 в
Nrf2 человека и 7 – у мыши), часть из которых являются консервативными и присутствуют у
неродственных видов: так, С119, С191, С235 и С506 являются общими для белков мышей,
крыс, птиц и человека; С316 и С414 – для Nrf2 млекопитающих, С311 – для грызунов, что дает
основания предполагать, что активация Nrf2 может зависеть и от модификации его
собственных сульфгидрильных групп [Ткачев В.О. и др., 2011].
1.1.3.3.
Структура Keap1
В отсутствие стимулирующего воздействия Nrf2 находится преимущественно в
цитоплазме в виде комплекса с регуляторной субъединицей – белком Keap1. Лишь малая часть
19
Nrf2 постоянно присутствует в клеточном ядре, где поддерживает базальный уровень
экспрессии ARE-зависимых генов. Белки Keap1 мыши и человека имеют молекулярную массу
соответственно 69,5 и 69,7 кДа и состоят из 624 и 625 аминокислотных остатков, из которых 25
и 27 – это подверженные окислительной модификации остатки цистеина, которые являются
сенсорами для широкого спектра соединений, активирующих Nrf2 [Wakabayashi N. et al., 2004].
Keap1 содержат пять высококонсервативных доменов (рисунок 1.1): N-концевой участок (Nterminal region, NTR); домен BTB (Broad complex, Tramtrack, and Bric-a-brac), ответственный за
димеризацию и взаимодействие с Cul3-E3-лигазой [Zipper L.M., Mulcahy R.T., 2002;
Kobayashi A. et al., 2004; Tong K.I. et al., 2006]; промежуточный домен IVR (intervening region),
содержащий чувствительные к окислению цистеиновые остатки и мотив NES [DinkovaKostova A.T. et al., 2002]; Kelch-домен, состоящий из шести повторов (KR1 – KR6),
обладающий структурой шестилопастного β-пропеллера и осуществляющего ассоциацию
Кеар1 с Nrf2 и белками цитоскелета актином и/или миозином VIIa, благодаря чему комплекс
Keap1/Nrf2 локализуется в цитоплазме [Kang M.I. et al., 2004; Zhang D.D., 2006; Li W.,
Kong A.N., 2009] (однако другими авторами не обнаружено совместной локализации
комплексов Keap1/Nrf2 и актина [Velichkova M., Hasson T., 2005]); а также С-концевого
фрагмента (C- terminal region, CTR).
1.1.4. Механизмы активации системы Keap1/Nrf2/ARE
Первоначально считалось, что транскрипция гена NRF2 не изменяется в ответ на действие
специфических индукторов [Ishii T. et al., 2000], однако позднее в его промоторе были
обнаружены ARE-последовательности и доказана способность транскрипционного фактора к
активации
синтеза
собственной
мРНК
[Kwak
M.K.
et
al.,
2002],
приводящей
к
ауторегуляторному усилению процесса активации данной сигнальной системы в ответ на
действие индукторов. Кроме того, промотор гена NRF2 содержит три последовательности XRE,
благодаря чему его транскрипция усиливается в ответ на действие диоксинов за счет активации
AhR и связывания его с ДНК [Miao W. et al., 2005]. В последние годы были получены
доказательства участия в регуляции активности сигнальной системы Keap1/Nrf2/ ARE
эпигенетических механизмов. Так, гиперметилирование CpG-островков промотора гена NRF2 в
клетках злокачественной опухоли простаты мышей TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of
Mouse Prostate) сопровождается нарушением связывания РНК-полимеразы II с ДНК и
репрессией синтеза соответствующей мРНК [Yu S. et al., 2010]. При этом экспрессию Nrf2 и
ARE-завсимых
генов
восстанавливает
обработка
таких
клеток
ингибиторами
ДНК-
метилтрансферазы и гистондеацетилазы. Интересно, что экспрессия гена KEAP1 также зависит
от степени метилирования его промотора [Wang R. et al., 2008].
20
Индуцируемое
прооксидантами
усиление
трансляции
мРНК
Nrf2
[Purdom-
Dickinson S.E. et al., 2007] за счет включения кэп-независимой трансляции соответствующей
мРНК в дополнение к кэп-зависимой трансляции, конститутивно происходящей в клетках,
является причиной увеличения его содержания в цитоплазме [Li W. et al., 2010]. Данный
процесс связан с наличием в составе 5'-нетранслируемой области мРНК Nrf2 редоксчувствительного внутреннего участка посадки рибосом (internal ribosomal entry site, IRES)
[Li W. et al., 2010]. IRESNrf2 содержит два участка связывания рРНК, один из которых
высококонсервативен и соседствует с ингибиторным элементом, имеющим структуру шпильки
и в условиях физиологической нормы препятствующим взаимодействию IRES Nrf2 с
рибосомами. Эта блокировка трансляции снимается при окислительном стрессе (например,
вызванном воздействием Н2О2) или под действием индукторов ARE (например, сульфорафана),
в результате чего активность IRESNrf2 возрастает, и трансляция Nrf2 увеличивается.
Общепризнанным считается, что активация Nrf2 преимущественно контролируется на
посттрансляционном уровне за счет изменения его стабильности [Jain A.K. et al., 2008;
Hayes J.D., McMahon M., 2009; Baird L., Dinkova-Kostova A.T., 2011]. Nrf2 – короткоживущий
белок (время его существования t1/2≈10-20 мин [Alam J. et al., 2003; Itoh K et al., 2003;
Zhang J. et al., 2007]), его стабильность регулируется Keap1-зависимым убиквитинированием и
деградацией в протеасомах 26S [Eggler A.L. et al., 2008]: Keap1 функционирует как адаптерный
белок, осуществляющий взаимодействие Nrf2 и Cullin-3-содержащего убиквитин-лигазного
комплекса Е3 (далее Cul3-E3-лигаза) [Kobayashi A. et al., 2004; Villeneuve N.F. et al., 2010]. Для
нормального убиквитинирования также необходим белок Rbx1 (RING-box protein 1), который
совместно с Cul3 образует каталитический компонент ферментативного комплекса и
взаимодействует
с
Е2-убиквитинлигазой
для
переноса
убиквитина
на
Nrf2
[Taguchi K. et al., 2011]. Показана возможность убиквитинирования Nrf2, не зависящая от
комплекса Keap1/Cul3-E3-лигаза/Rbx1, после его фосфорилирования киназой GSK-3 (glycogene
sinthase kinase 3) [Rada P. et al., 2011].
Взаимосвязь между активацией Nrf2 и протеасом носит двойственный характер: с одной
стороны, индукция системы Keap1/Nrf2/ARE закономерно усиливается при ингибировании
протеасом [Kobayashi A. et al., 2006; Yerlikaya A., 2012]; приводящие к нарушению
взаимодействия Keap1с Cul3-E3-лигазой мутации или воздействия повышают стабильность
Nrf2 и приводят к увеличению его содержания в клетках [Barid L., Dinkova-Kosova A.T., 2011;
Villeneuve N. F. et al., 2010]. С другой стороны, поскольку, как правило, активация системы
Keap1/Nrf2/ARE возникает в ответ на развитие окислительного стресса, она сопряжена с
повышением экспрессии белков, входящих в состав протеасом, и протеасомной активности в
целом, что способствует эффективному удалению окислено модифицированных белков
21
[Sebens S. et al., 2011; Chapple S.J. et al., 2012]. Показана возможность миграции в ядро Keap1
или комплекса Keap1/Cul3-E3-лигаза/Rbx1, где он может либо способствовать экспорту Nrf2 в
цитоплазму [Sun Z. et al., 2007], либо убиквитинировать его с последующей деградацией
[Niture S.K. et al., 2010]. Экспорт из ядра комплекса Keap1/Cul3-E3-лигаза/Rbx1 контролируется
фосфорилированием остатка тирозина Y85 Keap1 и важен для регуляции величины ядерного
пула Nrf2 и, таким образом, его транскрипционной активности [Kaspar J.W. et al., 2012]. Кроме
того, показано, что активация Nrf2 прооксидантами или электрофильными соединениями
сопряжена с подавлением убиквитин-лигазной активности Keap1 [Kobayashi A. et al., 2006].
Считается,
что
Keap1
связывается
с
актином
цитоскелета
клетки
[Holtzclaw W.D. et al., 2004]. Однако в 2006 году исследователи из Университета Миссури
обнаружили
локализацию
фосфоглицератмутазы
5
комплекса,
(PGAM5),
на
состоящего
внешней
из
белков
мембране
Nrf2,
митохондрий
Keap1
[Lo
и
S.C.,
Hannink M., 2008]. Образование такого комплекса приводит к ингибированию Nrf2, поскольку в
клетках с генотипом PGAM5–/– усилена экспрессия ARE-зависимых генов. Показано, что во
взаимодействии с Nrf2 и PGAM5 участвуют одни и те же аминокислотные остатки Keap1, но,
хотя фосфоглицератмутаза, заякоренная N-концевым регионом в митохондриальной мембране,
может являться субстратом для Cul3-E3-лигазы, ее убиквитинирования не происходит. Хотя
лишь малая часть белков Nrf2 в клетках обнаруживает митохондриальную локализацию,
существование комплекса Nrf2/Keap1/PGAM5 может играть важную биологическую роль,
передавая при нарушении функций митохондрий сигнал в клеточное ядро [Lo S.C.,
Hannink M., 2008]. Это предположение подтверждается данными, свидетельствующими об
активации Nrf2 в ответ на изменение окислительно-восстановительного баланса во
внеклеточной среде [Imhoff B.R., Hansen J.M., 2009], воздействие на клетки tBHQ [Imhoff B.R.,
Hansen J.M., 2010] или куркумина [McNally S.J. et al., 2007] и ингибирование ферментов
дыхательной
цепи
ротеноном
[MacKenzie E.L.
et
al.,
2008]
за
счет
увеличения
митохондриальной продукции АКМ.
Ключевую роль в снятии Keap1-зависимой репрессии транскрипционного фактора Nrf2
играют процессы электрофильной/окислительной модификации сульфгидрильных групп
остатков цистеина ингибиторного белка [Holland R., Fishbein J.C., 2010]. Экспериментально
установлено, что остатки цистеина в молекуле Keap1 взаимодействуют с алкилирующими
агентами и прооксидантами с неодинаковой скоростью, что обусловлено как значением pKa,
зависящим от их аминокислотного окружения, так и природой индуктора. Наиболее
реакционны С151 в ВТВ-домене, С257, С273, С288, С297 и С319 в линкерном участке IVR,
С489 и С583 в Kelch-домене и С613 в С-концевом участке [He X., Ma Q., 2010;
Fourquiet S. et al., 2010]. Кроме того, показана различная физиологическая значимость
22
отдельных цистеиновых остатков. Замены C273 и C288 на серин или аланин не влияют на
стабильность и внутриклеточное распределение Keap1 и не изменяют его константу связывания
c Cul3-E3-лигазой и Nrf2 [Zhang D.D., Hannink M., 2003; Kobayashi A. et al., 2006], но нарушают
деградацию молекулы транскрипционного фактора. При этом одновременная трансфекция
двумя плазмидами, несущими ген KEAP1 с мутациями С273А и С288А, обеспечивающими
замену в Keap1 соответствующих остатков цистеина на аланин, в соотношении 1:1 клеток с
генотипом KEAP1–/– восстанавливает репрессорное действие Keap1 [Kobayashi A. et al., 2006].
На основании этого предложена модель активации Nrf2, предусматривающая образование
межмолекулярной дисульфидной связи между C273 и C288 белков Keap1 в гомодимере
[Eggler A.L. et al., 2005]. Трансгенные мыши, одновременно экспрессирующие мутантные белки
Keap1(C273A) и Keap1(C288A), характеризуются высоким базальным уровнем активации Nrf2.
Таким образом, для обеспечения репрессорной функции при физиологических условиях белок
Keap1 должен содержать оба данных цистеиновых остатка [Yamamoto T. et al., 2008].
Критически необходимым для нормального функционирования сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE оказывается C151 в домене BTB репрессорного белка [He X., Ma Q., 2010]. В
условиях окислительного стресса и при действии электрофилов к этому остатку ковалентно
присоединяется
модификации
множество
Keap1,
различных
устойчивые
к
низкомолекулярных
действию
соединений,
восстановителей,
что
образующих
нарушает
его
взаимодействие с Cul3-E3-лигазой [Rachakonda G. et al., 2008], или между молекулами
гомодимерного комплекса Keap1 образуется дисульфидная связь [Fourquiet S., 2010] Потеря
или модификация остатка C151 не сказывается на способности Кеар1 подавлять экспрессию
Nrf2/ARE-зависимых генов в базальных условиях, но приводит к отмене активации Nrf2,
вызываемой трет-бутилгидрохиноном или сульфорафаном [Luo Y. et al., 2007; Yamamoto T. et
al., 2008] за счет изменения конформации региона репрессорного белка (125–127
аминокислотные
остатки)
и
нарушения
взаимодействия
с
Cul3-E3-лигазой
[Eggler A.L. et al., 2009; Niture S.K., Jaiswal A.K., 2009] и, кроме того, ускоряет и усиливает
деградацию молекулы Keap1 при обработке клеток tBHQ [Niture S.K., Jaiswal A.K., 2009]. Эти
результаты позволяют заключить, что C151, который подвергается модификации в клетках в
условиях
окислительного
стресса,
может
являться
«сенсором»
окислительно-
восстановительного баланса, ответственным за индукцию Nrf2/ARE-зависимых генов. Кроме
того, установлено, что при
окислительном стрессе активация Nrf2 сопровождается
образованием внутримолекулярной дисульфидной связи между аминокислотными остатками
C226 и C613 Keap1, хотя замена этих цистеинов на серин не сказывается на репрессорной
способности мутантного белка [Fourquiet S. et al., 2010]. Цистеиновый остаток C23 является еще
одним физиологически значимым сайтом окислительной модификации Keap1, образуя при
23
обработке окисленным глутатионом (GSSG) внутримолекулярную дисульфидную связь с C38.
В клетках раковых опухолей человека с нарушенным Keap1-зависимым убиквитинированием
Nrf2 обнаружена замена C23 на тирозин [Nioi P., Nguyen T., 2007].
Взаимодействие
Keap1
с
Nrf2,
по-видимому,
регулируется
не
только
прямой
модификацией цистеиновых остатков: было показано, что в состав Keap1 входят ионы цинка,
атомы которого взаимодействуют с атомами серы остатков C273 и C288, а их удаление
приводит к разобщению комплексов Nrf2–Keap1, при этом активация Nrf2 сопровождается
высвобождением атомов цинка, так же как их удаление хелаторами приводит к разобщению
комплекса Keap1/Nrf2 [Dinkova-Kostova A.T. et al., 2005].
Белки Keap1 в цитоплазме формируют гомодимер (за счет спаривания собственных BTBдоменов), связывающий одну молекулу Nrf2, поэтому первоначально доминировала простая
модель диссоциации комплекса Nrf2/Keap1, происходящей за счет окислительной модификации
и конформационных изменений репрессорного белка, в результате которой высвободившийся
Nrf2 транслоцируется в ядро, где при помощи белков Maf и Jun и коактиваторов транскрипции
взаимодействует с ARE и активирует экспрессию генов, а Keap1 убиквитинируется,
перемещается к протеасомам 26S с помощью актина и разрушается. Однако ряд факторов
противоречит модели диссоциации: так, во многих исследованиях было показано, что после
воздействия электрофилов значительное количество комплексов Nrf2-Keap1 остается в
связанном виде [Eggler A.L. et al., 2008; Li W., Kong A.N., 2009].
Наибольшее распространение на сегодняшний день получила модель конститутивной
деградации комплекса Nrf2/Keap1, так называемая модель «петли и крюка»: детальные
исследования функционального строения полипептидных цепей Nrf2 и Keap1 выявили в
составе Keap1-связывающего домена Nrf2, Neh2, наличие двух последовательностей с высокой
и низкой аффинностью к ингибитору («петли» (Leu-Asp-Glu-Glu-Thr-Gly-Glu, ETGE) и «крюка»
(Leu-Trp-Arg-Gln-Asp-Ile-Asp-Leu-Gly, DLG), соответственно) [Li W., Kong A.N., 2009]
(рисунок 1.2). Согласно этой модели, конститутивно синтезирующиеся молекулы Nrf2
связываются с гомодимерами Keap1 в результате взаимодействия ETGE и DLG с Kelchдоменом ингибиторной субъединицы, так что в условиях гомеостаза концентрация свободного
Nrf2 невелика [Tong K.I., Kobayashi A., et al., 2006; Tong K.I., Katoh Y. et al., 2006]. При этом
последовательности ETGE и DLG в составе одной молекулы Nrf2 взаимодействуют с разными
мономерами Keap1. Такое взаимодействие Nrf2 и Keap1 приводит к облегченному
убиквитинированию остатков лизина между ETGE и DLG, за счет их оптимальной ориентации
(шесть из семи лизиновых остатков 9-витковой α-спирали, соединяющей «петлю» и «крюк»,
расположены на одной стороне [Tong K.I., Katoh Y. et al., 2006]), и к последующей деградации в
26-протеасомах. Эффективность взаимодействия мотиву ETGE придают отрицательно
24
заряженные остатки глутамата, посредством которых он взаимодействует с положительно
заряженной высококонсервативной аргининовой триадой (R380, R415, R483), расположенной
на дне шестилопастного β-пропеллерного Kelch-домена белка Keap1 [Li W., Kong A.N., 2009].
Рисунок 1.2. Возможный механизм активации транскрипции ARE-регулируемых генов:
модель "петли" и "крюка" [Меньщикова, Е.Б. и др., 2010].
В результате модификации ингибитора Keap1, наблюдаемой при окислительном стрессе,
обусловленной преимущественно окислением редокс-чувствительных остатков цистеина его
доменов IVR и BTB, белок изменяет конформацию и теряет сродство к мотиву DLG: «крючок»
соскакивает, а Nrf2 повисает на «петле» – высокоаффинном мотиве ETGE. При этом, возможно,
в результате окисления С273 и С288 образовывается перекрестная межмолекулярная
25
дисульфидная связь между мономерами Keap1. В результате нарушается убиквитинирование
Nrf2 и, следовательно, его протеасомная деградация (но не ассоциация с Keap1), пул молекул
ингибитора насыщается, что приводит к увеличению содержания свободного Nrf2 (чему
способствует также индуцируемая прооксидантами активация синтеза Nrf2 [Purdom-Dickinson
S.E. et al., 2007] и изменение субстратной специфичности убиквитин-лигазного комплекса,
модифицирующего в данных условиях сам Keap1 [Zhang D.D. et al., 2005]), время
существования которого в клетках увеличивается до 200 минут [Зенков Н.К. и др., 2013].
Еще одним механизмом регуляции стабильности Nrf2 является модификация его
собственных цистеиновых остатков [He X., Ma Q., 2010; Lukosz M. et al., 2010]. Установлено,
что молекулы транскрипционного фактора с заменами С506, С235 и С191 на остатки аргинина
отличаются меньшим временем существования в клетках (39, 66 и 58% от t1/2 нормального
белка, соответственно) за счет усиленного связывания с Keap1 и убиквитинирования,
приводящего к снижению способности Nrf2 активировать экспрессию генов-мишеней. С
сульфгидрильными группами остатков цистеина Nrf2 связываются соединения-индукторы ARE
(tBHQ, фениларсеноксид), что приводит к стабилизации транскрипционного фактора [He X.,
Ma Q., 2009].
Помимо Keap1 известны и другие регуляторы стабильности Nrf2. Белок DJ-1 (продукт
гена PARK7) ингибирует убиквитинирование транскрипционного фактора, увеличивает время
его существования и повышает спонтанную и индуцированную экспрессию ARE-зависимых
генов. При этом подавление экспрессии DJ-1 у мышей приводит к снижению содержания Nrf2 в
клетках, его стабильности и индукции транскрипции его генов-мишеней [Im J.Y. et al., 2012].
Онкосупрессорный белок p21Cip1/WAF1 стабилизирует Nrf2, конкурируя с Keap1 за связывание
последовательностей ETGE и DLG, у мышей, нокаутных по p21 снижены базальный и
индуцированный уровни транскрипции ARE-зависимых генов [Wakabayashi N. et al., 2010].
Индукция р21 в ответ на повреждение ДНК, вызванное УФ-облучением, воздействием АКМ,
мутагенными и канцерогенными веществами, благодаря такому взаимодействию сигнальных
систем, приводит к аресту клеточного цикла и запуску процессов репарации, с одной стороны,
и
к
Nrf2-зависимой
активации
систем
антиоксидантной
защиты
и
детоксикации,
нейтрализующих повреждающие агенты, – с другой [Wakabayashi N. et al., 2010;
Villneuve N.F. et al., 2009].
Адаптерный белок р62 (секвестосома 1) выполняет в клетках ряд важных функций: за счет
наличия в его структуре множества протеин-связывающих участков облегчает межбелковые
взаимодействия; обеспечивает агрегацию поврежденных и несвернутых белков; участвуя в
процессе аутофагии, транспортирует полиубиквитинированные белки к протеасомам, а их
агрегаты – к лизосомам [Seibenhener M.L. et al., 2007]. Как и Nrf2, р62 содержит в своей
26
структуре последовательность ETGE, за счет которой он способен связываться с аргининовой
триадой Kelch-домена Keap1, ингибируя ферментативную активность убиквитин-лигазного
комплекса и увеличивая стабильность транскрипционного фактора [Hancock R. et al., 2012].
Такое
межбелковое
взаимодействие
приводит
к
агрегации
Keap1,
усиливает
его
убиквитинирование и протеасомную деградацию [Copple I.M. et al., 2010; Lau A. et al., 2010],
поэтому увеличение эндогенной (в результате нарушения процессов аутофагии) или
эктопической экспрессии р62 снижает содержание белка Keap1. Еще одним регулятором
стабильности может служить белок CRIF1 (CR6-interacting factor 1), который (как и Keap1)
усиливает убиквитинирование молекулы транскрипционного фактора и его деградацию в
протеасомах. Однако в отличие от Keap1 данный регуляторный белок помимо домена Neh2
взаимодействует с С-концевым bZip-участком, способен связывать мутантный Nrf2 с
измененной последовательностью ETGE и, что наиболее важно, опосредованная им репрессия
не снимается при окислительном стрессе. Таким образом, CRIF1 является редокс-независимым
негативным
регулятором
экспрессии
ARE-зависимых
генов,
действующим
на
этапе
посттрансляционной модификации молекулы Nrf2 [Kang H.J. et al., 2010].
Кроме того, существует еще один механизм активации Nrf2, связанный с его
ацетилированием. Гистон-ацетилтрансфераза р300/СВР катализирует перенос ацетильных
групп на несколько остатков лизина в Neh1-домене Nrf2. Этот процесс активируется при
окислительном стрессе, индуцированном арсенитами. При этом замена остатков лизина на
аргинин не влияет на стабильность мутантного белка, но снижает его ДНК-связывающую
активность. Интересно, что опосредованная р300/СВР модификация фактора Nrf2 усиливает
экспрессию ARE-зависимых генов NQO1, TRXR и GSTA1, но не НO-1, таким образом,
избирательно взаимодействуя с различными промоторами [Sun Z. et al., 2009].
Важным механизмом, регулирующим экспрессию ARE-зависимых генов, является
фосфорилирование молекул Nrf2 и Keap1, которое катализируется протеинкиназами различных
семейств: PKC (protein kinase C), JNK (c-Jun N-terminal protein kinase), PI3K (phosphoinositide 3
kinase), ERK (extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK (p38 mitogen activated protein
kinase), PERK (pancreatic eIF-2α-related endoplasmic reticulum kinase), GSK-3β (glycogen synthase
kinase 3β) [Зенков Н.К. и др., 2013]. Одной из главных киназ, вовлеченных в регуляцию ARE
является PKC, фосфорилирующая остаток серина в Neh2-участке Nrf2 (S40, распложенный
между мотивами DLG и ETGE), что ослабляет его взаимодействие с Keap1 и повышает
стабильность и время его существования в клетках, не влияя, однако, на транспорт в ядро и
связывание с ARE [Bloom D.A., Jaiswal A.K., 2003]. Фосфорилирование Nrf2 PERK,
активирующейся в ответ на образование несвернутых белков, приводит к стабилизации
транскрипционного фактора, вызывая диссоциацию комплекса с Keap1 и предупреждая его
27
обратную сборку, и усиливает экспрессию ARE-зависимых генов [Cullinan S.B. et al., 2003;
Cullinan S.B., Diehl J.A., 2004]. Протеинкиназный каскад PI3K/Akt активируется при действии
сульфорафана [Lee Y.J. et al., 2012], куркумина [Zhao S.G. et al., 2011], тритерпеноидов [PithaRowe I. et al., 2009], 15-дезоксипростагландина J2 [Song N.Y. et al., 2011], пероксинитрита
[Lee C. et al., 2011], в результате чего повышается экспрессия контролируемых ARE генов, тем
не менее механизм этой активации остается неизвестным. Изменения активности митогенактивируемых протеинкиназ JNK, ERK и p38 приводит к разнообразным эффектам – от
многократного усиления активации Nrf2 до ее полной отмены в зависимости от условий
эксперимента [Ткачев В.О. и др., 2011].
Некоторые протеинкиназы участвуют в негативной регуляции передачи сигнала в системе
Keap1/Nrf2/ARE.
Фосфорилирование
кальмодулин-зависимой
казеинкиназой
2
серин/треониновых остатков транскрипционного фактора Nrf2 снижает его стабильность и
угнетает способность связываться с ARE [Pi J. et al., 2007]. Синтезируемый de novo белок Keap1
конститутивно
фосфорилируется
в
положении
Y141
ВТВ-домена
неустановленной
тирозинкиназой. Дефосфорилирование данного аминокислотного остатка, происходящее при
окислительном стрессе, ускоряет деградацию репрессорного белка. Мутантный белок
Keap1(Y141А) также имеет меньшее время существования и, хотя способен формировать
димеры, функционально неактивен [Jain A.K. et al., 2008].
Таким образом, фосфорилирование является одним из ключевых этапов активации Nrf2,
однако роль конкретных протеинкиназ и фосфатаз в регуляции сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE во многом зависит как от типа клеток, так и природы индуктора.
Наличие специфических сигналов NES и NLS, связывающих белки экспортины и
импортины, в структуре Keap1 [Velichkova M., Hasson T., 2005; Sun Z. et al., 2007] и Nrf2
[Jain A.K et al., 2005; Theodore M. et al., 2008] указывает на возможность регуляции этой
системы за счет транспорта белков из цитоплазмы в ядро и обратно. Nrf2 содержит три NLS – в
bZip-домене Neh1 (двойной сигнал bNLS), в N-концевом (NLSN, домен Neh2) и C-концевом
(NLSC, домен Neh3) участках, и два NES – в bZip-домене Neh1 (NESZip) и в трансактивационном
домене
Neh5
(NESTA),
в
физиологических
условиях
взаимно
компенсирующих
разнонаправленное действие друг друга [Меньщикова Е.Б. и др., 2010]. При нарушениях
гомеостаза начинает преобладать относительная активность NLS, в результате чего Nrf2
накапливается в ядре. Участок NLS TA идентифицирован как редокс-чувствительный
регуляторный элемент, содержащий чрезвычайно реакционноспособный аминокислотный
остаток Сys183, который модифицируется низкими дозами алкилирующих агентов [Li W.,
Kong A.N., 2009]. Модификация C183 под воздействием окислителей (Н2О2, сульфорафана и
tBHQ) дозозависимо приводит к накоплению Nrf2 в ядрах клеток с подавленным синтезом
28
Keap1, а мутация С183А нарушает индуцированную транслокацию Nrf2 в ядро и экспрессию
генов-мишеней [Li W. et al., 2006].
Таким образом, действие Keap1 в качестве молекулярного сенсора окислительного стресса
может играть разрешительную роль в активации Nrf2, тогда как прямая окислительная
модификация транскрипционного фактора позволяет в зависимости от интенсивности
стрессорного воздействия регулировать силу, скорость и продолжительность ARE-зависимого
ответа. Образование гетеродимерного комплекса Nrf2 c Maf-белками за счет взаимодействия их
bZip-доменов приводит к маскированию участка NESZip и снижает транспорт фактора из ядра в
цитоплазму [Li W. et al., 2008]. Белок ядерного матрикса NRP/B (nuclear restricted protein/brain),
относящийся к тому же семейству, что и Keap1, связываясь с Nrf2 (под действием Н 2О2 это
взаимодействие
может
усиливаться),
усиливает
экспрессию
ARE-зависимых
генов
[Seng S. et al., 2007] за счет аккумуляции транскрипционного фактора в ядре и предотвращения
его экспорта в цитоплазму. Мутации белка NRP/B, изменяющие его локализацию с ядерной на
цитоплазматическую,
нарушают
индуцированную
экспрессию
ARE-зависимых
генов
[Seng S. et al., 2009].
Посттрансляционная модификация экспортина Crm1 способствует подавлению обратного
транспорта фактора Nrf2 в цитоплазму при окислительном/нитрозирующем стрессе.
S-нитрозилирование цистеиновых аминокислотных остатков C528 и C585 белка Crm1 тормозит
транспорт белков-мишеней в цитоплазму за счет нарушения его взаимодействия с NESпоследовательностями. Экспрессия ARE-зависимых генов в результате этого процесса
усиливается донорами оксида азота за счет усиленного накопления Nrf2 в клеточном ядре
[Wang P. et al., 2009].
Связывание Nrf2 с ДНК регулируется за счет изменения внутриядерного окислительновосстановительного баланса: если C506 в домене Neh1 (отвечающем за связывание с ДНК)
находится
в
восстановленном
взаимодействует
с
[Bloom D. et al., 2002].
ARE
(Nrf2
Для
состоянии,
с
транскрипционный
мутацией
нормального
С506S
фактор
функционально
функционирования
эффективно
менее
сигнальной
активен)
системы
Keap1/Nrf2/ARE в клеточном ядре должно происходить восстановление аминокислотного
остатка C506, так как в цитоплазме в условиях окислительного стресса происходит его
модификация.
Показано,
что
восстановление
C506
осуществляется
тиоредоксином-1
[Hansen J.M. et al., 2004], являющимся, таким образом, коактиватором экспрессии AREзависимых генов [Kim Y.C. et al., 2003]. Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза АРЕ/Ref-1
принимает участие в этом процессе, играя роль своеобразного «редокс-шаперона» и усиливая
взаимодействие Nrf2 с тиоредоксином [Gurusamy N. et al., 2007]. Другими остатками цистеина,
участвующими во взаимодействии Nrf2 с ARE, являются C119 и C235 (их замена на аланин (как
29
и замена C506) существенно снижает способность мутантных белков связываться с энхансером
гена NQO1 в условиях подавления протеиназной активности в сравнении с белком дикого
типа). Они же оказались абсолютно необходимы для взаимодействия с коактиватором
транскрипции р300/СВР [He X., Ma Q., 2010].
В условиях физиологической нормы последовательности ARE заняты белком Bach1,
образующим с Maf-белками не обладающие трансактивирующей способностью димеры и
препятствующие связыванию Nrf2 с ДНК. Bach1 негативно регулирует экспрессию AREзависимых генов, обладая бóльшим сродством к промотору HO-1 [MacLeod A.K. et al., 2009].
Индукция
гемом
гена
HO-1
сопровождается
диссоциацией
комплексов
Bach1/Maf
[Sun J. et al., 2004], Crm1-зависимым экспортом в цитоплазму Bach1, его убиквитинированием и
разрушением
в
протеасомах
[Zenke-Kawasaki
Y.,
et
al.,
2007].
фосфорилирование
неустановленной тирозинкиназой Bach1 по аминокислотному остатку Y486 приводит к его
диссоциации от ДНК и выходу в цитоплазму при действии на клетку tBHQ, в результате чего
становится возможным взаимодействие Nrf2 с ARE [Kaspar J.W., Jaiswal A.K., 2010]. Кроме
того, для редокс-зависимого выключения репрессорного действия Bach1 необходимо окисление
в его ДНК-связывающем домене аминокислотного остатка C574, замена которого на серин
приводит к потере чувствительности к окислительному стрессу [Ishikawa M. et al., 2005]. ARE
также связывают белки подсемейства NF-E2 Bach2, Nrf3, укороченная изоформа р65 фактора
Nrf1 (в отличие от «полноразмерного» белка), а также С-концевой фрагмент Nrf2,
образующийся за счет деградации молекулы транскрипционного фактора каспазой 3, но они не
обладают трансактивирующей способностью, за счет чего и являются репрессорами
транскрипции генов [Biswas M., Chan J.Y., 2010]. Помимо этого с Nrf2 за сайты связывания
также конкурируют c-Fos, Fra1 (в комплексе с Jun-белками), малые Maf-белки (образующие
гомодимеры с репрессорными свойствами) и c-Maf (в форме гетеродимеров с малыми Maf)
[Dhakshinamoorthy S., Jaiswal A.K., 2002]. Ретиноевые кислоты снижают экспрессию AREзависимых генов, усиливая транслокацию рецептора RARα (retinoic acid receptor α) в клеточное
ядро,
где
он
образует
комплексы
с
Nrf2,
нарушая
его
взаимодействие
с
ДНК.
[Wang X.J. et al., 2007].
Недавно было показано, что предотвращать транскрипцию Nrf2-зависимых генов за счет
уменьшения доступных уровней коактиваторов и привлечения корепрессоров способен белок
семейства NF-κB р65. И Nrf2, и p65 способны связываться с доменом CH1-KIX СВР, но после
фосфорилирования р65 по Ser276 он эффективнее связывается с CBP, таким образом, NF-кВ
может подавляет транскрипцию ARE-зависимых генов, предотвращая связывание СВР с Nrf2
(93). Описан и второй механизм p65-зависимой репрессии ARE, в котором принимает участие
гистондезацетилаза 3 (HDAC3). Фосфорилированный р65 снижает уровень доступного для Nrf2
30
коактиватора CBP, связываясь с ним, что снижает уровень транскрипции ARE-зависимых
генов, и, к тому же, позволяет HDAC3 тоже связываться с CBP. Удаление CBP из комплекса с
гетеродимером Nrf2-MafK приводит к его дестабилизации, что позволяет HDAC3 связывать и
деацетилировать MafK [Wakabayashi N. et al., 2010]. Таким образом, HDAC3 взаимодействует с
ARE-содержащими последовательностями ДНК, будучи связанной с CBP или MafK, в
результате чего структура хроматина становится более компактной и затрудняется экспрессия
зависимых генов [Liu G.H. et al., 2008]. Комплексы с Nrf2, нарушающие его взаимодействие с
коактиваторами транскрипции, образуют орфановый рецептор ERRβ (estrogen-related receptor
β), эстрогеновый рецептор α и содержащий bZip-домен транскрипционный фактор ATF3
(activating transcription factor 3) [Zhou W. et al., 2007; Brown S.L. et al., 2008]. Этим объясняется
репрессия экспрессии ARE-зависимых генов, вызываемая 17β-эстрадиолом (естественным
лигандом эстрогенового рецептора α) [Ansell P.J. et al., 2005] и трансформирующим фактором
роста β (активатором продукции ATF3) [Bakin A.V. et al., 2005].
1.1.5. Механизмы инактивации системы Keap1/Nrf2/ARE
Механизмы деактивации сигнального пути Nrf2/Keap1 в послеиндукционный период,
когда в клетке восстанавливается редокс-баланс, изучены мало, несмотря на интенсивное
изучение механизмов его активации. В одной из работ, посвященных исследованию
нисходящей фазы Nrf2/Keap1-опосредованного ответа клетки, показано, что экспорт Nrf2 из
ядра в цитоплазму происходит при помощи все того же Keap1 благодаря наличию в его
структуре мотива NES [Sun Z. et al., 2007]. Авторы предполагают, что Keap1 содержит некий
неклассический редокс-чувствительный мотив NLS, который активируется при восстановлении
редокс-гомеостаза и способствует проникновению белка в ядро, где он связывается с Nrf2 и
транспортирует его назад в цитоплазму, хотя в этом случае остается неясным, каким образом
Keap1 освобождается от взаимодействия с актином. Кроме того, предложен еще один механизм.
Если ранее предполагали, что убиквитинирование молекулы Nrf2 происходит исключительно в
цитоплазме, то затем обнаружили способность ассоциированного с комплекса Keap1/Cul3Rbx1поступать в клеточное ядро вместе с белком протимозином-α, конкурирующим за
связывание Kelch-домена с Nrf2 и не подверженным Keap1-зависимому убиквитинированию
[Ткачев В.О. и др., 2011]. Протимозин-α – это небольшой кислый белок массой 12,1 кДа (его
структура очень динамична и неупорядочена, вследствие чего он не формирует стабильных
вторичных и третичных структур, однако, связываясь с ионами цинка, он может принимать
более компактные конформации [Yi S. et al., 2007; Uversky V.N. et al., 2000], имеющий
множество биологических функций: он усиливает клеточную пролиферацию, укорачивая G1
фазу клеточного цикла [Rodriguez P. et al., 1998], способен связываться с гистонами, участвуя в
31
ремоделинге хроматина [Karetsou Z. et al., 1998; Karetsou Z. et al., 2004], является активатором
транскрипции, действуя через CBP [Karetsou Z., 2002; Subramanian C. et al., 2002],
предотвращает формирование апоптосом [Khan H. et al., 2013]. Отрицательно заряженный
протимозин-α при помощи мотива ENGE связывается с положительно заряженной аргининовой
триадой, расположенной на дне шестилопастного β-пропеллерного Kelch-домена Keap1 (как
мотив ETGE Nrf2) [Khan H. et al., 2013]. В ядре происходит обмен протимозина-α на Nrf2, что
сопровождается внутриядерным убиквитинированием молекулы фактора транскрипции с
последующей деградацией в протеасомах [Niture S.K., Jaiswal A.K., 2009]. Предполагается, что
такой механизм опосредует завершение Nrf2-зависимой активации и «выключение» AREзависимых генов (рисунок 1.1.4.1). Кроме того, было показано, что, несмотря на свою
антиапоптотическую деятельность в цитоплазме,
протимозин-α способен увеличивать
активность р53, усиливая его ацетилирование [Kobayashi T. et al., 2006]. Хотя р53 известен, в
основном, как проапоптотический белок, в последнее время были выявлены некоторые аспекты
его функционирования, приводящие к увеличению экспрессии р21, который, связываясь с Nrf2
в комплексе Keap1/Cul3-Rbx1, приводит к снижению убиквитинирования и стабилизации
транскрипционного фактора [Chen W. et al., 2009]. С другой стороны, эти действия прямо
противоположны усилению убиквитин-зависимой деградации Nrf2 через транспортировку
комплекса Keap1/Cul3-Rbx1 в ядро. Показано, что взаимодействие протимозина-α с Keap1
значительно усиливается в присутствии ионов цинка, способствующих его структурированию и
компактизации [Uversky V.N. et al., 1999; Yi S. et al., 2007], что может являться основой
механизма переключения клеточной функции протимозина-α: высокая концентрация ионов
цинка выключает Nrf2-зависимый ответ и способствует апоптозу [Stępkowski T.M., Kruszevski
M.K., 2011].
Соединения As(III), являющиеся мощными индукторами Nrf2, увеличивают время
существования молекулы транскрипционного фактора с 21 до 200 мин в клетках гепатомы
мыши Hepa1c1c7, нарушая процесс формирования и вызывая диссоциацию уже образованных
комплексов Keap1/Nrf2 в клеточном ядре [He X. et al., 2006]. Таким образом, этот класс ARE
реализует свое действие на этапе «выключения» сигнального действия Nrf2.
Существуют и другой путь выключения Nrf2. Киназы подсемейства А семейства Src: Fyn,
Src, Yes и Fgr - фосфорилируют Nrf2 по остатку тирозина Y568, что приводит к его экспорту из
ядра и последующей Keap1-опосредованной деградации [Kaspar J.W., Jaiswal A.K., 2010;
Kaspar J.W., Jaiswal A.K. 2011; Kaspar J.W. et al., 2012]. При окислительном стрессе киназы
подсемейства
SrcA,
включая
Fyn,
активируется
в
результате
фосфорилирования
неустановленного остатка треонина киназой GSK-3β, благодаря чему осуществляется
32
негативный контроль экспрессии ARE-зависимых генов [Rada P. et al., 2011; Jain A.K.,
Jaiswal A.K., 2007].
Выключению Nrf2 способствует усиление экспрессии генов BACH1, KEAP1, RBX1 и
CUL3, а также убиквитина и компонентов 26S-протеасомы, содержащих в своих промоторах
последовательности ARE и регулирующих активность транскрипционного фактора по
механизму обратной связи [Lee O. et al., 2007; Kaspar J.W., Jaiswal A.K., 2010a,b]. Кроме того, в
ответ на действие антиоксидантов развивается преиндукционный ответ, в ходе которого
негативные регуляторы Nrf2 экспортируются из ядра. Показано, что через 0,5-1 час после
воздействия антиоксидантов неустановленная тирозинкиназа фосфорилирует Y85 Keap1, Y213
Fyn, Y486 Bach1, приводя к экспорту из ядра, убиквитинированию и деградации этих белков,
обеспечивая беспрепятственное поступление в ядро Nrf2 и эффективную индукцию
цитопротекторных генов [Niture S.K. et al., 2013].
Таким образом, Keap1/Nrf2/ARE – сложная система внутриклеточной редокс-регуляции.
Её отличительной особенностью является большое количество способных к окислительным
модификациям цистеиновых остатков, отвечающих достаточно специфично на разные
стимулы, а также возможность редокс-регуляции Nrf2 на разных стадиях, от синтеза мРНК до
связывания с последовательностями ARE. Это делает систему с одной стороны весьма
чувствительной к различным индукторам, а с другой – чрезвычайно гибкой и способной
дифференцированно отвечать на различные стимулы. Благодаря этому сигнальная система
Keap1/Nrf2/ARE, хотя и не является жизненно необходимой, определяет физиологический
уровень изменений редокс-баланса, превышение которого ведет к патологическим изменениям
и инициирует «превентивный» ответ клетки на нарушения гомеостаза.
1.2. Активированные кислородные метаболиты и их роль в развитии окислительного
стресса и воспаления
Под активированными кислородными метаболитами (АКМ) в современной науке
подразумевают широкий класс высокореакционных соединений радикальной и нерадикальной
природы, образующихся в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или
изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях (в последнем
случае речь идет о синглетном кислороде) [Зенков Н.К. и др. 2001; Halliwell B.,
Gutteridge J.M.C., 1999].
Данное определение подчеркивает основные свойства АКМ – их высокую химическую
активность и наличие в химической структуре атома кислорода с промежуточной степенью
окисления. Таким образом, группа АКМ не сводится ни к радикалам вообще, ни к кислородным
радикалам (рисунок 1.3); в более общем случае можно говорить о прооксидантах.
33
Рисунок 1.3. Активированные кислородные метаболиты, активные формы кислорода и
радикалы [Меньщикова Е.Б. и др., 2006]
Химические вещества, относящиеся к группе первичных АКМ, синтезируются с участием
специализированных молекулярных механизмов, большая часть из которых представляет собой
ферментативные процессы. Стационарная концентрация АКМ в клетках зависит как от
скорости процессов их образования, так и от активности антиоксидантных систем клетки
(содержания
антиоксидантов
ферментативной
и
неферментативтной
природы).
Взаимосвязанные между собой стационарная концентрация АКМ и общая антиоксидантная
активность (составляющие «окислительно-восстановительный внутриклеточный баланс», или
"редокс-баланс") оказывают важное влияние практически на все процессы жизнедеятельности
клетки.
Согласно определению, данному Гельмутом Зисом в 1991 г. и видоизменённом им в
соавторстве с Дином Джонсом в 2007 г., окислительный стресс – это изменение баланса
прооксидантов и антиоксидантов в сторону относительного преобладания прооксидантов,
которое приводит к повреждению макромолекул и нарушению редокс-регуляции [Sies H., 1991;
Sies H., Jones D.P., 2007].
Изначально окислительный стресс рассматривался в качестве ведущего патогенетического
механизма дезорганизации клеточного метаболизма и развития различных патологических
процессов (воспаления, канцерогенеза, формирования резистентности к инсулину, старческих
изменений и др.) [Sies H., 1991; Storey K.B., 1996]. Однако позднее было доказано, что АКМ
принимают участие в физиологической регуляции клеточных функций. По современным
представлениям АКМ являются важными сигнальными молекулами. При этом ведущая роль в
процессах внутри- и межклеточной сигнализации отводится оксиду азота, перекиси водорода и,
в меньшей степени, супероксидному анион-радикалу, в силу их относительно более высокой
стабильности (в том числе обусловленной способностью образовывать лабильные аддукты с
биологическими молекулами, например, за счет обратимого нитрозилирования SH-групп или
координации по атомам металлов в металлопротеинах [Oya Y., Yamomoto K., 1988;
Ванин А.Ф., 1998; Gow A.J., Stamler J.C., 1998; Gladwin M.T. et al., 2000[) и способностью
34
мигрировать на достаточно большие расстояния, в том числе через клеточные мембраны (в том
числе используя аквапорины или ионные каналы [Lynch R.E., Fridovich I., 1978;
Bienert G.P. et al., 2007]).
В настоящее время воспаление рассматривается как сформировавшаяся в эволюции
местная стереотипная аварийная защитно-приспособительная сосудисто-тканевая реакция
организма на действие патогенного раздражителя, вызывающего повреждение ткани, и
направленная на восстановление гомеостаза. С точки зрения патофизиологии воспаление
относится к типовым патологическим процессам, описывающим общие закономерности ряда
заболеваний разной этиологии и локализации. Эффекторами и модуляторами воспалительного
процесса являются фагоцитирующие клетки: макрофаги, моноциты, полиморфноядерные
лейкоциты [Маянский Д.Н., 1991; Меньщикова Е.Б и др., 2010].
В развитии острого воспаления выделяют три фазы: альтерацию, экссудацию и
пролиферацию. На стадии альтерации развиваются повреждения ткани, нарушение в ней
питания, а также изменяются её структура и функции.
Первичная
альтерация
зависит
от
свойств
флогогена
и
является
результатом
повреждающего воздействия воспалительного агента. На стадии первичной альтерации можно
выделить два основных процесса включения окислительных реакций с участием АКМ.
В физиологических условиях во всех тканях аэробных организмов, главным образом, в
мембранах и липопротеиновых структурах, протекают процессы перекисного окисления
липидов (ПОЛ), являющиеся вырожденно-разветвленными, которые сдерживаются на низком
уровне многокомпонентной системой антиоксидантов. Как и любая цепная реакция, процесс
ПОЛ состоит из этапов инициации (зарождения цепей окисления), продолжения, разветвления
и обрыва (схема 1.1).
Важную роль в ингибировании ПОЛ играет структурная организация мембран, поэтому
всякого рода повреждения структуры живой системы неизбежно сопровождаются активацией
ПОЛ. Таким образом, усиление окисления липидов является универсальным ответом клеток и
тканей
на
начальной
эволюционными
стадии
воспаления.
предшественниками
По-видимому,
эйкозаноидной
процессы
регуляции,
и
ПОЛ
являются
потому
продукты
свободнорадикального окисления липидов мембран на уровне целого организма могут
индуцировать нейрогуморальные изменения. Кроме того, за счет нестабильности связи О-О из
перекисей липидов могут образовываться различные токсичные для организма продукты
[Меньщикова Е.Б. и др., 2008].
Конечные продукты ПОЛ (2-алкенали и 4-гидроксиалкенали) обладают высокой
хемотаксической активностью [Curzio M., 1988; Torrielli M.V., Dianzani M.U., 1984]: 4гидрокиси-2-алкенали,
представляющие
собой
образующиеся
при
неферментативном
35
окислении жирных кислот в клеточных мембранах или липопротеинах крови биологически
активные
альдегиды,
участвуют,
в
частности,
в
хемотаксисе
гранулоцитов
[Curzio M. et al., 1987]. Продукты ПОЛ не только стимулируют направленную миграцию
нейтрофилов, но при высоких концентрациях могут и ингибировать ее [Curran R.D. et al., 1989;
Dianzani M.U. et al., 1996].
Схема 1.1
Характерные реакции, протекающие при окислении углеводорода (RH) в присутствии
кислорода и ингибитора (InH)
Зарождение цепей окисления:
(0)
RH  R
Продолжение цепей окисления:
(1)
R + O2  RO 2
(2)
RO 2 +RH  ROOH +R
Вырожденное разветвление цепей:
(3)
RООН  RO + OH
(3')
RООR'  RO + ОR'
Обрыв цепей окисления:
(4)
R + R  RR
(5)
RO 2 + R  ROOR
(6)
RO 2 + RO 2  ROOR + O2
(7)
RO 2 + InH  ROOH + In
(7')
RO + InH  ROH + In
(7'') R + InH  RH + In
(8)
RO 2 + In  ROOIn
Прочие реакции с участием ингибитора (–7) ROOH + In  RO 2 + InH
и продуктов его превращений:
(9)
In + In  молекулярные продукты
(10) In + RH  InH + R
(11) InH + ROOH  In + RO + Н2О
(12) InH + О2  In + НO 2
(13) ROOIn  RO + InO

Примечание. RH – углеводород (липид); R, RO и RO 2 – соответственно алкильный, алкоксильный и перекисный
(пероксидный) радикалы; RООН – органический гидропероксид; InH – ингибитор; In – радикал ингибитора.
Реактивные альдегиды могут изменять активность ферментов, ингибировать действие
шаперонов и модифицировать структуру апобелков в липопротеинах, взаимодействуя с
сульфгидрильными
и
аминогруппами
белков.
Так,
4-гидрокси-2-ноненаль
способен
образовывать циклические аддукты в результате взаимодействия с аминокислотными
остатками лизина, гистидина и цитозина [Лущак В.И., 2007], усиливать адгезию моноцитов,
подавлять активность тиоредоксина-1, взаимодействуя с его аминокислотным остатком Cys73
[Go Y. et al., 2007]. В очаге воспаления продукты ПОЛ модулируют метаболическую
активность фагоцитирующих клеток (в высоких (микромолярных) концентрациях 4-гирокси-2ноненаль
ингибирует
хемилюминесценцию
гранулоцитов
и
продукцию
О2
в
форболмиристатацетат- и зимозан-стимулированных клетках [Dianzani M.U. et al., 1996; Di
Mauro C. et al., 1990], в низких же концентрациях он оказывает прайминг-эффект на продукцию
О2 гранулоцитами [Dianzani M.U. et al., 1996]). Таким образом, подобно другим липидным
модуляторам, таким как простагландин Е2, в низких концентрациях альдегиды оказывают
36
провоспалительный эффект, индуцируя выход гранулоцитов в очаг воспаления и повышая их
активность. В то же время высокие концентрации оказывают антивоспалительное действие,
снижая хемотаксис и метаболическую активность фагоцитов [Меньщикова Е.Б. и др., 2008].
Первичные продукты процессов ПОЛ также оказывают существенное влияние на
активность развития воспалительной реакции. Так, гидроперекиси полиненасыщенных жирных
кислот (докозагексаеновой, эйкозапентаеновой, арахидоновой кислот), действуя через
ингибирование экспрессии молекул адгезии VCAM-1 (vascular cell adhesion molucule-1) и
ELAM-1 (endothelial leukocyte adhesion molecule-1), ингибируют адгезию моноцитов к
эндотелиоцитам, стимулированным липополисахаридом, фактором некроза опухолей-α (tumor
necrosis factor-α, TNF-α), IL-1, форболмиристатацетат [Sethi S. et al., 1996].
Другими источниками продукции АКМ на стадии первичной альтерации являются NOсинтаза, ксантиноксидоредуктаза, и экстрацеллюлярная супероксиддисмутаза.
Супероксиддисмутазы (superoxide dismutase, SOD) являются важным источником
перекиси в клетках, катализируя реакцию дисмутации супероксидного радикала (и увеличивая
скорость спонтанного протекания дисмутации [Field L.S. et al., 2003]).
2 О2 + 2Н+ → H2O2 + О2
Известно о существовании нескольких изоформ SOD, отличающихся строением активного
центра.
В
организмах
млекопитающих
выявляются
3
основные
формы
фермента:
цитоплазматическая (SOD1), митохондриальная (SOD2) и экстрацеллюлярная (SOD3)
[Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. SOD1 в качестве кофакторов-ионов металлов содержит Zn2+ и
Cu2+.
Ксантиноксидоредуктаза осуществляет окисление ксантина и гипоксантина с переносом
электронов на молекулу кислорода, при этом, окисляясь в исходное каталитически активное
состояние, ксантиндегидрогеназная форма фермента в качестве акцептора электронов
использует главным образом NAD+, оксидазная же – молекулярный кислород, в результате чего

наблюдается образование О 2 (при высоком парциальном давлении кислорода) и Н2О2 (при
низком давлении) [Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. Ксантиноксидоредуктазы активно
секретируются клетками и в больших количествах обнаруживаются во внеклеточных
пространствах, в частности в сыворотке крови [Yamamoto T. et al., 1996]. В условиях покоя
активность фермента невелика, но провоспалительные цитокины, липополисахарид, гипоксия
увеличивают его экспрессию [Berry C.E., Hare J.M., 2004].
NO-синтазы (NOS) – это цитохром-Р450-подобные гемопротеины, образующие NO за счет
ферментативного окисления аминокислоты L-аргинина до цитруллина в ходе реакции:
2L-аргинин + 3NADPH + 4O2 + 3H+ → 2L-цитруллин + 2NO + 3NADP+ + 4H2O
37
Монооксид азота NO (оксоазанил, оксидонитроген(), устар. оксид азота) является
важным эндогенным регулятором внутриклеточных процессов. По своим физико-химическим
характеристикам NO представляет собой парамагнитный газ, имеющий один неспаренный
электрон на внешней орбитали, вследствие чего может быть отнесен к свободным радикалам.
За счет достаточно большого времени полужизни, способности, зависящим от типа ткани и
условий [Kikuchi K. et al., 1993; Thomas D.D. et al., 2001] и способности образовывать
лабильные S-нитрозотиолы [Ванин А.Ф., 1998] и присоединяться к центральному атому
металлов гемопротеинов [Gow A.J., Stamler J.S., 1998], формируя в тканях «депо», NO
способен оказывать действие на структуры, относительно удаленные от места образования
данной молекулы, благодаря чему он способен оказывать пара- и эндокринное действие
[Schechter A.N, Gladwin M.T, 2003]. В то же время NO легко вступает в реакции с
молекулярным кислородом (k = 6 х 106 М-1с-1) и тем более с супероксидным анион-радикалом
(k = 1,6 х 1010 М-1с-1) [Inoue M. et al., 2003].
На сегодняшний день известно о существовании трех изоформ данного фермента –
нейрональной (nNOS), индуцибельной, или макрофагальной, (iNOS), и эндотелиальной (eNOS),
которые кодируются различными генами (NOSI, NOSII и NOSIII, соответственно). Механизм
образования NO из L-аргинина у всех трех изоформ схож, их различия касаются
преимущественно структуры [Loesch A. et al., 1993], механизмов регуляции, распределения в
тканях и внутриклеточной локализации [Alderton W.K. et al., 2001].
Активные ферменты NOS представляют собой гомодимеры, мономеры которых имеют в
своем составе редуктазный и оксигеназный домены. Оксигеназный домен содержит в своей
структуре гем, тетрагидробиоптерин в качестве кофакторов и сайт связывания L-аргинина. В
состав редуктазного домена входят кофакторы FAD и FMN и сайт связывания кальмодулина и
NADPH [Richards M.K, Marletta M.A., 1994; McMillan K., Masters B.S., 1995].
Эндотелиальная
(локализована
в
мембранах,
кавеолах
и
комплексе
Гольджи
эндотелиоцитов, эпителиоцитов, кардиомиоцитов, нейронов, обнаруживается в тромбоцитах) и
нейрональная (локализована в цитоплазме и комплексе Гольджи нейронов и скелетных мышц)
изоформы NOS конститутивны и кальций/кальмодулин-зависимы. Основным регулятором
активности этих изоформ является внутриклеточная концентрация кальция [Andrew P.J,
Mayer B., 1999]. Образование в эндотелиальных клетках NO-радикалов является важным
компонентом физиологической регуляции тонуса сосудов, предупреждения тромбообразования
и снижения адгезии нейтрофилов к эндотелию [Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. В
эндотелиоцитах также выявляется ксантиноксидоредуктаза, которая, в результате окисления
дисульфидных связей или ограниченного протеолиза, может переходить в оксидазную форму.
Если в эндотелиоцитах в нормальных условиях на оксидазу приходится менее 1/3 суммарной
38
активности фермента, то в очаге воспаления это значение возрастает до 2/3 и выше (величины
во многом зависят от методов приготовления образцов) [Ward P.A., 1991]. Переход в
оксидазную форму, как было сказано выше, сопровождается резким усилением продукции О2 и
Н2О2 [Меньщикова Е.Б. и др., 2006].
Хотя NO и О2 – малоактивные радикалы, они эффективно взаимодействуют между собой
с образованием реакционного пероксинитрита (О2 + NO· → ONOO¯) (причем константа
скорости этой реакции выше константы реакции дисмутации, катализируемой SOD
[Меньщикова Е.Б. и др., 2008]), который способен проникать через липидные мембраны (в
форме пероксиазотистой кислоты) [Marla et al., 1997], окислять NH2- и SH-группы белков,
гидроксилировать и нитровать остатки ароматических аминокислот в составе белков
[Alvarez B., Radi R., 2003], индуцировать процессы перекисного окисления липидов в
мембранах
[Radi
R.
et
al.,
1991],
образование
однонитевых
разрывов
ДНК
[Salgo M.G. et al., 1995] и поперечных сшивок между цепями или ДНК и белком [Beda N.V.,
Nedospasov A.A., 2007] и модификации азотистых оснований [Inoue S., Kawanishi S., 1995].
Кроме того, из пероксинитрита в кислой среде в ходе реакции, не требующей присутствия
ионов металлов в качестве катализаторов, может образовываться НО∙. Поскольку скорость
взаимодействия супероксидного радикала с NO выше, чем с супероксиддисмутазой, возможно,
данная реакция является основным источником гидроксильных радикалов в клетках
[Freeman B., 1994]. Ингибирование NO-радикалов в результате взаимодействия с О2 вызывает
вазоконстрикцию, повышает адгезию нейтрофилов и агрегацию тромбоцитов.
Ксантиноксидаза, находящаяся на люминальной поверхности эндотелиальных клеток
капилляров, действует как молекулярный переключатель, индуцирующий синтез О2, который, в
свою очередь, ингибирует NO· и способствует адгезии циркулирующих фагоцитов; в результате
усиливается
обнаружение,
поглощение
и
утилизация
микроорганизмов
ретикулоэндотелиальной системой [Bulkley G.B., 1993]. Тонкость такой регуляции дополняется
контролем со стороны SOD3, связанной с обращенной в просвет сосуда поверхностью
эндотелиальной выстилки и лимитирующей локальную концентрацию О2.
Окислительный стресс, возникающий при воспалении, не только индуцирует поступление
фагоцитов в очаг воспаления, но и модулирует их рецепторные свойства, а также вызывает
регулируемое изменение фенотипа эндотелиальных клеток, характеризующееся повышением
экспрессии поверхностных молекул адгезии и других белков, участвующих в межклеточных
взаимодействиях
(так
называемую
активацию
эндотелия).
Так,
перекись
водорода
индуцировала экспрессию Fс-рецепторов CD64, CD32 и CD16 на поверхности нейтрофилов,
при этом на цитоплазматической мембране снижалось количество С-рецепторов CD35 и
CD11b/CD18. В отличие от перекиси водорода, супероксидный анион-радикал индуцировал
39
экспрессию С-рецепторов на поверхности клеток [Simms H.H., D’Amico R., 1995]. Во многих
работах показано, что усиление липкости эндотелия, характерное для воспалительной реакции,
опосредуется АКМ, в том числе супероксид-анионом, генерируемым NAD(P)H-оксидазами в
результате их активации медиаторами воспаления: под их действием на эндотелиальных
клетках возрастает экспрессия адгезивных молекул ICAM-1, VCAM-1, селектинов [Ray R.,
Shah A.M., 2005].
Таким образом, развитие окислительного стресса на начальных стадиях воспаления
вызывает вазоконстрикцию, усиливает агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к
эндотелию; миграцию в ткани гранулоцитов и моноцитов стимулируют продукты ПОЛ,
вызывающие также нейроэндокринные изменения на уровне целого организма.
При развитии воспалительной реакции выделяется фаза вторичной альтерации, которая
является следствием воздействия на соединительную ткань и микрососуды высвобождающихся
из
клеток
лизосомальных
ферментов
и
АКМ.
Вторичная
альтерация
определяется
преимущественно состоянием общего и местного иммунитета, и прежде всего — активностью
фагоцитирующих клеток.
В процессе фагоцитоза параллельно активируются две функции фагоцитов: выброс
содержимого гранул в фагосому и "кислородный взрыв" ("дыхательный", "метаболический")
[Сологуб Т.В., Романцов М.Г., 2010]. Главным ферментом дыхательного взрыва является
NADPH-оксидаза фагоцитов – сложный ассоциированный с мембраной комплекс, состоящий из
6
гетерогенных
субъединиц
и
катализирующий
реакцию
окисления
NADPH
(при
физиологических концентрациях NADH в клетках его окисление данным ферментом
практически не происходит [Cross A.R., Jones O.T., 1991]) с переносом электронов на
молекулярный кислород и образованием супероксидного анион-радикала:
NADPH + 2O2 → NADP+ + H+ + 2 О2
Активация NADPH-оксидазы фагоцитов приводит к многократному увеличению
потребления кислорода (что и привело к появлению термина «дыхательный взрыв») и
повышению стационарной концентрации О2 в фаголизосомах лейкоцитов, прежде всего
нейтрофилов, обеспечивая их микробицидный потенциал, и включает в себя сборку NADPHоксидазного комплекса на клеточной мембране.
Субъединицы p22phox и gp91phox вместе составляют цитохром b558 [Quinn M.T.,
Gauss K.A., 2004], который в нестимулированных нейтрофилах преимущественно локализован
на мембранах специфических (вторичных) и желатиназных (третичных) гранул и секреторных
пузырьков [Babior B.M., 1999], а после активации клетки – на мембранах первичных и
вторичных лизосом и наружной клеточной мембране [Borregaard N., 1985; Karlsson A.,
Dahlgren C., 2002]. Субъединица gp91phox содержит 6 α-спиральных трансмембранных доменов,
40
сайты связывания с основными кофакторами, FAD и NADPH, и цитоплазматической
субъединицей p47phox, а также 2 гема [Quinn M.T., Gauss K.A., 2004). Таким образом, цитохром
b558 содержит все необходимые компоненты для трансмембранного переноса электрона.
Остальные субъединицы NADPH-оксидазы не участвуют в переносе электронов, но
необходимы для ее работы (поскольку генетические дефекты, нарушающие синтез мРНК или
структуру любого компонента оксидазы приводят к редкому тяжёлому заболеванию –
хроническому гранулематозу [Lekstrom-Himes
J.A.,
Gallin
J.I.,
2000],
связанному с
неспособностью лейкоцитов продуцировать O2 ), и играют роль регуляторных элементов.
Субъединица p47phox облегчает сборку NADPH-оксидазного комплекса на мембране
[Freeman J.L., Lambeth J.D, 1996] и вместе с p40phox обеспечивает его взаимодействие с
фосфолипидами мембраны и актином цитоскелета. В состоянии покоя цитоплазматические
компоненты p47phox, p40phox и p67phox [El Benna J. et al. 1994] образуют тримерный комплекс. При
стимуляции клеток происходит их фосфорилирование, связанное с этим изменение
конформации и последующая транслокация на клеточные мембраны, где и осуществляется
взаимодействие с цитохромом b558. Компоненты NADPH-оксидазы Rac-белки 1 и 2 относятся к
семейству малых GTPаз. Их роль, по всей видимости, состоит в обеспечении взаимодействия
субъединиц и их правильной ориентации на мембранах [Alloul N. et al., 2001], хотя, возможно,
они участвуют в переносе электрона [Bokoch G.M., Diebold B.A., 2002]. Процесс активации
NADPH-оксидазы занимает достаточно короткое время, и продукция супероксидного радикала
начинается уже спустя секунды после активации клетки [Babior B.M., 1999].
Кроме фосфорилирования белков, существует и другой, более медленный путь регуляции
продукции О2, связанный с увеличением экспрессии gp91phox провоспалительными цитокинами
(IL-1β, TNF-α, IFN-γ) и LPS [Cassatella M.A. et al., 1990; Gupta J.W. et al., 1992) и ее снижением
противовоспалительными медиаторами (IL-4, IL-10) [Zhou et al., 1995; Kuga et al., 1996].
Экспрессия цитозольных компонентов NADPH-оксидазы под влиянием цитокинов практически
не изменяется.
В
настоящее
соответствующим
время
показано,
компонентам
что
наряду
NADPH-оксидазы
с
субъединицами,
фагоцитов,
идентичными
немиелоидные
клетки
экспрессируют их гомологи.
Наибольшим количеством изоформ представлен белок gp91phox. К настоящему времени,
включая сам gp91phox (он же Nox2), выявлено 7 его гомологов (таблица 1.3). В отличие от Nox2,
ферменты нефагоцитирующих клеток используют в качестве кофактора преимущественно
NADH (поэтому в целом семейство носит название "NAD(P)H-оксидазы") и конститутивно
синтезируют
супероксид-анион
в
небольших
внутриклеточно [Меньщикова Е.Б. и др., 2006].
количествах,
причём
преимущественно
41
Синтез АКМ и усиление свободнорадикальных окислительных процессов при альтерации
вызывает повреждение клеток и тканей, повышается проницаемость мембран. Наработка
органических перекисей вызывает закисление среды в очаге воспаления. Если на стадии
первичной
альтерации
наблюдается
ингибирование
NO-радикалов,
что
приводит
к
вазоконстрикции, то на более поздней стадии под действием цитокинов и бактериальных
липополисахаридов в клетках активируется индуцибельная NO-синтаза.
Таблица 1.3
phox
Особенности строения изоформ белка gp91
Степень
Белок
гомологии
с Nox2
Nox1
Nox3
60%
56%
Основное
место
Описание
экспрессии
Эпителий
При недостатке Nox2 частично компенсирует
толстого
дефицит, восстанавливая способность клеток
кишечника
генерировать О2 [Geiszt M. et al, 2003].
Внутреннее
ухо,
ткани плода
Опосредует
АКМ-зависимые
процессы
кристаллизации кальцита отокониев [Bánfi B.
et. al, 2004].
Функционирует в качестве молекулярного
Nox4
39%
Почки, эндотелий
сосудов
сенсора О2, регулирует рост клеток и синтез
эритропоэтина [Quinn M.T., Gauss K.A., 2004].
Синтезирует преимущественно H2O2, а не О2
[Takac I. et al., 2011].
Участвует
в
сперматогенезе
и
функционировании зрелых сперматозоидов; в
Nox5
27%
Селезенка,
активации, пролиферации и дифференцировке
лимфоузлы,
лимфоцитов [Bánfi B. et al, 2001]. Са2+-
семенники
зависимая и может функционировать без
участия
цитозольных
субъединиц
[Bánfi B. et al, 2001].
Duox1
53%
Duox2
47%
Щитовидная
На 83% гомологичны между собой. Обладают
железа
пероксидазной активностью, Са2+-зависимые
Щитовидная
[Lambeth
железа
Gauss K.A., 2004].
J.D.,
2004;
Quinn
M.T.,
42
Активность индуцибельной NO-синтазы (локализуется на мембране, в цитоплазме и
фагосомах,
пероксисомах
и
митохондриях
макрофагов,
нейтрофилов,
гепатоцитов,
гладкомышечных, глиальных клеток) в 100–1000 раз выше активности конститутивной NOсинтазы, не зависит от ионов Са2+ и регулируется преимущественно на уровне образования
матричной РНК. Транскрипция гена NOS II контролируется JAK/STAT и NF-κB-зависимыми
механизмами [Lowenstein C.J., Padalko E., 2004]. Активность iNOS при активации макрофагов
LPS в сочетании с IFN-γ начинает увеличиваться уже спустя несколько часов после
воздействия, достигает максимума спустя 12 часов и возвращается к исходному уровню через
72 часа [Cunha F.Q. et al., 1993]. Помимо этого существует механизм регуляции активности
iNOS за счет изменения стабильности мРНК iNOS [Rodriguez-Pascual F. et al., 2000].
Следует отметить, что оксид азота сам по механизмам отрицательной обратной связи
регулирует активность NO-синтазы за счет связывания с гемом оксигеназного домена
[Hyun J. et al., 1995], либо нитрозилирования SH-групп, что препятствует димеризации
фермента [Ravi K. et al., 2004]. Также показана способность NO ингибировать синтез мРНК
iNOS [Colasanti M. et al., 1995].
Известны гомологи p47phox и p67phox – Noxo1 и Noxa1 соответственно. Они колокализованы
с белком Nox1 и необходимы для образования О2 и регуляции данного процесса. Noxo1 и Noxa1
идентичны гомологам на 27 и 28% соответственно, но содержат все компоненты,
обеспечивающие специфические функции фагоцитарного аналога [Geiszt M., Leto T.L., 2004;
Lambeth J.D., 2004].
Провоспалительные цитокины повышают продукцию NO• не только посредством
усиления синтеза индуцибельной NO-синтазы, но также и посредством повышения экспрессии
диметиларгининдиметиламиногидролазы, отвечающей за метаболизм эндогенного ингибитора
NO-синтаз — асимметричного диметиларгинина [Гилинский М.А., 2007; Ueda S. et al., 2003].
Активация индуцибельной NO-синтазы и последующее повышение содержания NO• в
крови приводят к неконтролируемой вазодилатации в очаге воспаления, а, следовательно, и к
усилению кровоснабжения, что необходимо для удаления токсических продуктов и для
поступления нужных для репарации компонентов в дальнейшем. Помимо вазодилатации,
высокие концентрации NO-радикалов в очаге воспаления оказывают микробицидное,
туморицидное, антипролиферативное действие и модулируют развитие воспалительной
реакции [Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997; Blake D.R. et al., 1987]. NO• влияет на
метаболическую и секреторную активность макрофагов [Albina J.E. et al., 1989], ингибируя, в
частности, 5-липоксигеназу и NADPH-оксидазу [Меньщикова Е.Б. и др., 2006], тем самым
снижая синтез медиаторов воспаления лейкотриенов и О2, а также стимулируя активность
циклооксигеназ и усиливая синтез простагландина Е2 [Moilanen E., Vapaatalo H., 1995].
43
Индуцируя апоптоз макрофагов и гранулоцитов, NO-радикалы также могут влиять на их
жизнеспособность [Sarih M. et al., 1993; Ward C. et al., 2000]. Кроме того, NO-радикалы
способны снижать адгезию и хемотаксис гранулоцитов, агрегацию тромбоцитов, ингибировать
пролиферацию лимфоцитов и гладкомышечных клеток, модулировать синтез инсулина и
тиреоидных гормонов [Kasai K. et al., 1995]. При сепсисе активация NOS и избыточная
продукция NO∙ приводит к снижению тонуса сосудов и падению системного давления, что
является причиной коллапса сосудов и шока [Ochoa J.B. et al., 1991].
Миелопероксидаза
(МПО)
является
важным
компонентом
АКМ-генерирующей
ферментативной системы фагоцитирующих клеток. В ходе ферментативной реакции,
катализируемой МПО и эозинофильной пероксидазой (ЭПО) в организме образуются
гипогалогениты:
H2O2 + Х¯ + Н+ → НОХ + H2O (Х = Cl, Br, I, SCN)
На эту реакцию тратится до 30% образующегося в нейтрофилах О2 и до 70% перекиси
водорода [Hampton M.B. et al., 1998]. Гипогалогениты являются очень реакционноспособными
соединениями, окисляющими и галогенирующими органические молекулы, в первую очередь
белки и полипептиды. Хлорноватистая кислота, HOCl, реагирует с органическими аминами с
образованием хлораминов, которые также обуславливают и усиливают ее цитотоксический и
бактерицидный эффект [Klebanoff S.J., 2005].
Дегрануляция и высвобождение МПО при стимуляции фагоцитов (прежде всего
нейтрофилов) приводит к усилению процессов ПОЛ и индукции образования эйкозаноидов.
Этот процесс, по-видимому, не связан прямо с синтезом HOCl или других гипогалогенитов, а
опосредуется через окисление оксидов азота [Zhang R. et al., 2002]. Высокая скорость активации
гранулоцитов позволяет рассматривать МПО как один из главных ферментов, ответственных за
усиление процессов ПОЛ и синтез провоспалительных эйкозаноидов на начальной стадии
развития воспалительного процесса.
На стадии экссудации изменение микроциркуляции и нарушение проницаемости мембран
эндотелия в результате их повреждения приводит к поступлению плазмы в мышечный слой.
При
малых
повреждениях
наблюдается
преимущественная
экссудация
жидкости
и
низкомолекулярных соединений, тогда как усиление деструкции приводит к выходу в ткани
высокомолекулярных соединений и даже клеток. Экссудация и развитие отека во многом
определяются состоянием микроциркуляторного русла и эффективностью кровотока. За счет
низкого содержания внутриклеточной каталазы эндотелиоциты микрососудов чувствительны к
повреждающему действию АКМ, особенно Н2О2 [Shingu M. et al., 1985]. Ингибиторы NOсинтазы вызывают сужение сосудов и угнетают развитие экссудативных процессов при
воспалении [Pörsti I., Paakkari I., 1995], как и глюкокортикоиды, которые, как известно,
44
снижают синтез NO• [Warren J.B., 1993]. Кроме того, угнетение продукции NO-радикалов
усиливает адгезию нейтрофилов к эндотелию и их повреждающее действие вследствие
сопутствующего угнетения эндотелий-протективного действия NO•.
В развитии отека при воспалении существенную роль могут играть тучные клетки, в ходе
активации которых происходит высвобождение гистамина и тромбоцит-активирующего
фактора, что приводит к усилению роллинга и адгезии лейкоцитов, которые могут быть
подавлены действием NO• [Gaboury J.P. et al., 1996]. Показано, что развитие воспалительного
отека снижает применение ингибиторов NADPH-оксидазы дифенилиодония и стауроспорина
[Miesel R. et al., 1995]. Аналогичный противовоспалительный эффект наблюдается при
действии антибиотиков, способных ингибировать NADPH-оксидазу [Umeki S., 1995]. Процесс
экссудации, таким образом, во многом зависит от интенсивности и соотношения образования
разных форм АКМ, индуцирующих повреждение эндотелиоцитов, а также состояния
антиоксидантной защиты эндотелия.
Цитокины являются эффективными модуляторами синтеза АКМ в очаге воспаления:
провоспалительные цитокины Г-КСФ, ГМ-КСФ, TNF-α, интерферон-γ, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 и
фактор активации тромбоцитов усиливают продукцию радикалов О2 и NO•, в то время как
противовоспалительные IL-4, IL-10, IL-13 и росттрансформирующие факторы снижают ее.
Механизмы действия цитокинов во многом неясны. Так, показано, что эффект Г-КСФ, ГМ-КСФ
и
IL-8
реализуется
через
активацию
G-белков
в
нейтрофилах
человека
[Balazovich K.J. et al., 1991; Kupper R.W. et al., 1992], однако пути этой активации для них
различаются; TNF-α и интерферон-γ прямо индуцируют экспрессию генов, кодирующих синтез
тяжелой цепи (gp91phox) цитохрома b558 и цитозольных факторов p47phox и p67phox NADPHоксидазной системы [Gupta J.W. et al., 1992]. IL-1 и TNF-α усиливают экспрессию iNOS,
активируя фактор транскрипции NF-кВ, при этом их эффект проявляется не только в
отношении фагоцитирующих клеток: они также усиливают синтез фермента в гепатоцитах,
фибробластах, -клетках поджелудочной железы и клетках щитовидной железы и, возможно, в
большинстве соматических клеток [Меньщикова Е.Б. и др., 2008]. Кроме того, интерферон-γ и
TNF-α индуцируют синтез de novo кофактора NOS тетрагидробиоптерин в макрофагах,
фибробластах и эндотелиальных клетках [Pfeilschifter J. et al., 1996]. Возможно, регуляторное
действие цитокинов при воспалении во многом реализуется через активацию продукции АКМ.
Вместе с тем сами АКМ индуцируют синтез некоторых цитокинов. Так, было показано, что
образование IL-8 в цельной крови человека, моноцитах, фибробластах и эпителиальных клетках
ингибируется антиоксидантами и усиливается активацией эндогенных механизмов синтеза
АКМ или добавлением экзогенных АКМ [Remick D.G., Villarete L., 1996], а синтез TNF-α,
макрофагального воспалительного белка-2 и моноцитарного хемотаксического пептида-1,
45
индуцированный частицами кварца, супрессировался антиоксидантами [Barrett E.G.et al., 1999].
Перекись водорода в низких концентрациях (10–5 М) усиливает продукцию Т-лимфоцитами
IL-2 [Кетлинский С.А. и др., 1992]. Действие АКМ реализуется через активацию NF-кВ,
контролирующего синтез ряда иммунорегуляторных цитокинов, молекул адгезии и белков
острой фазы. Кроме того, на метаболическую активность фагоцитирующих клеток
существенное влияние оказывает состояние внутренней среды организма: так, высокий уровень
глюкозы в крови при диабете [Hiramatsu K., Arimori S., 1998] усиливает продукцию АКМ
полиморфноядерными
лейкоцитами,
что,
соответственно,
провоцирует
развитие
окислительного стресса в очаге воспаления.
Защитная функция воспаления требует включения механизмов микробицидного,
фунгицидного, цитотоксического действия, что осуществляется посредством выделения
множества токсических соединений. Повреждение клеток может быть индуцировано
микробными токсинами или их ферментами, высвобождающимися из лейкоцитов гидролазами
и катионными полипептидами, цитокинами, цитотоксическими антителами, белками системы
комплемента, а также высокореакционными молекулами АКМ. Исследования на клеточных
культурах показывают, что, в зависимости от штамма бактерий, на АКМ приходится от 40 до
90% микробицидного действия фагоцитирующих клеток [Меньщикова Е.Б. и др., 2010]. При
этом все специализированные ферментативные системы синтеза АКМ (NADPH-оксидаза,
МПО, ЭПО и NOS) участвуют в микробицидном действии фагоцитов.
Генетические
дефекты
NADPH-оксидазы,
в
результате
которых
нарушается
ее
способность восстанавливать кислород, являются причиной хронического гранулематоза
[Маянский Д.Н., Урсов И.Г, 1997], у людей с врожденными дефицитами МПО выявляется
пониженная способность гранулоцитов убивать бактерии Candida albicans, хотя клинически
такие
нарушения
инфекционными
не
проявляются,
патологиями
у
них
и
не
существенного
наблюдается
увеличения
(кроме
заболеваемости
больных
диабетом)
[Nauseef W.M., 1990].
Однако, несмотря на большое количество работ, свидетельствующих об участи
ферментативных систем синтеза АКМ в микробицидном и цитотоксическом действии
фагоцитирующих клеток, существуют вопросы относительно механизмов этого действия
[Weiss S.J., 1989; Cerutti P.A., Trump B.F., 1991]. Так, активация NADPH-оксидазы приводит к
синтезу О2, однако цитотоксическая и реакционная активность этого радикала невысока, а в
биохимических реакциях супероксид-анион выступает как окислителем, так и восстановителем.
Активным цитотоксином при неопосредованном действии на клетки не является и NO-радикал,
более того, он выступает в качестве антиоксиданта во многих радикальных окислительных
реакциях [Меньщикова Е.Б. и др., 2006]. Образующиеся при активации МПО и ЭПО
46
гипогалогениты являются эффективными окислителями, цитотоксичными в системах in vitro,
однако генетические дефициты МПО, как отмечалось выше, слабо проявляются на уровне
целого организма, и роль данной ферментативной системы в защите от инфекций также неясна.
Таким образом, сама по себе ни одна из ферментативных систем генерации АКМ не обладает
существенным
цитотоксическим
действием,
и
для
объяснения
прямой
зависимости
микробицидного, цитотоксического и мутагенного действия фагоцитов от активности
ферментативных
механизмов
синтеза
АКМ
предлагается
схема
взаимодействий
и
последовательных превращений АКМ. При стимуляции фагоцитирующих клеток в результате
активации NADPH-оксидазы наблюдается резкое усиление продукции О2. Считается, что
супероксид-анион не обладает непосредственной микробицидной активностью, а является
триггером каскада реакций, приводящих к образованию других более реакционных форм АКМ
(гидроксид-аниона ОН∙ и синглетного кислорода 1О2) и пероксинитрита. В присутствии SOD О2
быстро переходит в Н2О2, а в реакциях с ионами металлов переменной валентности образуются
синглетный кислород (высокореактивная молекула, отличающаяся спиновой конфигурацией
электронов, находящихся на π•-молекулярных орбиталях) и гидроксильный радикал,
являющийся наиболее реакционным и токсичным из всех АКМ. Основным источником
гидроксильного радикала в живых организмах являются две основные реакции:
реакция Фентона с участием металлов с переменной валентностью (главным образом, Fe2+ и
Cu+):
H2O2 + Fe2+ → ОН¯ + ОН• + Fe3+;
и реакция Габера-Вейса, в ходе которой ионы металлов катализируют реакцию взаимодействия
супероксидного радикала с перекисью, увеличивая ее скорость на 4 порядка:
О2 + H2O2 → ОН¯ + ОН• + О2.
Скорость окисления гидроксильным радикалом большинства органических соединений
сравнима со скоростью диффузии молекул, а радиус миграции сравним с радиусом
органических молекул, поэтому можно утверждать, что ОН• реагирует с первой попавшейся
молекулой без какой-либо субстратной избирательности [Меньщикова Е.Б. и др., 2006].
Участие ОН-радикалов в микробицидном и туморицидном действии фагоцитов в настоящее
время твердо доказано. Считается, что 50% цитотоксических свойств АКМ связано именно с
гидроксильным
радикалом
[Imlay
J.A.,
Linn
S.,
1988].
Цитотоксическое
действие
фагоцитирующих клеток значительно снижают каталаза, хелаторы металлов переменной
валентности, а также ингибиторы ОН• диметилсульфоксид и диметилтиомочевина, что является
доказательством ключевой роли ОН-радикалов в повреждении клеток и биологических
структур [Ward P.A., 1991; Klebanoff S.J., 1993]. Взаимодействие же О2 с оксидом азота
приводит к образованию реакционного пероксинитрита ONOOˉ, о котором говорилось выше.
47
Кроме того, теоретически антиоксиданты, снижающие активность свободнорадикального
окисления и процессов с участием АКМ, однозначно должны тормозить развитие и
прогрессирование воспаления. Так, в конце прошлого столетия в разных странах были
проведены широкомасштабные и дорогостоящие исследования возможности профилактики
сердечно-сосудистых заболеваний, как правило, сопряжённых с развитием атеросклероза
(воспаления стенки сосудов [Araujo J.A. et al., 2012]), с помощью антиоксидантных витаминов
(витамины Е и С, -каротин) [Tinkel J. et al., 2012; Myung S.K. et al., 2013]. Однако, как это
часто бывает, такая «лобовая атака» не принесла желаемого успеха [Ланкин, В.З. и др., 2004],
что, в частности, объясняется тем, что АКМ являются важнейшими регуляторами тонуса
сосудов и обменных процессов в организме [Ray, P.D. et al., 2012]. Поэтому сегодня для
купирования острых, особенно чрезмерных и неадекватных воспалительных ответов
предпринимаются
попытки
«непрямых»
антиоксидантных
воздействий
на
редокс-
чувствительные сигнальные системы, в том числе на сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE,
регулирующую уровень эндогенных внутриклеточных антиоксидантов.
1.3. Роль системы Keap1/Nrf2/ARE в воспалении
Функциональное значение участия системы Keap1/Nrf2/ARE в воспалении отчетливо
проявляется в работах с нокаутными по Nrf2 животными. Несмотря на то, что как при
рождении, так и в период созревания мыши Nrf2–/– не имеют существенных фенотипических
отличий от животных с генотипом Nrf2+/+ [Chan K. et al., 1996], после 20 недель жизни
нокаутированные
мыши
часто
гибнут
от
различных
болезней:
у них
появляются
генерализованные кожные отеки и язвы, начинается некроз кончика хвоста и воспаление глаз,
все это сопровождается неврологическими расстройствами (нарушения ориентации, дрожание,
сонливость, частые припадки) [Ma Q. et al., 2006]. У животных с гомозиготным нокаутом с
возрастом нарастает анемия (предположительно, за счет уменьшения у эритроцитов
устойчивости к окислительным повреждениям [Lee J.M. et al., 2004]), а также развиваются
аутоиммунные
гломерулонефриты,
которые
являются
главной
причина
гибели
[Yoh K. et al., 2001]. Эти изменения более выражены у самок, поэтому у них средняя
продолжительность жизни составляла примерно 30 недель, тогда как у самцов – 7 недель
[Chan K. et al., 1996]. В условиях гипергликемии кардиомиоциты мышей с нокаутом гена Nrf2
были более чувствительными к повреждениям, вызванным окислительным стрессом
[He X. et al., 2009].
У животных с выключенным геном Nrf2 воспалительный ответ на различные воздействия
более выражен, чем у животных дикого типа. При этом в очагах воспаления и в крови
повышалась концентрация провоспалительных цитокинов. Эти данные подтверждаются
48
результатами
опытов
на
культурах
клеток.
При
стимуляции
липополисахаридом в
–/–
перитонеальных макрофагах мышей Nrf2 усиливалась продукция TNFα, IL–1β, а также iNOS и
COX–2. В то же время в Nrf2–/– макрофагах сульфорафан в значительно меньшей степени
подавлял синтез провоспалительных медиаторов, чем в клетках мышей дикого типа
[Lin W. et al., 2008]. В ядерных экстрактах перитонеальных макрофагов и эмбриональных
фибробластов мышей Nrf2–/–, стимулированных LPS и TNFα, возрастало содержание
субъединиц р65 и р50 фактора транскрипции NF-κВ [Thimmulappa R.K. et al., 2006].
Мыши с генотипом Keap1–/– имели малый вес и погибали в первые 20 дней постнатального
периода, у них наблюдался выраженный гиперкератоз пищевода и желудка. При этом у мышей
с двойным нокаутом Keap1–/–/Nrf2–/– снижалась постэмбриональная смертность, что указывает
на
подавление
фактора
Nrf2
под
действием
Keap1
в
нормальных
условиях
[Wakabayashi N. et al., 2003]. У мышей с выключенным геном Keap1 гепатотоксический эффект
конканавалина А [Osburn W.O. et al., 2008], как и повреждение легких под действием
компонентов
табачного
дыма,
менее
выражены,
чем
у
мышей
дикого
типа
[Blake D.J. et al., 2010]. На высокую активность NQO1 и глутатион-S-трансфераз μ и π в
эмбриональных фибробластах мышей Keap1–/– не влияли электрофильные соединения, а сами
клетки
проявляли
устойчивость
к
апоптозу,
индуцированному
УФ-излучением
[Hirota A. et al., 2005]. В культуре кортикальные нейроны мышей Keap1–/– имели повышенную
устойчивость к окислительному стрессу, индуцированному высокими концентрациями
глутамата и ротенона [Satoh T. et al., 2009].
В настоящее время определены и достаточно хорошо изучены основные факторы
транскрипции, регулирующие развитие воспалительного процесса. Прежде всего, это NF-κВ и
АР-1, которые контролируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз а также
ядерные рецепторы гормонов и система Keap1/Nrf2/ARE, отвечающие за липидный и
энергетический метаболизм клеток и их антиоксидантную защиту [Ляхович В.В. и др., 2006;
Турпаев К.Т., 2006]. Большинство из этих факторов редокс-чувствительные, т.е. их активность
зависит от баланса про- и антиоксидантов.
Фактор транскрипции АР-1 (activating protein-1) регулирует различные этапы клеточной
пролиферации и дифференцировки, а также апоптоза. АР-1 представляет собой группу
структурно сходных белков Jun- и Fos-семейств, содержащих bZIP-домен с лейциновой
молнией, отвечающий за их димеризацию и связывание с регуляторным сайтом ДНК TRE.
Транскрипционный фактор Nrf2 непосредственно взаимодействует с белками фактора АР-1,
способными формировать гетеродимеры для связывания с ARE-последовательностями ДНК.
Так как часть последовательностей ARE включает в себя сайт TRE, поэтому Jun- и Fos-белки
могут прямо участвовать в индукции транскрипции контролируемых ARE генов, при этом все
49
гены могут быть разделены на 2 группы: регулируемые только Nrf2 и регулируемые Nrf2
совместно с AP-1 [Sankaranarayanan K., Jaiswal A.K., 2004]. Существует предположение, что
взаиморегуляция Nrf2 и некоторых белков АР-1 происходит на транскрипционном уровне. Так,
в промоторах генов nrf2 и fra-1 содержатся последовательности TRE и ARE, взаимодействие
между которыми может носить антагонистический характер [Bacon J.R. et al., 2007].
Фактор транскрипции NF-κB (nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells)
контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Большое
количество исследований посвящено взаимосвязи факторов транскрипции Nrf2 и NF-κВ, что
вполне естественно, так как они играют ключевую роль при воспалительных процессах,
аутоиммунных заболеваниях, а также канцерогенезе [Kundu J.K., Surh A.J., 2010; Slocum S.L.,
Kensler T.W., 2011]. NF-κB белки представляют собой семейство транскрипционных факторов,
участвующих в таких процессах, как воспаление, иммунный ответ, апоптоз, развития и роста
клеток. Мишенями NF-κB являются гены хемокинов, цитокинов, иммунных рецепторов,
молекул клеточной адгезии, генов стресс-реакций, регуляторов апоптоза, факторов роста, и
транскрипционных факторов и многих других. Показано, что NF-кВ индуцирует экспрессию
TNF-α, iNOS, IL-1, внутриклеточных молекул адгезии-1 и COX-2 [Pahl H.L., 1999]. Патологии,
связанные
с
нарушениями
NF-κB-пути
включают
аллергии,
болезнь
Альцгеймера,
аутоиммунные заболевания, ожирение, атеросклероз, артрит, рак, болезнь Крона, сахарный
диабет и инсульт [Wakabayashi N. et al., 2010].
Все белки NF-κB содержат консервативный Rel-домен гомологии, ответственный за
димеризацию и связывание с консенсусной последовательностью ДНК GGGRNNYYCC,
(R = пурин, N = любое основание, Y = пиримидин). В зависимости от наличия домена
трансактивации семейство белков NF-κВ может быть разделено на две группы: RelA (p65), RelB
и с-Rel содержат трансактивационные домены, в то время как p50 и p52 – нет, и для активации
транскрипции им требуется гетеродимеризация с белками Rel. Неактивный NF-κВ находится в
цитоплазме, связанный с негативным регулятором IκB, который способен скрывать
последовательность
ядерной
локализации
или
ДНК-связывающий
домен
NF-κВ
для
предотвращения транскрипции [Wakabayashi et al., 2010].
Активация NF-κB осуществляется через фосфорилирования IκB киназами IκB (IκB kinase,
IKK), что приводит к высвобождению NF-κB и его ядерной транслокации [Chen Z.J. et al., 1996;
DiDonato J.A. et al., 1997]. Широкий спектр факторов обладает способностью стимулировать
IKK для активации NF-κВ, в том числе H2O2, TNF-α, IL-1, форболовые эфиры, гипоксия с
последующей реоксигенацией, ультрафиолетовое излучение и бактериальные и вирусные
инфекции [Pahl H.I. et al., 1999].
50
Сигнальные пути Nrf2 и NF-κB имеют несколько точек взаимодействия, позволяющих им
контролировать транскрипцию или функционирование белков-мишеней. Существует много
примеров, в которых активация и репрессия происходят в результате взаимодействия между
участниками двух путей через различные механизмы регуляции: от прямого воздействия
непосредственно
на
транскрипционные
факторы,
как
таковые,
до
белок-белковых
взаимодействий и действия вторичных посредников на гены-мишени. Действие некоторых
индукторов Nrf2 сопровождается репрессией NF-κB и его генов-мишеней. Так, сульфорафан
ослабляет связывание NF-κB с ДНК и уменьшает генерацию NO, PGE2 и TNF-α в макрофагах
Raw 264,7, не затрагивая IκB или ядерную транслокацию транскрипционного фактора
[Heiss E. et al., 2001]; 3Н-1,2-дитиол-3-тион снижает ядерную транслокацию и ДНК связывание
NF-кВ, параллельно вызывая изменения в фосфорилировании IκB в LPS-обработанных
гепатоцитах крыс [Karuri A.R., 2006]; эпигаллокатехин-3-галлат индуцирует Nrf2 и снижает
активность NF-кB и синтез TNF-α IL-1β в легких крыс, получавших блеомицин
[Sriram N. et al., 2009]. Флаваноид халкон индуцирует Nrf2 и ингибирует активацию NF-κB в
эндотелиальных клетках [Liu Y.C. et al., 2007], а синтетический тритерпеноид CDDO-Me может
ингибировать деятельность NF-κB через репрессию IKK [Ahmad R. et al., 2006]. Куркумин
способен ингибировать NF-кВ, блокируя фосфорилирование и деградацию IκB в макрофагах,
обработанных LPS [Pan M.H. et al., 2000]). NF-κB, как было описано выше, способен
регулировать активацию ARE путем снижения доступности коактиваторов и привлечения
корепрпессоров.
В промоторе мышиного гена Nrf2 выявлен консенсусный сайт связывания NF-κB [Nair. S.
et al., 2008], который может увеличивать транскрипцию Nrf2 для угнетения пролонгированной
активности NF-κB. Так как было показано, что множество агентов и стимулов, таких как АКМ,
LPS, сдвиговый стресс, окисленные липопротеины низкой плотности и сигаретный дым,
способны индуцировать активность как Nrf2, так и NF-κB [Wakabayashi N. et al., 2010],
полностью антагонистический эффект двух факторов транскрипции друг против друга во всех
ситуациях маловероятен.
Известны взаимодействия между мишенями Nrf2 и NF-κB, приводящие в конечном итоге
к модуляции активности факторов транскрипции. Примерами генов-мишеней Nrf2, способных
влиять на активность NF-κB, являются гены HO-1, NQO1, и тиоредоксин (TRX). HO-1, которая
разрушает гем до биливердина, СО и свободного железа, способна модулировать активацию
NF-кВ через действие билирубина и свободного железа [Wakabayashi N. et al., 2010] Показано,
что HO-1, в частности, предотвращает фосфорилирование RelA через действие свободного
железа на сайт, необходимый для TNF-α-зависимой активации NF-κB [Seldon M.P. et al., 2007].
Индукция HO-1 может ингибировать деградацию IκB, тогда как ингибирование HO-1
51
увеличивает активность p65 в клетках слизистой оболочки толстой кишки НТ-29 после
обработки TNF-α или ИЛ-1ß [Jun C.D., et al., 2006].
NQO1 оказывает как положительное, так и отрицательное влияние на NF-κB.
Гиперэкспрессия NQO1 снижает LPS-индуцированную экспрессию воспалительных генов TNFα и IL-1 в клетках ТНР-1 независимо от NF-κB [Rushworth S.A. et al., 2008]. Мыши с дефицитом
NQO1 в костном мозге, селезенке и тимусе показывают сниженное связывания NF-κB с ДНК в
нормальных условиях или при обработке LPS [Iskander K. et al., 2006]. TRX также имеет как
положительное, так и отрицательное влияние на NF-κB. TRX может модулировать активность
NF-κB за счет восстановления остатков цистеина [Wakabayashi N. et al., 2010]. Так, ядерный
TRX восстанавливает остатки цистеина на р50, что позволяет тому связываться с ДНК, в то
время
как
цитоплазматический
TRX
способен
блокировать
деградацию
IκB
[Hirota K. et al., 1999].
Белки-мишени Nrf2 и NF-κB путей и их продукты также могут взаимодействовать для
регуляции ферментативной активности. Так, IL-10, белок-мишень NF-κВ, [Cao S. et al., 2006]
индуцирует HO-1 в мышиных макрофагах и in vivo [Lee T.S., Chau L.Y., 2002]. Для защиты
клеток от повреждений из-за избыточного количества NO в макрофагах существует петля
обратной связи между HO-1 и iNOS. Экспрессия iNOS, приводящая к избыточной продукции
NO, вызывает индукцию HO-1 [Foresti R. et al., 1997, Immenschuh S. et al., 1999]. HO-1, в свою
очередь, способна ингибировать iNOS через действие свободного железа [Weiss G. et al., 1994]
и CO [Sarady J.K. et al., 2004], а также через окисление гема [Albakri Q.A., Stuehr D.J., 1996],
предотвращая дальнейшую продукцию NO [Srisook K., Cha Y.N., 2005]. Кроме того,
биливердин и билирубин являются эффективными скэвинджерами АКМ, снижающими их
токсические эффекты на клетки при воспалении [Mancuso C. et al., 2006]. Интересно, что NO
может улавливаться биливердином и билирубином для дальнейшего вовлечения в сигнальные
пути [Kaur H. et al., 2003]. Также было показано, что HO-1 негативно влияет на экспрессию
VCAM-1 [Banning A., Brigelius-Flohe R., 2005]. Дополнительные взаимодействия между HO-1 и
NF-κB можно наблюдать на примере СО, продукта HO-1, который может подавлять
образование TNF-α, IL-1 β и макрофагального воспалительного белка-1β и увеличивать
образование IL-10 после стимуляции LPS [Otterbein L.E. et al., 2000]. Кроме того, СО действует
аналогично оксиду азота и активирует гуанилатциклазу, повышая тем самым внутриклеточное
содержание cGMP [Kim H.P. et al., 2006].
Белками-мишенями NF-кВ, способными влиять на активность Nrf2, являются COX-2 и его
продукт 15-дезокси-Δ12,14-простагландин J2 (15d-PGJ2). Индукция СОХ-2 при сдвиговом
стрессе ингибирует фосфатидилинозитол-3-киназы, в результате чего в хондроцитах человека
снижается транскрипция генов Nrf2, NQO1, HO-1, GCLR и GSTM1. Восстановление Nrf2-
52
зависимой индукции генов в макрофагах было выявлено при воздействии СОХ-2-специфичных
ингибиторов CAY10404 и NS398 [Healy Z.R. et al., 2005]. 15d-PGJ2 играет важную роль в
модуляции
Nrf2,
связываясь
с
Keap1
и
вызывая
ядерную
транслокацию
Nrf2
[Itoh K. et al., 2004].
В качестве механизма негативной регуляции воспалительного процесса, который
предотвращает избыточную продукцию провоспалительных медиаторов, повреждение и гибель
собственных клеток в условиях развивающегося окислительного стресса, рассматривается
активация Nrf2 в иммунокомпетентных клетках. Сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE также
опосредует противовоспалительный эффект 15d-PGJ2, цитокинов IL–4 и 10, а также некоторых
нестероидных противовоспалительных средств [Itoh K. et al., 2004; Chen X.L., Kunsch C., 2004].
Так, 15d-PGJ2, обладающий электрофильными свойствами, способен прямо взаимодействовать
с
белком
Keap1,
что
обеспечивает
активацию
фактора
Nrf2
и
определяет
противовоспалительные свойства этого медиатора [Itoh K. et al., 2004].
Кроме того, последовательности ARE выявлены в промоторах генов ядерных рецепторов,
активируемых пролифераторами пероксисом (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR),
PPARγ и PPARδ, и было показано, что экспрессия этих рецепторов регулируется Nrf2
[Hayes J.D., McMahon M., 2009; Cho H.Y., Kleeberger S.R., 2010]. В то же время в промоторе
самого гена NRF2 имеются связывающие рецепторы PPAR последовательности PPRE
[Cho H.Y. et al., 2010], таким образом, существует прямая связь транскрипционных активностей
Nrf2 и PPARγ [Polvani S. et al., 2012]. Активация PPARγ обладает противовоспалительным,
антифибротическим,
антиоксидантным
и
васкулопротективным
эффектами
[Gounder V.K. et al., 2013]. Показано, что при гипероксии защитный и противовоспалительный
эффект PPARγ реализуется через активацию Nrf2.
Сульфорафан, классический индуктор Nrf2/ARE-зависимого сигнального пути, оказывает
выраженное
противовоспалительное
действие,
уменьшая
стимулированную
липополисахаридом продукцию IL-1β и TNFα макрофагами, а также угнетая синтез
простагландина Е2 и оксида азота за счет снижения уровня COX 2 и iNOS [Lin W. et al., 2008].
Индукторы Nrf2/ARE различной химической природы (тритерпеноиды, изотиоцианаты,
меркаптаны,
тяжелые
металлы
и
др.)
дозозависимо
снижают
липополисахарид-
стимулированную продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей и клетками
линии Raw 264.7 [Liu H. et al., 2008]. При этом между их способностью соединений
индуцировать синтез NQO1 и выраженностью iNOS-ингибирующего эффекта существует
линейная зависимость. Увеличение продукции Nrf2 в эндотелиальных и мезангиальных клетках
путем аденовирусной трансфекции соответствующего гена приводит к снижению продукции
хемокина MCP-1 и молекулы адгезии VCAM-1 [Chen X.L. et al., 2009]. В то же время
53
обнаружено, что повышенный синтез Nrf2 в эндотелиоцитах, мезангиоцитах, клетках линий
HeLa и HEK293 приводит к усилению продукции провоспалительного хемокина IL-8, что
достигается за счет стабилизации соответствующей мРНК [Zhang X. et al., 2005].
Повышение содержания восстановленного глутатиона в клетках и, соответственно,
увеличение
соотношения
глутамилцистеинсинтетазы
GSH/GSSG
и
в
результате
глутатионредуктазы
индукции
считается
еще
экспрессии
одним
генов
γ-
механизмом
противовоспалительного действия Nrf2 [Surh Y.J. et al., 2008]. Глутатион – главный элемент,
необходимый для поддержания редокс-баланса в клетках, увеличение соотношения GSH/GSSG
в цитоплазме ингибирует редокс-зависимую активацию NF-κB и AP–1, ключевых факторов
транскрипции, регулирующих воспалительный процесс [Kabe Y. et al., 2005].
Подавление сульфорафаном TNFα-стимулированной продукции молекул адгезии VCAM–
1 и хемокина MCP-1 эндотелиальными клетками [Chen X.L. et al., 2009], а также вызываемое
tBHQ подавление липополисахарид-стимулированной продукции IL-1β, IL-6 и TNFα в клетках
микроглии [Koh K., et al., 2009] обусловлено нарушением фосфорилирования протеинкиназы
р38. Таким образом, противовоспалительный эффект системы Keap1/Nrf2/ARE может
реализоваться либо посредством прямого воздействия на факторы транскрипции NF-κB и АР-1,
либо через редокс-чувствительные протеинфосфатазы и киназы.
Таким образом, к настоящему времени об участии сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в
регуляции течения и разрешения воспаления в опытах in vitro и in vivo получено много
убедительных данных. Усиление экспрессии ARE-регулируемых генов при острых процессах
оказывает цитопротективное действие и снижает деструктивные эффекты воспаления
[Xu W. et al., 2008; Li W. et al., 2008]. В случае хронического воспаления система
Keap1/Nrf2/ARE снижает фиброз и препятствует неопластической трансформации [Hayes J.D.,
McMahon M., 2001; Cho H.Y. et al., 2006; Lau A. et al., 2008]. На основании этого можно
предположить, что противовоспалительное действие сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE
связано с ограничением в пространстве и времени воспалительного процесса в результате
подавления воспалительными медиаторами активации клеток и предупреждения их вовлечения
в воспалительный процесс; быстрого выключения провоспалительной сигнальной программы в
клетках при прекращении действия на них флогогенов; защиты окружающих тканей от
окислительного стресса. В самом очаге воспаления сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE
инактивируется за счет высокой скорости эндогенной продукции прооксидантов и не
препятствует
апоптозу
иммунокомпетентных
клеток,
воспалительного процесса [Меньщикова Е.Б. и др., 2010].
необходимому
для
разрешения
54
1.4. Синтез и исследование антиоксидантных и биологических свойств новых
водорастворимых серосодержащих фенольных соединений
Среди ингибиторов радикалов в биологических системах важное место фенольные
антиоксиданты (соединения вида Ar(ОН)n , в которых одна или несколько гидроксильных групп
соединены с ароматическим ядром (Ar), при этом молекулы могут содержать несколько
фрагментов Ar(ОН)n). Фенольные антиоксиданты (ArOH) эффективно взаимодействуют с
гидроперекисными радикалами жирных кислот и ненасыщенных липидов в реакции (7) (схема
1.2.1) ArOH + RO 2  ArO + RООН. По существу в данной реакции не наблюдается
исчезновения свободной валентности, а имеет место только замена гидроперекисного радикала
RO 2
на феноксильный ArO, однако при этом достигается эффект ингибирования
свободнорадикального окисления, обусловленный большей стабильностью ArO , который
практически
не
участвует
в
реакциях
продолжения
цепей
окисления
[Меньщикова Е.Б. и др., 2012]. В природе существуют тысячи фенольных антиоксидантов
(только флавоноидов насчитывается более 5000), тем не менее химии всего мира пытаются
превзойти Природу и создают новые фенольные антиоксиданты с заданными свойствами,
придавая им те или иные преимущества в зависимости от стоящей перед ними задачи.
В НИИ химии антиоксидантов Новосибирского государственного педагогического
университета ведётся интенсивный поиск и скрининг новых синтетических антиоксидантов,
обладающих выраженным антирадикальным действием в системах in vitro и in vivo, низкой
токсичностью,
высокой
биодоступностью
и
эффективностью
in
vivo
в
отношении
патологических процессов и состояний, в основе этиопатогенеза которых лежит развитие
окислительного стресса [Просенко А.Е. и др., 2001; Просенко А.Е., 2010.].
Одним из перспективных направлений такого поиска являются работы в области
конструирования гидрофильных фенольных антиоксидантов, поскольку данное свойство
существенно повышает биодоступность соединений. В отличие от водорастворимых,
жирорастворимые
соединения
при
прохождении
через
желудочно-кишечный
тракт
взаимодействуют с желчными кислотами и их солями, кроме того, их всасывание в кишечнике
происходит путём пассивного транспорта и зависит от наличия жиров в диете, что усложняет
подбор дозировки и интервалов приёма, тогда как гидрофильные вещества усваиваются путём
активного транспорта. Был создан ряд структурно сходных водорастворимых монофенолов,
отличающихся наличием трет-бутильных орто-заместителей (0, 1, 2) и атома двухвалентной
серы в пара-пропильном заместителе (пропилсульфонат, проилтиосульфонат), для сравнения
применялись метоксилированные незамещённые сульфонаты и тиосульфонаты, а также
известный фенол фенозан-калий – водорастворимый антиоксидант схожей структуры,
55
сконструированный и на протяжении многих лет всесторонне исследованный в Институте
биохимической физики им. Н. М. Эмануэля РАН [Перевозкина М.Г. и др., 2005].
При исследовании in vivo острой токсичности данного ряда стурктурно подобных
фенольных антиоксидантов на мышах линии (C57B1/6  CBA) F1 (внутрибрюшинное введение,
значение LD50 определяли по методу Беренса и Шлоссера) [Меньщикова Е.Б. и др., 2012]
установлено, что они относятся к III классу опасности согласно ГОСТ 12.1.007-76, особенно
учитывая 3–6-кратное снижение острой токсичности при пероральном назначении препаратов
по сравнению с внутрибрюшинным [Барабой В.А., 1976]. По степени увеличения токсичности
тестируемые соединения расположились в следующий ряд: ТС-17 (175) > C-17 (275) = фенозанкалий (275) > ТС-13 (450) > ТС-9 (800) > С-9 (1800) (в скобках указаны величины LD50, мг/кг
массы тела).
В системах in vitro была всесторонне изучена антирадикальная и антиоксидантная
активность водорастворимых фенольных соединений данного структурного ряда (С-10, С-9, С13, С-17, ТС-9, ТС-13 и ТС-17) [Просенко А.Е. и др., 2001; Зенков Н.К. и др., 2007]. Все
препараты, за исключением метоксилированного аналога С-10 (что закономерно) в той или
иной степени оказывали антиоксидантный эффект, который прямо зависел от степени
экранирования ОН-группы и наличия атома двухвалентной серы в пара-пропильном
заместителе. При этом если такая структурная зависимость чётко прослеживалась в случае
простых бесклеточных и неферментативных систем (индуцированное ионами железа и меди
окисление этилолеата и липопротеинов низкой плотности), то при переходе к более сложным, в
том числе клеточным и ферментативным тест-системам (разложение морфолиносиднонимина,
генерация АКМ в системе "ксантин – ксантиноксидаза", дыхательный взрыв гранулоцитов
крови), связь структуры и активности соединения становилась менее однозначной. Это
послужило толчком к выполнению настоящей работы по следующим направлениям.
1.
Были синтезированы и исследованы соединения с варьирующими пара-алкильными
заместителями, аналоги наиболее перспективного антиоксиданта ТС-13 – с укороченной
(ТС-12) и удлинённой на одно метиленовое звено (ТС-14) углеводородной цепью, а также
с заменой активной двухвалентной серы атомом селена (CC-13). Предполагалось, что
такие изменения повлияют на активность ТС-13, так как его бифункциональное
антиоксидантное
действие
обусловлено
пероксирадикал,
канонически
наличием
восстанавливаясь
"активной"
атомом
серы:
водорода
липидный
ОН-группы
и
превращаясь в липопероксид, с участием этого же соединения восстанавливается до
неактивного гидроксилипида и не служит источником чрезвычайно реакционных
алкоксильного и гидроксильного радикалов (реакция Фентона). Заменой атома серы на
селен предполагалось имитировать активный центр глутатионпероксидазы, так как
56
существует целое направление создания имитаторов данного антиоксидантного фермента
путём моделирования его активного центра, в состав которого входит селеноцистеин
[Bhabak K., Mugesh G., 2010].
2.
Утрата однозначной взаимосвязи между структурой и активностью соединения при
переходе от простых тест-систем к более сложным является общебиологической
закономерностью и позволяет предположить, что in vivo соединения ведут себя подругому, не только проявляя непосредственную антирадикальную и антиоксидантную
активность, но и оказывая непрямой эффект на регуляторные и сигнальные системы, в
этом случае структурная зависимость будет иной.
3.
Было выдвинуто предположение, получившее косвенное подтверждение [Зенков Н.К. и
др., 2007], что фенольные антиоксиданты данной структуры способны активировать
редокс-чувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента, так
как они обладают структурным сходством с классическими низкомолекулярными
индукторами Keap1/Nrf2/ARE фенольной природы. При этом интерес к биологической
эффективности такого гипотетического индуктора был сфокусирован на воспалении, так
как развитие окислительного стресса, обязательное для любого воспалительного процесса,
приводит к изменению окислительно-восстановительного баланса в клетках и активирует
редокс-чувствительные внутриклеточные сигнальные пути, особое место среди которых
принадлежит системе антиоксидант-респонсивного элемента.
4.
Выявление оптимальной структуры фенольного антиоксиданта данного структурного ряда
положено
в
основу
углубленного
противовоспалительного действия.
исследования
универсальности
его
57
2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Культуральные среды и реагенты
2.1.
PBS (фосфатно-солевой буфер в таблетках) (Invitrogen, США), Triton X-100 (Лаборатория
Медиген, Россия), соляная кислота, ортофосфорная кислота, гидроксид калия (Реахим, Россия), 5сульфосалициловая кислота, дигидрат (Sigma, США), 2-винилпиридин (Реахим), трис(гидроксиметил)аминометан (Лаборатория Медиген), сахароза (Реахим), этилендиамин-тетрацетата
динатриевая соль, дигидрат (Лаборатория Медиген), (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол бромид) (Sigma), флавин-аденин-динуклеотид динатриевая соль, гидрат (Sigma),
глутатион окисленный, восстановленный (Reanal, Венгрия), 5,5’-дитиобис-2-нитробензойная
кислота (Sigma), 2,6-дихлориндофенола натриевая соль, гидрат (Fluka, Швейцария), 3,3’метиленбис-4-гидроксикумарин (Sigma, США), никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат восстановленный тетранатриевая соль (Reanal), диметилсульфоксид (Биолот, Россия), бромид 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия (МТТ) (Sigma), спирт этиловый, формалин 10%
забуференный (Biovitrum, Россия), Slow fade Gold antifade reagent (antifade, DAPI) (Invitrogen),
бычий сывороточный альбумин (BSA) (Amresco, США), поликлональные антитела барана к IgG
кролика, конъюгированные с Texas Red (Abcam, Великобритания), поликлональные антитела
кролика к Nrf2 человека и мыши (Abcam), глутатионредуктаза из пекарских дрожжей (Sigma),
питательная среда DMEM (Биолот), питательная среда RPMI-1640 (Биолот, Россия), среда Хенкса
без фенолового красного (Лаборатория Медиген), раствор трипсина стерильный (Биолот),
фетальная бычья сыворотка (Hyclone, США), пенициллин, стрептомицин, глутамин (100х)
(Invirogen), Кумасси G250 (Loba feinchemie, Австрия), 3,3'-дигексилоксакарбоцианин йодид (SigmaAldrich, США), йодид пропидия (Sigma-Aldrich), диацетат 2,7-дихлородигидрофлуоресцина
(Sigma), дигидроэтидин (Sigma), форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA, Sigma), люминол (Serva,
Германия), коллаген II (Chondrex Inc., США), полный и неполный адъюванты Фрейнда (Sigma; 1/1
об./об.), липополисахарид E. coli 055:B5 (Sigma), каррагинан (Sigma), зимозан (Sigma).
3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)этилтиосульфонат
гидроксифенил)пропилтиосульфонат
натрия
(ТС-13),
натрия
(ТС-12),
3-(3'-трет-бутил-4'-
3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)-
бутилтиосульфонат натрия (ТС-14), 3-(3',5'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат
натрия
(ТС-17),
3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилселеносульфонат
натрия
(СС-13),
фенозан-калий синтезированы в НИИ химии антиоксидантов Новосибирского государственного
педагогического университета (Россия).
Для культивирования клеток использовали чашки Петри (90 мм) (Jet biofil, США),
культуральные флаконы (50 мл, 250 мл) (Greiner Bio-one, США). Для спектрофотометрических
измерений использовали 96-луночные плоскодонные планшеты для культивирования (Orange
Scientific, Бельгия).
58
2.2.
Объекты исследования
2.2.2. Клеточные культуры
В работе использовали моноцито/макрофагоподобные клетки гистиоцитарной лимфомы
человека U937, гистиоцитарной саркомы мыши J774 и, в качестве сравнения, фибробласты
легкого эмбриона человека FLECH. Все клеточные линии были получены из Банка клеточных
культур ФГБУН Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург, Россия).
Клетки линии U937 культивировали в среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% фетальной
бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина, 1% стрептомицина, 1% глутамина, макрофаги J774
и FLECH – в среде, содержащей 90% DMEM, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1%
пенициллина, 1% стрептомицина, 1% глутамина.
Пересев клеток линии U937 осуществляли каждые 3-4 дня в зависимости от плотности
клеточного слоя. Для этого клетки ресуспендировали в ростовой среде пипетированием, после
чего полученную суспензию разливали по культуральным флаконам с питательной средой в
пропорции 1:5.
Пересев клеток линии J774 осуществляли каждые 4 дня. Клетки трижды промывали PBS,
после чего добавляли смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена (1:3). После
появления первых признаков открепления клеток трипсин инактивировали добавлением
культуральной среды, содержащей 10% FBS, затем клетки механически ресуспендировали,
центрифугировали 5 минут на скорости 900 об/мин, удаляли супернатант и ресуспендировали в
свежей среде, полученную суспензию разливали по культуральным флаконам с ростовой
средой в пропорции 1:3.
Пересев клеток линии FLECH осуществляли каждые 4 дня. Клетки трижды промывали
PBS, после чего добавляли 0,25% раствор трипсина. После появления первых признаков
открепления клеток трипсин инактивировали добавлением культуральной среды, содержащей
10% FBS. После этого клетки механически ресуспензировали, центрифугировали 5 минут на
скорости 900 об/мин, удаляли супернатант и ресуспензировали в свежей среде, полученную
суспензию разливали по культуральным флаконам с ростовой средой в пропорции 1:3.
2.2.3. Экспериментальные животные
В экспериментах использовали крыс линии Вистар массой 200–300 г и 6-недельных мышей
(C57Bl6xDBA/2)F1 массой 18–24 г, полученных из Экспериментально-биологической клиники
лабораторных животных СО РАМН и содержавшихся в стандартных условиях. Работу
проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского
сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации.
59
2.3.
Исследования на клеточных культурах и клетках in vitro
2.3.2. Определение жизнеспособности клеток
Влияние исследуемых соединений на жизнеспособность клеток определяли по их
способности восстанавливать бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия
(МТТ) до гранул формазана, образующимся в дыхательной цепи митохондрий супероксиданион радикалом (МТТ-тест) [Mosmann T., 1983]. Для этого клетки U937 инкубировали 24 часа
с исследуемыми соединениями в лунках 96-луночного планшета, после чего добавляли раствор
МТТ (финальная концентрация 0,5 мг/мл) и инкубировали еще 4 часа. Затем клетки
центрифугировали в течение 6 минут при 2000 об/мин, супернатант удаляли, клетки,
содержащие гранулы формазана, лизировали в лунках планшета 100 мкл диметилсульфоксида
(DMSO). После этого измеряли оптическую плотность на длине волны 540 нм (поглощение
раствора формазана в DMSO), используя референс-фильтр 630 нм. Результаты выражали в
долях от единицы, за единицу принимали значение медианы оптической плотности (OD540-630)
контрольных клеток.
Для исследования влияния препаратов на жизнеспособность, апоптоз и некроз в условиях
окислительного стресса к интактным клеткам линии U937, а также к клеткам, предварительно
(за 24 часа) обработанным различными концентрациями тестируемого соединения, однократно
добавляли перекись водорода в финальной концентрации 0,5 мМ. Через 24 часа после
добавления Н2О2 оценивали общее количество жизнеспособных клеток в МТТ-тесте, через 4
часа – количество клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза и некротически
измененных. Индукцию апоптоза и некроза определяли по величине трансмембранного
митохондриального
потенциала
(с
помощью
флуоресцентного
красителя
3,3'-
дигексилоксакарбоцианина йодида, DiOC6) [Williams O., 2004] и целостности клеточной
мембраны (по проницаемости для йодида пропидия PI) [Dive C. Et al., 1992] соответственно.
Для этого к клеткам добавляли 40 нМ DiOC6, инкубировали в течение 15 мин при +37 С, затем
отмывали от избытка красителя раствором PBS и инкубировали в течение 5 мин при комнатной
температуре в PBS, содержащем 10 мкг/мл PI. После однократной отмывки флуоресценцию
клеток (λEm = 520 нм для DiOC6 и λEm = 670 нм для PI) измеряли c помощью проточного
цитофлуориметра FACSCalibur (Becton-Dickinson, США). Клетки с высоким значением
интенсивности флуоресценции DiOC6 и неповрежденной клеточной мембраной принимали за
жизнеспособные, клетки cо сниженным митохондриальным потенциалом и непроницаемые для
PI – за находящиеся на ранних стадиях апоптоза, клетки с нарушенной целостностью мембраны
– за некротически измененные клетки.
60
2.3.3. Приготовление клеточных лизатов
Для
приготовления
клеточных
лизатов
клетки
линии
U937
отмывали
PBS,
ресуспендировали в 0,5 мл лизирующего буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl и 250 мМ
сахарозы, рН 7,4, после чего озвучивали на льду ультразвуковым аппаратом МУЗА 01/22-М
Надежда-3 (Россия). Затем лизаты центрифугировали 10 минут на скорости 13 000 об/мин и
отбирали супернатант для измерений.
2.3.4. Определение концентрации белка по Брэдфорду
Концентрацию
белка
спектрофотометрически
с
в
лизатах
красителем
и
воспалительных
Кумасси
G-250
на
экссудатах
длине
определяли
волны
600
нм
[Bradford M.M., 1976]. 5 мкл клеточного лизата добавляли к 150 мкл раствора красителя в лунки
96-луночного планшета.
Краситель приготавливали разведением 20 мг сухого Кумасси G-250 в 10 мл этилового
спирта, после чего к раствору добавляли 10 мл ортофосфорной кислоты, доводили объем до 200
мл дистиллированной водой, оставляли на сутки при комнатной температуре, а затем
фильтровали 2 раза через бумажные фильтры.
2.3.5. Определение активности ферментов
Активность NQO1 измеряли спектрофотометрически по скорости реакции NADPHзависимого двухэлектронного окисления дихлориндофенола [Siegel D. et al., 2007]. Для этого
рабочий раствор, содержащий 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,08% Triton X-100, 0,25 мМ NADPH, 80
мкМ 2,6-дихлориндофенола, разливали по 140 мкл в лунки 96-луночного плоскодонного
планшета для иммунологических реакций. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл
клеточного лизата и измеряли изменение оптической плотности на длине волны 600 нм в
кинетическом режиме на планшетном фотометре BioTek ELx808 (BioTek, США). В качестве
«пустой» пробы использовали рабочий раствор без добавления клеточного лизата. Реакцию с
каждым образцом проводили дважды – в присутствии 60 мкМ дикумарола и без него. После
этого вычисляли чувствительную к дикумаролу дихлориндофенол-восстанавливающую
активность
образцов. Изменение оптической
плотности
пересчитывали
в изменение
концентрации субстрата, используя коэффициент экстинкции 21,0  10-3 М–1см–1. После
измерения количества белка в клеточном лизате активность фермента нормировали на общее
количество белка, на основании чего делали вывод об изменении активности фермента.
Активность GST измеряли спектрофотометрически по скорости образования конъюгатов
глутатиона с динитрохлорбензолом [Mannervik B. et al., 2001]. Для этого рабочий раствор,
содержащий 100 мМ PBS, 1 мМ восстановленного глутатиона, 1 мМ динитрохлорбензола,
разливали в кварцевые кюветы по 1400 мкл. Реакцию запускали добавлением к рабочему
раствору 100 мкл клеточного лизата, после чего на 1 и на 10 минутах измеряли оптическую
61
плотность на длине волны 340 нм. В качестве «пустой» пробы использовали рабочий раствор
без добавления клеточного лизата. Изменение оптической плотности пересчитывали в
изменение концентрации продукта, используя коэффициент экстинкции 9,6  10-3 М–1см–1.
После измерения количества белка в клеточном лизате активность фермента нормировали на
общее количество белка, на основании чего делали вывод об изменении активности фермента.
Активность глутатионредуктазы (GR) измеряли спектрофотометрически по скорости
окисления NADPH, расходующегося на восстановление окисленного глутатиона [Mannervik B.,
2001]. Для этого рабочий раствор, содержащий 50 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ EDTA, 0,14 мМ
NADPH, 1 мМ окисленного глутатиона, разливали в кварцевые кюветы по 1400 мкл, реакцию
запускали добавлением 100 мкл клеточного лизата, после чего измеряли оптическую плотность
на длине 340 нм на 1 и 20 минутах реакции. В качестве «пустой» пробы использовали рабочий
раствор без добавления клеточного лизата. Изменение оптической плотности пересчитывали в
изменение концентрации субстрата, используя коэффициент экстинкции 6,2  10-3 М–1см–1.
После определения содержания белка в клеточном лизате активность фермента нормировали на
общее количество белка, на основании чего делали вывод об изменении его активности.
2.3.6. Определение концентрации глутатиона
Для приготовления депротеинизированных клеточных лизатов клетки линии U937
отмывали PBS, ресуспендировали в 0,5 мл лизирующего буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl
и 250 мМ сахарозы, рН 7,4, после чего озвучивали на холоду ультразвуковым аппаратом МУЗА
01/22-М Надежда-3. Из полученных лизатов отбирали по 50 мкл для измерения концентрации
белка, после чего добавляли по 50 мкл 50% водного раствора сульфосалициловой кислоты для
осаждения белка. Затем лизаты центрифугировали 10 минут на скорости 13 000 об/мин и
отбирали супернатант для проведения измерений.
Суммарное
содержание
глутатиона
(восстановленного
и
окисленного)
в
депротеинизированных клеточных лизатах определяли спектрофотометрически по скорости его
взаимодействия с 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислотой [Zhang J., Kirkham M.B., 1996].
Для этого в лунки 96-луночного планшета к 150 мл рабочего раствора (100 мМ калиевофосфатный буфер, содержащий 1 мМ ЭДТА, рН 7, 0,1 мМ 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной
кислоты и 0,44 Ед/мл глутатионредуктазы) вносили по 10 мкл клеточного лизата. Реакцию
инициировали добавлением 50 мкл 0,19 мМ раствора NADPH (40 мг/мл). После этого в
кинетическом режиме измеряли изменение оптической плотности на длине волны 450 нм на
планшетном фотометре BioTek ELx808. Калибровочную кривую строили по образцам с
известной концентрацией восстановленного глутатиона. Для определения содержания
окисленного глутатиона каждую пробу предварительно инкубировали с 2,5% 2-винилпиридина
для необратимой конъюгации восстановленного глутатиона. После этого проводили измерение
62
согласно
приведенной
выше
методике.
Концентрацию
восстановленного
глутатиона
определяли как разность содержания суммарного и окисленного глутатиона.
2.3.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание
Для иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к транскрипционному фактору Nrf2
клетки линий J774 и FLECH снимали трипсином и сажали на стекла с полилизиновым
покрытием в полную культуральную среду, после распластывания добавляли раствор
исследуемого вещества и инкубировали 4 часа. Затем клетки фиксировали 4% формалином в
течение 15 минут (эту и все последующие стадии приготовления препаратов проводили при
комнатной температуре) и пермеабилизировали 0,15% раствором Triton в PBS в течение 3
минут, после чего дважды отмывали в PBS в течение 5 минут. После инкубации в
блокирующем буфере (50 мг/мл BSA в PBS) в течение 40 минут препараты инкубировали 3 часа
с кроличьими поликлональными антителами к Nrf2, после чего дважды отмывали в PBS в
течение
10
минут.
Затем
препараты
инкубировали
с
вторичными
антителами
к
иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с флуорохромом Texas Red в течение часа в
темноте. После двукратной десятиминутной отмывки в PBS клеточные ядра контрастировали
DAPI, разведенным в antifade, и накрывали покровным стеклом. Анализ препаратов проводили
на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss, Германия).
2.3.8. Исследование продукции АКМ лейкоцитами
Кровь из хвостовой вены собирали в пластиковые пробирки с гепарином (конечная
концентрация 40 ЕД/мл), после чего добавляли десятикратный избыток лизирующего буфера
(0,8 % NH4Cl, 0,08 % EDTA, 0,08 % NaHCO3). Лизированные эритроциты отмывали
центрифугированием (10 минут, 300 g), лейкоциты ресуспендировали в растворе Хенкса без
фенолового красного в концентрации (0,5–1)  106/мл. Содержание ядросодержащих клеток в
крови с лизированными эритроцитами определяли стандартным методом с использованием
камеры Горяева. Для определения лейкоцитарной формулы готовили мазки периферической
крови, окрашиваемые по Нохту – Максимову, подсчитывали количество различных видов
лейкоцитов стандартными методами.
Для определения продукции АКМ с помощью проточной цитометрии лейкоциты,
полученные описанным выше способом, либо клетки воспалительного экссудата инкубировали
в течение 15 минут при +37 °С с диацетатом 2,7-дихлородигидрофлуоресцина в финальной
концентрации
20 мкМ,
который
в
присутствии
перекиси
водорода
окисляется
до
дихлорфлуоресцина (DCF), обладающего выраженной флуоресценцией, или дигидроэтидином
в финальной концентрации 20 мкМ, который в присутствии супероксид-аниона окисляется до
флуоресцентного этидина (E+) [Robinson J.P., 2001]. Для активации продукции АКМ
(стимуляции
дыхательного
взрыва)
к
клеткам
добавляли
100
нг/мл
PMA
(PMA-
63
стимулированные пробы, продукцию АКМ без PMA считали спонтанной). Интенсивность DCFзависимой флуоресценции (λEm = 488 нм, λEx = 530 нм) и Е+-зависимой флуоресценции (λEm =
520 нм, λEx = 610 нм) измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton-Dickinson,
США). Регионы, содержащие нейтрофилы и моноциты, выделяли на основании показателей
бокового и прямого светорассеяния (FSC и SSC).
Для измерения хемилюминесценции 100 мкл крови вводили в 0,8 мл бесцветной среды
Хенкса с гепарином (4 ЕД/мл); после добавления 0,1 мл раствора люминола 100 мкМ,
термостатирования и измерения спонтанной хемилюминесценции в систему вводили в качестве
стимулятора дыхательного взрыва лейкоцитов взвесь зимозана (0,1 мл 20 мг/мл) и измеряли
хемилюминесценцию
интенсивности
до
достижения
дыхательного
взрыва
максимума
служила
свечения
(показателем
интенсивность
суммарной
хемилюминесценции
в
максимуме). Одновременно определяли общее содержание лейкоцитов и выполняли расчет
удельной интенсивности дыхательного взрыва [Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., 1990].
Исследование влияния тестируемых соединений на развитие воспаления в моделях
2.4.
in vivo
2.4.2. Индукция острого локального воспаления у крыс
Моделью
локального
воспаления
послужил
каррагинан-индуцированный
отек
[Morris C.J., 2003]. Крысам линии Вистар интраплантарно вводили в правую заднюю лапу 0,1
мл
10%
раствора
каррагинана
в
физиологическом
растворе.
Показателем
развития
воспалительного процесса служил отек лапы, определяемый плетизмометрически через 5 ч
после инъекции каррагинана и выражаемый как ((Vп – Vл)/Vл)  100%, где Vп – объем правой
лапы, Vл – объем левой лапы. Тестируемые соединения и препарат сравнения фенозан-калий,
растворенные в 1 мл дистиллированной воды, вводили per os с помощью внутрижелудочного
зонда за 1 ч до индукции воспаления каррагинаном в дозе 100 мг/кг веса тела животного, а
крысам контрольной группы – по 1 мл дистиллированной воды.
2.4.3. Индукция острого системного воспаления у крыс
Неспецифическое острое системное воспаление индуцировали однократным введением в
латеральную хвостовую вену крысам линии Вистар 1 мл суспензии зимозана (20 мг/мл) в
физиологическом растворе [Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Воробьева Н.Ф. и др., 2005].
Раствор ТС-13 в дистиллированной воде (100 мг/кг, 1 мл) животным опытной группы вводили с
помощью металлического зонда внутрижелудочно за 2 часа до и через 5 часов после индукции
воспаления и в последующем дважды в день (контрольным животным вводили по 1 мл
дистиллированной воды). Перед введением гранул зимозана а также на 2 и 3 сутки после
индукции воспалительной реакции из хвостовой вены прижизненно отбирали кровь для
64
определения общего количества лейкоцитов, подсчета лейкоцитарной формулы и измерения
продукции АКМ.
2.4.4. Индукция эндотоксинового шока у мышей
Эндотоксиновый шок вызывали внутрибрюшинным введением 6-недельным мышамсамцам (C57Bl6xDBA/2)F1 липополисахарида (LPS) E. coli 055:B5, растворенного в 0,89%
растворе NaCl, в дозе 1 мг на мышь [Witzenbichler B. et al., 2005]. За 3 часа до инъекции
животные
опытной
группы
получали
внутрижелудочно
0,1
мл
раствора
ТС-13
в
дистиллированной воде из расчета 200 мг/кг массы тела, контрольные мыши – 0,1
дистиллированной воды. Противошоковую активность препаратов оценивали с помощью логрангового теста и анализа кривых выживаемости Каплана-Майера.
2.4.5. Индукция обострения хронического воспаления на модели «воздушного мешка» у
крыс
У самцов крыс линии Вистар ежедневным введением стерильного воздуха под кожу в течение 7
дней формировали воздушную полость, выстланную синовиально-подобной оболочкой ("air
pouch"), после чего в нее вводили 2 мл 1% водного раствора каррагинана для индукции
развития острой воспалительной реакции [Sedgwick A.D. et al., 1986]. Через 24 часа животных
выводили из эксперимента эфирным наркозом, полость вскрывали, собирали клеточный
экссудат и изучали его объем, состав и функциональную активность клеток. Раствор ТС-13 в
дистиллированной воде из расчета по 100 мг/кг массы тела вводили внутрижелудочно 3 раза: за
1 сутки, за 1 час до инъекции и через 5 часов после инъекции каррагинана, контрольным
животным аналогичным образом вводили дистиллированную воду.
2.4.6. Индукция неспецифического аутоиммунного воспаления суставов лап крыс
(модель ревматоидного артрита)
Неспецифическое воспаление суставов лап самцов крыс Вистар индуцировали путем
внутрикожной инъекции раствора гетерологичного бычьего коллагена типа II в смеси с
адъювантом Фрейнда [Moore A.R., 2003]. Коллаген II вводили в 0,01М раствор CH3COOH (4
мг/мл) и перемешивали в течение ночи при +4 С, затем смешивали (1/1 об./об.) с полным и
неполным адъювантами Фрейнда. Полученную эмульсию вводили крысам под наркозом
внутрикожно у основания хвоста с удаленным волосяным покровом по 100 мкл на крысу в 2
инъекции
(200
мкг
коллагена
на
крысу).
После
этого
животное
взвешивали
и
плетизмометрически измеряли объемы правой и левой задних лап. Крысам опытной группы
вводили с помощью внутрижелудочного зонда по 1 мл ТС-13 в дистиллированной воде (100
мг/кг массы тела) в день иммунизации, крысам контрольной группы вводили по 1 мл
дистиллированной воды. В последующем животным опытной группы раствор ТС-13 вводили
через день. Через каждые 7 суток после иммунизации проводили взвешивание и измерение
65
объемов задних лап, определяя процент прироста. Через каждые 7 суток после иммунизации
проводили взвешивание и измерение объемов задних лап, определяя процент прироста.
Начиная с 15 суток, когда появились внешние признаки развития артрита, каждые 2–3 дня по 5балльной системе [Brand D.D. et al., 2007] определяли его визуальные стадии: 0 стадия –
отсутствие эритемы и отека; 1 стадия – эритема и небольшой отек, ограничивающийся
предплюсневой областью или голеностопным суставом; 2 стадия – эритема и небольшой отек,
распространяющийся от лодыжки к предплюсневой области; 3 стадия – эритема и умеренный
отек, распространяющаяся от лодыжки до плюсневых суставов; 4 стадия – эритема и сильный
отек, охватывающий лодыжки, стопы и пальцы, или анкилоз конечности. На 32-й день после
инъекции коллагена II у наркотизированных крыс проводили вышеописанные измерения и
умерщвляли животных декапитацией, забирая кровь в пробирки с гепарином (40 ЕД/мл) для
определения количества и функциональной активности фагоцитирующих клеток.
2.5.
Статистическая обработка экспериментальных данных
Поскольку распределение показателей внутри экспериментальных групп отличалось от
нормального, статистическую обработку проводили с использованием непараметрического
критерия Манна – Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия между
сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали
достоверными при p < 0,05.
На рисунках и в таблицах, кроме специально оговоренных случаев, отмечены достоверные
различия: * – между контрольной и опытной группой; # – между опытными группами (p<0,05).
Данные представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей, минимального и
максимального значения либо диапазона без выбросов. Для определения достоверности
различий в опытных и контрольных выборках между кривыми выживаемости животных,
построенными по методу Каплана  Майера, применяли логранговый тест.
66
3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для целей настоящего исследования в НИИ химии антиоксидантов ФГБОУ ВПО
"Новосибирский государственный педагогический университет" были синтезированы десять
оригинальных
гидрофильных
различающихся
длиной
серо-
и
селен-содержащих
углеводородной
цепи
фенольных
антиоксидантов,
алкилтиосульфонатного
заместителя,
находящегося в пара-положении по отношению к гидроксильной группе (ТС-12, ТС-13 и ТС-14,
рисунок 3.1 (А–В)), количеством трет-бутильных орто-заместителей (ТС-9, ТС-17, рисунок 3.1
(Г, Д)) и заменой атома серы (II) на атом селена (II) в аналоге ТС-13 (СС-13, рисунок 3.1 (Е)), не
содержащие бивалентный атом серы в пара-пропильном заместителе (С-9, С-13 и С-17, рисунок
3.1 (Ж–И)), а также незамещённый фенол С-10, в котором гидроксильная группа заменена на
метоксильную (рисунок 3.1 (К)). В качестве препарата сравнения был синтезирован известный
водорастворимый антиоксидант фенозан-калий (рисунок 3.1 (Л)).
А) ТС-12
Б) ТС-13
В) ТС-14
Г) ТС-9
Д) ТС-17
Е) СС-13
Ж) С-9
З) С-13
И) С-17
К) С-10
Л) Фенозан-калий
Рисунок 3.1. Структура водорастворимых фенольных антиоксидантов
67
Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на жизнеспособность
3.1.
клеток в культуре
Влияние исследуемых соединений на жизнеспособность клеток U937 оценивали по
результатам МТТ-теста, основанном на способности NAD(P)H-зависимых оксидоредуктаз
восстанавливать МТТ до формазана; реакция происходит только в живых клетках с активными
митохондриальными ферментами. Концентрации антиоксидантов варьировали в диапазоне 0–
500 мкМ, результаты представлены в виде медиан и разбросов, а также диаграмм рассеяния, из
приведённых на которых уравнений аппроксимации рассчитывали IC 50 (концентрацию
соединения, в которой оно подавляет жизнеспособность клеток на 50 %).
Наименее токсичным про результатам МТТ-теста является фенозан-калий, значимо
снижающий жизнеспособность клеток только при обработке клеток его 500 мкМ раствором, но
даже тогда жизнеспособность клеток была не ниже 85 % (рисунок 3.2, таблица 3.1).
Рисунок 3.2. Влияние фенозан-калия на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы
значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния (кружки – отдельные значения, сплошная линия
– линейная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал).
Соединения ТС-17 (тиосульфонат с полностью экранированной функциональной ОНгруппой) и С-13 (частично экранированный сульфонат) проявляют выраженную токсичность:
жизнеспособность клеток при обработке этими соединениями линейно снижалась, начиная в
200 мкМ и достигая значения 15 % под действием 500 мкМ растворов соединений (рисунок 3.3,
рисунок 3.4, таблица 3.1).
68
Таблица 3.1
Характеристика зависимости жизнеспособности клеток линии U937 от концентрации
внесённого в среду инкубации фенольного антиоксиданта
Соединение
Фенозан-калий
ТС-131
ТС-12
ТС-17
С-13
СС-13
Вид аппроксимации;
уравнение
Достоверность
Коэффициент
аппроксимации
корреляции
(R2; p)
Спирмена (rS; p)
0,38; 0,0013
–0,57; 0,003828
900
0,92; 0,0000
–0,93; 0,000000
658
0,94; 0,0000
–0,98; 0,000000
438
0,95; 0,0000
–0,95; 0,000000
302
0,95; 0,0000
–0,97; 0,000000
291
0,96; 0,0000
–0,81; 0,000001
80
Линейная;
y = 1,0197 – 0,0003  x
Линейная;
y = 1,0335 – 0,0007  x
Линейная;
y = 1,0379 – 0,0011  x
Линейная;
y = 0,9802 – 0,0017  x
Линейная;
y = 1,0488 – 0,0018  x
Экспоненциальная;
y = 1,075 + 0,8810  e–x/97,25
Примечание. Соединения расположены по мере увеличения токсичности.
1
IC50,
мкМ
– данные приведены без учета
стимулирующих концентраций.
Рисунок 3.3. Влияние ТС-17 на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы
значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния (кружки – отдельные значения, сплошная линия
– линейная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал).
69
Рисунок 3.4. Влияние С-13 на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы значений
и разбросы, Б – диаграмма рассеяния (кружки – отдельные значения, сплошная линия –
линейная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал).
Тиосульфонат с несимметрично экранированной фенольной гидроксильной группой ТС-13
не только обладает невысокой токсичностью (при обработке клеток его 500 мкМ раствором их
жизнеспособность составляла 65 %), но и в невысоких концентрациях достоверно увеличивает
жизнеспособность клеток (при воздействии 100 мкМ раствора ТС-13 повышая ее на 40 %)
(рисунок 3.5, таблица 3.1).
Рисунок 3.5. Влияние ТС-13 на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы
значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния без учета стимулирующих концентраций
(кружки – отдельные значения, сплошная линия – линейная аппроксимация, пунктирная – 95%
доверительный интервал).
70
Укорочение пара-пропильного заместителя ТС-13 на одно метиленовое звено (ТС-12)
отменяло стимулирующее действие низких концентраций антиоксиданта, в то же время
результирующее соединение было менее токсичным, чем остальные аналоги (ТС-17, С-13, СС13), жизнеспособность клеток была не ниже 45 % при воздействии максимальной из
протестированных дозировок 500 мкМ (рисунок 3.6, таблица 3.1). Напротив, замена атома
"активной" серы на селен в пара-пропильном заместителе ТС-13 (СС-13) приводила к
существенному увеличению токсичности итогового соединения: СС-13, единственный из
исследованных препаратов, достоверно снижает жизнеспособность клеток в концентрации 100
мкМ (более чем на 50 %), максимального ингибирующего эффекта соединение достигает в
концентрации 200 мкМ (более чем на 80 %) с последующим выходом на плато (рисунок 3.7,
таблица
3.1).
Очевидно,
это
можно
объяснить
высокой
токсичностью
селена
[Доклад 58 ВОЗ, 1989].
Рисунок 3.6. Влияние ТС-12 на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы
значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния (кружки – отдельные значения, сплошная линия
– линейная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал).
Обнаруженная у ТС-13 уникальная среди тестируемых соединений способность в малых
концентрациях увеличивать жизнеспособность клеток, очевидно, связана со стимулированием
им пролиферации и/или роста клеток. Для более детального анализа были проведены
дополнительные эксперименты по исследованию влияния ТС-13 в концентрациях от 1 до 200
мкМ на жизнеспособность, апоптоз и некроз клеток в условиях окислительного стресса,
индуцированного экзогенным пероксидом водорода.
71
Рисунок 3.7. Влияние СС-13 на жизнеспособность клеток линии U937. А – медианы
значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния (кружки – отдельные значения, сплошная линия
– экспоненциальная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал).
Инкубирование клеток U937 с 0,5 мМ H2O2 в течение 24 ч 0,5 мМ снижает их
жизнеспособность на 40–60 % (MTT-тест, рисунок 3.8). Установлено, что ТС-13 защищает
клетки
от
цитотоксического
действия
пероксида
водорода,
увеличивая
количество
жизнеспособных клеток, при этом кривая "доза – эффект" вновь имела колоколообразный
характер, но в данном случае её купол был смещён влево, с максимально эффективными
концентрациями 20 мкМ (рисунок 3.8).
При этом предварительная обработка клеток U937 фенольным антиоксидантом ТС-13
существенно снижала количество клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, через 4
часа после добавления к ним пероксида водорода (рисунок 3.9А). Данный эффект зависел от
концентрации
исследуемого
антиоксиданта,
будучи
наиболее
выраженным
при
его
использовании в дозах 100 и 200 мкМ, в которых соединение уменьшало количество клеток со
сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом до 50 % от значения
соответствующего показателя в контроле. В то же время предварительная обработка клеток
фенольным антиоксидантом ТС-13 не влияла на увеличение числа клеток с нарушенной
целостностью клеточной мембраны через 4 часа после индукции окислительного стресса H2O2
(рисунок 3.9Б), то есть на повышение количества пропидий-позитивных событий – клеток,
погибших путем первичного и вторичного некроза (находящихся на поздних стадиях апоптоза).
72
Рисунок 3.8. Влияние ТС-13 на выживаемость клеток U937 через 24 ч после добавления
цитотоксической концентрации H2O2 по результатам МТТ-теста. По оси абсцисс –
концентрация ТС-13; обозначены статистически значимые отличия (p < 0,05) от величин
соответствующих показателей: # – интактных клеток (культивируемых без H2O2), * – клеток,
культивируемых с H2O2 в отсутствие ТС-13.
Рисунок 3.9. Влияние ТС-13 на относительное количество клеток со сниженным
трансмембранным митохондриальным потенциалом (А) и относительное количество пропидийпозитивных клеток (Б) (в % от общего количества проанализированных клеток).
Таким образом, можно заключить следующее. Из ряда структурно подобных вновь
синтезированных водорастворимых антиоксидантов наименьшей цитотоксичностью обладает
73
несимметрично экранированный трет-бутилом фенол с атомом бивалентной серы в парапропильном заместителе ТС-13. Большая степень экранирования (ТС-17), отсутствие
"активной" серы (С-13), приближение её к бензольному ядру (ТС-12) или замена на атом селена
(СС-13) приводит к однозначному, но выраженному в разной степени увеличению токсичности
соединения. При этом в малых дозах (до 200 мкМ) ТС-13 повышает жизнеспособность клеток
in vitro – как в нормальных условиях, так и при индукции окислительного стресса, что,
очевидно, связано с его способностью подавлять развитие апоптоза.
Изучение способности исследуемых фенольных антиоксидантов индуцировать
3.2.
ARE-зависимые ферменты в культуре клеток
Сравнительный анализ способности фенольных антиоксидантов данного структурно
взаимосвязанного ряда индуцировать в клетках миелоидной линии U937 синтез AREзависимых ферментов II фазы детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантных ферментов был
проведен на модели индукции суммарной активности GST, катализирующих реакции
химической
модификации ксенобиотиков с
участием
GSH
(реакции конъюгации и
нуклеофильного замещения ксенобиотиков и GSH и восстановление органических пероксидов
до спиртов с образованием GSSG [Sherratt P.J. et al., 2002]), и NQO1, катализирующей реакции
двухэлектронного восстановления широкого спектра хинонов, предотвращая образование
высокореактивных
семихинонов,
и
функционирующей
как
эффективный
скэвинджер
супероксид-радикала [Siegel D. et al., 2004]. С исследуемыми соединениями в концентрациях 5,
20 и 100 мкМ клетки инкубировали в течение 24 часов.
С-13 не оказывал значимого влияния на активность NQO1 и GST (рисунок 3.10). ТС-12 не
влиял на активность NQO1 и существенно повышал активность GST (в бóльшей степени в
концентрациях 5 и 100 мкМ, линейная зависимость эффекта от дозы: достоверность
аппроксимации R2 = 0,50, p = 0,0023; коэффициент корреляции Спирмена rS = 0,79, p = 0,0003)
(рисунок 3.11). ТС-17 значимо увеличивал активность обоих ферментов только в концентрации
100 мкМ, практически не влияя на их индукцию в более низких дозах (рисунок 3.12), в то же
время зависимость эффекта от дозы была линейной – для NQO1 достоверность аппроксимации
R2 = 0,37, p = 0,0073; коэффициент корреляции Спирмена rS = 0,58, p = 0,0112, для GST
достоверность аппроксимации R2 = 0,73, p = 0,0000; коэффициент корреляции Спирмена
rS = 0,39, p = 0,1107).
Фенозан-калий (рисунок 3.13) и СС-13 (рисунок 3.14) во всех концентрациях достоверно
повышали активность как NQO1, так и GST, однако эффект был умеренным. Кроме того, если
для фенозан-калия зависимость эффекта от дозы была однозначно линейной для обоих
ферментов (для NQO1 достоверность аппроксимации R2 = 0,35, p = 0,0103; коэффициент
74
корреляции Спирмена rS = 0,71, p = 0,0011, для GST достоверность аппроксимации R2 = 0,24,
p = 0,0462; коэффициент корреляции Спирмена rS = 0,68, p = 0,0024), то для СС-13 она не была
столь очевидной (для NQO1 достоверность аппроксимации R2 = 0,25, p = 0,0477; коэффициент
корреляции Спирмена rS = 0,72, p = 0,0018, для GST достоверность аппроксимации R2 = 0,13,
p = 0,1649; коэффициент корреляции Спирмена rS = 0,57, p = 0,0212).
Рисунок 3.10. Влияние С-13 на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б) в клетках
U937.
Рисунок 3.11. Влияние ТС-12 на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б) в
клетках U937.
75
Рисунок 3.12. Влияние ТС-17 на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б) в
клетках U937.
Рисунок 3.13. Влияние фенозан-калия на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б)
в клетках U937.
76
Рисунок 3.14. Влияние СС-13 на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б) в
клетках U937.
Наибольшим же индуцирующим эффектом обладает ТС-13 (рисунок 3.15), который
эффективно повышал активность NQO1 в концентрациях 5 мкМ (увеличение в 2,2 раза по
сравнению с контролем), 20 мкМ (в 2,3 раза) и 100 мкМ (в 2,6 раза), линейная зависимость
эффекта от дозы (достоверность аппроксимации R2 = 0,37, p = 0,0074; коэффициент корреляции
Спирмена rS = 0,78, p = 0,0002). Инкубация клеток U937 с ТС-13 также приводила к увеличению
в них активности GST (нелинейная зависимость), при этом интересно, что этом случае вновь
проявился горметический эффект ТС-13 – в более низких концентрациях (5 и 20 мкМ)
соединение дозозависимо ее повышало (соответственно в 1,29 и 1,86 раза), в то время как при
увеличении дозы до 100 мкМ стимулирующий эффект исчезал.
Таким образом, исследуемые водорастворимые фенольные антиоксиданты существенно
различаются по способности активировать NQO1 и
GST
в клетках моноцитарно-
макрофагальной линии U937 в зависимости от своей химической структуры. Наибольшим
стимулирующим эффектом обладает несимметрично экранированный фенол ТС-13, в то время
как полное экранирование фенольной группы (на примере соединения ТС-17 и фенозан-калия),
укорочение пара-алкильного заместителя на одно метиленовое звено (соединение ТС-12),
удаление из его структуры бивалентного атома серы (соединение С-13) или замена его на атом
селена (II) (соединение СС-13) приводит к частичной (от умеренной до почти полной) потере
биологической активности.
77
Рисунок 3.15. Влияние ТС-13 на активность NQO1 (А) и общую активность GST (Б) в
клетках U937.
Эти факты свидетельствуют, что для реализации биологической активности исследуемых
соединений важно присутствие в структуре пара-алкильного заместителя атома двухвалентной
серы и степень экранирования ОН-группы, так как укорочение пара-алкильного заместителя,
удаление из него атома серы (II) или замена его на селен (II), а также полное экранирование
фенольной
группы
двумя
трет-бутильными
заместителями
приводят
к
снижению
эффективности фенолов в качестве индукторов ферментов второй фазы детоксикации и
антиоксидантных ферментов. При этом отмечено, что NQO1- и GST-индуцирующие
способности тестируемых соединений тесно взаимосвязаны (рисунок 3.16), что указывает на
возможность координированной индукции данных ферментов и наличие общей регуляторной
системы, обеспечивающей их активацию в ответ на обработку клеток фенольными
антиоксидантами.
Наиболее
вероятным
механизмом
активации
NQO1
и
GST
(представителей
антиоксидантных ферментов и ферментов II фазы детоксикации ксенобиотиков) фенольными
антиоксидантами является усиление экспрессии соответствующих генов (поскольку через сутки
в водных растворах происходит полный гидролиз большинства исследуемых фенолов, что
исключает наличие аллостерических эффектов на сами ферменты). Так как экспрессия этих
генов является ARE-зависимой, а структура соединений отвечает критериям индукторов ARE,
можно сделать вывод о их возможном активирующем влиянии на сигнальную систему
Keap1/Nrf2/ARE.
78
Рисунок 3.16. Корреляция GST- и NQO1-активирующих свойств исследуемых фенольных
антиоксидантов (диаграмма рассеяния). ФК - фенозан-калий. Кружки – отдельные значения
(отношения медиан активностей ферментов при инкубации клеток U937 с 20 мкМ
соответствующего соединения и контроля), сплошная линия – линейная аппроксимация,
пунктирная – 95% доверительный интервал. Приведены уравнения аппроксимации и ее
достоверность.
Изучение влияния исследуемых фенольных антиоксидантов на способность
3.3.
модулировать развитие острого локального воспаления in vivo (модель 1)
Каррагинан-индуцированное локальное воспаление является острым, неиммунным и, кроме
того, хорошо изученным и легко воспроизводимым, вследствие чего эта модель широко
используется для определения противовоспалительной активности различных веществ
[Di Rosa M. et al., 1971a, b; Di Rosa M., 1972; Garcia Leme J. et al., 1973], в том числе
рекомендована для доклинических исследований новых нестероидных противовоспалительных
препаратов в России [Хабриев Р.У., 2005].
Проведен скрининг синтезированных соединений по их влиянию на выраженность
локального воспаления в модели каррагинан-индуцированного отека лап крыс линии Вистар с
целью
отбора
наиболее
эффективного
флоголитика.
Обнаружено,
что
большинство
тестируемых соединений проявляют достоверно значимый противовоспалительный эффект,
однако укорачивание пара-алкильного заместителя на одно метиленовое звено (ТС-12),
инактивация ОН-группы (С-10), также как и замена активного атома серы на селен (СС-13)
приводит к потере способности соединения ингибировать развитие отёка лапы. Наиболее
выраженным противовоспалительным эффектом, не уступающим эффекту аспирина, обладает
79
частично экранированный тиосульфонат ТС-13, однако удаление на одно метиленовое звено от
бензольного ядра атома "активной" двухвалентной серы в составе тиосульфонатного фрагмента
у соединения ТС-14 обеспечивало ему эффективность, близкую к эффективности ТС-13
(рисунок 3.17).
Рисунок 3.17. Влияние фенольных антиоксидантов на выраженность воспалительной
реакции.
При варьировании дозы ТС-13 с целью установить ту, в которой он подавляет
выраженность отека на 50 % (ED50), было обнаружено, что данный фенол проявляет достоверно
значимую дозовую зависимость, ED50 составила 26 мг/кг массы тела (r = –0,655, p < 0,00001)
(рисунок 3.18). При этом введение препарата даже в такой высокой концентрации, как 1600 мг
на 1 кг массы тела, не сопровождается полным угнетением развития каррагинаниндуцированного отека лапы у крыс.
Формирование отека при остром воспалительном ответе, который характеризуется
повышением сосудистой проницаемости и клеточной инфильтрации, происходит в результате
транссудации жидкости и белков и скопления лейкоцитов в очаге воспаления. На повышение
проницаемости сосудов влияют такие медиаторы воспаления, как гистамин, серотонин,
брадикинин и простагландины. Другим важным медиатором острого воспаления является NO ,
продуцируемый множеством различных клеток, включая лейкоциты, эндотелиоциты и
чувствительные нервные клетки [Handy R.L., Moore P.K., 1998]. Стационарная концентрация
NO в очаге воспаления возрастает за счет активации индуцибельной NOS, экспрессию генов
80
которой контролирует транскрипционный фактор NF-κB. В ходе клеточной инфильтрации,
следующей за повышением проницаемости сосудов, в очаг воспаления проникает множество
нейтрофилов, продуцирующих супероксидный анион и гидроксильные радикалы [Fantone J.C.,
Ward P.A., 1982]. Циклооксигеназы, также находящиеся под контролем NF-κB, катализируют
образование PGH2 (простагландина, прекурсора синтеза простагландинов, простациклинов и
тромбоксанов) [Smith W.L. et al., 1991] из арахидоновой кислоты (многие нестероидные
противовоспалительные
препараты
являются
именно
ингибиторами
COX
[Herschman H.R., 1996; Vane J.R., Botting R.M., 1995]). При каррагинан-индуцированном отеке
лапы уровень COX-2 возрастает (достигает максимального уровня экспрессии через час после
инъекции) с сопутствующим увеличением количества простагландинов, в частности –
простагландина Е2 [Nantel F. et al., 1999].
Рисунок 3.18.
Зависимость от концентрации ингибирующего действия ТС-13 на
выраженность воспалительной реакции (диаграмма рассеяния). Белые квадраты – отдельные
значения, чёрные – средние, разбросы – ошибки средних, сплошная линия – экспоненциальная
аппроксимация (уравнение приведено на рисунке), пунктирная линия – 95% доверительный
интервал.
Вследствие многокомпонентности воспаления и множественности процессов, протекающих
в ходе его развития, очевидно, что тестируемый препарат ингибирует лишь часть
задействованных реакций, многие из которых находятся под контролем фактора NF-κB,
провоспалительные эффекты которого способна подавлять система Keap1/Nrf2/ARE. Так,
например, показано, что проявляемая трет-бутилгидрохиноном антивоспалительная активность
связана с его способностью активировать Nrf2, который, посредством взаимодействия с
энхансером гена TNF-, конкурирует за связывание с этим участком ДНК провоспалительного
фактора транскрипции NF-B, тем самым подавляя синтез цитокина [Ma Q., Kinneer K., 2002].
81
Эти данные, а также тот факт, что ранее была показана способность исследуемых соединений
индуцировать активность ARE-зависимых ферментов [Зенков Н.К. и др., 2007], позволяет
предположить, что в основе противовоспалительного действия синтезированных фенольных
антиоксидантов лежит их способность индуцировать систему Keap1/Nrf2/ARE. На основании
полученных данных для дальнейшей работы был выбран частично экранированный
тиосульфонат ТС-13, обладающий максимально выраженными биологическими эффектами при
умеренно выраженной токсичности.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 индуцировать систему
3.4.
антиоксидант-респонсивного элемента
3.4.1. Изучение влияния фенольного антиоксиданта ТС-13 на содержание глутатиона и
активность глутатионредуктазы
Основополагающим моментом, служащим в качестве триггера для индукции системы
Keap1/Nrf2/ARE, является изменение редокс-баланса биологической системы в сторону
преобладания прооксидантов, в том числе развитие окислительного стресса. Наиболее
адекватным показателем окислительно-восстановительного равновесия служит соотношение
восстановленных и окисленных SH-групп
в белках, непосредственно зависящее от
специализированной системы трипептида глутатиона, к которой можно отнести сам глутатион
в окисленной (GSSG) и восстановленной (GSH) форме, использующие последний в качестве
кофактора ферменты (глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы) и глутатионредуктазу
(GR),
восстанавливающую
дисульфидную
связь
окисленного
глутатиона
до
его
сульфгидрильной формы.
В результате исследования влияния ТС-13 на активность GR в клетках миелоидной линии
U937 обнаружено его ТС-13 дозозависимое стимулирующее действие (рисунок 3.19А). При
этом максимальным эффектом на активность GR исследуемый фенол обладает в дозе 20 мкМ
(аналогично влиянию на GST), увеличивая данный показатель в 1,75 раза по сравнению с
контролем (для сравнения, фенозан-калий в той же концентрации увеличивает активность GR в
1,48 раза), а при дальнейшем увеличении конечной концентрации происходит инверсия эффекта
(рисунок 3.19Б), что объясняется явлением гормезиса, часто встречающимся у индукторов
системы Keap1/Nrf2/ARE: низкие концентрации этих индукторов повышают экспрессию AREзависимых генов, а высокие, напротив, снижают [Hyberston B.M. et al., 2011]. Такая зависимость
вполне
объяснима
негативными
последствиями,
которыми
чревата
для
организма
гиперактивация системы антиоксидант-респонсивного элемента (этот эффект наглядно заметен
у мышей, нокаутных по Keap1 [Wakabayashi N. et al., 2003]).
82
Рисунок 3.19. Влияние ТС-13 (А) и фенозан-калия (Б) на активность GR в клетках U937.
Также установлено, что через 24 часа после однократного добавления ТС-13 к промоноцитам
U937 увеличивает содержание общего (GSH + GSSG) глутатиона в клетках, что в большей
степени достигается за счет увеличения содержания его восстановленной формы (GSH), в
результате чего наблюдается тенденция к увеличению соотношения GSH/GSSG (рисунок 3.20).
3.4.2. Изучение
влияния
фенольного
антиоксиданта
ТС-13
на
активацию
транскрипционного фактора Nrf2
Приведенные выше данные свидетельствуют о наличии у фенольного антиоксиданта ТС-13
способности увеличивать экспрессию и активность комплекса антиоксидантных ферментов и
ферментов II фазы детоксикации ксенобиотиков, контролируемых антиоксидант-респонсивным
элементом на уровне транскрипции соответствующих генов, что, в сочетании с особенностями его
химического строения, косвенно подтверждает его принадлежность к индукторам антиоксидантреспонсивного
элемента.
Для
подтверждения
способности
частично
экранированного
тиосульфоната ТС-13 индуцировать редокс-чувствительную сигнальную систему на основании
данных о поэтапном механизме активации Nrf2 была изучена способность ТС-13 инициировать
ядерную транслокацию молекулы Nrf2, являющуюся ключевым моментом активации системы
Keap1/Nrf2/ARE. Исследование выполнено на клеточных линиях макрофагов гистиоцитарной
саркомы мыши J774 (модель клеток-эффекторов и регуляторов воспаления) и фибробластах легкого
эмбриона человека FLECH (в качестве объекта сравнения).
Было установлено, что в интактных клетках обеих линий Nrf2 равномерно локализован как в
цитоплазме, так и в клеточном ядре (рисунок 3.21А, 3.23А). Спустя 4 часа после добавления к
клеткам
ТС-13
наблюдается
изменение
внутриклеточного
распределения
транскрипционного фактора, который транслоцируется в клеточное ядро.
молекулы
83
Рисунок 3.20. Влияние ТС-13 на внутриклеточное содержание общего глутатиона (А),
восстановленного глутатиона (Б) и соотношение GSH/GSSG (В).
Наибольший эффект достигался при концентрации ТС-13 20 мкМ (рисунок 3.21В, 3.22),
при этом до 50 мкМ он зависел от дозы (достоверность аппроксимации R2 = 0,35; p = 0,000001;
коэффициент корреляции Спирмена rS = 0,60, p = 0,000005) (рисунок 3.22), а при концентрации
100 мкМ (рисунок 3.21Г, 3.22) происходило снижение выраженности данного эффекта (то есть
наблюдалось уменьшение целенаправленного транспорта молекулы Nrf2 в ядро), что может
быть
связано с эффектом гормезиса индуктора, активацией исследуемым фенолом
конкурирующих сигнальных путей, тормозящих активацию антиоксидант-респонсивного
элемента, либо с активацией Nrf2 в данных условиях на более ранних сроках, тогда как через 4
часа после воздействия преобладают уже механизмы инактивации данного сигнального пути.
84
А)
Б)
Рисунок 3.21. Внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в
интактных макрофагах мыши (J774) (А) и макрофагах, предварительно (за 4 часа)
обработанных ТС-13 в концентрации 5 мкМ (Б). Слева приведены диаграммы распределения
сигнала от антител, специфичных к Nrf2 (красный) и сигнала от красителя DAPI, специфичного
к ДНК (синие линии).
85
В)
Г)
Рисунок 3.21. (продолжение) Внутриклеточное распределение транскрипционного фактора
Nrf2 в макрофагах мыши (J774), предварительно (за 4 часа) обработанных ТС-13 в
концентрациях 20 мкМ (В) и 100 мкМ (Г). Слева приведены диаграммы распределения сигнала
от антител, специфичных к Nrf2 (красный) и сигнала от красителя DAPI, специфичного к ДНК
(синие линии).
86
Рисунок 3.22. Влияние ТС-13 на изменение ядерно-цитоплазматического соотношения
содержания Nrf2 в клетках J774. А – медианы значений и разбросы, Б – диаграмма рассеяния в
диапазоне концентраций ТС-13 от 0 до 20 мкМ (кружки – отдельные значения, сплошная линия
– линейная аппроксимация, пунктирная – 95% доверительный интервал, штрих-пунктирная –
95% интервал предсказания).
При использовании в качестве тест-системы фибробластов FLECH обнаружено, что 4часовая инкубация клеток с ТС-13 также сопровождается перераспределением Nrf2, однако в
этом случае преимущественное накопление Nrf2 в ядре происходило только при использовании
концентрации соединения 20 мкМ (рисунок 3.23В, 3.24).
Таким образом, полученные данные подтверждают предположение о наличии у фенольного
антиоксиданта ТС-13 способности активировать сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, что,
наиболее вероятно, является основой его цитопротекторного действия. Обнаруженная
индуцирующая активность носит универсальный характер, хотя для разных типов клеток
дозовая зависимость неоднозначна и наиболее явно проявляется в случае мононуклеарных
фагоцитов.
87
А)
Б)
Рисунок 3.23. Внутриклеточное распределение транскрипционного фактора Nrf2 в
интактных фибробластах легкого эмбриона человека (FLECH) (А) и фибробластах,
предварительно (за 4 часа) обработанных ТС-13 в концентрации 5 мкМ (Б). Слева приведены
диаграммы распределения сигнала от антител, специфичных к Nrf2 (красный) и сигнала от
красителя DAPI, специфичного к ДНК (синие линии).
88
В)
Г)
Рисунок 3.23 (продолжение). Внутриклеточное распределение транскрипционного фактора
Nrf2 в фибробластах легкого эмбриона человека (FLECH), предварительно (за 4 часа)
обработанных ТС-13 в концентрациях 20 мкМ (В) и 100 мкМ (Г). Слева приведены диаграммы
распределения сигнала от антител, специфичных к Nrf2 (красный) и сигнала от красителя DAPI,
специфичного к ДНК (синие линии).
89
Рисунок 3.24. Влияние ТС-13 на изменение ядерно-цитоплазматического соотношения
содержания Nrf2 в клетках FLECH.
3.5.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
острого системного асептического воспаления in vivo (модель 2)
Острое системное асептическое воспаление индуцировали внутривенным введением крысам
линии Вистар суспензии зимозана. Ранее было установлено, что внутривенное введение
зимозана, представляющего собой частицы инактивированных дрожжевых грибков (прежде
всего их клеточные стенки) и способного активировать фагоциты, в частности инициируя их
дыхательный взрыв, за счет взаимодействия с мембранным рецепторным аппаратом, в том
числе с рецепторами Toll-семейства (TLR2), а также (опосредованно) с рецепторами для белков
системы комплемента, приводит к развитию острой системной воспалительной реакции с
последующим формированием очагов хронического гранулематозного воспаления (введение
зимозановых гранул вызывает инфильтративные процессы в печени и легких, служащие
показателями развития воспалительной реакции [Маянский А.Н., Маянский Д.Н. 1989.]).
Выраженность зимозан-индуцированного воспаления в его острой фазе может быть оценена по
продукции активных форм кислорода лейкоцитами. При этом АКМ выполняют роль как
эффекторных молекул, так и внутриклеточных регуляторов биологических функций.
Внутривенное введение частиц зимозана на первоначальном этапе приводит к развитию
острого системного воспаления, в настоящей работе характеризовавшегося увеличением
количества циркулирующих в периферической крови гранулоцитов у животных как
контрольной, так и опытной группы (рисунок 3.25б), в то время как повышение общего
90
содержания лейкоцитов статистически значимого уровня достигало только на 2 сутки у крыс,
которые получали ТС-13 (рисунок 3.25а). При этом внутрижелудочное введение фенольного
антиоксиданта ТС-13 ускоряло снижение концентрации гранулоцитов в крови, которая на 3
сутки после индукции воспаления была ниже, чем у животных контрольной группы. Более того,
хотя назначение ТС-13 не влияло на величины показателей объемной плотности деструктивных
изменений (дистрофии и некроза), оно значимо (на 47 %) снижало объемную плотность
инфильтратов в печени животных (таблица 3.2), величина которой коррелировала с
содержанием в крови лейкоцитов (r = 0,67, p = 0,0498) и гранулоцитов (r = 0,73, p = 0,0245).
Рисунок 3.25. Влияние ТС-13 на количество лейкоцитов (а) и гранулоцитов (б)
периферической крови крыс в динамике острого системного воспалительного процесса.
Светлые прямоугольники – контроль, темные – ТС-13; # – p < 0,05 по сравнению с исходным
значением, принятым за 100%, * р < 0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 3.2
Влияние ТС-13 на морфологические изменения в печени крыс на 3 сутки после индукции
острого системного воспаления, Ме (Q1–Q3)
Параметры исследования
Объемная плотность (Vv)
воспалительных инфильтратов, %
Объемная плотность (Vv) гепатоцитов в
состоянии дистрофии, %
Объемная плотность (Vv) зон некроза, %
* р < 0,05 по сравнению с контролем.
Контроль (зимозан)
2,88 (2,33–3,58)
Опыт (зимозан + ТС-13)
1,96* (1,77–2,08)
85,53 (78,84–86,41)
88,39 (85,12–88,89)
2,46 (1,27–4,29)
3,04 (2,73–3,58)
Назначение фенольного антиоксиданта ТС-13 приводило к существенному снижению в
динамике острого системного воспаления спонтанной продукции АКМ гранулоцитами крови
(рисунок
3.26а,
3.26б)
и
способности
клеток
к
развитию
дыхательного
взрыва,
индуцированного корпускулярными (рисунок 3.26в) и растворимыми (рисунок 3.26г)
стимуляторами.
91
Рисунок 3.26. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (а, б) и
дыхательного взрыва (в, г) гранулоцитов периферической крови крыс, определяемой с
помощью хемилюминесценции (а, в) и проточной цитометрии (б, г), в динамике острого
системного воспалительного процесса. Светлые прямоугольники – контроль, темные – ТС-13;
* р < 0,05 по сравнению с контролем.
Таким образом, можно предположить, что эффект ТС-13 реализуется как непосредственно,
путем ингибирования генерации АКМ гранулоцитами, основными клетками-эффекторами
острого
воспаления,
так
и
в
результате
угнетения
провоспалительной
активности
моноцитов/макрофагов и их способности праймировать гранулоциты к развитию дыхательного
взрыва, что, в частности, подтверждается уменьшением образования мононуклеарных
инфильтратов в печени животных – характерного признака данной модели воспаления. Сегодня
накоплено много данных, показывающих, что праймирование гранулоцитов крови при
воспалительных процессах индуцируется комплексом цитокинов (TNF-, ИЛ-1 и др.).
Известно, что синтез провоспалительных цитокинов и молекул адгезии мононуклеарными
92
фагоцитами контролируется редокс-чувствительным фактором NF-B, активность которого
регулируется, в частности, Nrf2 (глава 1). Доказанная способность ТС-13 индуцировать систему
Keap1/Nrf2/ARE и наличие сильной обратной корреляции между транскрипционной
активностью NF-B и Nrf2 в мононуклеарных фагоцитах позволяет предположить, что
действие ТС-13 на циркулирующий пул гранулоцитов опосредовано снижением активности
в
NF-B
моноцитах
и
макрофагах,
что
сопровождается
ингибированием
синтеза
провоспалительных цитокинов, праймирующих нейтрофилы. Хотя в данном случае нельзя
исключать также прямое влияние ТС-13 на полиморфноядерные лейкоциты.
Известно, что основными ферментами дыхательного взрыва являются NADPH-оксидазы,
которые начинают продуцировать супероксидный радикал уже спустя секунды после активации
клеток. Механизмы активации этой группы ферментов (как быстрый, так и медленный)
опосредованы провоспалительными цитокинами, синтез которых, как отмечено выше,
находится под контролем фактора NF-κB. Таким образом, наблюдаемое снижение продукции
АКМ, в основном, указывает на NF-κB-регулирующую функцию системы Keap1/Nrf2/ARE.
Литературные
данные
подтверждают
полученные
результаты:
опубликованы
работы,
свидетельствующие об угнетении транскрипционного фактора NF-κB пропорционально
степени
индукции
Keap1/Nrf2/ARE
в
мононуклеарных
клетках
крови
человека
[Garbin U. et al., 2009]
На основании полученных данных можно заключить, что, по-видимому, индукция редоксчувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE оказывает противовоспалительный
эффект при остром системном воспалении в основном за счет влияния на NF-κB-индуцируемые
генерацию АКМ и способность моноцитов и макрофагов праймировать гранулоциты к
развитию дыхательного взрыва.
3.6.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
острого системного септического воспаления in vivo (модель 3)
Таким образом, нами были получены данные, однозначно свидетельствующие в пользу
наличия выраженного противовоспалительного эффекта индукции редокс-чувствительной
сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE, определяющегося преимущественно ингибированием
дыхательного взрыва лейкоцитов и связанного с активацией транскрипционного фактора Nrf2 и
с его тесным взаимодействием с транскрипционным фактором NF-κB. На основании этого было
предположено, что активация системы Keap1/Nrf2/ARE может оказывать протективное
действие и при летальном эндотоксиновом шоке, вызванном внутрибрюшинным введением
бактериального липополисахарида, ведущим звеном патогенеза которого является массовая
93
генерация АКМ, играющих роль провоспалительных медиаторов и приводящих к повреждению
собственных тканей с молниеносным формированием полиорганной недостаточности.
К концу первого часа после введения эндотоксина у животных развивались первые
клинические признаки септического шока. Субъективно это проявлялось резким торможением
двигательной активности (в отдельных случаях судорожными подергиваниями), одышкой,
обильной дефекацией в виде жидкого стула, потерей аппетита. Гибель животных начинали
регистрировать с 15 ч после инъекции LPS. Обнаружено, что смертность животных, однократно
получивших раствор ТС-13, была достоверно (p < 0,05) ниже, чем контрольных мышей
(рисунок 3.27).
Рисунок 3.27. Влияние приема раствора ТС-13 на выживаемость мышей после индукции
эндотоксинового шока.
LPS при попадании в организм распознается системой комплемента и антителами, что
приводит к его опсонизации и лизису. Фагоциты способны распознавать опсонизированный
LPS Fc-ресепторами и рецепторами комплемента [Frank M.M., Fries L.F., 1991] и
экспрессировать рецепторы распознающие бактериальный эндотоксин. Основное значение в
этом
процессе
имеют
[Moore R.N. et al.,1976].
LPS
мононуклеарные
-активированные
фагоциты:
моноциты
макрофаги
продуцируют
и
макрофаги
АКМ,
такие
микробицидные агенты как лизоцим и кислые гидролазы и медиаторы воспаления
[Van Amersfoort E.S. et al., 2003], среди которых ключевыми являются конститутивно
экспрессируемый TNF-α и синтезируемые сразу же после активации IL-1 и IL-6 (максимальный
уровень их мРНК достигается в клетке уже через 40 минут) [Van Amersfoort E.S. et al., 2003].
Таким образом, развивается системная воспалительная реакция, имитирующая септический
шок при генерализации инфекции, вызванной грамотрицательными бактериями. Избыточный
ответ приводит к аутодеструкции, полиорганной недостаточности и гибели хозяина, и важен не
94
только поиск способов угнетения избыточной реакции, но и анализ механизмов дизрегуляции
воспаления.
На основании полученных данных можно предположить, что индукция сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE водорастворимым фенольным антиоксидантом ТС-13 обладает выраженным
защитным
эффектом
в
отношении
септического
шока,
индуцированного
введением
бактериального эндотоксина, вероятнее всего, за счет снятия эффектов, опосредуемых редоксчувствительным транскрипционным фактором NF-κB [Kong et al., 2010; Wang H. et al.,2010] и
выраженности дыхательного взрыва фагоцитов [Thimmulappa R.K. et al., 2006]. Важно отметить
высокую скорость наступления данного эффекта.
Таким образом, учитывая результаты о способности ТС-13, а, значит, и системы
Keap1/Nrf2/ARE подавлять воспалительные процессы при каррагинан-индуцированном отеке
лапы, можно заключить, что редокс-чувствительная сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE
обладает выраженным протективным действием в отношении острых воспалительных
процессов in vivo, способствуя уменьшению продукции АКМ и выраженности окислительного
стресса при асептическом системном воспалении и септическом шоке, вызванном введением
бактериального
эндотоксина,
действуя,
в
том
числе,
через
угнетение
системы
провоспалительного редокс-чувствительного фактора NF-κB.
3.7.
Изучение способности фенольного антиоксиданта ТС-13 модулировать развитие
хронического воспаления
Роль редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE при хроническом
воспалении была рассмотрена на примере развития воспалительной реакции в различных
моделях артрита.
3.7.1. Обострение хронического воспаления (модель 4)
Для моделирования обострения хронического воспаления суставов широко используется
модель
"воздушного
мешка"
("air
pouch").
В
1980–1990-х
гг.
морфологическими
исследованиями было показано, что при разрушении тканей в результате подкожного введения
воздуха и последующей миграции и пролиферации макрофагов и фибробластов через 6–7 дней
формируется синовиально-подобная оболочка, достаточно точно имитирующая синовиальную
выстилку суставов [Edwards J.C. et al., 1981], а инъекция в эту модель суставной полости
инфламмогена сопровождается развитием острого воспаления [Martin S.W. et al., 1994],
характеризующегося
экссудацией
лейкоцитов
(в
первые
сутки
–
преимущественно
гранулоцитов).
В качестве модели обострения хронического воспаления сустава была выбрана модель
воздушного мешка, индуцируемая введением в сформированную воздушную полость у крыс
95
линии Вистар каррагинана, используемая для исследования ревматоидных заболеваний в связи
с наибольшей приближенностью выстилки образующейся полости к синовиальной ткани
[Sedgwick A.D. et al., 1985]. Детальное исследование формирующихся воздушных мешков в
течение 6 дней после начала введения воздуха свидетельствует о наличии поверхностной
популяции
клеток
гистохимические
соединительной
черты,
характерные
ткани,
для
демонстрирующей
смешанных
ультраструктурные
популяций,
наблюдаемых
и
в
синовиальных выстилках: при разрушении тканей в результате подкожного введения воздуха и
последующей миграции и пролиферации макрофагов и фибробластов через 6–7 дней
формируется синовиально-подобная оболочка, достаточно точно имитирующая синовиальную
выстилку суставов [Edwards, J.C. et al., 1981], а инъекция в эту модель суставной полости
инфламмогена сопровождается развитием острого воспаления [Martin S.W et al., 1994],
характеризующегося
экссудацией
лейкоцитов
(в
первые
сутки
–
преимущественно
гранулоцитов). Кроме того, данная модель позволяет оценить параметры, преимущественно
определяемые состоянием эндотелиального барьера в очаге воспаления и параметры,
характеризующие активность собственно клеток воспалительного экссудата.
При исследовании воспалительного экссудата, собранного из полости «воздушного мешка»
(его объема, состава и функциональной активности клеток) было показано, что индукция
системы
Keap1/Nrf2/ARE
фенольным
антиоксидантом
ТС-13
не
влияет
на
объем
воспалительной жидкости, содержание в ней белка и клеточных элементов (рисунок 3.28). В то
же время способность клеток воспалительного экссудата к генерации АКМ, как спонтанной, так
и при развитии дыхательного взрыва под действием корпускулярных (зимозан) и растворимых
(РМА) стимуляторов была статистически значимо ниже у животных, получавших накануне и
после введения инфламмогена раствор ТС-13, чем у контрольных (рисунок 3.29).
Рисунок 3.28. Влияние ТС-13 на объем экссудата (а), содержание в нем белка (б) и клеток (в)
при моделировании воспаления в "воздушном мешке". Светлые прямоугольники – контроль,
темные – ТС-13.
96
Рисунок 3.29. Влияние ТС-13 на интенсивность спонтанной генерации АКМ (1, левые оси
ординат) и дыхательного взрыва (2, правые оси ординат) клеток экссудата, определяемой с
помощью хемилюминесценции (а) и проточной цитофлуорометрии (б), при моделировании
воспаления в "воздушном мешке". Светлые прямоугольники – контроль, темные – ТС-13;
* р < 0,05 по сравнению с контролем.
Таким
образом,
проявления
воспалительной
реакции,
зависящие
от
состояния
эндотелиального барьера, оказались парадоксальным образом неизмененными, тогда как
функциональная активность лейкоцитов, мигрировавших в очаг воспаления, была закономерно
снижена. Полученные данные позволяют считать гранулоциты крови и, возможно,
праймирующие
фенольных
их
макрофаги
антиоксидантов,
основной
активирующих
мишенью
ARE.
противовоспалительного
Результаты
работы
действия
согласуются
с
приводимыми выше литературными данными, свидетельствующими об угнетении активности
ключевого провоспалительного транскрипционного фактора NF-B пропорционально степени
индукции Keap1/Nrf2/ARE в мононуклеарных клетках крови человека. Кроме того, показано,
что хронический гранулематоз  наследственное заболевание, обусловленное дефектом
NADPH-оксидазы и ее неспособностью синтезировать супероксид-анион (в том числе при
развитии дыхательного взрыва фагоцитами)  сопряжен с угнетением функционирования
сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE и с повышением активности провоспалительного
транскрипционного фактора NF-B [Rieber N. et al., 2012].
3.7.2. Неспецифическое аутоиммунное воспаление суставов (полиартрит; модель 5)
С
целью
оценки
способности
системы
Keap1/Nrf2/ARE
влиять
на
выраженность
неспецифического воспаления суставов лап самцов крыс Вистар и генерацию АКМ клеткамиэффекторами воспаления была использована модель ревматоидного артрита. Индуктор системы
ТС-13 вводили крысам опытной группы в день иммунизации, в последующем – через день.
97
Крысы контрольной группы получали дистиллированную воду. Визуальные стадии воспаления,
выделенные в настоящем исследовании и оценённые по 5-балльной системе, отражены на
рисунке 3.30.
0 баллов
1 балл
2 балла
3 балла
4 балла
Рисунок 3.30. Визуальные стадии воспаления суставов лап самцов крыс Вистар,
полученные в ходе эксперимента, оцененные по 5-бальной системе [Brand D.D. et al., 2007].
В динамике проведения эксперимента установлено, что ревматоидный артрит развился у
100 % животных. В соответствии с данными литературы, степень тяжести процесса
коррелировала с уменьшением прироста массы тела крыс, поскольку развитие данного
поражения сопряжено с многократным усилением синтеза и секреции TNF-α. Наиболее явной
эта взаимосвязь становилась к концу эксперимента, когда на 25 сутки после иммунизации
коэффициенты корреляции между приростом массы тела с одной стороны и увеличением
98
объема правой лапы и стадией воспаления – с другой составляли соответственно –0,89 и –0,67
(p < 0,05). Кроме того, обнаружена тесная взаимосвязь между выраженностью приростом
размеров обеих конечностей и стадией воспаления: r = 0,80 (p < 0,05).
Наиболее явные различия между крысами опытной и контрольной групп проявились на
начальных стадиях патологического процесса, когда на 15 и 18 сутки после иммунизации
показатель средней визуальной стадии воспаления на пораженную конечность был достоверно
ниже (p < 0,05) в опытной группе, чем в контрольной (рисунок 3.31).
Рисунок 3.31. Динамика изменения визуальных признаков воспаления в ходе развития
ревматоидного артрита у крыс, получавших раствор ТС-13 ( ) и воду ( ).
Достоверных различий между группами по приросту массы тела и объема пораженных лап
в динамике наблюдений не выявлено в силу больших разбросов показателей (таблица 3.3), хотя
величины медиан толщины конечностей у животных, получавших ТС-13, на 25 сутки
наблюдений были многократно меньше, чем в контроле. После забоя животных на 32–33-и
сутки развития артрита был проведен анализ влияния активации системы Keap1/Nrf2/ARE на
количество лейкоцитов крови, их процентный состав и способность генерировать АКМ (
на 32-е сутки развития ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном ii, крысы в
опыте и контроле не различались по содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови. не
выявлено достоверных различий и по определяемой хемилюминесцентными методами
99
способности лейкоцитов крови генерировать акм – как спонтанно, так и при развитии зимозанстимулированного дыхательного взрыва. в то же время обнаружено, что интенсивность
зимозан-стимулированного
хемилюминесцентного
ответа
гранулоцитов
крови
значимо
коррелирует как с увеличением объемов обеих задних конечностей, так и со стадией
воспаления (r = 0,64, r = 0,49 и r = 0,58 соответственно), что подтверждает праймированность
клеток в ходе развития артрита. при более детальном рассмотрении отдельных компонентов
акм-синтезирующей функции фагоцитов с помощью флуоресцентных методов можно видеть,
что
праймированность
моноцитов
к
наработке
перекиси
водорода
(dcf-зависимая
интенсивность флуоресценции моноцитов при стимуляции pma) у животных, получавших тс13, достоверно ниже, чем в контроле, а активация и праймированность нейтрофилов имеет
тенденцию к уменьшению (p = 0,062).
коллаген ii-индуцированный артрит является моделью полиартрита млекопитающих, при
котором включается как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы [moore a.r., 2003]. это
модель неспецифического аутоиммунного воспаления суставов, основанная на введении
гетерологичного
ревматоидного
коллагена,
артрита
имитирует
человека
и
клинические
широко
и
иммунологические
используется
в
признаки
настоящее
время
[brand d.d et al., 2007. hall s.w., cooke a., 2011].
таблица 3.4).
Таблица 3.3
Изменение массы тела и объема задних конечностей в ходе развития индуцированного
коллагеном II ревматоидного артрита у крыс, получавших раствор ТС-13 (опыт) и воду
(контроль), Me (Q1–Q3)
Группа
животных
Контроль
Опыт
Контроль
Опыт
Контроль
Опыт
Прирост массы тела, %
18 сутки
25 сутки
32 сутки
12,2 (9,5–13,6)
17,3 (11,5–22,8)
24,5 (19,0–31,1)
12,7 (10,8–16,7)
20,5 (8,8–26,9)
29,6 (16,9–31,3)
Прирост объёма правой задней лапы, %
18 сутки
25 сутки
32 сутки
5,3 (0,0–5,6)
26,7 (15,8–31,6)
26,7 (26,3–72,2)
5,9 (0,0–12,1)
5,0 (0,0–50,0)
11,8 (11,8–68,8)
Прирост объёма левой задней лапы, %
18 сутки
25 сутки
32 сутки
0,2 (0,0–3,5)
12,5 (12,5–31,6)
31,3 (26,3–42,1)
0,9 (0,0–6,7)
6,7 (5,3–55,6)
26,7 (20,0–77,8)
100
На 32-е сутки развития ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном II, крысы в
опыте и контроле не различались по содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови. Не
выявлено достоверных различий и по определяемой хемилюминесцентными методами
способности лейкоцитов крови генерировать АКМ – как спонтанно, так и при развитии
зимозан-стимулированного
дыхательного
взрыва.
В
то
же
время
обнаружено,
что
интенсивность зимозан-стимулированного хемилюминесцентного ответа гранулоцитов крови
значимо коррелирует как с увеличением объемов обеих задних конечностей, так и со стадией
воспаления (r = 0,64, r = 0,49 и r = 0,58 соответственно), что подтверждает праймированность
клеток в ходе развития артрита. При более детальном рассмотрении отдельных компонентов
АКМ-синтезирующей функции фагоцитов с помощью флуоресцентных методов можно видеть,
что
праймированность
моноцитов
к
наработке
перекиси
водорода
(DCF-зависимая
интенсивность флуоресценции моноцитов при стимуляции PMA) у животных, получавших ТС13, достоверно ниже, чем в контроле, а активация и праймированность нейтрофилов имеет
тенденцию к уменьшению (p = 0,062).
Коллаген II-индуцированный артрит является моделью полиартрита млекопитающих, при
котором включается как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы [Moore A.R., 2003].
Это модель неспецифического аутоиммунного воспаления суставов, основанная на введении
гетерологичного
ревматоидного
коллагена,
артрита
имитирует
человека
и
клинические
широко
и
иммунологические
используется
в
признаки
настоящее
время
[Brand D.D et al., 2007. Hall S.W., Cooke A., 2011].
Таблица 3.4
Содержание лейкоцитов крови и их функциональная активность на 32-й день развития
ревматоидного артрита, индуцированного коллагеном II, у крыс, получавших раствор ТС-13
(опыт) и воду (контроль), Me (Q1–Q3)
Показатель
Контроль
Опыт
Содержание лейкоцитов, 109/л
14,9 (11,7–18,4)
11,0 (8,4–14,2)
Содержание гранулоцитов, 109/л
2,70 (1,67–5,21)
2,82 (2,18–3,55)
спонтанной (суммарной), усл. ед.
270 (269–274)
208 (174–500)
зимозан-индуцированной (суммарной), усл. ед. х 105
1,47 (1,11–2,03)
1,18 (0,58–1,88)
зимозан-индуцированной (удельной), усл. ед. х 105
0,44 (0,43–0,68)
0,32 (0,28–0,58)
нейтрофилов с Е+, спонтанной
145 (144–218)
152 (122–285)
нейтрофилов с Е+, + PMA
314 (267–356)
234 (206–498)
моноцитов с Е+, спонтанной
133 (69–157)
78 (68–157)
Интенсивность хемилюминесценции:
Интенсивность флуоресценции, усл. ед:
101
моноцитов с Е+, + PMA
254 (144–319)
137 (106–296)
нейтрофилов с DCF, спонтанной
150 (147–154)
107 (80–135) †
нейтрофилов с DCF, + PMA
202 (175–261)
129 (98–156) †
моноцитов с DCF, спонтанной
105 (100–137)
87 (77–101)
моноцитов с DCF, + PMA
206 (191–268)
122 (111–157) *
Примечание: † – p = 0,062
На основании полученных данных можно сделать вывод, что на ранних стадиях развития
аутоиммунного полиартрита индукция Keap1/Nrf2/ARE оказывает защитное действие,
проявляющееся в снижении выраженности воспалительной реакции. На более поздних стадиях
противовоспалительный эффект активации редокс-чувствительной системы проявлялся в
снижении активности и праймированности к генерации АКМ нейтрофилов и, в большей
степени, моноцитов. Действительно, показано, что при моделировании ревматоидного артрита
применение соединений, активирующих сигнальный путь Keap1/Nrf2/ARE, способствует
уменьшению проявлений синовиита, синтеза и секреции цитокинов опосредованным через
повышение экспрессии гемоксигеназы-1, а также путем одновременного ингибирования
транскрипционного фактора NF-κB [Park S.Y. et al. 2010], то есть оказывая влияние лишь на
неиммунный компонент воспаления.
Полученные на этом этапе работы результаты позволяют предположить, что в отношении
хронических иммуноопосредованных воспалительных процессов флоголитическое действие
редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE выражено менее, чем при остром воспалении.
Так, в обоих случаях клинические признаки воспаления (отек, покраснение, миграция
гранулоцитов) практически не изменялись при активации ARE индуктором ТС-13, несколько
уменьшаясь лишь на начальных этапах. И даже выявленное снижение окислительного
метаболизма лейкоцитов, клеток-эффекторов и модуляторов воспаления, не могло существенно
повлиять
на
выраженность
процесса.
Действительно,
в
синовиоцитах
пациентов
с
ревматоидным артритом в суставах повышена экспрессия Nrf2, но это не может остановить
прогрессирование болезни [Maicas N. et al., 2011]. При этом у животных с выключенным геном
Nrf2 признаки заболевания выражены в большей степени, чем у животных дикого типа
[Wruck C.J. et al., 2011].
Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что в отношении
хронических
воспалительных
процессов,
когда
иммунный
компонент
становится
преобладающим, действие редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE менее
выражено,
чем
при
остром
воспалении.
Эффективное
угнетение
развития
острых
102
воспалительных реакций системой Keap1/Nrf2/ARE, развившейся в эволюции организмов очень
рано (аналоги Nrf2 присутствуют у таких родов беспозвоночных животных как Caenorhabditis и
Drosophila [Maher J, Yamamoto M., 2010], а значит, присутствовали у их последнего общего
предка) и выполнявшая функции антиоксидантной защиты в условиях окислительного стресса,
логически обоснованы взаимосвязью с древними неспецифическими механизмами развития
воспаления (как аварийно-приспособительной сосудисто-тканевой реакции на действие
патогена), включающих усиление продукции АКМ. Однако при развитии хронического
воспаления, при котором преобладающим является иммунный компонент, сигнальная система
Keap1/Nrf2/ARE, скорее всего, участвует в предупреждении заболевания, но при его развитии
активация системы не может в достаточной мере противодействовать специфическим
механизмам,
лежащим
в
основе
иммуноопосредованного воспаления.
эволюционно
более
молодых
механизмов
103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Поиск путей терапии воспалительных процессов, несмотря на историю исследований,
насчитывающую сотни лет, по сей день остаётся важной проблемой. Воспаление можно
описать как благотворный неспецифический ответ тканей на повреждения, который приводит, в
целом, к восстановлению нормальной структуры и функции. В рамках этой концепции
разрешение воспалительной реакции, как только она исполняет свои защитные и
проиммуногенные функции, становится важнейшим фактором, определяющим так называемый
парадокс воспаления. С одной стороны, воспаление необходимо для устранения тканевых
травм и поддержания гомеостаза. С другой же стороны, оно является ключевым участником в
подавляющем большинстве заболеваний человека. Опасен не воспалительный процесс как
таковой,
но
его
подавление
или
неразрешение,
приводящее
к
патологиям
[Valledor A.F. et al., 2010; Janssen W.J., Henson P.M., 2011]. Острое воспаление с разрешением
предотвращает развитие хронического воспаления, неразрешённое же является одной из
главных причин множества заболеваний, таких как атеросклероз, хроническая обструктивная
болезнь лёгких, ожирение, карцинома, рассеянный склероз, астма, синдром раздражённого
кишечника, ревматоидный артрит [Marks D.J.B. et al., 2006; Nathan C., Ding A., 2010].
Одним из важных компонентов комплексного лечения острого воспаления является
стабилизация
процессов
свободнорадикального
окисления,
которое
сопровождается
повреждением биологических мембран и внутриклеточных фракций и коррелирует с уровнем
аутоинтоксикации. Степень
активации
мембранодеструктивных
процессов
во
многом
определяет тяжесть течения заболевания и зависит от состояния антиоксидантной защиты
организма, поэтому в комплекс лечебных мероприятий рекомендуется включать антиоксиданты
[Чеснокова Н.П. и др., 2008].
Таким образом, является актуальным поиск средств, способствующих одновременно
разрешению воспалительного процесса и усилению антиоксидантной защиты организма. Более
того, в современных исследованиях всё больший акцент делается не на непосредственную
антирадикальную и антиоксидантную активность экзогенных соединений, призванных
нивелировать опасную гиперпродукцию АКМ, а на возможность мобилизации эндогенных
защитных антиоксидантных систем, то есть на скрининг препаратов, оказывающих непрямой
эффект – на регуляторные и сигнальные системы. Именно поэтому перспективной мишенью
для разработки противовоспалительных препаратов является сигнальная система антиоксидантреспонсивного элемента [Hybertson B.M. et al., 2011], занимающая особое место среди редоксчувствительных сигнальных систем, активирующихся в ответ на развитие окислительного
стресса, обязательное для любого воспалительного процесса. Система Keap1/Nrf2/ARE отвечает
за поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза и контролирует работу многих
редокс-чувствительных элементов, в том числе и транскрипционных факторов NF-κB и АР-1,
регулирующих
течение
воспалительного
процесса
[Hayes
J.D.
et
al.,
2010;
104
Wakabayashi N. et al., 2010] и являющихся одной из перспективных мишеней современного
подхода к терапии воспаления [Tabas I., Glass C.K., 2013]. На сегодняшний день описано 10
классов
различных
индукторов
системы
антиоксидант-респонсивного
элемента
[Xiao H. et al., 2006; Garbin U. et al., 2009]. Прежде всего это фенолы и хиноны, акцепторы
Михаэля,
серосодержащие
соединения
(изотиоцианаты,
1,2-дитиол-3-тионы,
алкилполисульфиды и др.), каротиноиды, селен-содержащие соединения, ионы тяжелых
металлов, гидроперекиси.
В настоящей работе исследован ряд структурно взаимосвязанных водорастворимых
фенольных соединений, в различной степени оказывающих, как показано в более ранних
работах [Зенков Н.К. и др., 2007], антиоксидантный эффект (за исключением незамещённого
метоксилированного фенола С-10), зависящий от наличия атома двухвалентной серы и степени
экранирования
ОН-группы.
Таким
образом,
это
группа
соединений,
одновременно
проявляющих антиоксидантные свойства и обладающих признаками сразу трёх классов
индукторов системы антиоксидант-респонсивного элемента (фенолы, акцепторы Михаэля,
серосодержащие соединения), что позволяет предполагать у них наличие ARE-индуцирующего
действия. Наиболее перспективным представителем этого ряда соединений является ТС-13,
проявляющий бифункциональное антиоксидантное действие, обусловленное наличием в параалкильном
заместителе
активной
серы:
липидный
пероксирадикал,
канонически
восстанавливаясь атомом водорода ОН-группы и превращаясь в липопероксид (RO 2 + InH 
ROOH + In), с участием этого же соединения восстанавливается до неактивного
гидроксилипида и не служит источником чрезвычайно реакционных алкоксильного и
гидроксильного радикалов (реакция Фентона). Кроме того, частичное экранирование ОНгруппы трет-бутильным заместителем увеличивает стабильность соединения при небольших
пространственных затруднениях: природных соединений аналогичного строения не существует
в связи с отсутствием в живых организмах трансфераз, способных переносить трет-бутильные
группы на бензольное кольцо [Зенков Н.К. и др., 2003].
Целью работы являлось исследование механизмов реализации противовоспалительной
активности данного ряда структурно взаимосвязанных новых синтетических водорастворимых
фенольных антиоксидантов в связи со способностью соединений индуцировать редоксчувствительную сигнальную систему антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE.
В ходе работы было установлено, что, за исключением селенсодержащего аналога, все
соединения представленного ряда структурно зависимых монофенольных серосодержащих
антиоксидантов обладают невысокой токсичностью, а ТС-13 в малых концентрациях способен
даже увеличивать жизнеспособность клеток как в нормальных условиях, так и при развитии
окислительного стресса за счёт ингибирования апоптоза.
105
Сравнительный анализ способности фенольных антиоксидантов представленного ряда
индуцировать синтез ARE-зависимых ферментов II фазы детоксикации ксенобиотиков и
антиоксидантных ферментов, оцененный на основе их влияния на активность GST и NQO1,
показал, что способность к активации данных энзимов у исследуемых соединений существенно
различается и зависит от их химической структуры. Наибольшим стимулирующим эффектом
обладал ТС-13, в то время как для соединений, отличающихся от него полным экранированием
функциональной
группы,
укороченным
на
одно
метиленовое
звено
пара-алкильным
заместителем, отсутствием бивалентного атома серы или заменой его на атом селена (II), была
характерна частичная (от умеренной до почти полной) потеря биологической активности. Эти
данные свидетельствуют о том, что для реализации биологической активности исследуемых
соединений важна степень экранирования ОН-группы и присутствие атома двухвалентной серы
в структуре пара-алкильного заместителя. Предположение об индукции именно синтеза
ферментов (т.е. экспрессии соответствующих генов) как механизма их активации основано на
свойстве большинства представленных фенолов полностью гидролизироваться в водных
растворах уже через сутки, что исключает возможность аллостерического влияния на сами
ферменты.
Способность
же
индуцировать
экспрессию
зависимых
от
антиоксидант-
респонсивного элемента генов антиоксидантами, структура которых отвечает критериям
индукторов ARE, косвенно подтверждает их активирующее влияние на сигнальную систему
Keap1/Nrf2/ARE, об этом же свидетельствует наличие тесной корреляции между NQO1- и GSTиндуцирующими способностями тестируемых соединений.
В результате проведённого с целью выявления соединения с наиболее выраженными
противовоспалительными
свойствами
скрининга
синтезированных
фенолов
в
модели
каррагинан-индуцированного отёка лап крыс линии Вистар обнаружено, что хотя практически
все тестируемые соединения обладают способностью оказывать достоверно значимый
противовоспалительный эффект, выраженность её зависит от химического строения
антиоксидантов:
у
соединений
с
укороченным
пара-алкильным
заместителем,
инактивированной функциональной группой или заменой активного атома серы на селен
способность ингибировать развитие отёка лапы практически отсутствовала. Очевидно, что
исследуемые соединения ингибируют лишь часть из множества процессов и реакций,
протекающих в ходе развития такого многокомпонентного процесса как воспаление. В то же
время многие из этих процессов находятся под контролем фактора NF-κB, провоспалительные
эффекты которого способна подавлять система Keap1/Nrf2/ARE, что позволяет предложить
способность синтезированных фенольных антиоксидантов индуцировать эту систему как
основу их противовоспалительного действия.
106
На основании полученных данных для дальнейшей работы был выбран частично
экранированный
тиосульфонат
ТС-13,
обладающий
максимально
выраженными
биологическими эффектами при умеренно выраженной токсичности.
Так как основным триггерным механизмом индукции системы Keap1/Nrf2/ARE является
сдвиг окислительно-восстановительного равновесия в биологических системах в сторону
прооксидантов, а наиболее адекватным показателем редокс-баланса служит соотношение
восстановленных и окисленных SH-групп в белках, напрямую зависящее от системы
глутатиона, было изучено влияние ТС-13 на эту систему. На данном этапе работы показано, что
ТС-13 способен оказывать дозозависимое стимулирующее действие на GR, проявляя при этом
характерный для многих индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE горметический эффект и
увеличивать содержание общего глутатиона в клетках (в основном за счёт его восстановленной
формы), тем самым формируя тенденцию к увеличению соотношения восстановленного и
окисленного глутатиона.
Все полученные в ходе исследования данные косвенно свидетельствовали о способности
фенольного
антиоксиданта
ТС-13
индуцировать
систему
антиоксидант-респонсивного
элемента, для подтверждения которой на основании данных о поэтапном механизме активации
Nrf2 была изучена способность ТС-13 инициировать ядерную транслокацию молекулы Nrf2,
являющуюся ключевым моментом активации системы Keap1/Nrf2/ARE. Было показано, что под
действием
ТС-13
происходит
перераспределение
внутриклеточного
пула
Nrf2
с
преимущественным накоплением его в ядре, эффект зависел от дозы. Полученные результаты,
таким образом, подтверждают предполагавшуюся способность фенольного антиоксиданта ТС13 индуцировать сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE, которая, наиболее вероятно, и является
основной его цитопротекторных свойств. Кроме того обнаруженная индуцирующая активность
носит универсальный характер, хотя для разных типов клеток дозовая зависимость
неоднозначна и наиболее явно проявляется в случае мононуклеарных фагоцитов.
Влияние индуцирующего систему Keap1/Nrf2/ARE действия ТС-13 на воспалительный
процесс было рассмотрено в нескольких модельных системах in vivo, помимо уже описанного
эффекта на острое локальное воспаление.
На модели зимозан-индуцированного острого системного асептического воспаления было
установлено, что индукция ARE замедляла повышение до статистически значимого уровня
общего содержания лейкоцитов в крови (которое в данной модели является основным
показателем развития острого системного воспаления) и способствовала ускорению снижения
концентрации гранулоцитов, которая уже на третьи сутки после индукции воспаления была
ниже, чем у животных контрольной группы. При этом, хотя индуцирующее действие ТС-13 не
влияло на показатели объёмной плотности таких деструктивных изменений как некроз и
дистрофия, оно способствовало значимому (на 47 %) снижению объёмной плотности
107
инфильтратов в печени животных. Кроме того, индукция антиоксидант-респонсивного
элемента фенольным антиоксидантом приводила к существенному снижению спонтанной
продукции АКМ гранулоцитами крови и способности клеток к развитию индуцированного как
корпускулярными (зимозан), так и растворимыми (РМА) стимуляторами дыхательного взрыва.
Таким образом, флоголитический эффект ТС-13 в отношении острого системного воспаления
реализуется как путём непосредственно подавления генерации АКМ гранулоцитами,
являющимися основными эффекторами острого воспаления, так и вследствие угнетения
провоспалительной активности макрофагов/моноцитов и их способности праймировать
гранулоциты к развитию дыхательного взрыва. Кроме того, доказанная способность ТС-13
индуцировать систему Keap1/Nrf2/ARE и наличие сильной обратной корреляции между
транскрипционной активностью NF-B и Nrf2 в мононуклеарных фагоцитах позволяет
предположить, что действие ТС-13 на циркулирующий пул гранулоцитов опосредовано
снижением активности NF-B в моноцитах и макрофагах, что сопровождается ингибированием
синтеза провоспалительных цитокинов, праймирующих нейтрофилы. Хотя в данном случае
исключать прямое влияние ТС-13 на полиморфноядерные лейкоциты также нельзя.
На основании полученных на предыдущем этапе работы результатов было высказано
предположение, что активация системы Keap1/Nrf2/ARE может оказывать протективное
действие и при липополисахарид-индуцированном летальном эндотоксиновом шоке, ведущим
звеном
патогенеза
которого
является
массовая
генерация
АКМ,
играющих
роль
провоспалительных медиаторов и приводящих к повреждению собственных тканей с
молниеносным формированием полиорганной недостаточности. Проведённое исследование
подтвердило предполагаемый эффект: смертность животных, получавших ТС-13, была
достоверно ниже, чем мышей контрольной группы. Вероятнее всего, индукция сигнальной
системы Keap1/Nrf2/ARE водорастворимым фенольным антиоксидантом ТС-13 обладает
выраженным защитным эффектом в отношении септического шока, индуцированного
введением бактериального эндотоксина за счет снятия эффектов, опосредуемых редоксчувствительным транскрипционным фактором NF-κB и выраженности дыхательного взрыва
фагоцитов. Важно отметить высокую скорость наступления эффекта.
Таким образом, учитывая полученные ранее данные о способности индуктора системы
антиоксидант-респонсивного элемента ТС-13 подавлять развитие каррагинан-индуцированного
отёка лапы, можно сделать вывод о выраженном протективном действии редоксчувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных
процессов
in
окислительного
vivo,
способствующем
стресса,
снижению
осуществляемом,
в
том
продукции
числе,
провоспалительного редокс-чувствительного фактора NF-κB.
АКМ
через
и
выраженности
угнетение
системы
108
Роль редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE при хроническом
воспалении была рассмотрена в двух модельных системах in vivo.
На модели обострения хронического воспаления ("air pouch", "воздушный мешок") было
установлено, что индукция системы Keap1/Nrf2/ARE фенольным антиоксидантом ТС-13 не
влияет на объем воспалительного экссудата, содержание в нём белка и клеточных элементов, но
статистически значимо снижает способность этих клеток к наработке АКМ, как спонтанной,
так и при развитии дыхательного взрыва под действием корпускулярных и растворимых
стимуляторов. Таким образом, функциональная активность лейкоцитов, мигрировавших в очаг
воспаления, была закономерно снижена, тогда как проявления воспалительной реакции,
зависящие от состояния эндотелиального барьера, оказались неизмененными, что позволяет
считать основной мишенью противовоспалительного действия фенольных антиоксидантов,
активирующих ARE, гранулоциты крови и, возможно, праймирующие их макрофаги.
С целью оценки способности системы Keap1/Nrf2/ARE влиять на выраженность
неспецифического воспаления суставов лап самцов крыс Вистар и генерацию АКМ клеткамиэффекторами воспаления была использована модель индуцированного гетерологичным
коллагеном ревматоидного артрита, степень тяжести которого коррелировала с уменьшением
прироста массы тела крыс, поскольку развитие данного поражения сопряжено с многократным
усилением синтеза и секреции TNF-α (наиболее явно эта зависимость проявилась ближе к
концу эксперимента). Кроме того, обнаружена тесная взаимосвязь между выраженностью
прироста размеров обеих конечностей и стадией воспаления. Наиболее явные различия между
крысами опытной и контрольной групп проявились на начальных стадиях патологического
процесса, когда на 15 и 18 сутки после иммунизации показатель средней визуальной стадии
воспаления на пораженную конечность был достоверно ниже в опытной группе, чем в
контрольной. На 32-е сутки эксперимента крысы в опыте и контроле не различались по
содержанию лейкоцитов и гранулоцитов крови, как не было различий и по способности
лейкоцитов генерировать АКМ. Но в то же время установлено, что интенсивность
дыхательного взрыва гранулоцитов крови значимо коррелирует как с увеличением объемов
обеих задних конечностей, так и со стадией воспаления, что подтверждает праймированность
клеток в ходе развития артрита. При детальном рассмотрении отдельных компонентов АКМсинтезирующей функции фагоцитов было установлено, что праймированность моноцитов к
наработке перекиси водорода у животных, получавших ТС-13, достоверно ниже, чем в
контроле, а активация и праймированность нейтрофилов имеет тенденцию к уменьшению.
На основании полученных данных можно заключить, что на ранних стадиях развития
аутоиммунного полиартрита индукция системы Keap1/Nrf2/ARE оказывает защитное действие,
проявляющееся в снижении выраженности воспалительной реакции. На более поздних стадиях
противовоспалительный эффект активации редокс-чувствительной системы проявлялся в
109
снижении активности и праймированности к генерации АКМ нейтрофилов и, в большей
степени, моноцитов.
Таким образом, в случае хронического воспаления клинические признаки воспаления (отек,
покраснение, миграция гранулоцитов) практически не изменялись при активации ARE
индуктором ТС-13, несколько уменьшаясь лишь на начальных этапах. И даже выявленное
снижение окислительного метаболизма лейкоцитов, клеток-эффекторов и модуляторов
воспаления, не влияет существенно на выраженность процесса.
Полученные данные свидетельствуют о выраженном флоголитическом действии редоксчувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE в отношении острых воспалительных процессов и её
участии только в предупреждении заболевания при развитии хронического воспаления, когда
иммунный компонент является преобладающим (рисунок 4.1).
Рисунок 4.1. Схематическое изображение механизмов реализации противовоспалительного
действия 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфоната натрия (ТС-13) через редоксчувствительную сигнальную систему Keap1/Nrf2/ARE.
110
ВЫВОДЫ
1.
Исследованные структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные
антиоксиданты обладают невысокой токсичностью (за исключением селенсодержащего
аналога СС-13) при тестировании в культурах моноцито/макрофагоподобных клеток
линии U937 in vitro, по степени увеличения токсичности располагаясь в ряд: ТС-13 > ТС12 > ТС-17 = С-13 > СС-13. Единственное соединение из протестированных, 3-(3'-третбутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), в низких концентрациях
(100 и 200 мкМ) увеличивает жизнеспособность клеток, что, очевидно, связано с его
способностью ингибировать апоптоз.
2.
Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты
обладают различной способностью активировать ферменты, контролируемые системой
антиоксидант-респонсивного элемента, выраженность эффекта в наибольшей степени
определяется
степенью
экранирования
фенольной
группы
и
наличием
атома
двухвалентной серы в пара-алкильном заместителе. Максимальную эффективность из
исследованных
соединений
проявляет
3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)
пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) в концентрации 20 мкМ, увеличивая активность
глутатион-S-трансфераз и NAD(P)H:хиноноксидоредуктазы 1 в 1,86 и 2,31 раза
соответственно.
3.
ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия) в моноцитарномакрофагальной клеточной культуре J774 и культуре фибробластов FLECH дозозависимо
(с максимальным эффектом при концентрации 20 мкМ) индуцирует транслокацию
молекулы Nrf2 в ядро, что служит прямым доказательством его участия в индукции
системы антиоксидант-респонсивного элемента.
4.
Структурно подобные синтетические водорастворимые фенольные антиоксиданты
оказывают противовоспалительное действие в отношении острого воспаления на модели
отека лапы. Максимальную дозозависимую активность из исследованных соединений
проявляет 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13), ED50 =
26 мг/кг массы. ТС-13 также эффективен в отношении проявлений острого системного
асептического воспаления и эндотоксинового шока при назначении в дозах 100 и 200
мг/кг массы тела животного соответственно. Очевидно, защитное действие ТС-13 в
отношении исследованных проявлений острых воспалительных процессов связано со
способностью соединения индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента.
111
5.
Протективный эффект индуктора системы антиоксидант-респонсивного элемента 3-(3'трет-бутил-4'-гидроксифенил)
пропилтиосульфоната
натрия
(ТС-13)
в
отношении
визуальных проявлений клинических признаков хронического воспаления (модели
"воздушного мешка" и коллаген-индуцированного артрита) менее выражен, чем при
остром воспалении, при этом применение этого соединения в дозе 100 мг/кг массы тела
сопровождалось снижением продукции активированных кислородных метаболитов
фагоцитирующими клетками.
6.
ТС-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия) может служить
перспективным средством дополнительной терапии состояний, связанных с избыточной
активацией фагоцитирующих клеток, за счет выраженной активности при острых
воспалительных процессах и высокой скорости наступления эффекта.
112
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Барабой В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений.– Киев:
Наук. думка, 1976.– 260 с.
Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы – две возможные
формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия. – 1998. –
№ 63(7). – C. 924–938.
Воробьeва Н.Ф., Спиридонов В.К., Никитенко Е.В. Морфологические особенности ткани
печени при повреждении капсаицин-чувствительных нейронов и индукции воспаления
формалином и зимозаном // Бюл. СО РАМН. – 2005. – № 3. – С. 91-95.
Гилинский М.А. Ассиметричный диметиларгинин: метаболизм, аргининовый парадокс,
патофизиология // Успех физиол. наук. – 2007. – Т. 38. – № 3. – С. 21-39.
Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Практические замечания по регистрации
хемилюминесценции фагоцитирующих клеток // Бюл. СО РАМН. – 1990. – № 2. – С. 72-77.
Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и
патофизиологический аспекты – МАИК, Москва, 2001. – 343 с.
Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Кадалинцева Н.В., Олейник А.С., Просенко А.Е.,
Гусаченко О.Н., Шкляева О.А., Вавилин В.А., Ляхович В.В. Антиоксидантные и
противовоспалтельные свойства новых водорастворимых серосодержащих фенольных
соединений // Биохимия. – 2007. – Т. 72. – № 6. – С. 790-798.
Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Ткачёв В.О. Некоторые принципы и механизмы редоксрегуляции // Кислород и антиоксиданты.– 2009.– № 1.– С. 3–64.
Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О. Редокс-чувствительная сигнальная система
Keap1/Nrf2/ARE как фармакологическая мишень // Биохимия – 2013. – Т. 78. - №1. –
С. 27-47.
Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. –
СПб.: Гиппократ, 1992.
Ланкин В.З. Тихазе А.К., Каминный А.И., Беленков Ю.Н., Антиоксиданты и
атеросклероз: Критический анализ проблемы и направление дальнейших исследований //
Патогенез. – 2004 – №1. – С. 71-86
Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным
состоянием организма // Биохимия. – 2007. – Т. 72. – № 8. – С. 995-1017.
Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активная защита при
окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент. Обзор. // Биохимия. –
2006. – Т. 71. – №9. – С. 1183-1198.
Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. – Новосибирск,
«Наука», 1983. – 256 с.
Маянский Д. Н., Урсов И. Г. Лекции по клинической патологии. — Новосибирск, 1997.
Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. – М.: Медицина, 1991. – 272 с.
Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении // Успехи соврем.
биологии. – 1997. – Е. 117. – №. 2. – С. 155-171.
Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный
стресс: патологические состояния и заболевания. – Новосибирск, 2008. – 284 с.
113
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Кандалинцева Н.В. Фенольные антиоксиданты в
биологии и медицине. Saarbrücken: LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. 496 с.
Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О., Зенков Н.К. Редокс-чувствительная сигнальная система
Nrf2/ARE и ее роль при воспалении // Молекулярная биология – 2010. – Т. 44. – № 2. – С. 1-17.
Перевозкина М., Сторожок Н.М., Никифоров Г.А. Взаимосвязь химической структуры и
ингибирующего действия стерически затрудненных фенолов группы ИХФАНов //
Биомед. химия. – 2005. – Т. 51. – № 4. – С. 413–423
Просенко А.Е., Клепикова С.Ю., Кандалинцева Н.В., Дюбченко О.И., Душкин М.И.,
Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Синтез и исследование антиоксидантных свойств новых
водорастворимых серосодержащих фенольных соединений // Бюл. СО РАМН.– 2001.–
№ 1.– С. 114–126.
Просенко А.Е., Терах Е.И., Кандалинцева Н.В., Пинко П.И., Горох Е.А., Толстиков Г.А.
Синтез и исследование антиокислительных свойств новых серосодержащих
производных пространственно-затрудненных фенолов // Журн. прикл. химии. - 2001. № 11(74). - С. 1839-1843.
Просенко А.Е. Полифункциональные серо-, азот-, фосфорсодержащие антиоксиданты на
основе алкилированных фенолов: синтез, свойства, перспективы применения: автореф.
дис. … докт. хим. наук.– Новосибирск, 2010.
Селен. Доклад 58 ВОЗ. – Женева 1989. – 270 с.
Сологуб Т.В., Романцов М.Г. Свободнорадикальные процессы и воспаление
(патогенетические, клинические и терапевтические аспекты): учеб. пос. для врачей /
Рос. академия естествознания. - М., 2010.
Ткачев В.О., Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Механизм работы сигнальной системы
Nrf2/Keap1/ARE // Биохимия – 2011. – Т. 76. – № 4. – С. 502-519.
Турпаев К.Т. Роль фактора транскрипции АР–1 в интеграции внутриклеточных
сигнальных систем // Молекуляр. биология. – 2006. – № 40. – С. 945–961.
Турпаев К. Т. Сигнальная система Keapl-Nrf2. Механизм регуляции и значение для
защиты клеток от токсического действия ксенобиотиков и электрофильных соединений.
Обзор // Биохимия. – 2013. – Т. 78. - №2. – С. 147-166.
Хабриев Р.У. (ред). Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ. – 2е изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство
«Медицина»», 2005. – 832 с.
Чеснокова Н.П. (ред.) Воспаление: этиология, патогенез, патогенетическое обоснование
принципов терапии. Учебно-методический комплекс по дисциплине «Общая патология»,
«Патология». – Издательство Саратовского медицинского университета, 2008. – 120 с.
Ahmad R., Raina D., Meyer C., Kharbanda S., Kufe D. Triterpenoid CDDO-Me blocks the NFkappaB pathway by direct inhibition of IKKbeta on Cys-179 // J Biol Chem. – 2006. –
№ 281(47). – Р. 35764–35769.
Alam J., Killeen, E., Gong P., Naquin R., Hu B., Stewart D., Ingelfinger J. R., Nath K. A.
Heme activates the heme oxygenase-1 gene in renal epithelial cells by stabilizing Nrf2 // Am J
Physiol Renal Physiol. – 2003. – № 284(4). – Р. 743–752.
Albakri Q. A., Stuehr D. J. Intracellular assembly of inducible NO synthase is limited by nitric
oxide-mediated changes in heme insertion and availability. J Biol Chem. – 1996. –
№ 271(10). – Р. 5414–5421.
114
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
Albina J. E., Caldwell M. D., Henry W. L., Mills C. D. Regulation of macrophage functions by
L-arginine // The Journal of Experimental Medicine. – 1989. – № 169(3). – Р. 1021–1029.
Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and
inhibition // Biochem. J. – 2001. – № 357(Pt 3). – P. 593-615.
Alloul N., Gorzalczany Y., Itan M., Sigal N., Pick E. Activation of the superoxide-generating
NADPH oxidase by chimeric proteins consisting of segments of the cytosolic component
p67(phox) and the small GTPase Rac1 // Biochemistry. – 2001. – № 40(48). – Р. 14557–14566.
Alvarez B., Radi R. Peroxynitrite reactivity with amino acids and proteins // Amino Acids. –
2003. – № 25(3-4). – P. 295-311.
Amersfoort E. S. Van, Berkel T. J. C. Van, Kuiper J. Receptors, Mediators, and Mechanisms
Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock // Clin Microbiol Rev. – 2003. – № 16(3). –
Р. 379–414.
Andrew P.J., Mayer B. Enzymatic function of nitric oxide synthases // Cardiovasc. Res. –
1999. – № 43(3). – P. 521-531.
Ansell P. J., Lo S.-C., Newton L. G., Espinosa-Nicholas C., Zhang D. D., Liu J.-H., Hannink
M., Lubahn D. B. Repression of cancer protective genes by 17beta-estradiol: ligand-dependent
interaction between human Nrf2 and estrogen receptor alpha // Mol Cell Endocrinol. – 2005. –
№ 243(1-2). – Р. 27–34.
Araujo J. A., Zhang M., Yin F. Heme oxygenase-1, oxidation, inflammation, and
atherosclerosis // Front Pharmacol. – 2012. – № 3. – Р. 119.
Babior B.M. NADPH-oxidase: an update // Blood. – 1999. – N. 93(5). – P. 1464-1476.
Bacon J. R., Plumb G. W., Howie A. F., Beckett G. J., Wang W., Bao Y. Dual action of
sulforaphane in the regulation of thioredoxin reductase and thioredoxin in human HepG2 and
Caco-2 cells // J Agric Food Chem. – 2007. – № 55(4). – Р. 1170–1176.
Baird L., Dinkova-Kostova A. T. The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway // Arch
Toxicol. – 2011. – № 85(4). – Р. 241–272.
Bakin A. V, Stourman N. V, Sekhar K. R., Rinehart C., Yan X., Meredith M. J., Arteaga C. L.,
Freeman M. L. Smad3-ATF3 signaling mediates TGF-beta suppression of genes encoding
Phase II detoxifying proteins // Free Rad Biol Med. – 2005. – № 38(3). – Р. 375–387.
Balazovich K. J., Almeida H. I., Boxer L. A. Recombinant human G-CSF and GM-CSF prime
human neutrophils for superoxide production through different signal transduction
mechanisms // J Lab Clin Med. – 1991. – № 118(6). – Р. 576–584.
Bánfi B., Molnar G., Maturana A., Steger K., Hegedus B., Demaurex N., Krause K.H.
A Ca(2-)-activated NADPH oxidase in testis, spleen, lymph nodes // J Biol Chem -2001. –
№ 276. – P. 37594–37601.
Bánfi B., Tirone F., Durussel I., Knisz J., Moskwa P., Molnar G.Z., Krause K.H., Cox J.A.
Mechanism of Ca2+-activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5) // J Biol Chem – 2004. –
№ 279. – P.18583–18591.
Banning A., Brigelius-Flohé R. NF-kappaB, Nrf2, and HO-1 interplay in redox-regulated
VCAM-1 expression // Antioxids Redox Signal. – 2005. – № 7(7-8). – Р. 889–899.
Barrett E.G., Johnston C., Oberdörster G., Finkelstein J.N. Silica-induced chemokine
expression in alveolar type II cells is mediated by TNF-alpha-induced oxidant stress // Am J
Physiol – 1999. – № 276(6 Pt 1). – Р.979–988.
115
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
Beda N.V., Nedospasov A.A. (NO-dependent modifications of nucleic acids) // Bioorg.
Khim. – 2007. – №. 33(2). – P. 195-228.
Bensasson R. V, Zoete V., Dinkova-Kostova A. T., Talalay P. Two-step mechanism of
induction of the gene expression of a prototypic cancer-protective enzyme by diphenols //
Chem Res Toxicol. – 2008. – № 21(4). – Р. 805–812.
Berry C.E., Hare J.M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: molecular
mechanisms and pathophysiological implications // J. Physiol. – 2004. – № 555(Pt 3). –
P. 589-606.
Kikuchi K, Nagano T, Hayakawa H, Hirata Y, Hirobe M. Real time measurement of nitric
oxide produced ex vivo by luminol-H2O2 chemiluminescence method // J. Biol. Chem. –
1993. – №. 268(31). – P. 23106-23110.
Bhabak K. P., Mugesh G. Functional mimics of glutathione peroxidase: bioinspired synthetic
antioxidants // Acc Chem Res. – 2010. – № 43(11). – Р. 1408–1419.
Bienert G.P., Moller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., Moller I.M., Schjoerring J.K.,
Jahn T.P. Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes //
J Biol Chem – 2007. – 282: 1183–1192.
Biswas M., Chan J.Y. Role of Nrf1 in antioxidant response element-mediated gene expression
and beyond // Toxicol Appl Pharmacol. – 2010. – № 244(1). – Р. 16–20.
Blake D.J., Singh A., Kombairaju P., Malhotra D., Mariani T. J., Tuder R. M., Gabrielson E.,
Biswal S. Deletion of Keap1 in the lung attenuates acute cigarette smoke-induced oxidative
stress and inflammation // Am J Respir Cell Mol Biol. – 2010. - № 42(5). – Р. 524–536.
Blake D.R., Allen R.E., Lunec J. Free radicals in biological systems--a review orientated to
inflammatory processes // Br Med Bull. – 1987. - № 43(2). – Р. 371–385.
Bloom D.A., Jaiswal A.K. Phosphorylation of Nrf2 at Ser40 by protein kinase C in response to
antioxidants leads to the release of Nrf2 from INrf2, but is not required for Nrf2
stabilization/accumulation in the nucleus and transcriptional activation of antioxidant response
element // J Biol Chem. – 2003.- № 278(45). – Р. 44675–44682.
Bloom, D., Dhakshinamoorthy S., Jaiswal A. K. Site-directed mutagenesis of cysteine to serine
in the DNA binding region of Nrf2 decreases its capacity to upregulate antioxidant response
element-mediated expression and antioxidant induction of NAD(P)H:quinone oxidoreductase1
gene // Oncogene. – 2002. - № 21(14). – Р. 2191–2200.
Bokoch G.M., Diebold B.A. Current molecular models for NADPH oxidase regulation by Rac
GTPase // Blood. – 2002. – №. 100(8). – P. 2692-2696.
Borregaard N. The respiratory burst of phagocytosis: biochemistry and subcellular
localization // Immunol. Lett. – 1985. – №. 11(3-4). – P. 165-171.
Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – № 72. –
P. 248-254.
Brand D. D., Latham K. A., Rosloniec E. F. Collagen-induced arthritis // Nat Protoc. – 2007. № 2(5). – Р. 1269–1275.
Brown S. L., Sekhar K. R., Rachakonda G., Sasi S., Freeman M. L. Activating transcription
factor 3 is a novel repressor of the nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2 (Nrf2)regulated stress pathway // Cancer Res. – 2008. - № 68(2). – Р. 364–368.
116
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
Brüne B., Dehne N., Grossmann N., Jung M., Namgaladze D., Schmid T., von Knethen A.,
Weigert A. Redox control of inflammation in macrophages // Antioxid Redox Signal. – 2013. № 19(6). – Р. 595–637.
Bulkley G.B. Evaluating oxidant or antioxidant status // Shock. – 1994. - № 1(4). – Р. 313–4.
Cassatella M.A., Bazzoni F., Flynn R.M., Dusi S., Trinchieri G., Rossi F. Molecular basis of
interferon-gamma and lipopolysaccharide enhancement of phagocyte respiratory burst
capability. Studies on the gene expression of several NADPH oxidase components. // J. Biol.
Chem. – 1990. – №. 265(33). – P. 20241-20246.
Cerutti P. A., Trump B. F. Inflammation and oxidative stress in carcinogenesis // Cancer
Cells. – 1991. - № 3(1). – Р. 1–7.
Chan K., Lu R., Chang J.C., Kan Y.W. NRF2, a member of the NFE2 family of transcription
factors, is not essential for murine erythropoiesis, growth, and development // Proc Natl Acad
Sci U S A. – 1996. - № 93(24). – Р. 13943–13948.
Chapple S.J., Siow R.C.M., Mann G.E. Crosstalk between Nrf2 and the proteasome:
therapeutic potential of Nrf2 inducers in vascular disease and aging // Int J Biochem Cell Biol. 2012. - № 44(8). – Р. 1315–1320.
Chen X.-L., Dodd G., Kunsch C. Sulforaphane inhibits TNF-alpha-induced activation of p38
MAP kinase and VCAM-1 and MCP-1 expression in endothelial cells // Inflamm Res. – 2009. № 58(8). – Р. 513–521.
Chen Z.J., Parent L., Maniatis T. Site-specific phosphorylation of IκBα by a novel
ubiquitination-dependent protein kinase activity // Cell. – 1996. - № 84(6). – Р. 853–862.
Cho H.-Y., Gladwell W., Wang X., Chorley B., Bell D., Reddy S.P., Kleeberger S.R. Nrf2regulated PPAR{gamma} expression is critical to protection against acute lung injury in mice //
Am J Respir Crit Care Med. – 2010. - № 182(2). – Р. 170–182.
Cho H.-Y., Kleeberger S.R. Nrf2 protects against airway disorders // Toxicol Appl Pharmacol.
– 2010. - № 244(1). – Р. 43–56.
Cho H.-Y., Reddy S.P., Debiase A., Yamamoto M., Kleeberger S.R. Gene expression profiling
of NRF2-mediated protection against oxidative injury // Free Rad Biol Med. – 2005. № 38(3). – Р. 325–343.
Cho H.-Y., Reddy S.P., Kleeberger S.R. Nrf2 defends the lung from oxidative stress //
Antioxids Redox Signal. – 2006. – № 8(1-2). – Р. 76–87.
Colasanti M., Persichini T., Menegazzi M., Mariotto S., Giordano E., Caldarera C.M.,
Sogos V., Lauro G.M., Suzuki H. Induction of nitric oxide synthase mRNA expression.
Suppression by exogenous nitric oxide // J. Biol. Chem. – 1995. – №. 270(45). –
P. 26731-26733.
Copple I.M., Lister A., Obeng A.D., Kitteringham N.R., Jenkins R.E., Layfield R., Foster B. J.,
Goldring C.E., Park B.K. Physical and functional interaction of sequestosome 1 with Keap1
regulates the Keap1-Nrf2 cell defense pathway // J Biol Chem. – 2010. - № 285(22). –
Р. 16782–16788.
Cross A.R., Jones O.T. Enzymic mechanisms of superoxide production // Biochim Biophys
Acta. – 1991. – № 1057(3). – Р. 281–98.
Cullinan S.B., Diehl J.A. PERK-dependent activation of Nrf2 contributes to redox homeostasis
and cell survival following endoplasmic reticulum stress // J Biol Chem. – 2004. - № 279(19). –
Р. 20108–20117.
117
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
Cullinan S.B., Zhang D., Hannink M., Arvisais E., Kaufman R.J., Diehl J.A. Nrf2 is a direct
PERK substrate and effector of PERK-dependent cell survival // Mol Cell Biol. – 2003. № 23(20). – Р. 7198–7209.
Cunha F.Q., Assreuy J., Moncada S., Liew F.Y. Phagocytosis and induction of nitric oxide
synthase in murine macrophages // Immunology. – 1993. – №. 79(3). – P. 408-411.
Curran R.D., Billiar T.R., Stuehr D.J., Hofmann K., Simmons R.L. Hepatocytes produce
nitrogen oxides from L-arginine in response to inflammatory products of Kupffer cells // J Exp
Med. – 1989.- № 170(5). – Р. 1769–1774
Curzio M. Interaction between neutrophils and 4-hydroxyalkenals and consequences on
neutrophil motility // Free Radic Res Commun. – 1988. - № 5(2). – Р. 55–66.
Curzio M., Esterbauer H., Poli G., Biasi F., Cecchini G., Di Mauro C., Cappello N.,
Dianzani M. U. Possible role of aldehydic lipid peroxidation products as chemoattractants // Int
J Tissue React. – 1987. - № 9(4). – Р. 295–306.
Dhakshinamoorthy S., Jaiswal A.K. c-Maf negatively regulates ARE-mediated detoxifying
enzyme genes expression and anti-oxidant induction // Oncogene. – 2002. - № 21(34). –
Р. 5301–5312.
Di Mauro C., Cavalli G., Amprimo M.C., Paradisi L., Scano G., Curzio M., Dianzani M.U.
Influence of 4-hydroxynonenal on chemiluminescence production by unstimulated and
opsonized zymosan-stimulated human neutrophils // Cell Biochem Funct. – 1990. - № 8(3). –
Р. 147–155.
Di Rosa M. Biological properties of carrageenan // J Pharm Pharmacol. – 1972. – № 24(2). –
Р. 89–102.
Di Rosa M., Giroud J. P., Willoughby D. A. Studies on the mediators of the acute inflammatory
response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine // J Pathol. – 1971. - №
104(1). – Р. 15–29.
Di Rosa M., Papadimitriou J.M., Willoughby D.A. A histopathological and pharmacological
analysis of the mode of action of nonsteroidal anti-inflammatory drugs // J Pathol. – 1971. - №
105(4). – Р. 239–256.
Dianzani C., Parrini M., Ferrara C., Fantozzi R. Effect of 4-hydroxynonenal on superoxide
anion production from primed human neutrophils // Cell Biochem Funct. – 1996. - № 14(3). –
Р. 193–200.
DiDonato J.A., Hayakawa M., Rothwarf D.M., Zandi E., Karin M.A cytokine-responsive
IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB // Nature. – 1997. - №
388(6642). – Р. 548–554.
Dinkova-Kostova A.T., Fahey J.W., Talalay P. Chemical structures of inducers of nicotinamide
quinone oxidoreductase 1 (NQO1) // Methods Enzymol. – 2004. - № 382. – Р. 423–448.
Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Cole R.N., Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y.,
Yamamoto M., Talalay P. Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensors
regulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens and oxidants // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 2002. - № 99(18). – Р. 11908–11913.
Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Wakabayashi N. Keap1, the sensor for electrophiles
and oxidants that regulates the phase 2 response, is a zinc metalloprotein // Biochemistry. –
2005. - № 44(18). – Р. 6889–6899.
118
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
Dinkova-Kostova A.T., Wang X.J. Induction of the Keap1/Nrf2/ARE pathway by oxidizable
diphenols // Chem Biol Interact – 2011. - № 192(1-2). – Р. 101–106.
Dive C, Gregory C.D., Phipps D.J., Evans D.L., Milner A.E., Wyllie A.H. Analysis and
discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow
cytometry // Biochim Biophys Acta. – 1992. – № 1133. – P. 275-285.
Edwards J.C., Sedgwick A.D., Willoughby D.A. The formation of a structure with the features
of synovial lining by subcutaneous injection of air: an in vivo tissue culture system //
J Pathol. – 1981. – № 134(2). – Р. 147–156.
Eggler A.L., Gay K.A., Mesecar A.D. Molecular mechanisms of natural products in
chemoprevention: induction of cytoprotective enzymes by Nrf2 // Mol Nutr Food Res. – 2008. № 52, Suppl 1. – Р. 84–94.
Eggler A.L., Liu G., Pezzuto J.M., van Breemen R.B., Mesecar A.D. Modifying specific
cysteines of the electrophile-sensing human Keap1 protein is insufficient to disrupt binding to
the Nrf2 domain Neh2// Proc Natl Acad Sci U S A. – 2005. - № 102(29). – Р. 10070–10075.
Eggler A.L., Small E., Hannink M., Mesecar A.D. Cul3-mediated Nrf2 ubiquitination and
antioxidant response element (ARE) activation are dependent on the partial molar volume at
position 151 of Keap1 // Biochem J. – 2009. – № 422(1). – Р. 171–180.
El Benna J., Ruedi J.M., Babior B.M. Cytosolyc guanine nucleotide-binding protein Rac2
operates in vivo as a component of the neutrophil burst oxidase. Transfer of Rac2 fnd the
cytosolic oxidase components p47phox and p67phox to the submembranous actin cytoskeleton
during oxidase activation // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269. – P. 6729-6734
Fantone J.C., Ward P.A. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocytedependent inflammatory reactions // Am J Pathol. – 2009. - № 107(3). – Р. 395–418
Field L.S., Furukawa Y., O’Halloran T.V, Culotta V.C. Factors controlling the uptake of yeast
copper/zinc superoxide dismutase into mitochondria // J Biol Chem. – 2003. - № 278(30). –
Р. 28052–28059.
Foresti R., Clark J.E., Green C.J., Motterlini R. Thiol compounds interact with nitric oxide in
regulating heme oxygenase-1 induction in endothelial cells. Involvement of superoxide and
peroxynitrite anions// J Biol Chem. – 1997. - № 272(29). – Р. 18411–18417.
Fourquet S., Guerois R., Biard D., Toledano M.B. Activation of NRF2 by nitrosative agents
and H2O2 involves KEAP1 disulfide formation // J Biol Chem. – 2010. - № 285(11). –
Р. 8463–8471.
Frank M.M., Fries L.F. The role of complement in inflammation and phagocytosis // Immunol
Today. – 1991. - № 12(9). – Р. 322–326.
Freeman B. Free radical chemistry of nitric oxide. Looking at the dark side // Chest. – 1994. –
№. 105(3 Suppl). – P. 79-84.
Freeman J.L., Lambeth J.D. NADPH oxidase activity is independent of p47phox in vitro // J.
Biol. Chem. – 1996. – №. 271(37). – P. 22578-22582.
Gaboury J.P., Niu X.F., Kubes P. Nitric oxide inhibits numerous features of mast cell-induced
inflammation // Circulation. – 1996. - № 93(2). – Р. 318–326.
Garbin U., Fratta Pasini A., Stranieri C., Cominacini M., Pasini A., Manfro S., Lugoboni F.,
Mozzini C., Guidi G., Faccini G., Cominacini L. Cigarette smoking blocks the protective
expression of Nrf2/ARE pathway in peripheral mononuclear cells of young heavy smokers
favouring inflammation // PloS One. – 2009. - № 4(12). –Р.e8225.
119
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
Garcia Leme J., Hamamura L., Leite M.P., Rocha e Silva M. Pharmacological analysis of the
acute inflammatory process induced in the rat’s paw by local injection of carrageenin and by
heating // Br J Pharmacol. – 1973. - № 48(1). – Р. 88–96.
Geiszt M., Lekstrom K., Brenner S., Hewitt S.M., Dana R., Malech H.L., Leto T.L. NAD(P)H
oxidase 1, a product of differentiated colon epithelial cells, can partially replace glycoprotein
91phox in the regulated production of superoxide by phagocytes // J Immunol – 2003. –
№ 171. – P.299–306.
Geiszt M., Leto T.L. The Nox family of NAD(P)H oxidases: host defense and beyond // J Biol
Chem – 2004. – № 279. – P.51715–51718.
Gladwin M.T., Ognibene F.P., Pannell L.K., Nichols J.S., Pease-Fye M.E., Shelhamer J.H.,
Schechter A.N. Relative role of heme nitrosylation and β-cysteine 93 nitrosation in the
transport and metabolism of nitric oxide by hemoglobin in the human circulation // Proc Natl
Acad Sci U S A – 2000. – № 97 – P.9943-9948.
Go Y.-M., Halvey P.J., Hansen J.M., Reed M., Pohl J., Jones D. P. Reactive aldehyde
modification of thioredoxin-1 activates early steps of inflammation and cell adhesion // Am J
Pathol. – 2007. - № 171(5). – Р. 1670–1681.
Gounder V.K., Arumugam S., Arozal W., Thandavarayan R. A., Pitchaimani V., Harima M.,
Suzuki K., Nomoto M., Watanabe K. Olmesartan protects against oxidative stress possibly
through the Nrf2 signaling pathway and inhibits inflammation in daunorubicin-induced
nephrotoxicity in rats // Int Immunopharmacol. – 2014. - № 18(2). – Р. 282–289.
Gow A.J., Stamler J.S. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under physiological
conditions // Nature. – 1998. – № 391(6663). – P. 169-173.
Gupta J.W., Kubin M., Hartman L., Cassatella M., Trinchieri G. Induction of expression of
genes encoding components of the respiratory burst oxidase during differentiation of human
myeloid cell lines induced by tumor necrosis factor and gamma-interferon. // Cancer Res. –
1992. – № 52(9). – P. 2530-2537.
Gupta J.W., Kubin M., Hartman L., Cassatella M., Trinchieri G. Induction of expression of
genes encoding components of the respiratory burst oxidase during differentiation of human
myeloid cell lines induced by tumor necrosis factor and gamma-interferon // Cancer Res. –
1992. - № 52(9). – Р. 2530–2537.
Gurusamy N., Malik G., Gorbunov N.V, Das D. K. Redox activation of Ref-1 potentiates cell
survival following myocardial ischemia reperfusion injury // Free Rad Biol Med. – 2007. № 43(3). – Р. 397–407.
Hall S.W., Cooke A. Autoimmunity and inflammation: murine models and translational
studies // Mamm Genome. – 2011. - № 22(7-8). – Р. 377–389.
Halliwell B., Gutteridje J.M.C. Free radicals in biology and medicine. – Oxford, Oxford
University Press, 1999.– 936 p.
Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosome: oxidants,
myeloperoxidase, and bacterial killing // Blood. – 1998. – №. 92(9). – P. 3007-3017.
Hancock R., Bertrand H. C., Tsujita T., Naz S., El-Bakry A., Laoruchupong J., Hayes J.D.,
Wells G. Peptide inhibitors of the Keap1-Nrf2 protein-protein interaction // Free Rad Biol
Med. – 2012. - № 52(2). – Р. 444–451.
120
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
Handy R.L., Moore P.K. Effects of selective inhibitors of neuronal nitric oxide synthase on
carrageenan-induced mechanical and thermal hyperalgesia // Neuropharmacology. – 1998. № 37(1). – Р. 37–43.
Hansen J.M., Watson W.H., Jones D.P. Compartmentation of Nrf-2 redox control: regulation of
cytoplasmic activation by glutathione and DNA binding by thioredoxin-1 // Toxicol Sci. –
2004. - № 82(1). – Р. 308–317.
Hayes J.D., McMahon M. Molecular basis for the contribution of the antioxidant responsive
element to cancer chemoprevention // Cancer Letters. – 2001. - № 174(2). – Р. 103–113.
Hayes,J.D., McMahon M. NRF2 and KEAP1 mutations: permanent activation of an adaptive
response in cancer // Trends Biochem Sci. – 2009. - № 34(4). – Р. 176–188.
Hayes J.D., McMahon M., Chowdhry S., Dinkova-Kostova A.T. Cancer chemoprevention
mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. // Antioxids Redox Signal. -2010. - №
13(11). – Р. 1713–1748.
He X., Chen M.G., Lin G.X., Ma Q. Arsenic induces NAD(P)H-quinone oxidoreductase I by
disrupting the Nrf2 x Keap1 x Cul3 complex and recruiting Nrf2 x Maf to the antioxidant
response element enhancer // J Biol Chem. -2006. - № 281(33). – Р. 23620–23631.
He X., Kan H., Cai L., Ma Q. Nrf2 is critical in defense against high glucose-induced oxidative
damage in cardiomyocytes // J Mol Cell Cardiol. – 2009. - № 46(1). – Р. 47–58.
He X., Ma Q. Critical cysteine residues of Kelch-like ECH-associated protein 1 in arsenic
sensing and suppression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 // J Pharmacol Exp
Ther. – 2010. - № 332(1). – Р. 66–75.
He X., Ma Q. NRF2 cysteine residues are critical for oxidant/electrophile-sensing, Kelch-like
ECH-associated protein-1-dependent ubiquitination-proteasomal degradation, and transcription
activation // Mol Pharmacol. – 2009. - № 76(6). – Р. 1265–1278.
Healy Z.R., Lee N.H., Gao X., Goldring M.B., Talalay P., Kensler T.W., Konstantopoulos K.
Divergent responses of chondrocytes and endothelial cells to shear stress: cross-talk among
COX-2, the phase 2 response, and apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2005. № 102(39). – Р. 14010–14015.
Heiss E., Herhaus C., Klimo K., Bartsch H., Gerhäuser C. Nuclear factor kappa B is a
molecular target for sulforaphane-mediated anti-inflammatory mechanisms // J Biol Chem. –
2001. - № 276(34). – Р. 32008–32015.
Herschman H.R. Prostaglandin synthase 2 // Biochim Biophys Acta. – 1996. - № 1299(1). –
Р. 125–140.
Hiramatsu K., Arimori S. Increased superoxide production by mononuclear cells of patients
with hypertriglyceridemia and diabetes // Diabetes. – 1996. - № 37(6). – Р. 832–837.
Hirota A., Kawachi Y., Itoh K., Nakamura Y., Xu X., Banno T., Takahashi T., Yamamoto M.,
Otsuka F. Ultraviolet A irradiation induces NF-E2-related factor 2 activation in dermal
fibroblasts: protective role in UVA-induced apoptosis // J Invest Dermatol. – 2005. № 124(4). – Р. 825–832.
Hirota K., Murata M., Sachi Y., Nakamura H., Takeuchi J., Mori K., Yodoi J. Distinct roles of
thioredoxin in the cytoplasm and in the nucleus. A two-step mechanism of redox regulation of
transcription factor NF-kappaB // J Biol Chem. – 1999. - № 274(39). – Р. 27891–27897.
Holland R., Fishbein J.C. Chemistry of the cysteine sensors in Kelch-like ECH-associated
protein 1 // Antioxids Redox Signal. – 2010. - № 13(11). – Р. 1749–1761.
121
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
Holtzclaw W.D., Dinkova-Kostova A.T., Talalay P. Protection against electrophile and
oxidative stress by induction of phase 2 genes: the quest for the elusive sensor that responds to
inducers // Adv Enzyme Regul. – 2004. - № 44. – Р. 335–367.
Hu R., Hebbar V., Kim B.-R., Chen C., Winnik B., Buckley B., Soteropoulos P., Tolias P.,
Hart R.P., Kong A.-N. In vivo pharmacokinetics and regulation of gene expression profiles by
isothiocyanate sulforaphane in the rat // J Pharmacol Exp Ther. – 2004. - № 310(1). – Р. 263–271.
Hur W., Gray N.S. Small molecule modulators of antioxidant response pathway // Curr Opin
Chem Biol. – 2011. - № 15(1). – Р. 162–173.
Hybertson B.M., Gao B., Bose S. K., McCord J.M. Oxidative stress in health and disease: the
therapeutic potential of Nrf2 activation // Mol Aspects Med. – 2011. - № 32(4-6). – Р. 234–246.
Hyun J., Komori Y., Chaudhuri G., Ignarro L.J., Fukuto J.M. The protective effect of
tetrahydrobiopterin on the nitric oxide-mediated inhibition of purified nitric oxide synthase //
Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1995. – №. 206(1). – P. 380-386.
Im J.-Y., Lee K.-W., Woo J.-M., Junn E., Mouradian M.M. DJ-1 induces thioredoxin 1
expression through the Nrf2 pathway // Hum Mol Genet. – 2012. - № 21(13). – Р. 3013–24.
Imhoff B.R., Hansen J.M. Extracellular redox status regulates Nrf2 activation through
mitochondrial reactive oxygen species // Biochem J. – 2009.- № 424(3). – Р. 491–500.
Imhoff B.R., Hansen J.M. Tert-butylhydroquinone induces mitochondrial oxidative stress
causing Nrf2 activation // Cell Biol Toxicol. – 2010. - № 26(6). – Р. 541–551.
Imlay J.A., Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity // Science. – 1988. № 240(4857). – Р. 1302–1309.
Immenschuh S., Tan M., Ramadori G. Nitric oxide mediates the lipopolysaccharide dependent
upregulation of the heme oxygenase-1 gene expression in cultured rat Kupffer cells // Journal
of Hepatology. – 1999. - № 30(1). – Р. 61–69.
Inoue S., Kawanishi S. Oxidative DNA damage induced by simultaneous generation of nitric
oxide and superoxide // FEBS Lett. – 1995. – № 371(1). – P. 86-88.
Inoue S., Kawanishi S. Oxidative DNA damage induced by simultaneous generation of nitric
oxide and superoxide // FEBS Lett. – 1995. – № 371(1). – P. 86-88.
Ishii T., Itoh K., Takahashi S., Sato H., Yanagawa T., Katoh Y., Bannai S., Yamamoto M.
Transcription factor Nrf2 coordinately regulates a group of oxidative stress-inducible genes in
macrophages // J Biol Chem. – 2000. - № 275(21). – Р. 16023–16029.
Ishikawa M., Numazawa S., Yoshida T. Redox regulation of the transcriptional repressor
Bach1 // Free Rad Biol Med. – 2005. - № 38(10). –Р. 1344–1352.
Iskander K., Li J., Han S., Zheng B., Jaiswal A. K. NQO1 and NQO2 regulation of humoral
immunity and autoimmunity // J Biol Chem. – 2006. - № 281(41). Р. 30917–30924.
Itoh K., Mochizuki M., Ishii Y., Ishii T., Shibata T., Kawamoto Y., Kelly V., Sekizawa K.,
Yamamoto M. Transcription factor Nrf2 regulates inflammation by mediating the effect of 15deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin j(2) // Mol Cell Biol. – 2004. - № 24(1). – Р. 36–45.
Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii T., O’Connor T., Yamamoto M. Keap1 regulates both
cytoplasmic-nuclear shuttling and degradation of Nrf2 in response to electrophiles // Genes
Cells. – 2003. - № 8(4). – Р. 379–391.
Jain A.K., Bloom D.A., Jaiswal A.K. Nuclear import and export signals in control of Nrf2 // J
Biol Chem. – 2005. - № 280(32). –Р. 29158–29168.
122
163.
164.
165.
166.
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
Jain A.K., Mahajan S., Jaiswal A.K. Phosphorylation and dephosphorylation of tyrosine 141
regulate stability and degradation of INrf2: a novel mechanism in Nrf2 activation // J Biol
Chem. – 2008. - № 283(25). – Р. 17712–17720.
Janssen W.J., Henson P.M. Cellular Regulation of the Inflammatory Response // Toxicol
Pathol. – 2011. - № 40(2). – Р. 166–173.
Jun C.-D., Kim Y., Choi E.-Y., Kim M., Park B., Youn B., Choi S.-C., Lee M.-S., Park K.-I.,
Choi M., Chung Y.,Oh J. Gliotoxin reduces the severity of trinitrobenzene sulfonic acidinduced colitis in mice: evidence of the connection between heme oxygenase-1 and the nuclear
factor-kappaB pathway in vitro and in vivo // Inflamm Bowel Dis. – 2006. - № 12(7). –
Р. 619–629.
Kabe Y., Ando K., Hirao S., Yoshida M., Handa H. Redox regulation of NF-kappaB activation:
distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus // Antioxids Redox Signal. –
2005. - № 7(3-4). – Р. 395–403.
Kang H.J., Hong Y.B., Kim H.J., Bae I. CR6-interacting factor 1 (CRIF1) regulates NF-E2related factor 2 (NRF2) protein stability by proteasome-mediated degradation // J Biol Chem. –
2010. - № 285(28). – Р. 21258–21268.
Kang M.-I., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.-G., Yamamoto M. Scaffolding of Keap1
to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective
phase 2 genes // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. - № 101(7). – Р. 2046–2051.
Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C., Tsolas O., Papamarcaki T. Prothymosin alpha interacts
with the CREB-binding protein and potentiates transcription // EMBO Reports. – 2002. № 3(4). – Р. 361–366.
Karetsou Z., Martic G., Tavoulari S., Christoforidis S., Wilm M., Gruss C., Papamarcaki T.
Prothymosin alpha associates with the oncoprotein SET and is involved in chromatin
decondensation // FEBS Letters. – 2004. - № 577(3). – Р. 496–500.
Karetsou Z., Sandaltzopoulos R., Frangou-Lazaridis M., Lai C.Y., Tsolas O., Becker P.B.,
Papamarcaki, T. Prothymosin alpha modulates the interaction of histone H1 with chromatin //
Nucleic Acids Res. – 1998. - № 26(13). – Р. 3111–3118.
Karlsson A., Dahlgren C. Assembly and activation of the neutrophil NADPH oxidase in
granule membranes // Antioxid. Redox. Signal. – 2002. – № 4(1). – P. 49-60.
Karuri A. R., Huang Y., Bodreddigari S., Sutter C.H., Roebuck B.D., Kensler T.W., Sutter T.R.
3H-1,2-dithiole-3-thione targets nuclear factor kappaB to block expression of inducible nitricoxide synthase, prevents hypotension, and improves survival in endotoxemic rats //
J Pharmacol Exp Ther. – 2006. - № 317(1). – Р. 61–67.
Kasai K., Hattori Y., Nakanishi N., Manaka K., Banba N., Motohashi S., Shimoda S.
Regulation of inducible nitric oxide production by cytokines in human thyrocytes in culture //
Endocrinology. – 1995. - № 136(10). – Р. 4261–4270.
Kaspar J.W., Jaiswal A.K. An autoregulatory loop between Nrf2 and Cul3-Rbx1 controls their
cellular abundance // J Biol Chem. - 2010a. - № 285(28). – Р. 21349–21358.
Kaspar J.W., Jaiswal A.K. Antioxidant-induced phosphorylation of tyrosine 486 leads to rapid
nuclear export of Bach1 that allows Nrf2 to bind to the antioxidant response element and
activate defensive gene expression // J Biol Chem. - 2010b. - № 285(1). – Р. 153–162.
Kaspar J.W., Jaiswal A.K. Tyrosine phosphorylation controls nuclear export of Fyn, allowing Nrf2
activation of cytoprotective gene expression // FASEB J. – 2011. - № 25(3). – Р. 1076–1087.
123
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
189.
190.
191.
192.
193.
Kaspar J.W., Niture S. K., Jaiswal A.K. Antioxidant-induced INrf2 (Keap1) tyrosine 85
phosphorylation controls the nuclear export and degradation of the INrf2-Cul3-Rbx1 complex to
allow normal Nrf2 activation and repression // J Cell Sci. – 2012. - № 125(4). – Р. 1027–1038.
Kaur H., Hughes M.N., Green C.J., Naughton P., Foresti R., Motterlini R. Interaction of bilirubin
and biliverdin with reactive nitrogen species // FEBS Letters. – 2003. - № 543(1-3). – Р. 113–9.
Kensler T.W., Wakabayashi N. Nrf2: friend or foe for chemoprevention? // Carcinogenesis. –
2010. - № 31(1). – Р. 90–99.
Khan H., Cino E.A., Brickenden A., Fan J., Yang D., Choy W.-Y. Fuzzy Complex Formation
between the Intrinsically Disordered Prothymosin α and the Kelch Domain of Keap1 Involved
in the Oxidative Stress Response // J Mol Biol. – 2013. - № 425(6). – Р. 1011–1027.
Kim H.P., Ryter S.W., Choi A.M.K. CO as a cellular signaling molecule // Annual Review of
Pharmacology and Toxicology. – 2006. - № 46. Р. 411–449.
Kim J., Cha Y.-N., Surh Y.-J. A protective role of nuclear factor-erythroid 2-related factor-2
(Nrf2) in inflammatory disorder //. Mutation Research. – 2010. - № 690(1-2). – Р. 12–23.
Kim Y.-C., Yamaguchi Y., Kondo N., Masutani H., Yodoi J. Thioredoxin-dependent redox
regulation of the antioxidant responsive element (ARE) in electrophile response // Oncogene. –
2003. - № 22(12). – Р. 1860–1865.
Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: friend and foe // J. Leukoc. Biol. – 2005. – № 77(5). – P. 598-625.
Klebanoff S.J. Reactive nitrogen intermediates and antimicrobial activity: role of nitrite // Free
Rad Biol Med. – 1993. - № 14(4). – Р. 351–360.
Kobayashi A., Kang M.-I., Okawa H., Ohtsuji M., Zenke Y., Chiba T., Chiba T.,
Igarashi K.,Yamamoto M. Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2 // Mol Cell Biol. – 2004. № 24(16). – Р. 7130–7139.
Kobayashi A., Kang M.-I., Watai Y., Tong K. I., Shibata T., Uchida K., Yamamoto M.
Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of ubiquitination activity
of Keap1 // Mol Cell Biol. - 2006. - № 26(1). – Р. 221–229.
Koh K., Cha Y., Kim S., Kim J. tBHQ inhibits LPS-induced microglial activation via Nrf2mediated suppression of p38 phosphorylation // Biochem Biophys Res Commun. – 2009. № 380(3) – Р. 449–453.
Kong X., Thimmulappa R., Kombairaj P., Biswal,S. NADPH oxidase-dependent reactive
oxygen species mediate amplified TLR4 signaling and sepsis-induced mortality in Nrf2deficient mice // J Immunol. – 2010. -№ 185(1). – Р. 569–577.
Kuga S., Otsuka T., Niiro H., Nunoi H., Nemoto Y., Nakano T., Ogo T., Umei T., Niho Y.
Suppression of superoxide anion production by interleukin-10 is accompanied by a
downregulation of the genes for subunit proteins of NADPH oxidase. // ExP. Hematol. –
1996. – № 24(2). – P. 151-157.
Kundu J.K., Surh Y.-J. Nrf2-Keap1 signaling as a potential target for chemoprevention of
inflammation-associated carcinogenesis // Pharm Res. – 2010. - № 27(6). – Р. 999–1013.
Kupper R.W., Dewald B., Jakobs K.H., Baggiolini M., Gierschik P. G-protein activation by
interleukin 8 and related cytokines in human neutrophil plasma membranes // Biochem J. –
1992. - № 282. – Р. 429–434.
124
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
206.
207.
208.
209.
Kwak M.-K., Itoh K., Yamamoto M., Kensler T.W. Enhanced expression of the transcription
factor Nrf2 by cancer chemopreventive agents: role of antioxidant response element-like
sequences in the nrf2 promoter // Mol Cell Biol. – 2002. - № 22(9). – Р. 2883–2892.
Kwak M.-K., Wakabayashi N., Greenlaw J.L., Yamamoto M., Kensler T.W. Antioxidants
enhance mammalian proteasome expression through the Keap1-Nrf2 signaling pathway // Mol
Cell Biol. – 2003. -№ 23. – Р. 8786–8794.
Lambeth J.D. NOX enzymes and the biology of reactive oxygen // Nat. Rev. Immunol. –
2004. – № 4. – P.181-189
Lau A., Villeneuve N.F., Sun Z., Wong P.K., Zhang D.D. Dual roles of Nrf2 in cancer. //
Pharmacol Res. – 2008. - № 58(5-6). – Р. 262–270.
Lau A., Wang X.-J., Zhao F., Villeneuve N.F., Wu T., Jiang T., Sun Z., White E., Zhang D.D.
A noncanonical mechanism of Nrf2 activation by autophagy deficiency: direct interaction
between Keap1 and p62 // Mol Cell Biol. – 2010. - № 30(13). – Р. 3275–3285.
Lee C., Park G.H., Jang J.-H. Cellular antioxidant adaptive survival response to 6hydroxydopamine-induced nitrosative cell death in C6 glioma cells // Toxicology. – 2011. № 283(2-3). – Р. 118–128.
Lee J.-M., Chan K., Kan Y. W., Johnson J.A.. Targeted disruption of Nrf2 causes regenerative
immune-mediated hemolytic anemia // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. - № 101(26). –
Р. 9751–9756.
Lee O.-H., Jain A.K., Papusha V., Jaiswal A.K. An auto-regulatory loop between stress sensors
INrf2 and Nrf2 controls their cellular abundance // J Biol Chem. – 2007. - № 282(50). –
Р. 36412–36420.
Lee T.-S., Chau L.-Y. Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of interleukin10 in mice // Nat Med. – 2002. - № 8(3). – Р. 240–246.
Lee Y.-J., Jeong H.-Y., Kim Y.-B., Lee Y.-J., Won S. Y., Shim J.-H., Cho M.-K., Nam H.-S.,
Lee S.-H. Reactive oxygen species and PI3K/Akt signaling play key roles in the induction of
Nrf2-driven heme oxygenase-1 expression in sulforaphane-treated human mesothelioma
MSTO-211H cells // Food Chem Toxicol. – 2012. - № 50(2). – Р. 116–123.
Lekstrom-Himes J.A., Gallin J.I. Immunodeficiency diseases caused by defects in phagocytes //
N. Engl. J. Med. – 2000. – № 343(23). – P. 1703-1714.
Li J., Lee J.-M., Johnson J.A. Microarray analysis reveals an antioxidant responsive elementdriven gene set involved in conferring protection from an oxidative stress-induced apoptosis in
IMR-32 cells // J Biol Chem. - № 277(1). – Р. 388–394.
Li W., Khor T. O., Xu C., Shen G., Jeong W.-S., Yu S., Kong A.-N. Activation of Nrf2antioxidant signaling attenuates NFkappaB-inflammatory response and elicits apoptosis //
Biochem Pharmacol. – 2008. - № 76(11). – Р. 1485–1489.
Li W., Kong A.-N. Molecular mechanisms of Nrf2-mediated antioxidant response // Mol
Carcinog. – 2009. - № 48(2). – Р. 91–104.
Li W., Thakor N., Xu E.Y., Huang Y., Chen C., Yu R., Holcik M., Kong A.-N. An internal
ribosomal entry site mediates redox-sensitive translation of Nrf2 // Nucleic Acids Res. – 2010. № 38(3). – Р. 778–788.
Li W., Yu S., Liu T., Kim J.-H., Blank V., Li H., Kong A.-N. Heterodimerization with small
Maf proteins enhances nuclear retention of Nrf2 via masking the NESzip motif // Biochim
Biophys Acta. - № 1783(10). – Р. 1847–1856.
125
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
217.
218.
219.
220.
221.
222.
223.
224.
225.
226.
Li W., Yu S.-W., Kong A.-N. Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclear exporting signal in the
Neh5 transactivation domain // J Biol Chem. – 2006. - № 281(37). – Р. 27251–27263.
Lin W., Wu R.T., Wu T., Khor T.-O., Wang H., Kong A.-N Sulforaphane suppressed LPSinduced inflammation in mouse peritoneal macrophages through Nrf2 dependent pathway //
Biochem Pharmacol. – 2008. - № 76(8). – Р. 967–973.
Liu G.-H., Qu J., Shen X. NF-kappaB/p65 antagonizes Nrf2-ARE pathway by depriving CBP
from Nrf2 and facilitating recruitment of HDAC3 to MafK // Biochim Biophys Acta. – 2008. № 1783(5). –Р. 713–727.
Liu H., Dinkova-Kostova A.T., Talalay P. Coordinate regulation of enzyme markers for
inflammation and for protection against oxidants and electrophiles // Proc Natl Acad Sci
USA. – 2008. - № 105(41). – Р. 15926–15931.
Liu Y.-C., Hsieh C.-W., Wu C.-C., Wung B.-S. Chalcone inhibits the activation of NF-κB and
STAT3 in endothelial cells via endogenous electrophile // Life Sci. – 2007. - № 80(15). –
Р. 1420–1430.
Lo S.-C., Hannink M. PGAM5 tethers a ternary complex containing Keap1 and Nrf2 to
mitochondria // Exp Cell Res. – 2008. - № 314(8). – Р. 1789–1803.
Loesch A., Belai A., Burnstock G. Ultrastructural localization of NADPH-diaphorase and
colocalization of nitric oxide synthase in endothelial cells of the rabbit aorta // Cell. Tissue
Res. – 1993. – № 274(3). – P. 539-545.
Lowenstein C.J., Padalko E. iNOS (NOS2) at a glance // J. Cell. Sci. – 2004. – № 117(Pt 14). –
P. 2865-2867.
Lukosz M., Jakob S., Büchner N., Zschauer T.-C., Altschmied J., Haendeler J. Nuclear redox
signaling // Antioxid Redox Signal. – 2010. - № 12(6). – Р. 713–742.
Luo Y., Eggler A.L., Liu D., Liu G., Mesecar A. D., van Breemen R.B. Sites of alkylation of
human Keap1 by natural chemoprevention agents // J Am Soc Mass Spectrom. – 2007. № 18(12). – Р. 2226–2232.
Lynch R.E., Fridovich I. Permeation of the erythrocyte stroma by superoxide radical // J.Biol.
Chem. – 1978. – №.253 – P.4697-4699.
Ma Q., Battelli L., Hubbs A. F. Multiorgan autoimmune inflammation, enhanced
lymphoproliferation, and impaired homeostasis of reactive oxygen species in mice lacking the
antioxidant-activated transcription factor Nrf2 // Am J Pathol. – 2006. - № 168(6). – Р. 1960–1974.
Ma Q., Kinneer K. Chemoprotection by phenolic antioxidants. Inhibition of tumor necrosis
factor alpha induction in macrophages // J Biol Chem. – 2002. – № 277(4). – Р. 2477–2484.
MacKenzie E.L., Ray P.D., Tsuji Y. Role and regulation of ferritin H in rotenone-mediated
mitochondrial oxidative stress // Free Rad Biol Med. – 2008. - № 44(9). – Р. 1762–1771.
MacLeod A.K., McMahon M., Plummer S.M., Higgins L.G., Penning T.M., Igarashi K.,
Hayes J.D. Characterization of the cancer chemopreventive NRF2-dependent gene battery in
human keratinocytes: demonstration that the KEAP1-NRF2 pathway, and not the BACH1NRF2 pathway, controls cytoprotection against electrophiles as well as redox-cycling
compounds // Carcinogenesis. – 2009. - № 30(9). – Р. 1571–1580.
Magesh S., Chen Y., Hu L. Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as
potential preventive and therapeutic agents // Med Res Rev. – 2012. - № 32(4). – Р. 687–726.
Maher J., Yamamoto M. The rise of antioxidant signaling--the evolution and hormetic actions
of Nrf2 // Toxicol Appl Pharmacol. – 2010. - № 244(1). – Р. 4–15.
126
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
234.
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
Maicas N., Ferrándiz M.L., Brines R., Ibáñez L., Cuadrado A., Koenders M.I., van den Berg
W.B., Alcaraz M.J. Deficiency of Nrf2 accelerates the effector phase of arthritis and aggravates
joint disease // Antioxid Redox Signal. – 2011. - № 15(4). – Р. 889–901.
Mancuso C., Pani G., Calabrese V. Bilirubin: an endogenous scavenger of nitric oxide and
reactive nitrogen species // Redox Rep. – 2006. - № 11(5). – Р. 207–213.
Mannervik B. Measurement of Glutathione Reductase Activity // Curr Protoc Toxicol. –
2001. – U. 7.2.
Mannervik B., Jemth P. Measurement of Glutathione Transferases // Curr Protoc Toxicol. –
2001. – U. 6.4.
Marks D.J.B., Harbord M.W.N., MacAllister R., Rahman F.Z., Young J., Al-Lazikani B.,
Lees W., Novelli M, Bloom S., Segal A.W. Defective acute inflammation in Crohn’s disease: a
clinical investigation. // Lancet. – 2006. - № 367(9511). – Р. 668–678.
Marla S.S., Lee J., Groves J.T. Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes //
Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. – 1997. – № 94(26). – P. 14243-14248.
Martin S.W., Stevens A.J., Brennan B.S., Davies D., Rowland M., Houston J.B. The six-dayold rat air pouch model of inflammation: characterization of the inflammatory response to
carrageenan // J Pharmacol Toxicol Methods. -1994. - № 32(3). – Р. 139–147.
McMahon M., Thomas N., Itoh K., Yamamoto M., Hayes J.D. Redox-regulated turnover of
Nrf2 is determined by at least two separate protein domains, the redox-sensitive Neh2 degron
and the redox-insensitive Neh6 degron // J Biol Chem. – 2004. - № 279(30). – Р. 31556–31567.
McMillan K., Masters B.S. Prokaryotic expression of the heme- and flavin-binding domains of
rat neuronal nitric oxide synthase as distinct polypeptides: identification of the heme-binding
proximal thiolate ligand as cysteine-415 // Biochemistry. – 1995. – № 34. – P. 3686–3693
McNally S.J., Harrison E.M., Ross J.A., Garden O.J., Wigmore S.J. Curcumin induces heme
oxygenase 1 through generation of reactive oxygen species, p38 activation and phosphatase
inhibition // Int J Mol Med. – 2007. - № 19(1). – Р. 165–172.
Miao W., Hu L., Scrivens P.J., Batist G. Transcriptional regulation of NF-E2 p45-related factor
(NRF2) expression by the aryl hydrocarbon receptor-xenobiotic response element signaling
pathway: direct cross-talk between phase I and II drug-metabolizing enzymes // J Biol Chem. –
2005. - № 280(21). – Р. 20340–20348.
Miesel R., Sanocka D., Kurpisz M., Kröger H. Antiinflammatory effects of NADPH oxidase
inhibitors // Inflammation. – 1995. - № 19(3). – Р. 347–362.
Moilanen E., Vapaatalo H. Nitric oxide in inflammation and immune response // Ann Med. –
1995. - № 27(3). – Р. 359–367.
Moore R.N., Goodrum K.J., Berry L.J. Mediation of an endotoxic effect by macrophages //
J Reticuloendothel Soc. – 1976. - № 19(3). –Р. 187–197.
Morris C.J. Carrageenan-induced paw edema in the rat and mouse // Methods Mol Biol. –
2003.- № 225 – Р. 115–121.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. – 1983. – № 65. – P. 55-63.
Myung S.-K., Ju W., Cho B., Oh S.-W., Park S.M., Koo B.-K., Park B.-J. Efficacy of vitamin
and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and
meta-analysis of randomised controlled trials // BMJ. – 2013. – № 346. – Р. 10.
127
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
259.
260.
Nantel F., Denis D., Gordon R., Northey A., Cirino M., Metters K.M., Chan C.C. Distribution
and regulation of cyclooxygenase-2 in carrageenan-induced inflammation // Br J Pharmacol. –
1999. - № 128(4). – Р. 853–859.
Nathan C., Ding A. Nonresolving inflammation // Cell. – 2010. - № 140(6). – Р. 871–882.
Nauseef W.M. Myeloperoxidase deficiency // Hematol Pathol. – 1990. - № 4(4). – Р. 165–178.
Neves A.R., Lúcio M., Martins S., Lima J.L.C., Reis S. Novel resveratrol nanodelivery systems
based on lipid nanoparticles to enhance its oral bioavailability // Int J Nanomedicine. – 2013. № 8. – Р. 177–187
Nioi P., Nguyen T. A mutation of Keap1 found in breast cancer impairs its ability to repress
Nrf2 activity // Biochem Biophys Res Commun. – 2007. – № 362(4). – Р. 816–821.
Niture S.K., Jain A. K., Shelton P. M., Jaiswal A.K. Src Subfamily Kinases Regulate Nuclear
Export and Degradation of Transcription Factor Nrf2 to Switch Off Nrf2-mediated Antioxidant
Activation of Cytoprotective Gene Expression // J Biol Chem. – 2011. - № 286(33). –
Р. 28821–28832.
Niture S.K., Jaiswal A.K. Hsp90 interaction with INrf2(Keap1) mediates stress-induced Nrf2
activation // J Biol Chem. – 2010. - № 285(47). – Р. 36865–36875.
Niture S.K., Jaiswal A.K. Prothymosin-alpha mediates nuclear import of the INrf2/Cul3 Rbx1
complex to degrade nuclear Nrf2 // J Biol Chem. – 2009. - № 284(20). – Р. 13856–13868.
Niture S.K., Khatri R., Jaiswal A.K. Regulation of Nrf2-an update // Free Rad Biol Med. –
2014. - № 66. – Р. 36–44.
Ochoa J.B., Udekwu A.O., Billiar T.R., Curran R.D., Cerra F.B., Simmons, R. L., Peitzman, A.
B. Nitrogen oxide levels in patients after trauma and during sepsis // Ann Surg. – 1991. –
№ 214(5). – Р. 621–626.
Ohta K., Ohigashi M., Naganawa A., Ikeda H., Sakai M., Nishikawa J., Imagawa M., Osada S.,
Nishihara T. Histone acetyltransferase MOZ acts as a co-activator of Nrf2-MafK and induces
tumour marker gene expression during hepatocarcinogenesis // Biochem J. – 2007. - №
402(3). – Р. 559–66.
Osburn W.O., Yates M.S., Dolan P.D., Chen S., Liby K.T., Sporn M.B., Taguchi K.,
Yamamoto M., Kensler T.W. Genetic or pharmacologic amplification of nrf2 signaling inhibits
acute inflammatory liver injury in mice // Toxicol Sci. – 2008. - № 104(1). – Р. 218–227.
Otterbein L.E., Bach F.H., Alam J., Soares M., Tao Lu H., Wysk M., Davis R.J., Flavell R.A.,
Choi A. M. Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated
protein kinase pathway // Nat Med. – 2008. - № 6(4). – Р. 422–428.
Oya Y., Yamamoto K. The biological activity of hydrogen peroxide, IV. Enhancement of its
clastogenic actions by coadministration of r-histidine // Mutation Res. – 1988. – №.198 –
P.233-240.
Pahl H.L. Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors // Oncogene. –
1999. - № 18(49). – Р. 6853–6866.
Pan M.H., Lin-Shiau S.Y., Ho C.T., Lin J.H., Lin J.K. Suppression of lipopolysaccharideinduced nuclear factor-kappaB activity by theaflavin-3,3’-digallate from black tea and other
polyphenols through down-regulation of IkappaB kinase activity in macrophages // Biochem
Pharmacol. – 2000. - № 59(4). – Р. 357–367.
Park S.Y., Lee S.W., Shin H.K., Chung W.T., Lee W.S., Rhim B.Y., Hong K.W., Kim C.D.
Cilostazol enhances apoptosis of synovial cells from rheumatoid arthritis patients with
128
261.
262.
263.
264.
265.
266.
267.
268.
269.
270.
271.
272.
273.
274.
275.
inhibition of cytokine formation via Nrf2-linked heme oxygenase 1 induction // Arthritis
Rheum. – 2010. - № 62(3). – Р. 732–741.
Pfeilschifter J., Eberhardt W., Hummel R., Kunz D., Mühl H., Nitsch D., Plüss C., Walker G.
Therapeutic strategies for the inhibition of inducible nitric oxide synthase--potential for a novel
class of anti-inflammatory agents // Cell Biol Int. – 1996. - № 20(1). – Р. 51–58.
Pi J., Bai Y., Reece J.M., Williams J., Liu D., Freeman M.L., Fahl W.E., Shugar D., Liu J., Qu
W., Collins S., Waalkes M.P. Molecular mechanism of human Nrf2 activation and degradation:
role of sequential phosphorylation by protein kinase CK2 // Free Rad Biol Med. – 2007. № 42(12). – Р. 1797–806.
Pitha-Rowe I., Liby K., Royce D., Sporn M. Synthetic triterpenoids attenuate cytotoxic retinal
injury: cross-talk between Nrf2 and PI3K/AKT signaling through inhibition of the lipid
phosphatase PTEN // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2009. - № 50(11). – Р. 5339–5347.
Polvani S., Tarocchi M., Galli A. PPARγ and Oxidative Stress: Con(β) Catenating NRF2 and
FOX // PPAR Research. – 2012. – e641087.
Pörsti I., Paakkari I. Nitric oxide-based possibilities for pharmacotherapy // Ann Med. – 1995. № 27(3). – Р. 407–420.
Prestera T., Holtzclaw W. D., Zhang Y., Talalay P. Chemical and molecular regulation of enzymes
that detoxify carcinogens // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1993. - № 90(7). – Р. 2965–2969.
Prochaska H.J., Bregman H.S., De Long M.J., Talalay P.Specificity of induction of cancer
protective enzymes by analogues of tert-butyl-4-hydroxyanisole (BHA) // Biochem
Pharmacol. – 1985. - № 34(21). – Р. 3909–3914.
Prochaska H.J., Talalay P. Regulatory mechanisms of monofunctional and bifunctional
anticarcinogenic enzyme inducers in murine liver // Cancer Res. – 1988. - № 48(17). –
Р. 4776–4782.
Purdom-Dickinson S.E., Sheveleva E.V, Sun H., Chen Q.M. Translational control of nrf2
protein in activation of antioxidant response by oxidants // Mol Pharmacol. – 2007. - №
72(4). – Р. 1074–1081.
Quinn M.T., Gauss K.A. Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase:
comparison with nonphagocyte oxidases // J. Leukoc. Biol. – 2004. – № 76(4). – P. 760-781.
Rachakonda G., Xiong Y., Sekhar K.R., Stamer S.L., Liebler D.C., Freeman M.L. Covalent
modification at Cys151 dissociates the electrophile sensor Keap1 from the ubiquitin ligase
CUL3 // Chem Res Toxicol. – 2008. - № 21(3). – Р. 705–710.
Rada P., Rojo A.I., Chowdhry S., McMahon M., Hayes J. D., Cuadrado A. SCF/{beta}-TrCP
promotes glycogen synthase kinase 3-dependent degradation of the Nrf2 transcription factor in
a Keap1-independent manner // Mol Cell Biol. – 2011. - № 31(6). –Р. 1121–1133.
Radi R., Beckman J.S., Bush K.M, Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid
peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // Arch. Biochem.
Biophys. – 1991. – № 288(2). – P. 481-487.
Ravi K., Brennan L.A., Levic S., Ross P.A., Black S.M. S-nitrosylation of endothelial nitric
oxide synthase is associated with monomerization and decreased enzyme activity // Proc. Nat.
Acad. Sci. U.S.A. – 2004. – № 101(8). – P. 2619-2624.
Ray P.D., Huang B.-W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox
regulation in cellular signaling // Cell Signal. – 2012. - № 24(5). – Р. 981–990.
129
276.
277.
278.
279.
280.
281.
282.
283.
284.
285.
286.
287.
288.
289.
290.
291.
Remick D.G., Villarete L. Regulation of cytokine gene expression by reactive oxygen and
reactive nitrogen intermediates // J Leukoc Biol. – 1996. - № 59(4). – Р. 471–475.
Richards M.K., Marletta M.A. Characterization of neuronal nitric oxide synthase and a C415H
mutant, purified from a baculovirus overexpression system // Biochemistry. – 1994. – № 33. –
P. 14723–14732.
Robinson J.P. Oxidative metabolism // Current protocols in cytometry. – 2001. – U. 9.7.
Rodríguez P., Viñuela J.E., Alvarez-Fernández L., Buceta M., Vidal A., Domínguez, F.,
Gómez-Márquez, J. Overexpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards
differentiation in HL-60 cells // Biochem J. – 1998. - № 331. – Р. 753–61.
Rodriguez-Pascual F., Hausding M., Ihrig-Biedert I., Furneau H., Levy A.P., Forstermann U.,
Kleinert H. Complex contribution of the 3'-untranslated region to the expressional regulation of
the human inducible nitric-oxide synthase gene. Involvement of the RNA-binding protein
HuR // J. Biol. Chem. – 2000. – № 275. – P. 26040-26049.
Rushmore T. H., Morton M.R., Pickett C.B. The antioxidant responsive element. Activation by
oxidative stress and identification of the DNA consensus sequence required for functional
activity // J Biol Chem. – 1991. - № 266(18). – Р. 11632–11639.
Rushworth S.A., MacEwan D.J., O’Connell M.A. Lipopolysaccharide-induced expression of
NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 and heme oxygenase-1 protects against excessive
inflammatory responses in human monocytes // J Immunol. – 2008. - № 181(10). –Р. 6730–6737.
Salgo M.G., Stone K., Squadrito G.L., Battista J.R., Pryor W.A. Peroxynitrite causes DNA nicks in
plasmid pBR322 // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1995. – № 210(3). – P. 1025-1030.
Sankaranarayanan K., Jaiswal A.K. Nrf3 negatively regulates antioxidant-response elementmediated expression and antioxidant induction of NAD(P)H:quinone oxidoreductase1 gene // J
Biol Chem. – 2004. - № 279(49). – Р. 50810–50817.
Sarady J.K., Zuckerbraun B.S., Bilban M., Wagner O., Usheva A., Liu F., Ifedigbo E.,
Zamora R., Choi A.M., Otterbein L. E. Carbon monoxide protection against endotoxic shock
involves reciprocal effects on iNOS in the lung and liver // FASEB J. – 2004. - № 18(7). –
Р. 854–856.
Sarih M., Souvannavong V., Adam A. Nitric oxide synthase induces macrophage death by
apoptosis // Biochem Biophys Res Commun. – 1993. - № 191(2). –Р. 503–508.
Satoh T., Harada N., Hosoya T., Tohyama K., Yamamoto M., Itoh K. Keap1/Nrf2 system
regulates neuronal survival as revealed through study of keap1 gene-knockout mice // Biochem
Biophys Res Commun. – 2009. - № 380(2). – Р. 298–302.
Schechter A.N., Gladwin M.T. Hemoglobin and the paracrine and endocrine functions of nitric
oxide // N. Engl. J. Med. – 2003. – № 348(15). – P. 1483-1485.
Sebens S., Bauer I., Geismann C., Grage-Griebenow E., Ehlers S., Kruse M.-L., Arlt A.,
Schäfer H. Inflammatory macrophages induce Nrf2 transcription factor-dependent proteasome
activity in colonic NCM460 cells and thereby confer anti-apoptotic protection // J Biol Chem. –
2011. - № 286(47). – Р. 40911–40921.
Sedgwick A.D., Lees P. Studies of eicosanoid production in the air pouch model of synovial
inflammation // Agents Actions. – 1986. – № 18. – P. 429-438.
Sedgwick A.D., Moore A.R., Al-Duaij A.Y., Edwards J.C., Willoughby D.A. The immune
response to pertussis in the 6-day air pouch: a model of chronic synovitis // Br J Exp Pathol. –
1985. - № 66(4). – Р. 455–464.
130
292.
293.
294.
295.
296.
297.
298.
299.
300.
301.
302.
303.
304.
305.
306.
307.
Seibenhener M.L., Geetha T., Wooten M.W. Sequestosome 1/p62--more than just a scaffold //
FEBS Letters. – 2007. - № 581(2). – Р. 175–179.
Seldon M.P., Silva G., Pejanovic N., Larsen R., Gregoire I.P., Filipe J., Anrather J.,
Soares M.P. Heme oxygenase-1 inhibits the expression of adhesion molecules associated with
endothelial cell activation via inhibition of NF-kappaB RelA phosphorylation at serine 276 //
J Immunol. – 2007. - № 179(11). – Р. 7840–7851.
Seng S., Avraham H.K., Birrane G., Jiang S., Li H., Katz G., Bass C.E., Zagozdzon R.,
Avraham S. NRP/B mutations impair Nrf2-dependent NQO1 induction in human primary brain
tumors // Oncogene. – 2009. - № 28(3). – Р. 378–389.
Seng S., Avraham H.K., Jiang S., Yang S., Sekine M., Kimelman N., Li H., Avraham S. The
nuclear matrix protein, NRP/B, enhances Nrf2-mediated oxidative stress responses in breast
cancer cells // Cancer Res. – 2007. - № 67(18). – Р. 8596–8604.
Sethi S., Eastman A. Y., Eaton J. W. Inhibition of phagocyte-endothelium interactions by
oxidized fatty acids: a natural anti-inflammatory mechanism? // J Lab Clin Med. – 1996. № 128(1). – Р.27–38.
Sherratt P.J., Williams S., Foster J., Kernohan N., Green T., Hayes J.D. Direct comparison of
the nature of mouse and human GST T1-1 and the implications on dichloromethane
carcinogenicity // Toxicol Appl Pharmacol. – 2002. - № 179(2). – Р. 89–97.
Shingu M., Yoshioka K., Nobunaga M., Yoshida K. Human vascular smooth muscle cells and
endothelial cells lack catalase activity and are susceptible to hydrogen peroxide //
Inflammation. – 1985. - № 9(3). – Р. 309–320.
Siegel D., Gustafson D. L., Dehn D.L., Han J.Y., Boonchoong P., Berliner L.J., Ross D.
NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1: role as a superoxide scavenger // Mol Pharmacol. –
2004. - № 65(5). – Р. 1238–1247.
Siegel D., Kepa J.K., Ross D. Biochemical and Genetic Analysis of NAD(P)H:Quinone
Oxidoreductase 1 (NQO1) // Curr Protoc Toxicol. – 2007. – U. 4.22.
Sies H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. – London, Academic Press, 1991. – 650 p.
Sies H., Jones D.P. Oxidative stress // Encyclopedia of Stress (2nd ed.). Ed. G. Fink.– Elsevier,
2007.– P. 45–48.
Simms H., D’Amico R. Regulation of polymorphonuclear neutrophil CD16 and CD11b/CD18
expression by matrix proteins during hypoxia is VLA-5, VLA-6 dependent // J Immunol
(Baltimore, Md. : 1950). – 1995. - № 155(10). –Р. 4979–4990.
Slocum S.L., Kensler T.W. Nrf2: control of sensitivity to carcinogens // Arch Toxicol. – 2011. № 85(4). – Р. 273–284.
Smith W.L., Marnett L.J., DeWitt D.L. Prostaglandin and thromboxane biosynthesis //
Pharmacology Therapeutics. – 1991. - № 49(3). –Р. 153–179.
Song N.-Y., Kim, D.-H., Kim E.-H., Na H.-K., Kim N.-J., Suh Y.-G., Surh Y.-J. Multidrug
resistance-associated protein 1 mediates 15-deoxy-Δ(12,14)-prostaglandin J2-induced
expression of glutamate cysteine ligase expression via Nrf2 signaling in human breast cancer
cells // Chem Res Toxicol. – 2011. - № 24(8). –Р. 1231–1241.
Sriram N., Kalayarasan S., Sudhandiran G. Epigallocatechin-3-gallate exhibits anti-fibrotic
effect by attenuating bleomycin-induced glycoconjugates, lysosomal hydrolases and
ultrastructural changes in rat model pulmonary fibrosis // Chem Biol Interact. – 2009. № 180(2). – Р. 271–280.
131
308.
309.
310.
311.
312.
313.
314.
315.
316.
317.
318.
319.
320.
321.
322.
323.
Srisook K., Cha Y.-N. Super-induction of HO-1 in macrophages stimulated with
lipopolysaccharide by prior depletion of glutathione decreases iNOS expression and NO
production // Nitric Oxide :Biology and Chemistry. – 2005. - № 12(2). – Р. 70–79.
Stępkowski T.M., Kruszewski M.K. Molecular cross-talk between the NRF2/KEAP1 signaling
pathway, autophagy, and apoptosis // Free Rad Biol Med. – 2011. - № 50(9). – Р. 1186–1195.
Storey K.B. Oxidative stress: animal adaptations in nature // Braz J Med Biol Res. – 1996. - №
29(12). – Р. 1715–1733.
Subramanian C., Hasan S., Rowe M., Hottiger M., Orre R., Robertson E.S. Epstein-Barr virus
nuclear antigen 3C and prothymosin alpha interact with the p300 transcriptional coactivator at
the CH1 and CH3/HAT domains and cooperate in regulation of transcription and histone
acetylation // Journal of Virology. – 2002. - № 76(10). – Р. 4699–4708.
Sumi D., Numasawa Y., Endo A., Iwamoto N., Kumagai Y. Catechol estrogens mediated
activation of Nrf2 through covalent modification of its quinone metabolite to Keap1 //
J Toxicol Sci. – 2009. - № 34(6). – Р. 627–635.
Sun J., Brand M., Zenke Y., Tashiro S., Groudine M., Igarashi K. Heme regulates the dynamic
exchange of Bach1 and NF-E2-related factors in the Maf transcription factor network // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 2004. - № 101(6). – Р. 1461–1466.
Sun Z., Chin Y.E., Zhang D.D. Acetylation of Nrf2 by p300/CBP augments promoter-specific
DNA binding of Nrf2 during the antioxidant response // Mol Cell Biol. – 2009. - № 29(10). –
Р. 2658–1672.
Sun Z., Zhang S., Chan J.Y., Zhang D.D. Keap1 controls postinduction repression of the Nrf2mediated antioxidant response by escorting nuclear export of Nrf2 // Mol Cell Biol. – 2007. № 27(18). – Р. 6334–6349.
Surh Y.-J., Kundu J.K., Na H.-K. Nrf2 as a master redox switch in turning on the cellular
signaling involved in the induction of cytoprotective genes by some chemopreventive
phytochemicals // Planta Medica. – 2008. - № 74(13). – Р. 1526–1539.
Sykiotis G.P., Bohmann D. Stress-activated cap’n'collar transcription factors in aging and
human disease // Sci Signal. – 2010. - № 3(112). – Р. re3.
Tabas I., Glass C.K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and
opportunities // Science. – 2013. - № 339(6116). – Р. 166–172.
Taguchi K., Motohashi H., Yamamoto M. Molecular mechanisms of the Keap1–Nrf2 pathway
in stress response and cancer evolution // Genes Cells. – 2011. - № 16(2). – Р. 123–140.
Takabe W., Matsukawa N., Kodama T., Tanaka K., Noguchi N. Chemical structure-dependent
gene expression of proteasome subunits via regulation of the antioxidant response element //
Free Radic Res. – 2006. - № 40(1). – Р. 21–30.
Takac I., Schroder K., Zhang L. et al. The E-loop is involved in hydrogen peroxide formation
by the NADPH oxidase Nox4 // J. Biol. Chem.– 2011.– № 286.– P. 13304–13313.
Theodore M., Kawai Y., Yang J., Kleshchenko Y., Reddy S.P., Villalta F., Arinze I.J. Multiple
nuclear localization signals function in the nuclear import of the transcription factor Nrf2 //
J Biol Chem. – 2008. - № 283(14). – Р. 8984–8994.
Thimmulappa R.K., Lee H., Rangasamy T., Reddy S.P., Yamamoto M., Kensler T.W.,
Biswal S. Nrf2 is a critical regulator of the innate immune response and survival during
experimental sepsis // J Clin Invest. – 2006. - № 116(4). – Р. 984–995.
132
324.
325.
326.
327.
328.
329.
330.
331.
332.
333.
334.
335.
336.
337.
338.
Thimmulappa R.K., Mai K.H., Srisuma S., Kensler T.W., Yamamoto M., Biswal S.
Identification of Nrf2-regulated genes induced by the chemopreventive agent sulforaphane by
oligonucleotide microarray // Cancer Res. – 2002. - № 62(18). – Р. 5196–5203.
Thomas D.D., Liu X., Kantrow S.P., Lancaster J.R.Jr. The biological lifetime of nitric oxide:
implications for the perivascular dynamics of NO and O2 // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. –
2001. – № 98(1). – P. 355-360.
Tinkel J., Hassanain H., Khouri S.J. Cardiovascular antioxidant therapy: a review of
supplements, pharmacotherapies, and mechanisms // Cardiol Rev. – 2012. - № 20(2). – Р.7–83.
Tong K.I., Katoh Y., Kusunoki H., Itoh K., Tanaka T., Yamamoto M. Keap1 recruits Neh2
through binding to ETGE and DLG motifs: characterization of the two-site molecular
recognition model // Mol Cell Biol. – 2006. - № 26(8). – Р. 2887–2900.
Tong K. I., Kobayashi A., Katsuoka F., Yamamoto M. Two-site substrate recognition model
for the Keap1-Nrf2 system: a hinge and latch mechanism // Biol Chem. – 2006. - № 387(1011). – Р. 1311–1320.
Torrielli M.V., Dianzani M.U. Free radicals in inflammatory disease // Free Radicals in
Molecular Biology, Aging, and Disease. – N.Y., 1984 – P. 335-379.
Turan B., Tuncay E., Vassort G. Resveratrol and diabetic cardiac function: focus on recent in
vitro and in vivo studies // J Bioenerg Biomembr. – 2012. - № 44(2). –Р. 281–296.
Ueda S., Kato S., Matsuoka H., Kimoto M., Okuda S., Morimatsu M., Imaizumi T. Regulation
of cytokine-induced nitric oxide synthesis by asymmetric dimethylarginine: role of
dimethylarginine dimethylaminohydrolase // Circ Res. – 2003. - № 92(2). – Р. 226–233.
Umeki S. Anti-inflammatory action of gentamycin through inhibitory effect on neutrophil
NADPH oxidase activity // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. – 1995. № 110(4). – Р. 817–821.
Uversky V.N., Gillespie J.R., Millett I.S., Khodyakova A.V, Vasilenko R.N., Vasiliev A.M.,
Vasilenko R.N., Kozlovskaya G.D., Dolgikh D.A., Fink A.L., Doniach S., Abramov V.M.
Zn(2+)-mediated structure formation and compaction of the “natively unfolded” human
prothymosin alpha // Biochem Biophys Res Commun. – 2000. - № 267(2). – Р. 663–668.
Uversky V.N., Gillespie J.R., Millett I.S., Khodyakova A.V, Vasiliev A.M.,
Chernovskaya T.V, Vasilenko R.N., Kozlovskaya G.D., Dolgikh D.A., Fink A.L., Doniach S.,
Abramov V.M. Natively unfolded human prothymosin alpha adopts partially folded collapsed
conformation at acidic pH // Biochemistry. – 1999. - № 38(45). –Р. 15009–15016.
Valledor A.F., Comalada M., Santamaría-Babi L.F., Lloberas J., Celada A. Macrophage
proinflammatory activation and deactivation: a question of balance // Adv Immunol. – 2010. № 108(10). – Р. 1–20.
Vane J.R., Botting R.M. New insights into the mode of action of anti-inflammatory drugs.
Inflamm Res. – 1995. - № 44(1). – Р. 1–10.
Velichkova M., Hasson T. Keap1 regulates the oxidation-sensitive shuttling of Nrf2 into and
out of the nucleus via a Crm1-dependent nuclear export mechanism // Mol Cell Biol. – 2005. № 25(11). – Р. 4501–4513.
Villeneuve N.F., Lau A., Zhang D.D. Regulation of the Nrf2-Keap1 antioxidant response by
the ubiquitin proteasome system: an insight into cullin-ring ubiquitin ligases // Antioxid Redox
Signal. – 2010. - № 13(11). – Р. 1699–1712.
133
339.
340.
341.
342.
343.
344.
345.
346.
347.
348.
349.
350.
351.
352.
353.
354.
Villeneuve N.F., Sun Z., Chen W., Zhang D.D. Nrf2 and p21 regulate the fine balance between
life and death by controlling ROS levels // Cell Cycle. – 2009. - № 8(20). – Р. 3255–3256.
Wakabayashi N., Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kang M.-I., Kobayashi A.,
Yamamoto M., Kensler T.W., Talalay P. Protection against electrophile and oxidant stress by
induction of the phase 2 response: fate of cysteines of the Keap1 sensor modified by inducers //
Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. - № 101(7). – Р. 2040–2045.
Wakabayashi N., Itoh K., Wakabayashi J., Motohashi H., Noda S., Takahashi S., Imakado S.,
Kotsuji T., Otsuka F., Roop D.R., Harada T., Engel J.D., Yamamoto M. Keap1-null mutation
leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation // Nat Genet. – 2003. - № 35(3). –
Р. 238–245.
Wakabayashi N., Slocum S.L., Skoko J.J., Shin S., Kensler T.W. When NRF2 talks, who’s
listening? // Antioxid Redox Signal. – 2010. - № 13(11). – Р. 1649–1663.
Wang H., Khor T.O., Saw C.L.L., Lin W., Wu T., Huang Y., Kong A.-N.T. Role of Nrf2 in
suppressing LPS-induced inflammation in mouse peritoneal macrophages by polyunsaturated
fatty acids docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid. // Mol Pharm. – 2010. - № 7(6). –
Р. 2185–2193.
Wang P., Liu G.-H., Wu K., Qu J., Huang B., Zhang X., Zhou X., Gerace L., Chen C.
Repression of classical nuclear export by S-nitrosylation of CRM1 // J Cell Sci. – 2009. № 122(Pt 20). – Р. 3772–3779.
Wang R., An J., Ji F., Jiao H., Sun H., Zhou D. Hypermethylation of the Keap1 gene in human
lung cancer cell lines and lung cancer tissues // Biochem Biophys Res Commun. – 2008. № 373(1). – Р. 151–154.
Wang X.J., Hayes J.D., Henderson C.J., Wolf C.R. Identification of retinoic acid as an inhibitor
of transcription factor Nrf2 through activation of retinoic acid receptor alpha // Proc Natl Acad
Sci U S A. – 2007. - № 104(49). – Р. 19589–19594.
Wang X.J., Hayes J.D., Higgins L.G., Wolf C.R., Dinkova-Kostova A.T. Activation of the NRF2
signaling pathway by copper-mediated redox cycling of para- and ortho-hydroquinones // Chem
Biol. – 2010. - № 17(1). – Р. 75–85.
Ward C., Wong T.H., Murray J., Rahman I., Haslett C., Chilvers E.R., Rossi A.G. Induction of
human neutrophil apoptosis by nitric oxide donors: evidence for a caspase-dependent, cyclicGMP-independent, mechanism// Biochem Pharmacol. – 2000. - № 59(3). – Р. 305–314.
Ward P.A.. Mechanisms of endothelial cell injury // J Lab Clin Med. – 1991. - № 118(5). –
Р. 421–426.
Warren J.B. Vascular control of inflammatory oedema // Clin Sci (Lond). – 1993. - № 84(6). –
Р. 581–584.
Wasserman W.W., Fahl W.E. Functional antioxidant responsive elements // Proc Natl Acad Sci
USA. – 1997. - № 94(10). – Р. 5361–5366.
Weiss G., Werner-Felmayer G., Werner E.R., Grünewald K., Wachter H., Hentze M.W. Iron
regulates nitric oxide synthase activity by controlling nuclear transcription // J Exp Med. –
1994. - № 180(3). – Р. 969–976.
Weiss S.J. Tissue destruction by neutrophils // N Engl J Med. – 1989. - № 320. – Р. 365–376.
Witzenbichler B., Westermann D., Knueppel S., Schultheiss H.P., Tschope C. Protective role of
angiopoietin-1 in endotoxic shock // Circulation. – 2005. – № 111. – P. 97-105.
134
355.
356.
357.
358.
359.
360.
361.
362.
363.
364.
365.
366.
367.
368.
369.
Wruck C.J., Fragoulis A., Gurzynski A., Brandenburg L.-O., Kan Y.W., Chan K.,
Hassenpflug J., Freitag-Wolf S., Varoga D., Lippross S., Pufe T. Role of oxidative stress in
rheumatoid arthritis: insights from the Nrf2-knockout mice // Ann Rheum Dis. – 2011. № 70(5). – Р. 844–850.
Xiao H., Parkin K.L. Induction of phase II enzyme activity by various selenium compounds //
Nutr Cancer. – 2006. - № 55(2). – Р. 210–223.
Xiao Y., Chen X., Yang L., Zhu X., Zou L., Meng F., Ping Q. Preparation and oral
bioavailability study of curcuminoid-loaded microemulsion // J Agric Food Chem. – 2013. - №
61(15). – Р. 3654–3660.
Xu W., Hellerbrand C., Köhler U.A., Bugnon P., Kan Y.-W., Werner S., Beyer T.A. The Nrf2
transcription factor protects from toxin-induced liver injury and fibrosis // Lab Invest. – 2008. № 88(10). – Р. 1068–1078.
Yamamoto T., Moriwaki Y., Takahashi S., Tsutsumi Z., Yamakita J., Nasako Y., Hiroishi K.,
Higashino K. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance
liquid chromatography // J. Chromatogr. B. Biomed. Appl. – 1996. – № 681(2). – P. 395-400.
Yamamoto T., Suzuki T., Kobayashi A., Wakabayashi J., Maher J., Motohashi H.,
Yamamoto M.. Physiological significance of reactive cysteine residues of Keap1 in
determining Nrf2 activity // Mol Cell Biol. – 2008. - № 28(8). – Р. 2758–2770.
Yerlikaya A. Expression of heme oxygenase-1 in response to proteasomal inhibition // Protein
Pept Lett. – 2012. - № 19(12).- Р. 1330–1333.
Yi S., Boys B.L., Brickenden A., Konermann L., Choy W.-Y. Effects of zinc binding on the
structure and dynamics of the intrinsically disordered protein prothymosin alpha: evidence for
metalation as an entropic switch // Biochemistry. – 2007. - № 46(45). – Р. 13120–13130.
Yoh K., Itoh K., Enomoto A., Hirayama, A., Yamaguchi N., Kobayashi M., Morito N.,
Koyama A., Yamamoto M., Takahashi S. Nrf2-deficient female mice develop lupus-like
autoimmune nephritis // Kidney Int.- 2001. - № 60(4). – Р. 1343–1353.
Yu H., Li J., Shi K., Huang Q. Structure of modified ε-polylysine micelles and their application
in improving cellular antioxidant activity of curcuminoids // Food Funct. – 2011. - № 2(7). –
Р. 373–380.
Yu S., Khor T.O., Cheung K.-L., Li W., Wu T.-Y., Huang Y., Foster B.A., Kan Y.W.,
Kong A.-N. Nrf2 expression is regulated by epigenetic mechanisms in prostate cancer of
TRAMP mice // PloS One. – 2010. - № 5(1). – Р. 8579.
Zenke-Kawasaki Y., Dohi Y., Katoh Y., Ikura T., Ikura M., Asahara T., Tokunaga F.,
Igarashi K. Heme induces ubiquitination and degradation of the transcription factor Bach1 //
Mol Cell Biol. – 2007. - № 27(19). – Р. 6962–6971.
Zhang D.D. Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway // Drug Metab Rev. –
2006 – № 38(4). – Р. 769–789.
Zhang D.D., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1-dependent
ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative
stress // Mol Cell Biol. – 2003. - № 23(22). – Р. 8137–8151.
Zhang D.D., Lo S.-C., Sun Z., Habib G.M., Lieberman M.W., Hannink M. Ubiquitination of
Keap1, a BTB-Kelch substrate adaptor protein for Cul3, targets Keap1 for degradation by a
proteasome-independent pathway// J Biol Chem. – 2005. - № 280(34). – Р. 30091–30099.
135
370.
371.
372.
373.
374.
375.
376.
Zhang J., Hosoya T., Maruyama A., Nishikawa K., Maher J.M., Ohta T., Motohashi H.,
Fukamizu A., Shibahara S., Itoh K., Yamamoto M. Nrf2 Neh5 domain is differentially utilized
in the transactivation of cytoprotective genes // Biochem J. – 2007. - № 404(3). – Р. 459–466.
Zhang R., Brennan M.-L., Shen Z., MacPherson J.C., Schmitt D., Molenda C.E., Hazen S.L.
Myeloperoxidase functions as a major enzymatic catalyst for initiation of lipid peroxidation at
sites of inflammation // J Biol Chem. – 2002. - № 277(48). – Р. 46116–46122.
Zhang X., Chen,X., Song H., Chen H.-Z., Rovin B.H. Activation of the Nrf2/antioxidant
response pathway increases IL-8 expression // European J Immunol. – 2005. - № 35(11). –
Р. 3258–3267.
Zhao S.-G., Li Q., Liu Z.-X., Wang J.-J., Wang X.-X., Qin M., Wen Q.-S.. Curcumin attenuates
insulin resistance in hepatocytes by inducing Nrf2 nuclear translocation //
Hepatogastroenterology. – 2011. - № 58(112). – Р. 2106–2111.
Zhou Y., Lin G., Murtaugh M.P. Interleukin-4 suppresses the expression of macrophage
NADPH oxidase heavy chain subunit (gp91-phox). // Biochim. Biophys. Acta. – 1995. –
№ 1265(1). – P. 40-48.
Zhou W., Lo S.-C., Liu J.-H., Hannink M., Lubahn D.B. ERRbeta: a potent inhibitor of Nrf2
transcriptional activity // Mol Cell Endocrinol. – 2007. - № 278(1-2). – Р. 52–62.
Zipper L. M., Mulcahy R.T. The Keap1 BTB/POZ dimerization function is required to
sequester Nrf2 in cytoplasm // J Biol Chem. – 2002. - № 277(39). – Р. 36544–36552.