Лабораторная работа № 5 Брожение Краткая теория Брожение это одна из разновидностей биологического окисления. В основе многих бродильных процессов лежит универсальная реакция превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой промежуточный продукт (интермедиат) – пировиноградную кислоту – пируват, из которого синтезируются различные конечные продукты. По метаболиту, образующемуся в наибольшем количестве, называют брожению : спиртовое, маслянокислое, молочнокислое и т.д. 1) Спиртовое брожение Лежит в основе получения этанола, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия. Возбудителями брожения могут быть дрожжи – сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы и бактерии. 2) Ацетонобутиловое брожение Все углеводные источники (крахмал, патока, гидролизаты целлюлозы), применяемые при спиртовом брожении, могут быть использованы при ацетонобутиловом брожении, которое протекает в анаэробных условиях под действием спорообразующих бактерий. Кроме уксусной и масляной кислот основными отходами производства являются газообразный водород и двуокись углерода, а так же ацетонобутитоловая барда, которая содержит заметные количества рибофлавина (витамина В2) и используется для выращивания кормовых дрожжей. Экспериментальная часть Реактивы: 1. Дрожжи быстродействующие сухие; 2. Вода дистиллированная; 3. Фруктоза; 4. Нингидрин, спиртовой раствор с массовой долей 0,2%; 5. Азотная кислота, конц.; 6. Гидроксид натрия, раствор с массовой долей 10%; 7. Свинец уксуснокислый, раствор с массовой долей 5%; 8. Соляная кислота, конц.; 9. Сульфат меди, раствор с массовой долей 1%; 10.Натрий углекислый, раствор с массовой долей 10%; 11.Диазореактив. Выполнение работы Спиртовое брожение Ход работы Наблюдения В баночке смешали 10 г фруктозы, добавили 1 г сухих быстродействующих дрожжей, налили 30 мл дистиллированной воды, немного нагрели на Раствор имеет запах водяной бане. Оставили на 14 дней в темном месте. этанола, стал темнее, появилась густая пена. Вес баночки до: 209,3 г Вес баночки по истечению 14 дней: Установление состава дрожжей Реакция аминокислот с нингидрином: Все -аминокислоты, взаимодействуя с нингидрином, образуют продукты, окрашенные в синий или фиолетовый цвет. Эту реакцию дают также и белки. Взаимодействие аминокислот с нингидрином может быть рассмотрено на примере: NH 2 R + 2 COOH ОН O O O + R N O O O O + C OH CO 2 H 2O Как видно из уравнения реакции, в образовании окрашенного продукта принимает участие атом азота свободной -аминогруппы, на чем, собственно, и основана нингидриновая реакция. Чем больше свободных -аминогрупп содержит белок, тем интенсивнее окраска, образующаяся при взаимодействии его с нингидрином. Ход работы Наблюдения Смешали в пробирке 2 капли раствора нингидрина и небольшого Раствор окрашивается в фиолетовый количества быстродействующих цвет. дрожжей. Нагрели пробирку. Образование хеллатов аминокислот: Аминокислоты способны вступать во взаимодействие с ионами некоторых металлов с образованием особых комплексных соединений хеллатов. При этом между органическим соединением и металлом возникают две связи (ковалентная и координационная), и в силу этого образуется гетероцикл, а металл оказывается, как бы захвачен в клешни молекулами аминокислоты: R NH2 O O H2N R Cu O O Согласно принятой классификации хеллаты относят к внутрикомплексным соединениям. Аминокислоты, вошедшие в состав хеллатных комплексов, резко меняют свои свойства, в частности, они не дают реакцию с нингидрином. Хеллаты, в состав которых входят медь, кобальт, ряд других металлов, являются окрашенными соединениями. Последние два свойства и использованы в хеллатной реакции. Ход работы Наблюдения I. Взяли две пробирки. В первую из них внесли 6 капель раствора дрожжей. Вторая пробирка является контрольной – в неё вносят 6 капель воды. В каждую пробирку добавляют по 6 капель раствора сульфата меди и встряхивают. В первой пробирке, где имелась аминокислота, появляется синяя окраска, вызванная образованием хеллата. II. Берут две пробирки. В каждую пробирку добавляют по 6 капель раствора дрожжей. В первую добавляют 6 капель сульфата меди и В первой пробирке, где образовался цветной реакции на 6 капель нингидрина. Встряхнув, хеллат, содержимое пробирки нагревают. нингидрин не наблюдается. Вторая пробирка является контрольной – в неё вносят 6 капель нингидрина и, встряхнув, тоже нагревают. Реакция на серосодержащие аминокислоты и белки Реакцию на серу дают только те белки, которые содержат группы SH. На первом этапе происходит замещение SH-групп на гидроксогруппу ОН и переход серы из органического соединения в неорганическое: На втором этапе – качественное обнаружение ионов серы в растворе: Na2S + (CH3COO)2Pb → PbS↓ + 2CH3COONa Ход работы Наблюдения В пробирку внесли 6 капель раствора дрожжей и добавили 3 капли В пробирке появилось темнораствора гидроксида натрия. коричневое окрашивание, что Содержимое пробирки встряхнули и говорит о положительной реакции. немного нагрели, затем добавили раствор уксуснокислого свинца. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты Ход работы К 0, 5 мл раствора дрожжей прибавили 5-6 капель концентрированной азотной кислоты. Осторожно нагреил. При наличии в растворе циклических аминокислот или белков, в которых присутствуют эти аминокислоты, появляется желтое окрашивание за счет нитрования бензольного кольца. Наблюдения В пробирке появляется желтая окраска, вызванная нитрованием бензольного кольца. Проба Троммера Многие моносахариды обладают способностью восстанавливать в щелочной среде ионы меди, висмута, серебра и т.д. Эта реакция обусловлена наличием в молекуле моносахаридов альдегидной группы, которая, легко окисляясь, превращается в карбоксильную, и при этом происходит восстановление металлов. На этом основан метод обнаружения моносахаридов по Троммерру. Реакцию Троммера нельзя проводить в присутствии избытка солей меди, так как в этом случае желтая или красная окраска маскируется черным осадком окиси меди, образующимся из гидроксида меди. Для предотвращения этого реакцию проводят в присутствии сегнетовой соли, связывающей избыток гидроксида меди. Ход работы Наблюдения В пробирку добавили 6 капель раствора дрожжей. Внесли 6 капель раствора гидроксида натрия и 2 капли раствора сульфата меди. Содержимое пробирки встряхнули и нагрели В пробирке появляется сначала фиолетовое окрашивание, затем ярко-красное окрашивание, обусловлено тем, что дрожжи содержат как белок, так и углевод. Биуретовая реакция на простые белки: Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. Подобную окраску дают все соединения, содержащие пептидные связи (-NH-СО-). Ход работы В пробирку налили 2 мл раствора испытуемых дрожжей и затем добавили туда 1 мл раствора гидроокиси натрия и 1 мл раствора сульфата меди. Содержимое пробирки встряхивают. Наблюдения Появление фиолетового окрашивания, что говорит о положительной реакции на белок, при нагревании цвет меняется на ярко-красный, что свидетельствует о наличии углеводов в составе дрожжей. Изучение состава рибонуклеопротеинов дрожжей Ход работы В пробирку поместили небольшое количество дрожжей, добавили 1 мл раствора серной кислоты и 1 мл дистиллированной воды. Перемешали и закрыли пробкой. Пробирку поместили на кипящую водяную баню и кипятили при слабом нагревании 1 час. Затем содержимое пробирки охладили, отфильтровали на складчатом фильтре и с гидролизатом (фильтратом) проводили дальнейшую реакцию на составные части нуклеотидов. Серебряная проба на пуриновые основания Ход работы Наблюдения К 0,5 мл гидролизата добавили Через 5 минут при стоянии аммиак, лакмусовой бумажкой проверили выпал хлопьевидный белый осадок среду, она должна быть щелочная (синий серебряных соединений пуриновых лакмус) и добавили аммиачный раствор оснований. оксида серебра. Оставили на 5 минут. Масляно-кислое брожение Ход работы Наблюдения В баночке смешали 10 г выжимки из нечищенного немытого картофеля, добавили 1 г сухих быстродействующих дрожжей, налили 30 мл воды Раствор имеет запах из-под крана, немного нагрели на водяной бане. прогорклого масла, стал Оставили на 14 дней в темном месте. темнее, появилась густая пена. Вес баночки до: г Вес баночки по истечению 14 дней:
