УДК 60(075) ББК 30.16я73 С56 Авторы: Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова, С. В. Маркова, Л. А. Франк, Е. И. Шишацкая Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии» подготовлен в рамках реализации Программы развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) на 2007– 2010 гг. Рецензенты: Красноярский краевой фонд науки; Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дисциплин С56 Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс] : электрон. учеб. пособие / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. ; под науч. ред. Т. Г. Воловой. – Электрон. дан. (12 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 13232008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). – 1 электрон. опт. диск (DVD). – Систем. требования : Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей) 1 ГГц ; 512 Мб оперативной памяти ; 50 Мб свободного дискового пространства ; привод DVD ; операционная система Microsoft Windows XP SP 2 / Vista (32 бит) ; Adobe Reader 7.0 (или аналогичный продукт для чтения файлов формата pdf). ISBN 978-5-7638-1662-4 (комплекса) ISBN 978-5-7638-1769-0 (учебного пособия) Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320902481 (комплекса) Настоящее издание является частью электронного учебно-методического комплекса по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии», включающего учебную программу дисциплины, лабораторный практикум, методические указания по самостоятельной работе, контрольно-измерительные материалы «Современные проблемы и методы биотехнологии. Банк тестовых заданий», наглядное пособие «Современные проблемы и методы биотехнологии. Презентационные материалы». Рассмотрены новейшие достижения, направления исследования и практической реализации биотехнологической науки XXI в. Охарактеризованы революционные изменения комплекса наук биологического направления в области генетической инженерии, геномике и протеомике, новейшие достижения молекулярной биотехнологии. Предназначено для студентов направления подготовки магистров 020200.68 «Биология» укрупненной группы 020000 «Естественные науки». © Сибирский федеральный университет, 2009 Рекомендовано к изданию Инновационно-методическим управлением СФУ Разработка и оформление электронного образовательного ресурса: Центр технологий электронного обучения Информационно-телекоммуникационного комплекса СФУ; лаборатория по разработке мультимедийных электронных образовательных ресурсов при КрЦНИТ Содержимое ресурса охраняется законом об авторском праве. Несанкционированное копирование и использование данного продукта запрещается. Встречающиеся названия программного обеспечения, изделий, устройств или систем могут являться зарегистрированными товарными знаками тех или иных фирм. Подп. к использованию 30.11.2009 Объем 12 Мб Красноярск: СФУ, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 Оглавление ПРЕДИСЛОВИЕ ........................................................... 8 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» .......... 9 1.1. Роль биотехнологии в современном мире ....................................... 9 1.1.1. Биотехнология – основа научно-технического прогресса и повышения качества жизни человека ....................................................................................... 10 1.1.2. Особенности развития исследований и коммерциализации биологических технологий в США, Японии, странах ЕС и России ................ 11 1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов ................................................................................................... 30 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии ........................ 34 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий ............................................................................... 45 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ .................................. 51 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии ...................................................................................... 51 2.1.1. Рестриктазы и другие ферменты для молекулярного клонирования 52 2.1.2. Полимеразная цепная реакция ................................................................... 54 2.1.3. Общая схема молекулярного клонирования ............................................ 56 2.1.4. основные типы клонирующих векторов ................................................... 58 2.1.5. Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды.................................................................................................................. 63 2.1.6. Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку ........................................ 66 2.1.7. Проблемы экспрессии чужеродных генов ............................................... 73 2.1.8. Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов ................................................................................... 74 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры .............. 76 2.2.1. Рекомбинантные микроорганизмы для получения коммерческих продуктов ................................................................................................................. 77 2.2.2. Клеточные культуры для продукции белков ........................................... 81 2.2.3. Дрожжевые системы экспрессии ............................................................... 83 2.2.4. Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза белков ....................... 83 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы ................. 84 2.3.1. Конструирование трансгенных растений.................................................. 86 2.3.2. Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе . 91 2.3.3. Области применения генной инженерии растений.................................. 94 2.3.4. Коммерциализация трансгенных растений и биобезопасность .......... 98 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 3 ОГЛАВЛЕНИЕ 2.3.5. Регулирование производства и сертификация генномодифицированного сырья и пищевых продуктов........................................ 102 2.3.6. Трансгенные животные: технологии получения ................................... 103 2.3.7. Применение трансгенных животных ....................................................... 111 2.3.8. Перспективы использования генетически модифицированных организмов ............................................................................................................. 116 ГЛАВА 3. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ....................................................... 119 3.1. Геном человека ................................................................................... 119 3.1.1. Реализация научного проекта «Геном человека» .................................. 120 3.1.2. Построение генетических карт хромосом ............................................... 122 3.1.3. Практическое значение результатов секвенирования генома человека.................................................................................................................. 127 3.2. Методы молекулярной диагностики ............................................... 130 3.2.1. Методы иммунодиагностики – основные закономерности и разнообразие ...................................................................................................... 130 3.2.2. Методы диагностики, основанные на ДНК-гибридизации ................... 135 3.3. Основы молекулярной терапии ...................................................... 144 3.3.1. Генная терапия ............................................................................................ 145 3.3.2. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов....................... 152 3.3.3. Клонирование человека ............................................................................. 157 ГЛАВА 4 КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ................................................................ 159 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений ....................................................................................................... 159 4.1.1. Тотипотентность растительной клетки ................................................... 159 4.1.2. Исторические этапы развития методов культивирования in vitro .... 160 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro .................. 164 4.2.1. Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов.......... 165 4.2.2. Гормоны и регуляторы роста – необходимые компоненты питательных сред ................................................................................................. 170 4.2.3. Стерилизация питательных сред ............................................................. 173 4.2.4. Основные требования к условиям культивирования .......................... 175 4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений ........................................................... 176 4.3.1. Основные направления использования ................................................. 176 4.3.2. Проблемы культивирования изолированных тканей .......................... 177 4.4. Клональное микроразмножение растений .................................... 179 4.4.1. Этапы и методы клонального микроразмножения растений .............. 180 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 4 ОГЛАВЛЕНИЕ 4.4.2. Оздоровление посадочного материала растений ................................. 186 4.5. Культура каллусных тканей ............................................................. 189 4.5.1. Особенности каллусных клеток................................................................ 191 4.5.2. Генетика каллусных клеток ....................................................................... 192 4.5.3. Морфогенез в каллусных тканях .............................................................. 193 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей .............................. 196 4.6.1. Прямой и непрямой пути органогенеза ................................................... 196 4.6.2. Соматический эмбриогенез ....................................................................... 198 4.6.3. Сомаклональная изменчивость................................................................ 200 4.6.4. Гормоннезависимые растительные ткани ............................................. 203 4.7. Суспензионные культуры................................................................. 205 4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток ...................................................................................... 207 4.9. Культура протопластов ..................................................................... 209 4.9.1. Изоляция протопластов ............................................................................. 209 4.9.2. Тотипотентность протопластов ................................................................ 211 4.9.3. Требования к составу сред при культивировании протопластов ..... 212 4.9.4. Использование культуры протопластов ................................................ 213 4.10. Культура гаплоидных тканей ......................................................... 217 4.10.1. Культура пыльников ................................................................................ 218 4.10.2. Использование гаплопродюссеров и отдаленной гибридизации при получении гаплоидных тканей .................................................................... 220 4.10.3. Возможности гаплоидных технологий .................................................. 222 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам...................................................................................................... 222 4.11.1. Использование токсинов фитопатогенов в отборе форм растений, устойчивых к болезням ....................................................................................... 223 4.11.2. Выделение солеустойчивых форм растений путем прямой и непрямой селекции в культуре ткани ............................................................. 224 4.11.3. Отбор холодоустойчивых форм ............................................................ 225 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ......................................................... 227 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века .................................. 227 5.1.1. Полимеры: определение, виды, области применения ........................ 228 5.1.2. Проблема накопления и пути утилизации полимерных отходов ...... 232 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов ................................................................................ 236 5.2.1. Перспективы получения и утилизации разрушаемых полимеров на основе возобновляемых природных источников .................................... 237 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 5 ОГЛАВЛЕНИЕ 5.2.2. Придание биоразрушаемости высокомолекулярным синтетическим полимерам .............................................................................................................. 239 5.2.3. Синтез биоразрушаемых биополимеров ............................................... 241 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы .................. 243 5.3.1. Биоупаковка – альтернатива синтетическому пластику ...................... 247 5.3.2. Современное состояние и направление работ по разрушаемым биопластикам ......................................................................................................... 248 5.3.3. Факторы, влияющие на развитие производства разрушаемых биопластиков ......................................................................................................... 249 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков .............................................................................................. 253 5.4.1. Природные источники сырья для синтеза разрушаемых биопластиков ......................................................................................................... 253 5.4.2. Синтез, свойства, области применения разрушаемых биопластиков на основе молочной кислоты ............................................................................. 258 5.4.3. Полигидроксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры гидроксипроизводстных алкановых кислот: синтез, свойства, области применения ............................................................................................................ 262 5.5. Перспективы развития индустрии и рынка разрушаемых биополимеров ............................................................................................ 274 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ ........... 276 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта................ 276 6.1.1. Продукты биотехнологического производства ..................................... 276 6.1.2. Общие принципы разделения веществ ................................................... 280 6.1.3. Методы разрушения клеток ....................................................................... 282 6.1.4. Отделение и очистка продукта.................................................................. 283 6.1.5. Методы тонкой очистки и разделения препаратов .............................. 284 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для определения количественных и качественных характеристик целевых продуктов биотехнологии............................ 297 6.2.1. Основные виды хроматографии .............................................................. 298 6.2.2. Основные закономерности хроматографического разделения в колонке ................................................................................................................ 299 6.2.3. Газовая хроматография ............................................................................. 305 6.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография............................... 317 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии ........................................... 327 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ ............................................... 341 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов ......... 341 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 6 ОГЛАВЛЕНИЕ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии ................. 345 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста ............................................................................................................. 354 7.4. Элементный баланс роста микробных культур ........................ 358 7.5. Ферментационное оборудование .................................................... 364 7.5.1. Экспериментальные данные тепломассообмена при культивировании микроорганизмов .......................................................... 364 7.5.2. Характеристика газожидкостных биореакторов .................................... 368 7.5.3 Приемы и способы стерилизации в биотехнологии ............................. 379 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы ...................... 385 7.6.1. Выпарные пленочные аппараты ............................................................. 385 7.6.2. Флотаторы в микробиологической промышленности ........................ 391 7.6.3. Центрифуги и сепараторы ......................................................................... 393 7.6.4. Сушилки в биотехнологической промышленности.............................. 403 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................... 412 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ .......................................... 413 К главе 1 ....................................................................................................... 413 К главе 2 ....................................................................................................... 413 К главе 3 ....................................................................................................... 414 К главе 4 ....................................................................................................... 415 К главе 5 ....................................................................................................... 416 К главе 6 ....................................................................................................... 416 К главе 7 ....................................................................................................... 418 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 7 ПРЕДИСЛОВИЕ Достижения современной биологии, приведшие к формированию физико-химической биологии и комплекса новейших направлений биотехнологии, качественно влияют на многие сферы человеческой деятельности и все в большей степени становятся востребованными и способными решать ключевые проблемы жизнеобеспечения человека. Многообразие форм живой материи и новые знания о закономерностях функционирования живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации для синтеза широчайшего спектра ценных соединений. Необходимость повышения качества жизни человека делает все более актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых продуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чистых материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоносителей и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов. Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности, базируясь на каталитическом потенциале биологических агентов и систем различной степени организации и сложности. Биотехнология как область знаний и динамически развиваемая промышленная отрасль способна решать многие ключевые проблемы современности, обеспечивая при этом сохранение баланса в системе взаимоотношений «человек – природа – общество». Поэтому освоение новых биотехнологических процессов и подготовка специалистов-биотехнологов занимают важное место в научно-образовательной деятельности и экономической политике всех развитых стран. Учебное пособие «Современные проблемы и методы биотехнологии» предназначено для подготовки в рамках учебной программы «Микробиология и биотехнология» магистров, вооруженных новейшими знаниями в области современной биологии, необходимыми для решения ключевых проблем XXI в., направленных на сохранение и устойчивое развитие биосферы и повышения качества жизни человека в условиях возрастающего антропогенного воздействия. Данная дисциплина введена в учебный процесс в Институте фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета с 2008 г. в связи с открытием магистратуры и подготовки магистров по направлению «Микробиология и биотехнология». Информация, изложенная в учебном пособии, призвана обеспечить формирование у студентов представлений о революционных изменениях новейших направлений биотехнологии в области генетической инженерии, геномики и протеомики, новых технологиях диагностики и терапии, новых материалах и биоинженерии. Научный редактор, доктор биологических наук, профессор Т. Г. Волова Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 8 Г ЛА В А 1 ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности, базируясь на использовании каталитического потенциала биологических агентов и систем различной степени организации и сложности – микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. Развитие и преобразование биотехнологии обусловлено глубокими переменами, происшедшими в биологии в течение последних 25–30 лет. Основу этих событий составили новые представления в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. В то же время нельзя не отметить, что развитие и достижения биотехнологии теснейшим образом связаны с комплексом знаний не только наук биологического профиля, но также и многих других. Расширение практической сферы биотехнологии обусловлено также социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные проблемы, стоящие перед человечеством на пороге ХХI в., как дефицит чистой воды и пищевых веществ (особенно белковых), загрязнение окружающей среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость получения новых, экологически чистых материалов, развития новых средств диагностики и лечения, не могут быть решены традиционными методами. Поэтому для жизнеобеспечения человека, повышения качества жизни и ее продолжительности становится все более необходимым освоение принципиально новых методов и технологий. Развитие научно-технического прогресса, сопровождающееся повышением темпов материальных и энергетических ресурсов, к сожалению, приводит к нарушению баланса в биосферных процессах. Загрязняются водные и воздушные бассейны городов, сокращается воспроизводительная функция биосферы, вследствие накопления тупиковых продуктов техносферы нарушаются глобальные круговоротные циклы биосферы. Стремительность темпов современного научно-технического прогресса человечества образно описал швейцарский инженер и философ Эйхельберг: «Полагают, что возраст человечества равен 600 000 лет. Представим себе движение человечества в виде марафонского бега на 60 км, который где-то начинаясь, идет по направлению к центру одного из наших городов, как к финишу… Большая часть дистанции пролегает по весьма трудному пути – через девственные леса, и мы об этом ничего не знаем, ибо только в самом Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 9 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире конце, на 58–59 км бега, мы находим, наряду с первобытным орудием, пещерные рисунки, как первые признаки культуры, и только на последнем километре появляются признаки земледелия. За 200 м до финиша дорога, покрытая каменными плитами, ведет мимо римских укреплений. За 100 м бегунов обступают средневековые городские строения. До финиша остается 50 м, где стоит человек, умными и понимающими глазами следящий за бегунами, – это Леонардо да Винчи. Осталось 10 м! Они начинаются при свете факелов и скудном освещении масляных ламп. Но при броске на последних 5 м происходит ошеломляющее чудо: свет заливает ночную дорогу, повозки без тяглового скота мчатся мимо, машины шумят в воздухе, и пораженный бегун ослеплен светом прожекторов фото- и телекамер...», т.е. за 1 м человеческий гений совершает ошеломляющий рывок в области научно-технического прогресса. Продолжая этот образ, можно добавить, что в момент приближения бегуна к финишной ленточке оказывается прирученным термоядерный синтез, стартуют космические корабли, расшифрован генетически код. Автор задает вопрос: не окажется ли судьба человечества судьбой бегуна и не путь ли к гибели человечества столь стремительное развитие научно-технического прогресса? 1.1.1. Биотехнология – основа научно-технического прогресса и повышения качества жизни человека Биотехнология как область знаний и динамически развиваемая промышленная отрасль призвана решить многие ключевые проблемы современности, обеспечивая при этом сохранение баланса в системе взаимоотношений «человек – природа – общество», ибо биологические технологии (биотехнологии), базирующиеся на использовании потенциала живого по определению нацелены на дружественность и гармонию человека с окружающим его миром. В настоящее время биотехнология подразделяется на несколько наиболее значимых сегментов: это «белая», «зеленая», «красная», «серая» и «синяя» биотехнология. К «белой» биотехнологии относят промышленную биотехнологию, ориентированную на производство продуктов, ранее производимых химической промышленностью, – спирта, витаминов, аминокислот и др. (с учетом требований сохранения ресурсов и охраны окружающей среды). Зеленая биотехнология охватывает область, значимую для сельского хозяйства. Это исследования и технологии, направленные на создание биотехнологических методов и препаратов для борьбы с вредителями и возбудителями болезней культурных растений и домашних животных, создание биоудобрений, повышение продуктивности растений, в том числе с использованием методов генетической инженерии. Красная (медицинская) биотехнология – наиболее значимая область современной биотехнологии. Это производство биотехнологическими методами диагностикумов и лекарственных препаратов с использованием техно Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 10 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире логий клеточной и генетической инженерии (зеленые вакцины, генные диагностикумы, моноклональные антитела, конструкции и продукты тканевой инженерии и др.). Серая биотехнология занимается разработкой технологий и препаратов для защиты окружающей среды; это рекультивация почв, очистка стоков и газовоздушных выбросов, утилизация промышленных отходов и деградация токсикантов с использованием биологических агентов и биологических процессов. Синяя биотехнология в основном ориентирована на эффективное использование ресурсов Мирового океана. Прежде всего, это использование морской биоты для получения пищевых, технических, биологически активных и лекарственных веществ. Современная биотехнология – это одно из приоритетных направлений национальной экономики всех развитых стран. Путь повышения конкурентности биотехнологических продуктов на рынках сбыта является одним из основных в общей стратегии развития биотехнологии промышленно развитых стран. Стимулирующим фактором выступают специально принимаемые правительственные программы по ускоренному развитию новых направлений биотехнологии. Госпрограммы предусматривают выдачу инвесторам безвозмездных ссуд, долгосрочных кредитов, освобождение от уплаты налогов. В связи с тем что проведение фундаментальных и ориентированных работ становится все более дорогостоящим, многие страны стремятся вывести значительную часть исследований за пределы национальных границ. Как известно, вероятность успеха осуществления проектов НИОКР в целом не превышает 12–20 %, около 60 % проектов достигают стадии технического завершения, 30 % – коммерческого освоения и только 12 % оказываются прибыльными. 1.1.2. Особенности развития исследований и коммерциализации биологических технологий в США, Японии, странах ЕС и России США. Лидирующее положение в биотехнологии по промышленному производству биотехнологических продуктов, объемам продаж, внешнеторговому обороту, ассигнованиям и масштабам НИОКР занимают США, где уделяется огромное внимание развитию данного направления. В этом секторе к 2003 г. было занято свыше 198 300 чел. [1]. Ассигнования в этот сектор науки и экономики в США значительны и составляют свыше 20 млрд дол. США ежегодно [2]. Доходы биотехнологической индустрии США выросли с 8 млрд дол. в 1992 г. до 39 млрд дол. в 2003 г. Эта отрасль находится под пристальным вниманием государства. Так, в период становления новейшей биотехнологии и возникновения ее направлений, связанных с манипулированием генетическим материалом, в середине 70-х гг. прошлого столетия конгресс США уделял большое внимание вопросам безопасности генетических Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 11 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире исследований. Только в 1977 г. состоялось 25 специальных слушаний и было принято 16 законопроектов. В начале 90-х гг. акцент сместился на разработку мер по поощрению практического использования биотехнологии для производства новых продуктов. С развитием биотехнологии в США связывают решение многих ключевых проблем: энергетической, сырьевой, продовольственной и экологической. Среди биотехнологических направлений, близких к практической реализации или находящихся на стадии промышленного освоения, следующие: – биоконверсия солнечной энергии; – применение микроорганизмов для повышения выхода нефти и выщелачивания цветных и редких металлов; – конструирование штаммов, способных заменить дорогостоящие неорганические катализаторы и изменить условия синтеза для получения принципиально новых соединений; – применение бактериальных стимуляторов роста растений, изменение генотипа злаковых и их приспособление к созреванию в экстремальных условиях (без вспашки, полива и удобрений); – направленный биосинтез эффективного получения целевых продуктов (аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, пищевых добавок, фармакологических препаратов; – получение новых диагностических и лечебных препаратов на основе методов клеточной и генетической инженерии. Роль лидера США обусловлена высокими ассигнованиями государства и частного капитала на фундаментальные и прикладные исследования. В финансировании биотехнологии ключевую роль играют Национальный научный фонд (ННФ), министерства здравоохранения и социального обеспечения, сельского хозяйства, энергетики, химической и пищевой промышленности, обороны, Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА), внутренних дел. Ассигнования выделяются по программно-целевому принципу, т.е. субсидируются и заключаются контракты на исследовательские проекты. При этом крупные промышленные компании устанавливают деловые отношения с университетами и научными центрами. Это способствует формированию комплексов в той или иной сфере, начиная от фундаментальных исследований до серийного выпуска продукта и поставки на рынок. Такая «система участия» предусматривает формирование специализированных фондов с соответствующими экспертными советами и привлечение наиболее квалифицированных кадров. При выборе проектов с высокой коммерческой результативностью стало выгодным использовать так называемый «анализ с учетом заданных ограничений». Это позволяет существенно сократить сроки реализации проекта (в среднем с 7–10 до 2–4 лет) и повысить вероятность успеха до 80 %. Понятие «заданные ограничения» включают потенциальную возможность успешной продажи продукта и получения прибыли, увеличения годового производства, конкурентоспособность продукта, потенциальный риск с позиций сбыта, возможности перестройки производства с учетом новых достижений и т.д. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 12 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире Ежегодные общие государственные расходы США на генно-инженерные и биотехнологические исследования составляют миллиарды долларов. Инвестиции частных компаний существенно превосходят эти показатели. Только на создание диагностических и противоопухолевых препаратов ежегодно выделяется несколько миллиардов долларов. В основном это следующие направления: методы рекомбинации ДНК, получение гибридов, получение и применение моноклональных антител, культуры тканей и клеток. В США стало обычным, когда компании, не связанные ранее с биотехнологией, начинают приобретать пакеты акций действующих компаний и строить собственные биотехнологические предприятия (табл. 1.1). Это, например, практика таких химических гигантов, как Philips Petrolium, Monsanto, Dow Chemical. Около 250 химических компаний имеют в настоящее время интересы в области биотехнологии. Так, у гиганта химической индустрии США – компании De Pont есть несколько биотехнологических комплексов стоимостью 85–150 тыс. дол. со штатом 700–1 000 чел. Подобные комплексы созданы в структуре Monsanto, более того, в настоящее время до 75 % бюджета (свыше 750 млн дол.) направляется в сферу биотехнологии. В сфере внимания этих компаний – производство генно-инженерного гормона роста, а также ряда генно-инженерных препаратов для ветеринарии и фармакологии. Кроме этого, фирмы совместно с университетскими исследовательскими центрами подписывают контракты на проведение совместных НИОКР. Таблица 1.1 Крупнейшие концерны и фармацевтические фирмы США, производящие медицинские биотехнологические препараты Фирмы, компании США GENENTECH BIOGEN AMGEN CETUS CHIRON GENETICS INST. CALIFORNIA JOHNSON & JOHNSON MONSANTO SYNTEX DU PONT SMITH KLINE & FRENCH АВВОТ Выпускаемые препараты Альфа-, бета- и гамма-интерфероны Фактор опухолевого некроза 1-, 2-, 3- и 4-интерлейкины Инсулин. Эритропоэтин Соматотропин. Урокиназа Лимфотоксин. Тканевой активатор плазминогена Фактор трансформации роста. Сывороточный альбумин Вакцина против гепатита В Супероксиддимутаза Моноклональные антитела к цитокининам. Фактор роста нервов. Фактор роста костей Фактор роста фибробластов Белок С. Ангиогенин Тромболитические ферменты Фактор активации макрофагов Ингибиторы ренина Существует мнение, что все необходимые условия для становления и развития биотехнологии в США подготовил венчурный бизнес. Для крупных фирм и компаний венчурный бизнес является хорошо отработанным прие Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 13 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире мом, позволяющим за более короткий срок получить новые разработки, привлекая для этого мелкие фирмы и небольшие коллективы, нежели заниматься этим собственными силами. Например, в 80-е гг. General Electric с помощью мелких фирм стал осваивать производство биологически активных соединений, только в 1981 г. его рисковые ассигнования в биотехнологии составили 3 млн дол. Риск с участием мелких фирм обеспечивает крупным компаниям и корпорациям механизм отбора экономически оправданных нововведений с большими коммерческими перспективами. Несомненные успехи и лидерство США в биотехнологии обусловлены также особым вниманием к роли специалистов. Подготовка специалистовбиотехнологов является одним из важнейших элементов образовательной политики США. Ф. Хэндер, будучи президентом Национальной академии наук США, отмечал, что в науке «блестящее» имеет существенно большее значение, чем просто «очень хорошее» и два средних научных открытия не составляют вместе одного крупного, а большое число посредственных ученых не может заменить одного первоклассного. Таким образом, лидерство США обеспечивается не только большими вложениями в сферу биотехнологии, но и мощной кооперацией университетской науки с частными фирмами и компаниями, в том числе за счет создания сети дочерних филиалов как в США, так и за рубежом. Для удержания лидерства необходимо наращивание объемов вложений в эту отрасль, удержание рынков сбыта, а также ликвидация постоянно возникающего дефицита специалистов в новейших биотехнологических направлениях. Быстрое развитие биотехнологии в США обусловлено также притоком капитала из других стран. К концу 2000 г. в США было зарегистрировано свыше 200 совместных биотехнологических компаний, в том числе 98 с японскими фирмами и 46 с западно-европейскими. В 2005 г. общее число биотехнологических фирм в США, по оценке Medаd News, достигло 500, причем отмечена тенденция к созданию интегрированных крупных биофармацевтических фирм и их отделений. Разработка противоопухолевых лекарственных средств является приоритетным направлением биотехнологических исследований в США. Около 60 % препаратов из общего количества разрабатываемых биотехнологических средств предназначено для лечения онкологических заболеваний или связанных с ними проблем. Ряд генноинженерных препаратов, находящихся на разных стадиях клинических исследований, являются потенциальными средствами для лечения СПИДа и профилактики ВИЧ-инфекции. Общий объем инвестиций в биотехнологические компании США составил в 2005 г. около 20 млрд дол. Около 75 % объема инвестиций было получено за счет продажи акций биотехнологических компаний на бирже, оставшиеся 25 % пришлись на вложения венчурных фондов и других частных инвесторов. Всего на IPO свои акции в 2005 г. раз- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 14 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире местили 30 биотехнологических компаний. К сожалению, пока почти единственными биотехнологическими компаниями, которым доступно привлечение средств путем выхода на IPO, являются американские компании. Ситуация постепенно меняется, но в основном эти сделки носят разовый характер. При этом инвесторы предъявляют повышенные требования по срокам реализации проекта и получения прибыли. Серьезное внимание развитию биотехнологии уделяется в странах Европейского содружества, где в 2005 г. суммарный европейский биотехнологический рынок достиг 100 млрд евро. Очень сильны биотехнологические позиции Южной Кореи и Японии. Япония. Опыт нововведений и коммерческий успех Японии в области биотехнологии интересны и весьма поучительны. Как известно, в конце 70 – начале 80-х гг. Япония была вынуждена пересмотреть свою научнотехническую стратегию. При сохранении важной роли импортера биотехнологической промышленности резко возросли расходы на научные исследования и опытно-конструкторские разработки. За разработку и реализацию государственных биотехнологических программ в основном отвечает Министерство внешней торговли и промышленности (МВТП), Министерство сельского, лесного хозяйства и рыболовства и Агентство по науке и технике. Государством совместно с частным сектором была разработана десятилетняя программа (1981–1990 гг.) развития биотехнологии и микробиологии, на которую было ассигновано свыше 500 млн дол. В сфере обозначенных приоритетов программы были: – форсирование работ, связанных с селекцией микробных штаммов; – разработка методов рекомбинации ДНК и гибридизации клеток, иммобилизации ферментов и клеток; – разработка технологий и аппаратурного оформления биотехнологических процессов. Если в 1940 г. в Японии биотехнологии как промышленной отрасли не существовало, то в 1975 г. объемы производства составили, тыс. т/год: аминокислот – 67; ферментов – 13; витаминов – 7; органических кислот – 24. Если в 1982 г. Япония купила лицензию на производство генно-инженерного инсулина у США, то уже в 1986 г. внедрила на внутренний рынок собственные препараты инсулина с торговой маркой Humulin®. В 1984 г. был получен генно-инженерный пептидный гормон соматомедин, стимулирующий рост и способствующий делению клеток хрящевых тканей, а также снижающий уровень сахара в крови. Фирма Santory первой получила рекомбинантные штаммы E.coli – продуценты человеческого гормона аурикулина, снижающего кровяное давление; налажен также выпуск вакцин против вируса гепатита В. Количество фирм, занятых в области биотехнологии, достигло в 1981 г. 100; в 1990-х гг. – 300; в настоящее время – около 800 (табл. 1.2). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 15 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире Таблица 1.2 Крупнейшие концерны и фирмы Японии, производящие биотехнологические препараты Фирмы, компании Японии AJINOMOTO SHIONOGI DAIICHI SEIYAKU GREEN CROSS KYOWA HAKKO MITSUBISHI CHEM. IND. MOSHIDA PHARMACEUTICA TOYZO JOZO TAKEDA CHEM. IND. Выпускаемые препараты Альфа-, бета- и гамма-интерфероны Фактор опухолевого некроза 1-, 2-интерлейкины Cупероксидаза. Проинсулин. Инсулин Эритропоэтин. Соматотропин. Урокиназа Тканевой активатор плазминогена. Вакцина против гепатита В. Фактор опухолевого некроза Лимфотоксин. Сывороточный альбумин Проурокиназа. Супероксиддимутаза Моноклональные антитела к цитокининам Ощутимые преимущества японской биотехнологии связывают, прежде всего, со сложной и постоянно совершенствующейся научно-технической базой, технической сложностью вырабатываемых продуктов и быстрыми темпами ее обновления и замены. Особо следует подчеркнуть гибкость экономического механизма, обеспечивающего структурную маневренность и адаптивность к меняющимся условиям сбыта на внешних рынках и направленную политику государства, которое определяет стратегию для частных корпораций, активно поддерживает наукоемкие производства и принимает определенные меры к некоторому сокращению традиционных отраслей микробного синтеза. Успех реализации биотехнологических программ напрямую связывают с перспективами национального бизнеса и считают индикатором национальной безопасности страны. Большое внимание в Японии уделяется морской («синей») биотехнологии, включая скрининг полезных морских организмов, исследование их функций и разработку техники культивирования. В сфере пристального внимая также находятся создание банков клеточных культур и генов морских организмов, получение биологически активных соединений, синтезируемых морскими бактериями, адсорбированными на поверхности водорослей; регенерация тяжелых металлов; получение сверхтонких порошков магнетиков с использованием морских бактерий. Реализуются проекты получения фотоводорода в биореакторах с морскими фотосинтезирующими бактериями. Ключевыми считаются также проекты, ориентированные на выделение и модификацию микроорганизмовпродуцентов полисахаридов, разрушаемых биопластиков, линолевой и эйкозопентаеновой кислот, фикоцианина, каратиноидов и других пигментов, биоудобрений и биогаза. Активно финансируются проекты, рассматривающие возможности моделирования сенсорно-физиологических процессов с использованием морских беспозвоночных животных; выделение из рыб генов, контролирующих синтез гормонов и клонирование их в E.coli. Япония стала лидером в области промышленного производства продуктов на основе иммоби- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 16 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире лизованных ферментов (это аминокислоты, глюкозо-фруктозные сиропы, органические кислоты), а также техники культивирования клеток при высоком давлении для получения углеводов, липидов, белков. В Японии на государственном уровне поощряется развитие новых технологий. У отдельных зарубежных фирм и компаний государство закупает лицензии и патенты и на льготных условиях предлагает их внедрять японским компаниям. Так, при освоении и выпуске новых препаратов фирмам предоставляются налоговые льготы в размере 25 %, по некоторым – до 50 %. Компаниям, наладившим производство особо важных продуктов, в первый год выпуска разрешается повышать прямые амортизационные отчисления в размере до 25 % от общего объема продаж. Под особым контролем находятся следующие направления развития биотехнологии: – методы рекомбинантных ДНК, крупномасштабное производство культур клеток и тканей, биореакторы, биоэлектроника (биочипы); – разработка технологий и производство продуктов специального назначения с применением биоты моря; – обработка и очистка воды с применением биотехнологии; – технологическая биоэнергетика (производство топливного спирта, биологическое использование солнечной энергии); – изучение функций головного мозга с целью применения результатов в электронике и других отраслях промышленности. В последние 10–15 лет биотехнология в Японии развивалась настолько быстро, что бросила серьезный вызов американскому мировому лидерству в этой области. Расширение производства и рынка биотехнологических препаратов и новых материалов привело к тому, что ежегодно объем промышленной продукции в Японии возрастает на 5–7 %. Следует отметить, что собственно производство продуктов биотехнологии в Японии, выступая как новая динамичная отрасль, стимулирует процесс структурной перестройки экономики страны в целом. При этом крупные корпорации и компании, не связанные ранее с биотехнологией, переориентируют свои производства в эту сторону. Так, из-за падения спроса на сталь самая крупная сталелитейная компания Nippon Steel к 2000 г. планировала выделить около 20 % своего денежного оборота на развитие биотехнологии и электроники. Свыше 300 крупных фирм повысили к концу столетия свои активы и обороты на 10 % в результате освоения и выпуска биотехнологической продукции. Большие надежды на биотехнологию возлагает химическая промышленность, особенно в области получения сверхчистых материалов и реагентов. Существует специальная программа создания электронных приборов, в основном блоков памяти, с использованием белков. Фирма Hitachi создала специальное подразделение для разработки биодатчиков и биочипов. Фирма Sharp первой начала фундаментальные исследования, ориентированные на разработку компьютеров с биологическими элементами. Специалисты считают, что переключатели, изготовленные на основе ферментов, могут работать эффективнее по сравнению с кремниевыми. Другой известный производитель радиоаппаратуры, фирма Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 17 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире Sony, создает на основе собственной разработки высококачественные акустические системы с использованием в качестве мембран бактериальной целлюлозы. Для реализации своих проектов, требующих больших вложений и времени, японские фирмы привлекают партнеров, ряд фирм сотрудничает с зарубежными университетами и компаниями. В настоящее время среди фирм резко возросло соперничество за право производства моноклональных антител. Более 50 фирм специализируются на выпуске моноклональных антител для диагностики онкологических заболеваний. Уже в конце 90-х гг. объем продаж диагностикумов на основе моноклональных антител достиг 250 млн дол., а номенклатура составила 100 препаратов. Проводятся активные исследования, ориентированные на разработку средств диагностики и лечения СПИД. В настоящее время 36 компаний занято в программе, разрабатывающей лекарства против данного заболевания. Среди разрабатываемых направлений – создание препаратов, непосредственно убивающих вирус иммунодефицита человека; против ассоциированных заболеваний; а также реагенты и оборудование для диагностики. Особое внимание в Японии уделяется поддержанию и развитию коллекций промышленных культур. Японская федерация коллекций культур сохраняет свыше 66 000 штаммов дрожжей, бактерий, микроскопических грибов. Коллекция культур Института ферментации поддерживает около 9 000 микробных культур. Созданы коллекции генов и культур клеток. На создание центра клеточных культур при биохимическом институте фирмы Hayashibara затрачено 130 млн дол. При Институте физических и химических соединений коллекция достигает 10 000 клеточных культур, а банк генов ежегодно увеличивается на 1 000 образцов. На поддержание штаммов и развитие коллекции в начале 90-х гг. было выделено более 3 млн дол. С учетом национальных интересов в настоящее время цель биотехнологических работ Японии ориентирована не на ликвидацию отставания от США, а на принципиально новые решения, на разработку новых технологий и новых видов продуктов. Крупные компании и корпорации скупают акции виднейших биотехнологических предприятий США. Так, компания Kubota приобрела 14 % акций американской компании Mycoghen (свыше 1 млн акций по цене 9 долларов за акцию). В настоящее время Япония уже вытесняет США с рынка биоинсектицидных биопрепаратов. В ближайшее время биотехнология Японии будет ориентирована на изучение, создание и расширение технологий на основе рекомбинантных ДНК с целью получения противоопухолевых и противовирусных диагностикумов и препаратов. Достижения инженерной энзимологии нацелены на создание биодатчиков для электроники. Приоритетная цель – получение генноинженерных микробных штаммов, способных не только продуцировать ферменты, гидроксилдирующие оргсоединения для получения целевых продуктов, но и разлагающие токсические соединения. В системе национальных приоритетов также обозначены: – получение новых материалов; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 18 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире – утилизация целлюлозосодержащих отходов для получения энергии; – создание систем оборотного водоснабжения, очистки стоков и извлечения из них полезных компонентов; – создание трансгенных растений с генетическими системами азотфиксации, уничтожения возбудителей заболеваний и вредителей, засухо- и соленоустойчивости. Страны ЕС. Биотехнология является приоритетом стратегической политики в стран ах ЕС. Первоочередной для стран Европы является принятая долгосрочная стратегия реализации проектов с высокой коммерческой окупаемостью. При этом усилия стран сосредоточены на недопущении отрыва темпов роста от уровня биотехнологии США и Японии. В национальных программах Германии, Франции, Великобритании и других обозначена необходимость усиления фундаментальных и опытно-конструкторских работ в области биотехнологии и увеличение инвестиций в промышленную сферу. Германия, наряду с США и Японией, входит в тройку мировых лидеров в области биотехнологии. Западно-германская биотехнология в 70–80 гг. зарождалась на базе высокоразвитой химической промышленности. В настоящее время в этой области, наряду с острой конкурентной борьбой, наметился определенный кризис с связи с расширением объемов производства ряда альтернативных экологически чистых биотехнологических препаратов и продуктов. Знаковым в расширении биотехнологической линии в ФРГ был так называемый «шок Хехста», когда этот крупнейший химический концерн инвестировал 67 млн дол. на биотехнологичские исследования, но не в своей стране, а в Массачусетский технологический институт США. Крупнейшая химическая тройка – Hochst, BASE, Bauer, а также фармацевтические компании Boehringer и Schering составляют основной биотехнологический потенциал страны. Руководители этих компаний провозгласили: «Эра массовых вложений в нефтепереработку миновала, и сегодня главной сферой инвестиций стала биотехнология, которой предстоит сыграть выдающуюся роль». Основным проводником политики стимулирования биотехнологии в Германии является Министерство научных исследований и технологий, которое контролирует самые крупные проекты, а также определяет выбор приоритетных направлений в биотехнологии. Финансируются как частные компании, так и различные институты (соотношение примерно 2:1). Крупнейшие генетические центры функционируют в Кельне (проблемы генетики растений), Гейдельберге (вирусология и онкологические диагностикумы и препараты для лечения) и Мюнхене (синтез наследственного материала и изучение последовательности генов). Приоритеты в области биотехнологии формируются в соответствии с национальной научно-технической политикой правительства. Среди них можно отметить следующие: – расширение и повышение эффективности нетрадиционных пищевых и кормовых добавок; – производство биоинсектицидов; – медицинские препараты на основе клеточных культур растений. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 19 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире К концу 90-х гг. были успешно реализованы программы получения интерферона, интерлейкинов, моноклональных антител, ферментных препаратов и др. В биотехнологические программы и проекты активно вовлечены крупнейшие концерны – автомобильные, машиностроительные, электротехнические. В последние годы все чаще решаются вопросы стимулирования развития биотехнологических промышленных производств через систему льготных кредитов и налогооблажений. Федеральное правительство поддерживает не только национальные, но и международные проекты, выделяя на это ежегодно значительные средства. Реализация наиболее важной научно-технической стратегии возложена на самоуправляемые, полностью или частично финансируемые государством такие крупные организации, как Общество Макса Планка и Общество биотехнологических исследований. Институты данных обществ совместно с центрами «большой науки», институтами биохимии в г. Мартинсрид, биологии и вирусологии в г. Тюбинге, биологии клетки в г. Ладенбург, работают в тесной связи с ведущими университетами страны. В Германии среди государственных мер содействия развитию биотехнологии следует выделить также косвенное стимулирование. Оно проявляется в регулировании амортизационных и налоговых льгот на капиталовложения в НИОКР. Основная цель косвенного стимулирования – ускорение широкого освоения нововведений, обычно не связанных в госпрограммами. Столкнувшись с превосходством биотехнологии США и Японии, деловые круги Германии решили усилить свое положение с помощью финансовых и технических связей со своими конкурентами. Так, по соглашению концерна «Хехст» и Гарвардского университета в нем был создан отдел молекулярной генетики. В течение 10 лет (до 1995 г.) концерн оплачивал исследования в области регуляции генов клеток эукариот, генетики микроорганизмов, иммунологии и молекулярной биологии растений (около 67 млн дол.) и получил права на производство и продажу новых препаратов. Другой пример – германская фирма Wacker-Chemie в течение ряда лет финансировала разработки американской фирмы Biotechnology Int. в области получения высокоочищенных аминокислот и препаратов для пищевой, химической и фармацевтической промышленности. После завершения исследований немецкая сторона занимается масштабированием новых технологий, выпуском и продажей новых продуктов на мировом рынке. Концерн «Хехст» основал свой биотехнологический центр в Японии; первый завод по выпуску генноинженерных лекарственных препаратов был пущен в конце 1990 г. Подобный подход приводит не только к быстрому росту исследовательского потенциала крупных фирм и корпораций, но и содействует ускоренной разработке новых биотехнологических процессов и продуктов, которые после их освоения поддерживают высокую конкурентоспособность германских компаний на мировом рынке сбыта. Франция также рассматривает биотехнологию как одно из наиболее привилегированных направлений научно-технического прогресса. В 1982 г. Национальным собранием страны были приняты законы по общим исследо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 20 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире ваниям и специальная программа в области биотехнологии. Это не только увеличило финансирование работ, но и улучшило экономические условия для внедрения новых разработок. Принятая правительством в 1982 г. «мобилизационная программа» Министерства научных исследований и технологий предусматривала увеличение к 1990 г. доли биотехнологической продукции страны на мировом биотехнологическом рынке с 7 до 10 %. На эту программу госсектор выделил 600 млн франков; параллельные вложения исследовательских центров и национальных корпораций при этом составили 1,1 млрд франков; через год (в 1983 г.) они были доведены до 14 млрд франков. Финансировались исследования и разработки в области генетической инженерии, конструирования биореакторов и строительства установок для получения биогаза, микробного получения пищевых и фармацевтических препаратов, охраны окружающей среды и др.; в 90-х гг. ассигнования государства в биотехнологию удвоились. В исследованиях по биотехнологии во Франции главенствуют научные центры больших компаний, связанные с университетскими лабораториями. Это фирма Eif Aquitaine, 67 % ее акций принадлежит государственным организациям; национализированные компании Rhone Poulens и Roussel Uclaf, 40 % акций которых принадлежат госсектору. Для усиления роли биотехнологии французские фирмы уделяют большое внимание кооперационным связям с иностранными партнерами в научно-технической и производственной сферах. Это совместные патентно-лицензионные соглашения, совместный сбыт продукции, приобретение контрольных пакетов акций иностранных партнеров. Так, Институт Пастера совместно с компанией Genetic Systems (США) учредили совместную организацию для производства и продажи разработанного во Франции диагностикума вируса СПИД; американская сторона контролировала продажу препарата в США и Канаде, Франция – в странах общего рынка. Аналогично США и Японии, во Франции многие компании химической, машиностроительной и прочей направленности, переключаются на первоочередные вложения в развитие биотехнологических направлений. Структурные перестройки экономики Великобритании во второй половине 80-х гг. не сократили ее отставание в области биотехнологии от США и Японии. По уровню расходов на парные исследования Великобритания занимает пятое место после США, Японии, Германии и Франции. Пытаясь ускорить научно-технический прогресс в области биотехнологии в конце 70-х – начале 80-х гг., государство начало финансировать главным образом промышленные исследования. Созданный при правительстве Комитет содействия развитию биотехнологии наметил на 10–20 лет перспективы развития биотехнологии. Были определены приоритетные направления и разработан комплекс исследований, содержащий 39 проектов по развитию биотехнологии в сельском хозяйстве, промышленности, медицине, ветеринарии и других областях, и выделено для этих целей 10 млн фунтов. Было разработано свыше 100 новых технологий. Далее была принята пятилетняя программа (1990– 1995 гг.), реализуемая в основном через Министерство торговли и промыш- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 21 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире ленности, на которую правительство выделило 30 млн фунтов стерлингов. Было определено четыре приоритетных направления: – разработка новых биотехнологических процессов; – улучшение конструкций ферментеров; – автоматизация и управление технологическими процессами; – обеспечение асептических условий при культивировании микроорганизмов. К выполнению этой программы подключились частные фирмы, в том числе Croda, Alcan, Wellcame, Scimat, Biotech. Systems, Smith Kline, Netlon и др. Далее было выделено дополнительное финансирование для развития техники иммобилизации ферментов, крупномасштабного культивирования клеток животных и растений, изучения и совершенствования микробиологических процессов. Намечены пути постановки новейших биотехнологичеких процессов для получения вакцины против СПИДа, создания банка моноклональных антител и продуктов рекомбинантных ДНК, клинические испытания противоопухолевых дианостикумов и препаратов на основе моноклональных антител. В 1983 г. с участием государственного торгового банка Великобритании, ассигновавшего 28,5 млн фунтов, была организована фирма National Enterprise Board. Частные компании создали фирму Celtech с начальным капиталом 12 млн фунтов стерлингов. Эта фирма стала самым крупным экспортером моноклональных антител и уже в 1987 г. поставила на мировой рынок около 3 кг продукта (при мировой потребности в 15 кг). Объем продаж Великобританией моноклональных антител составил в 1990 г. 2,1 млрд дол., а в 1995 г. – 4,1 млрд дол. Специалисты фирмы Celltech – мирового лидера в производстве моноклональных антител – ввели в производства мощности для получения антител, включающие эрлифтные аппараты объемом до 10 000 л, обеспечивающие длительность стерильной ферметации до 12 сут при концентрации антител в культуральной среде до 500 мг/л, а общий выход продукта составил до 6 кг, т.е. 50 % мирового производства (1 кг стоит 5 млн дол.). Таким образом, в результате этого рывка Великобритания не только существенно сократила отставание от США и Японии, но и обеспечила себе прочные позиции на товарных рынках среди основных конкурентов. В настоящее время Великобритания, выделяя финансирование на развитие биотехнологии, выполняет роль катализатора, предоставляя частному бизнесу определять и направления, и объемы перспективных вложений. Госсектор при этом переходит на контрактные формы отношений с частной промышленностью. Таким образом, делая определенные заказы на НИОКР фирмам, государство не ориентирует свои исследовательские центры на выполнение заказов промышленных компаний. Эти формы разделения труда в сфере НИОКР государство стимулирует и осуществляет проведение фундаментальных и прикладных исследований, а сопутствующие разработки проводятся фирмами. На мировом рынке фармацевтические препараты Великобритании отличаются высокой конкурентоспособностью. Этому способствуют большие отчисления фармацевтических фирм на разработку новых пре Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 22 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире паратов и диагностикумов, достигающие 15 % от общего объема продаж (около 800 млн фунтов). Существенную поддержку от государства получают университеты и научно-исследовательские институты. Увеличенные в начале 90-х гг. ассигнования государства позволили создать два новых биотехнологических центра: в Эдинбурге (исследование трансгенных животных, например создание овец, продуцирующих с молоком необходимые для человека белковые продукты) и в Кембридже (белковая инженерия и молекулярные воздействия, создание антител с заранее заданными свойствами). Значительные средства выделяются для изучения организации генома растений и клонирования растительных генов. Министерством торговли и промышленности ассигновано 500 тыс. фунтов стерлингов на создание национальной коллекции культур клеток животных, которая стала крупнейшим депозитарием подобных объектов в Европе, в коллекции поддерживается свыше 20 000 клеточных клонов. Наряду с продвижением в области новейших биотехнологий, в Англии активно происходят перестройка и модернизация традиционных микробиологических производств получения продуктов для пищевой сферы и сельского хозяйства. Это глюкозо-фруктозные сиропы, подсластители, ксатан пищевого назначения, знаменитый заменитель мяса – биомасса гриба Fusarium graminearum, культивируемого на сахаросодержащих субстратах. Созданы пищевые аналоги свинины, куриного мяса, ветчины и мясных паштетов. Производство пищевого белка на основе данного гриба составляет 60–80 тыс. т/год. В настоящее время до 40 % мирового рынка ферментных препаратов для кормов принадлежит Великобритании. Широкое распространение получили английские биопрепараты для защиты растений – биоинсектициды на основе грибов, эффективные по отношению к щитовкам и тлям. Большим спросом пользуется вирусный препарат вирокс, эффективный против соснового пильщика, а также бактериальные препараты биовит и скитал, эффективные против гусениц и личинок. Кроме того, все больший вес приобретают наукоемкие технологии. К примеру, Великобритания разработала на основе моноклональных антител метод определения стельности коров. Создано семейство препаратов «аверметкитинов» на основе метаболитов почвенных стрептомицетов, которые в 10 раз эффективнее в отношении почвенных нематод по сравнению с химическими ядохимиками. Великобритания была первой в освоении производства и выпуска биодеградируемого пластика Биопол®. В Австрии биотехнология считается одной из отраслей, на которую возлагаются надежды развития экономики. С точки зрения национального развития Вена обладает самым высоким международным потенциалом. Австрийские предприятия делают основную ставку, прежде всего, на «красную» биотехнологию, т.е. на развитие и выпуск медицинских препаратов. Среди крупных производителей биотехнологической продукции – Лайф Сайенс Аустриа (LISA), Регион Вены, Аустриан Биотех Индастри, Центр биологии в Иннсбруке, Институт молекулярной биотехнологии (IMBA), Институт Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 23 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире молекулярной биологии растений (GMI) им. Грегора Менделя, Центр инноваций и технологий ГмбХ (ZIT) и др. К самым крупным предприятиям в области биотехнологий в Австрии относятся компания «Бакстер», «Амген» и «Новартис». Многочисленные специальные высшие учебные заведения активизируют учебные программы для подготовки современных специалистовбиотехнологов. Среди биотехнологических приоритетов Австрии обозначены: – разработка препаратов для фармацевтической промышленности; – создание продуктов питания, безопасных консервантов и усилителей вкуса; – разработка биотехнологических способов очистки стоков, отходов, газовых выбросов; – создание экологически чистых полимерные материалы; – биоинженерное оформление исследований и производств; – развитие, сбыт и консультирование в области биотехнологических приборов и оборудования. Таким образом, во всех высокоразвитых странах биотехнологии уделяется очень существенное внимание, при этом прогноз и стратегия развития данной отрасли находятся под пристальным вниманием государства. В настоящее время на мировом рынке стремительными темпами нарастают объемы выпуска и продаж препаратов и продуктов, получаемых на основе клеточной и генетической инженерии. Из этого краткого анализа видно, сколь значимым для развитых стран является реализация концепции развития и наращивания биотехнологического потенциала в области науки, образования и промышленной сферы. Россия. К сожалению, приходится констатировать, что пока биотехнологический потенциал России выглядит весьма скромно. Объем продаж на рынке биотехнологической продукции в России в целом не превышает 1 млрд дол. США/год, в то время как на мировом рынке он приближается к 100 млрд. Для сравнения, рынок Китая и Индии, который начал стремительно развиваться только в самые последние годы, уже достиг 3,8 млрд дол. Рынок биотехнологической продукции России представлен в настоящее время следующими направлениями: – фармацевтические препараты, – ферменты и ферментные препараты, – живые культуры микроорганизмов, – дрожжи, – биопрепараты для добывающих отраслей промышленности, – препараты для сельского хозяйства, – препараты для защиты окружающей среды. Следует подчеркнуть, что современная биотехнология для реализации своего потенциала требует значительных материальных и людских затрат. Развитие биотехнологии, налаживание производств для выпуска высокотехнологичной продукции невозможны без высоких капиталовложений и наличия грамотных специалистов. Период после прекращения существования СССР, перестроечный процесс производства и экономики нашей страны не Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 24 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире гативно отразились на биотехнологической промышленности в целом. И тому есть объективные причины. Среди таковых – резкое снижение финансирования науки и этой отрасли. Если в СССР на науку тратилось 7 % валового внутреннего продукта (ВВП), то в России в последние 10 лет только 0,3–0,5 %. По данным журнала «В мире науки», на биотехнологию Россия тратит в год 40 млн дол., а США – 100 млрд дол. Доля России в мировом производстве биотехнологической промышленности составляла в 1980 г. 5 %, а в России в 2000 г. – 0,17 % (в абсолютном выражении объемы продаж упали с 1,5 до 0,4 млрд дол.). Осознание необходимости развития отечественной биотехнологии и понимание, что без этого невозможен дальнейший научно-технической прогресс страны, приводят к тому, что на уровне лиц, принимающих решения, начинают предприниматься усилия в этом направлении. Свидетельство тому – специальные слушания в Государственной думе РФ, а также проект «Развитие биотехнологии в Российской Федерации в 2008–2020 гг., рассмотренный в преддверии открытия IX Съезда Всероссийской политической партии «Единая Россия» в рамках Общественного Форума «Стратегия 2020», обсудивший основные направления развития России до 2020 г., а также серия научных и научно-практических конференций, прошедших под патронажем правительства РФ и правительства Москвы в области биотехнологии. Так, в октябре 2004 г. в Москве состоялась Вторая Международная конференция «Биотехнология и бизнес» (очередная прошла также в Москве в мае 2009 г.), в которой участвовали представители двухсот компаний, в том числе производителей биотехнологической продукции и венчурных фондов. Организация конференции проходила под патронатом Минпромнауки и технологий РФ при участии Минсельхоза, Минздрава и Минэкономразвития, среди перспективных направлений в биотехнологии были обозначены: – создание трансгенных сельскохозяйственных растений с измененным генотипом; – применение микроорганизмов для повышения выхода нефти и выщелачивания цветных и редкоземельных металлов; – конструирование бактериальных штаммов, способных заменить дорогостоящие неорганические катализаторы и изменить условия биосинтеза для получения принципиально новых соединений; – применение бактериальных стимуляторов роста растений; – направленный биосинтез новых биологически активных веществ (БАВ) – аминокислот, ферментов, витаминов, антибиотиков, различных пищевых добавок и других продуктов; – изменение фотосинтезирующих характеристик растений; – создание трансгенных растений и животных с целенаправленными признаками и свойствами; – практическое использование генетических конструкций, созданных в лабораториях; – культивирование клеток растений и животных; – гибридизация клеток; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 25 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире – энзимология и клеточная биология, необходимые для создания возможности получения в промышленных условиях иммобилизованных ферментных и клеточных систем. На конференции было отмечено, что, несмотря на малую долю биотехнологических препаратов РФ в мировом объеме, уровень отечественных специалистов в области биотехнологий весьма высок и западные биотехнологические гиганты активно пользуются услугами российских лабораторий и отдельных специалистов. Так, около 40 % всего мирового офшорного (т.е. производящегося за пределами страны, в которой расположена компаниязаказчик) синтеза белков и других веществ с помощью биотехнологий осуществляется в России. Генеральный директор РАО «Биопрепарат» Р.У. Хабриев, характеризуя структуру российского биотехнологического рынка, отметил, что за последнее десятилетие четко прослеживается положительная тенденция по объемам биотехнологической продукции, в целом объемы их продаж возросли в 3 раза, при этом доля медицинских биотехнологий (от всего отечественного биотехнологического рынка) составляет около 19 %, а доля иммунологических биотехнологий – около 10 %. Было акцентировано, что иммунобиология – это отрасль, где в отличие от традиционной фармацевтики Россия не уступает Западу. Так, если соотношение отечественных и импортных лекарств на фармрынке РФ составляет 40:60 или 30:70, то по иммунобиологическим препаратам это соотношение равно 70:30 в пользу отечественного производства, а по качеству эта продукция не уступает зарубежным аналогам. В настоящее время в области («красной») медицинской биотехнологии в РФ функционируют два сегмента: традиционные препараты и продукты и современные. Традиционные продукты – это антибиотики, ферменты, стероиды, витамины, вакцины и др. В этой области работают около 50 отечественных предприятий, однако в научном плане традиционная медицинская биотехнология обеспечена весьма слабо. Современная (или новейшая) медицинская биотехнология, производящая интерфероны, интерлейкины, колонистимулирующие факторы, моноклональные антитела, генно-инженерный инсулин, набирает мощь. С конца 90-х гг. началась активная работа по получению новых биотехнологических препаратов. В 2000 г. было выведено на общемировой рынок около 42 новых активных субстанций, и доля биотехнологических препаратов составляла в нем более 35 %. В 2001 г. всего было выведено на рынок 52 биотехнологических препарата. Доля препаратов современной биотехнологии составляет сегодня около 10 % от общей медицинской биотехнологии России. Это при том, что объемы финансирования биотехнологической отрасли в России в сопоставлении с США и странами ЕС мизерны. На биотехнологическом рынке России ситуация такова, что спрос значительно превышает предложение. При этом произошел существенный упадок инфраструктуры, а роль малого и среднего бизнеса пока еще весьма незначительна. Примеров успешного развития биотехнологии в России немного, а основными производителями данного рода продукции по-прежнему ос Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 26 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире таются несколько научно-исследовательских институтов и небольших компаний, родившихся в их недрах. Так, в опытном производстве Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН производят инсулин (препарат инсуран, объем реализации 76 млн руб./год) и соматотропин – гормон роста (объем реализации 18 млн 200 тыс. руб./год). Из всех синтетических пептидных препаратов, производящихся сейчас в мире, доля российских составляет более 25 % (11 препаратов из 40). Среди них – отечественные тимоген и тимодепрессин, регулирующие иммунную систему. Их производят и продают не только в России, но и за рубежом. Еще несколько пептидных препаратов находятся на разных стадиях клинических испытаний. Что нужно для развития этого сектора биотехнологии? Гарантированная доля на рынке для российских производителей, развитие отечественного оборудования для производства, подготовка кадров. Hесмотря на многочисленные трудности, российские биотехнологические компании и их разработки привлекают все большее внимание инвесторов. Например, у Международного научно-технического центра (МHТЦ-ISTC) биотехнологии занимают первое место по объему финансирования. В последние годы на их поддержку выделено 150 млн дол. США; венчурные фонды тоже все активнее инвестируют в биотехнологию; однако к сотрудничеству с ними не всегда готовы руководители малых хайтек-компаний. В 2005 г. в рамках Третьего съезда Общества биотехнологов России была обсуждена и принята Программа «Развитие биотехнологии в российской Федерации на 2006–2015 гг.» (источник – www.biorosinfo.ru). От выполнения этой государственной программы зависит, впишется ли Россия в мировую тенденцию развития биотехнологии. Концепция, структура и механизмы реализации данной программы были представлены и получили одобрение на круглом столе «Законодательное обеспечение развития биотехнологической отрасли промышленности», состоявшемся в Государственной думе РФ 8 февраля 2005 г. На прошедших в Государственной думе парламентских слушаниях на тему «Законодательное обеспечение развития биотехнологии», организованных Комитетом по промышленности, строительству и наукоемким технологиям, было решено создать при этом комитете специальный экспертный совет по биотехнологии для подготовки рекомендаций, как вывести отрасль из кризиса. Эти слушания – событие эпохальное для отечественной биотехнологии. Открывая слушания, вице-спикер Государственной думы О.В. Морозов признал, что отрасль находится «в отчаянном состоянии и для своего спасения требует незамедлительного государственного вмешательства». Целью Программы является развертывание работ в области теоретической и практической биотехнологии в России на базе современных инновационных подходов для производства импортозамещающей отечественной биотехнологической продукции. К задачам Программы относятся: – формирование и реализация национальных приоритетных проектов в биотехнологии; – разработка теории и методологии фундаментальной биотехнологии; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 27 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире – внедрение новейших достижений в сфере геномики, биоинформатики, нанотехнологий в соответствии с наиболее важными приоритетами (генетический паспорт, биочипы и др.); – создание современных образовательных программ и системы подготовки кадров в области биотехнологии; – реализация целевых практических проектов по медицинской, сельскохозяйственной, пищевой, экологической, промышленной биотехнологии с целью обеспечения населения отечественной биотехнологической продукцией; – создание действенной правовой, экономической, информационной и организационной базы для развития биотехнологии. Реализация Программы планируется в три этапа: I этап – 2006–2008 гг., II этап – 2009–2011 гг., III этап – 2012–2015 гг. На каждом этапе ставятся промежуточные цели и задачи, ориентированные на достижение конечного результата Программы. В структуру Программы входят 4 раздела: 1. Национальные приоритетные проекты. 2. Федеральные проекты (направления): – фундаментальная биотехнология; – медицинская биотехнология; – сельскохозяйственная биотехнология; – пищевая биотехнология; – промышленная биотехнология; – экологическая биотехнология; – правовое, экономическое, информационное и организационное обеспечение развития биотехнологии; – материально-техническая база биотехнологии; – подготовка кадров для биотехнологии. 3. Региональные (межрегиональные, окружные) проекты 4. Целевые проекты. Для реализации мероприятий Программы предложено активно использовать творческий потенциал РАН, РАМН, РАСХН, ведущих профильных научных учреждений страны (ИБХ, ИМБ, Пущинский научный центр РАН, ИОГЕН, ИБР, ЦИН и др.), крупных вузов, том числе МГУ им. М.В. Ломоносова, Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина, Тимирязевской сельскохозяйственной академии и др., а также связанных с ними научно-исследовательских учреждений и организаций. Планируется взаимодействие с НИИ Министерства образования и науки РФ, Министерства промышленности и энергетики РФ, Министерства здравоохранения и социального развития РФ, РАН, РАМН, РАСХН, выбранными на конкурсной основе. Будет использован также механизм создания целевых рабочих групп, временных трудовых коллективов (ВТК) и другие научно-организационные подходы. При реализации региональных задач планируется использование такого базового элемента, как исходное формирование соответствующей областной Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 28 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.1. Роль биотехнологии в современном мире целевой программы с последующим подключением федеральных ресурсов в рамках ФЦП или целевого финансирования. Национальная программа предусматривает широкое международное сотрудничество с применением механизма грантов и формирования совместных проектов. Поставленные в Программе задачи требуют радикального изменения государственного финансирования биотехнологии. По предварительным подсчетам, только для реализации блока национальных приоритетных проектов потребуется не менее 2 млрд дол. Очевидно, такие объемы финансирования требуют специальных постановлений Правительства РФ. В случае целевого выделения средств из федерального бюджета планируется экономический эффект, значительно превосходящий объем вложений. Помимо средств федерального бюджета, мероприятия Программы будут реализовываться за счет бюджетов субъектов Российской Федерации и средств внебюджетных источников. Общий объем финансирования Программы оценен в 150 000 млн руб., в том числе за счет средств федерального бюджета – 15 000 млн руб. (10 %), за счет средств бюджетов субъектов Российской Федерации – 45 000 млн руб. (30 %) и за счет средств внебюджетных источников – 90 000 млн руб. (60 %). За счет средств бюджетов субъектов Российской Федерации предусматривается финансировать реализацию специальных проектов и программ, решающих проблемы того или иного региона. Основным результатом реализации Программы станет обеспечение населения отечественной биотехнологической продукцией, решение жизненно важных социальных и экономических задач. Предполагается, что в результате осуществления Программы будут решены следующие проблемы: – формирование статуса России как государства с экономикой нового типа, основанной на знаниях; – создание и массовое производство социально значимой отечественной биотехнологической продукции; формирование перспективного, стабильного, импортозамещающего рынка продукции и услуг повышенного спроса (питание, лекарства, диагностикумы); – сохранение кадров и решение проблем трудозанятости в ряде субъектов РФ, а также в наукоградах и территориях научно-технического развития биологического и биотехнологического профиля; – сохранение и рациональное использование генетических ресурсов России; – решение проблем биологической и экологической безопасности. Социальный эффект от реализации программы при достижении намеченных показателей ожидается значительным, в том числе это решение проблем трудозанятости, сохранение квалифицированных кадров и т.д. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 29 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов Многообразие форм живой материи и новые знания в области физики и химии живых систем позволяют конструировать биологические системы различной степени сложности и организации, продуцирующие широчайший спектр макромолекул. Фундаментальные знания о молекулярной организации и закономерностях функционирования биосинтетических путей являются основой для метаболической инженерии биосистем суперпродукции макромолекул с заданными свойствами. На смену ставших рутинными биотехнологическим продуктам (белку одноклеточных, биоудобрениям и биогазу, органическим кислотам, аминокислотам) приходят новые продукты и препараты, среди которых – средства диагностики и лечения на основе технологий генетической инженерии и клонирования, вакцины, сыворотки, моноклональные антитела, экологически чистые материалы, а также биоинженерная аппаратура нового поколения для реализации биотехнологических процессов. Ведущие фирмы (табл. 1.3) в области биотехнологии в течение небольшого периода (с 1978 до 1982 гг. – период взрыва мирового рынка генноинженерных продуктов) увеличили свои активы более чем в 30 раз; при этом их годовой доход возрос при этом с 5 до 67 млн дол. Таблица 1.3 Динамика мирового рынка продукции биотехнологии, млрд дол. Области применения Медицина: – терапевтические препараты – диагностикумы – вакцины Итого Кормовые добавки Приборы и оборудование Сельское хозяйство Защита окружающей среды Материалы Всего Годы 1985 1990 1995 2000 0,2 – 0,1 0,3 1,7 0,5 – – – 2,5 3,0 1,2 0,3 4,5 2,1 1,0 0,3 0,4 – 8,3 9,5 4,3 1,2 15,0 4,6 2,8 1,2 1,0 0,15 24,7 32,0 10,0 3,0 45,0 9,0 4,8 5,0 2,0 0,3 66,1 Десятки новых препаратов ежегодно проходят различные стадии законодательного утверждения. Среди них – диагностикумы вируса В, СПИДа и др., моноклональные антитела, конъюгированные с растительными токсинами, эффективные противоопухолевые препараты, генные диагностикумы и пр. К 2000 г. на мировом рынке биотехнологических продуктов доля медицинских препаратов, полученных только в США методами клеточной и генетической инженерии, достигла свыше 30 млрд дол., что составило около 60 % Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 30 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов всех затрат. Перечень медицинских препаратов, прошедших все стадии исследований и допущенных на рынок за период с конца 80-х гг. до 2004 г., существенно расширился. Ежегодно в США FDA (Администрация по продуктам питания и препаратам) выдает порядка 30–40 разрешений на серийное производство и применение биотехнологических препаратов и вакцин. Помимо полученных и выпущенных на рынок в 1981 г. рекомбинантных инсулина, гормона роста, иммунно-глобулинов и эритропоэтина, появились следующие препараты: липосомальная форма противогрибкового препарата, активатор тканевого плазминогена; рекомбинантные факторы свертывания крови; человеческий альбумин; заменитель человеческой кожи, состоящий из коллагена, фибробластов и кератиноцитов; культивированные аутологичные хондроциты; липосомальная форма химиотерапевтического агента даунорубицина; вакцины против гепатита В и для лечения хронического гепатита С; рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон для лечения бесплодия; биоинженерный коллагеновый матрикс для реконструкции мышечной ткани; препараты для диагностики и лечения ВИЧ-инфекции; костный трансплантат, содержащий рекомбинантный костный морфогенетический протеин (rhBMP-2); гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор при проведении аутологичных трансплантаций костного мозга; ботулинический токсин типа В и др. Японский рынок биотехнологических диагностикумов и препаратов в 2000 г. составил свыше 30 млрд дол.; среди них – препараты для лечения первичных и приобретенных иммунодефицитов, аутоиммунных состояний, вирусных и микробных инфекций, злокачественных новообразований, иммуноспецифических синдромов при шоке, лучевой и ожоговых болезнях. Серьезный прорыв был достигнут в области получения трансгенных сортов культурных растений, это генно-инженерный сорт сладкой («золотой») кукурузы; гибридные сорта кукурузы, рапса, пшеницы и сои с генами устойчивости к насекомым и гербицидам; трансгенные сорта хлопка, устойчивые к вилту, вредителям и гербицидам; трансгенные сорта папайи с красной и желтой мякотью, устойчивые к вирусу кольцевой пятнистости; а также генетически модифицированные фрукты и овощи с удлиненным сроком хранения (сорта томатов и клубники, не портящиеся при длительном хранении за счет снижения синтеза этилена, ускоряющего процесс физиологического дозревания плодов). В области рыбоводства были получены модифицированные быстрорастущие морепродукты (лосось, камбала), достигающие товарной массы в течение одного–полутора лет, по сравнению с двумя–тремя годами, требующимися для лососей традиционных пород и др. Объем рынка биотехнологий в мире к 2005 г. оценивался примерно в 200 млрд дол. США. Ежегодный рост в настоящее время составляет около 7–9 %. Для рынка биотехнологий в мире 2005 г. можно охарактеризовать как один из самых успешных за всю историю развития этой отрасли. В этот период правительства стран Европы и Азии продолжали демонстрировать энтузиазм по отношению к индустрии биотехнологий и инвестировать миллиар- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 31 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов ды долларов в эту отрасль, считая ее одним из приоритетов экономического развития своих государств. В настоящее время компании, связанные с биотехнологией и медициной, начинают выдвигаться на ведущие позиции в рейтингах по различным приоритетам. Так, журнал Fortune опубликовал ежегодный рейтинг 100 лучших компаний-работодателей. Лучшим местом работы в США признана компания Google. На втором месте – биотехнологическая компания Genetech. В рейтинге, проводимом компанией «Делойт», по показателям наиболее быстрого роста названы фирмы Anistoma и Biotage, занимающиеся разработкой биотехнологических препаратов для лечения онкологических заболеваний, генетическим анализом и медико-техническими исследованиями, заняли среди стран Европы 3-е и 4-е места, показав рост за 2005 г. на 20 и 13 % соответственно. Рынок биотехнологий в разных странах имеет свои особенности, обусловленные уровнем развития экономики стран и доходами населения. Наиболее активно в настоящее время ведется разработка лекарственных средств с использованием современной биотехнологии. В США, Японии и отдельных странах Западной Европы на эти цели расходуется в среднем 2/3 средств, выделяемых на НИОКР в области биотехнологии. Практически во всех этих государствах существуют правительственные программы поддержки биотехнологических компаний. В США, являющихся лидером в области современной биотехнологии, для проведения фундаментальных и прикладных исследований было образовано много специализированных биотехнологических фирм, которые, привлекая частный и государственный капитал и лучшие научные кадры, в считанные годы разработали и запатентовали способы получения многих белковых продуктов медицинского назначения. К таким фирмам относятся в первую очередь Genentech, Biogen, Amgen, Genetic Institute, Cetus, Immunex и ряд других. Примерно в это же время к финансированию НИОКР в области современной биотехнологии подключились и крупные транснациональные компании, приобретая акции или лицензии на готовые продукты, а впоследствии создавая собственные исследовательские подразделения. Эти фирмы сыграли решающую роль в промышленном внедрении первых генно-инженерных медицинских препаратов, таких как инсулин, гормон роста человека, интерферон, эритропоэтин, тканевой активатор плазминогена, вакцина против гепатита В и др. Например, фирма Genentech имеет различные лицензионные соглашения и соглашения о сотрудничестве с Elly Lilly (США), Hoffmann-La Roshe (Швейцария), Takeda, Daiichy Seiyaky, Toray и Fujisawa (Япония), Boeringer Ingelheim, Gruenenthal (Германия), Kabi Vitrum (Швеция). По данным исследовательской компании Abercade, основными сегментами рынка биотехнологических продуктов в РФ являются фармацевтика (66 %), препараты для сельского хозяйства (18 %), дрожжи (9 %) (рис. 1.1) при весьма низких (порядка 1 %) уровнях остальных продуктов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 32 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.2. Рынок новейших биотехнологических препаратов и продуктов Рис. 1.1. Долевой анализ рынка биотехнологии РФ (по данным исследовательской компании Abercade, источник – http://www.abercade.ru/) Однако нельзя не отметить, что основную долю самого развитого рынка фармацевтических препаратов в РФ (порядка 450 млн дол. США) в настоящее время занимает импортная продукция – это преимущественно инсулины, вакцины, сыворотки. Доля отечественной фармацевтической продукции в совокупном объеме составляет только 60,6 млн дол. США. Более перспективным выглядит рынок отечественной промышленной биотехнологии, в основном это производство ферментов и средств защиты растений. Объемы продаж ферментных препаратов отечественного производства составляет порядка 12,3 млн дол. США, это 38 % от общего объема этого сегмента рынка. Преимущественно это ферменты и ферментные препараты для спиртовой промышленности и для животноводства. Среди биотехнологических препаратов сельскохозяйственного назначения – средства защиты и стимуляторы роста растений, пробиотики, вакцины ветеринарные, кормовые антибиотики, аминокислоты и кормовой белок, витамины, кормовые добавки. На рынке биотехнологических препаратов для защиты окружающей среды доминирует отечественное производство продукции в размере 8 млн дол. США, а доля импортной продукции (бактериальные препараты для ликвидации нефтяных загрязнений, биосорбенты для очистки воды и донных отложений от нефтепродуктов) составляет только 800 тыс. дол. США. Объемы отечественного производства дрожжей составляют 58 млн дол. США, импорт этого вида биотехнологического продукта – в 3,5 раза меньше. Направления более наукоемких новейших биотехнологий, базирующихся на достижениях генетической инженерии, в России, к сожалению, только вступают в фазу своего развития. Так, на рынке генетически модифицированных культур, которые занимают в мире площадь 8,1 млн га и их продажи ежегодно растут на 20 %, Россия пока не представлена. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 33 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии Несмотря на то что в настоящее время препараты и продукты, получаемые в процессах промышленной («белой») биотехнологии, главенствуют на рынке биотехнологических продуктов, наиболее впечатляющие успехи и прорывы в этой области связаны с использованием достижений клеточной и генетической инженерии. Геномика – это направление биотехнологии, занимающееся изучением геномов и ролей, которые играют различные гены, индивидуально и в комплексе, в определении структуры, направлении роста и развития и регуляции биологических функций. Различают структурную и функциональную геномику. Предмет структурной геномики – создание и сравнение различных типов геномных карт и крупномасштабное секвенирование ДНК. Проект по изучению человеческого генома (Human Genome Project) и менее известная Программа по изучению растительных геномов (Plant Genome Research Program) являются самыми масштабными исследованиями структурной геномики. В задачи структурной геномики входят также идентификация, локализация и составление характеристик генов. В результате осуществления частных и государственных проектов по структурной геномике созданы карты геномов и расшифрованы последовательности ДНК большого количества организмов, в том числе сельскохозяйственных растений, болезнетворных бактерий и вирусов, дрожжей, необходимых для приготовления некоторых продуктов питания и производства пива, азотфиксирующих бактерий, малярийного плазмодия и переносящих его комаров, а также микроорганизмов, используемых человеком в самых разнообразных промышленных процессах. В 2003 г. завершен Проект по изучению генома человека. Предмет и область функциональной геномики – секвенирование геномов, идентификация и картирование генов, выявление функций генов и механизмов регуляции. Для понимания различий между видами основную роль играет не знание количества генов, а понимание того, как они различаются по составу и функциям, знание химических и структурных различий в генах, которые и лежат в основе различий организмов. Эволюционный анализ постепенно становится главным приемом выяснения функций и взаимодействий генов в пределах генома. Благодаря тому, что генетический код универсален и все живые организмы способны расшифровывать генетическую информацию других организмов и осуществлять заложенные в ней биологические функции, любой ген, идентифицированный в ходе того или иного геномного проекта, может быть использован в широком спектре практических приложений: – для целенаправленного изменения свойств растений и придания им желаемых признаков; – выделения специфических рекомбинантных молекул или микроорганизмов; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 34 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии – идентификации генов, участвующих в осуществлении сложных процессов, контролируемых множеством генов, а также зависящих от влияния окружающей среды; – обнаружения микробных заражений клеточных культур и др. Протеомика – это наука, занимающаяся изучением структуры, функций, локализации и взаимодействия белков внутри клетки и между клетками. Набор белков клетки называется ее протеомом. По сравнению с геномикой, протеомика ставит перед исследователями гораздо более многочисленные и трудные задачи. Структура белковых молекул гораздо сложнее, чем структура молекул ДНК, которые представляют собой линейные молекулы, состоящие из четырех нерегулярно повторяющихся элементов (нуклеотидов). Форма, которую принимает белковая молекула, зависит от последовательности аминокислот, однако все механизмы скручивания и складывания аминокислотной цепочки до конца не изучены. Задачей исследователей, работавших над программой Human Genome Project, была разработка методов, которые позволили бы добиться поставленных целей. Ученые, занимающиеся протеомикой, и сейчас находятся в подобном положении: им необходимо разработать достаточное количество методов и приемов, которые могли бы обеспечить эффективную работу над огромным количеством вопросов: – каталогизацию всех белков, синтезируемых различными типами клеток; – выяснение характера влияния возраста, условий окружающей среды и заболеваний на синтезируемые клеткой протеины; – выяснение функций идентифицированных белков; – изучение взаимодействий различных белков с другими белками внутри клетки и во внеклеточном пространстве. Потенциал белковой инженерии позволяет улучшать свойства используемых в биотехнологии белков (ферментов, антител, клеточных рецепторов) и создавать принципиально новые протеины, пригодные в качестве лекарственных препаратов, для обработки и улучшения питательных и вкусовых качеств пищевых продуктов. Наиболее значительны успехи белковой инженерии в биокатализе. Разработаны новые типы катализаторов, в том числе с применением техники иммобилизации ферментов, способные функционировать в неводной среде, при значительных сдвигах рН и температуры среды, а также растворимые в воде и катализирующие биологические реакции при нейтральном рН и при сравнительно низких температурах. Технологии белковой инженерии позволяют получать новые типы белков биомедицинского назначения, например способных связываться с вирусами и мутантными онкогенами и обезвреживать их; создавать высокоэффективные вакцины и белки-рецепторы клеточной поверхности, выполняющие функцию мишени для фармацевтических препаратов, а также связывания вещества, и биологические агенты, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Так, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды, а их производство, хранение и применение не опасно для окружающей среды и здоровья людей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 35 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии Новейшие биотехнологические методы позволяют диагностировать многие заболевания и патологические состояния экспрессно и с высокой точностью. Так, для постановки стандартного теста определения присутствия в крови липопротеидов низкой плотности («плохого» холестерина) требуется провести три отдельных дорогостоящих анализа: выявление содержания общего холестерина, триглицеридов и липопротеидов высокой плотности. Кроме этого, в течение 12 ч до проведения теста пациенту рекомендуется воздержаться от приема пищи. Новый биотехнологический тест состоит из одного этапа и не требует предварительного голодания. Эти тесты, помимо быстродействия, существенно снижают стоимость диагностики. К настоящему моменту разработаны и применяются биотехнологические тесты для диагностики некоторых видов опухолевых процессов, требующих для реализации небольшое количество крови, что исключает тотальную биопсию на начальных стадиях диагностики. Кроме снижения стоимости, повышения точности и скорости диагностики, биотехнология позволяет диагностировать заболевания на гораздо более ранних этапах, чем это было возможно ранее. Это, в свою очередь, обеспечивает гораздо более высокие шансы пациентов на излечение. Новейшие биотехнологические методы протеомики дают возможность идентифицировать молекулярные маркеры, сигнализирующие о приближающейся болезни, еще до появления регистрируемых клеточных изменений и симптомов заболевания. Огромное количество информации, ставшее доступным в результате успешного завершения проекта «Геном человека», должно сыграть особую роль в разработке методов диагностики наследственных заболеваний, таких как диабет I типа, муковисцидоз, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Ранее заболевания этого класса диагностировали только после появления клинических симптомов; новейшие методы позволяют до появления клинических признаков определить группы риска, предрасположенные к заболеваниям такого рода. Разработанные с помощью биотехнологии диагностические тесты не только повышают уровень диагностики заболеваний, но и улучшают качество медицинского обслуживания. Большинство из биотехнологических тестов портативны, что позволяет врачам проводить тестирование, интерпретировать результаты и назначать соответствующее лечение буквально у постели больного. Биотехнологические методы выявления патогенов важны не только для диагностики заболеваний. Один из самых наглядных примеров их использования – скрининг донорской крови на наличие ВИЧ-инфекции и вирусов гепатита В и С. Возможно, со временем биотехнологические подходы дадут возможность врачам определять характер инфекционного агента и в каждом конкретном случае подбирать наиболее эффективные антибактериальные препараты не за неделю, как это делается современными методами, а за считанные часы. Внедрение биотехнологических подходов со временем позволит врачам не только улучшить существующие методы терапии, но и разработать принципиально новые, полностью основанные на новых технологиях. На настоя Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 36 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии щий момент целый ряд биотехнологических методов лечения одобрен Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). В список заболеваний, подлежащих таким методам терапии, входят: анемия, муковисцидоз, задержка роста, ревматоидный артрит, гемофилия, гепатит, остроконечные кондиломы, отторжение трансплантата, а также лейкемия и ряд других злокачественных заболеваний. Использование биотехнологических методов позволяет создавать так называемые «съедобные вакцины», синтезируемые генетически модифицированными растениями и животными. Так, созданы генетически модифицированные козы, молоко которых содержит вакцину от малярии. Получены обнадеживающие результаты в клинических испытаниях бананов, содержащих вакцину от гепатита, и картофеля, содержащего вакцины против холеры и патогенных штаммов кишечной палочки. Такие вакцины (например, в виде сублимированного порошка для изготовления напитков), не требующие замораживания, стерилизации оборудования или закупки одноразовых шприцов, особенно перспективны для применения в развивающихся странах. В процессе разработки также находятся вакцины-пластыри против столбняка, сибирской язвы, гриппа и кишечной палочки. Уже получены трансгенные растения, синтезирующие терапевтические белки (антитела, антигены, факторы роста, гормоны, ферменты, белки крови и коллаген). Эти белки, производимые с помощью различных сортов растений, в том числе люцерны, кукурузы, ряски, картофеля, риса, подсолнечника, сои и табака, являются основными компонентами инновационных методов терапии ряда онкологических заболеваний, СПИДа, болезней сердца и почек, диабета, болезни Альцгеймера, болезни Крона, муковисцидоза, рассеянного склероз, повреждения спинного мозга, гепатита С, хронических обструктивных заболеваний легких, ожирения, онкологических заболеваний и др. Клеточные технологии находят все более широкое применение для селекции, размножения и повышения продуктивности полезных растений, а также получения биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Особое направление применения клеточных культур и клеточных технологий – тканевая инженерия, связанная с разработкой биоискусственных органов и тканей. В настоящее время на базе накопленных фундаментальных знаний освоены, включая промышленные масштабы, технологии ведения клеточных культур различного происхождения (растительных клеток, клеток насекомых и млекопитающих). Растительные клетки и культура растительных тканей позволяют регенерировать целое растение из протопластов и клеток. Особенностью клеточных культур растений является их способность к тотипотенции, т.е. в определенной среде и определенных условиях можно регенерировать целое растение из одной клетки. Эта техника обеспечивает за сравнительно короткий срок получение в контролируемых условиях многочисленных популяций клеток и дает возможность идентифицировать линии растений с повышенной биологической продуктивностью. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 37 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии Клеточная инженерия растений базируется на использовании культуры изолированных клеток, тканей, протопластов. Существует несколько направлений использования этих технологий в растениеводстве. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать в культуре ценные биологически активные соединения, в том числе женьшеня или идиолитов, эфирных масел, алкалоидов, глюкозидов и др. Второе направление – это использование культуры изолированных тканей для клонального размножения растений и оздоровления посадочного материала. Третье направление – это применение изолированных клеток в селекции растений. Культивируемые на искусственных средах растительные клетки характеризуются большой неоднородностью; при этом возможен отбор клеток, устойчивых к тем или иным неблагоприятным факторам – засухе, низкой температуре, фитопатогенам и пр. Культуры растительных клеток используют для биотрансформации химических соединений и для эффективного синтеза биологически активных соединений de novo. В культуре клеток сохраняется способность продуцировать биологически активные соединения, свойственные исходному целому растению, что позволяет организовать условия, обеспечивающие синтез ценных продуктов, ранее не обнаруженных в исходных интактных растениях. Например, в культурах растительных клеток стало возможным получать такие ценные соединения, как перицин, перикалин, хинокиол, ферригинол, акуаммалин и др. Реализованы крупномасштабные культивационные системы растительных клеток для получения различных ценных веществ – ментола, женьшеня, убихинона-10, бетанина, камптотецина (антиканцероген), полипептидов – ингибиторов фитовирусов, агар-агара и др. Например, эффективный и дорогостоящий цитостатический препарат паклитаксель, традиционно получаемый из коры Тиса среднеземноморского (8 т исходного сырья обеспечивают получение 1 кг препарата), в настоящее время с большей эффективностью получают в культуре клеток. Еще более эффективными оказались процессы с использованием иммобилизованных растительных клеток. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные культивационные условия. После установления способности апикальной меристемы (небольшой участок недифференцированных клеток на кончике стебля) к росту с образованием целого растения, эта техника стала применяться для клонирования линий растений. Культура растительных тканей, аналогично культуре клеток, позволяет достаточно быстро получать здоровые растительные клоны и на этой основе – перспективный посадочный материал практически в неограниченных масштабах. Культуры клеток насекомых дают возможность получать биологические агенты новых типов для борьбы с насекомыми-вредителями без негативного влияния на жизнеспособность полезных видов насекомых, а также не накапливающихся в окружающей среде. Достоинства биологических ме Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 38 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии тодов борьбы с вредителями известны уже давно, это бактериальные, грибные и вирусные препараты, получение которых требует специализированной техники и условий. Особенно это характерно для препаратов вирусной группы, производство которых основано на массовом размножении насекомогохозяина на искусственных средах. Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты до недавнего времени не находили массового применения. Использование культур клеток насекомых способно полностью решить эту проблему. Техника клеточных культур насекомых для размножения вирусов весьма перспективна. Для этого необходимо получение высокопродуктивных линий клеток, оптимизация питательных сред, выбор эффективных систем «вирус – клетка». По этой технологии в США производят препарат «Элькар». Весьма успешны разработки по рекомбинантным бакуловирусам с генами, кодирующими водный обмен насекомых. После применения такого препарата насекомые погибают в течение 5 дней от обезвоживания либо перенасыщения водой. Новые методы биотехнологии могут повлиять на цену вирусных препаратов. Кроме того, так же как и растительные клетки, клетки насекомых могут быть использованы для синтеза лекарственных препаратов. Начата реализация использования потенциала клеток насекомых для производства VLP-вакцин (VLP – virus-like particle – вирусоподобные частицы), предназначенных для лечения инфекционных заболеваний, таких как атипичная пневмония и грипп. Эта методика могла бы сильно снизить затраты и исключить проблемы безопасности, связанные с традиционным методом, использующим куриные яйца. Культуры клеток животных широко используют в качестве тестобъектов для оценки безопасности и эффективности новых лекарственных препаратов. Кроме этого, клетки млекопитающих пригодны для синтеза лекарственных веществ, особенно некоторых животных белков, слишком сложных для того, чтобы синтезировать их с помощью генетически модифицированных микроорганизмов, а также моноклональных антител и вакцин. Например, компанией Sanofi Pasteur (США) по заказу Министерства здравоохранения и социальных услуг США разрабатываются методы культивирования клеток млекопитающих с целью эффективного синтеза вакцин против гриппа. Особое направление применения клеточных культу, в особенности стволовых клеток, и технологий – терапия и реконструктивная хирургия поврежденных органов и тканей. Перечень болезней, лечение которых становится возможным благодаря использованию клеточной терапии и трансплантологии, быстро пополняется. Наиболее продвинутым в настоящее время является применение клеточных технологий в кардиологии для лечения инфаркта миокарда, восстановления кровотока в ишемизированных органах и тканях, повышения насосной функции сердца, а также лечения дислипидемий и атеросклероза. В неврологии трансплантационные клеточные технологии начали применять для лечения болезни Паркинсона и болезни Хагинтона. Имеются примеры положительного использования стволовых клеток костного мозга для заживления ожо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 39 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии говых и глубоких кожных ран, лечения системных и местных костных дефектов. В связи с выявленной противоопухолевой активностью низкодифференцированных кроветворных клеток и их способностью прямо супрессировать опухолевый рост проводятся исследования, направленные на клиническое применение стволовых клеток в онкологии. Поиск новых технологий для восстановления утраченной функции органа или системы привели к появлению на стыке биотехнологии и медицины тканевой инженерии (регенеративной медицины и органогенеза). Будущее медицины напрямую связывают с развитием клеточных технологий, которые позволяют, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его клеточный состав. Такое «обновление» структурно-функциональных элементов органа дает возможность решать те же задачи, что и органная трансплантация. Вместе с тем, эта технология намного расширяет возможности трансплантационного лечения, делая его доступным для широкого круга разных категорий пациентов. Основой для развития новейших реконструктивных технологий являются функционирующие клетки, способные в зависимости от микроокружения формировать ткани разных типов. Список болезней, при лечении которых клеточные технологии уже используются или их применение планируется в ближайшем будущем, быстро растет. В этот список, по-видимому, войдут все болезни, медикаментозное лечение которых малоэффективно. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на создание новых биокомпозиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградирующихся материалов, которые используют в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. Революционные преобразования традиционных биотехнологических процессов связаны с применением методов генетической инженерии. Метод рекомбинантных ДНК является краеугольным камнем новейшей биотехнологии. Создание рекомбинантных ДНК означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов. С помощью генетической инженерии разработаны и используются различные социально значимые технологии и процессы: – производство новых лекарственных препаратов и безопасных вакцин; – лечение некоторых генетических заболеваний; – создание биоконтролирующих агентов для сельского хозяйства; – повышение урожайности и снижение стоимости продукции; – снижение аллергенности некоторых продуктов; – улучшение питательных свойств продуктов; – разработка биодеградирующих пластмасс; – снижение уровня загрязненности воды и воздуха; – замедление скорости порчи пищевых продуктов; – контроль над вирусными заболеваниями. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 40 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии Молекулярное, или генетическое, клонирование – процесс создания генетически идентичных молекул ДНК – является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур, основывается на методах генетического клонирования. С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область применения клонирования чрезвычайно широка. К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых). Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами: баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала – части Ti-плазмиды (Т-ДНК) – Agrobacterium tumefaciens – возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы – Lux-гены или ген бактериальной β-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды. Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения. Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями. Цилиндрические эксплантанты заражали вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности зараженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского университета (США) предложили новый метод – стрелять по клеткам растений вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел» клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом металлических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался универсальным. С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии – активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы. Удаление средней части привело к по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 41 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии тери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать воду при −1–5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INAбактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки. Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение генетически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено, что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубеньков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нитрогеназы, т.е. азотфиксацию. В настоящее время большие средства в США и других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие. Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы. Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений. Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, – придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt. Известно, что гены, контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака. В выросшем целом растении табака каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница погибает, не причинив существенного вреда растению. Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 42 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получение рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, токсичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает усвоение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции. Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения сопряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков, обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные механизмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате трансплантации одного или немногих генов. В то же время устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом в полевые условия. Новый путь модификации генома – применение антисмысловых РНК, т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д. Генетическая инженерия животных направлена на выведение животных с высокими эксплуатационными свойствами. Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения видов, находящихся под угрозой вымирания. К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ран Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 43 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии няя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр. Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом клонирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец. Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок – ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными. Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры. Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока. Новый метод – перенос ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической клетки – любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой, кроме половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом (в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая – от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только из одного хромосомного набора. Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку. В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть исполь Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 44 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии зован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время. Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений – все это способствует повышению качества жизни человека. Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что создало глобальную экологическую проблему. Радикальным решением этой проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров – высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды). 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий Необходимость повышения качества жизни человека делает все более актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых продуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чистых материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоносителей и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов. Все новые продукты биотехнологии, особенно пищевого и медицинского назначения, должны быть проверены на безопасность прежде, чем они будут допущены в практику. Для получения законодательного разрешения на применение новых биотехнологических продуктов, препаратов и технологий необходимо пройти серию этапов. Процесс прохождения всех этапов до промышленного выпуска называется передачей технологии. На рис. 1.2 в обобщенном виде представлены этапы, обязательные для успешной передачи технологии производства продуктов биотехнологии биомедицинского назначения. Каждое направление передачи технологии имеет временные рамки, регулирующие последовательность шагов (этапов) процесса передачи технологии. Успех продвижения новой технологии зависит от многих составляющих и, прежде всего, от организационного – правового процесса регулирова- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 45 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий ния всех этапов прохождения разработки, от стадии поисковых научных исследований до маркетинговых исследований и выхода на рынок. В России еще предстоит создать условия и механизмы для эффективной разработки и коммерциализации биотехнологических разработок, особенно в области медицинского материаловедения, тканевой инженерии и конструирования биоискусственных органов. В США и странах ЕС это уже сложившийся и регламентированный путь. Каждый этап передачи технологии дает разный конечный результат и выдвигает разные требования к бюджету и персоналу. Прибыльность часто зависит от времени и затрат, вложенных в каждое направление. Финансовые затраты, связанные с направлениями, суммируются и должны точно прогнозироваться и выполняться, если нужно, чтобы процесс передачи был успешным. Движение к коммерциализации биотехнологической разработки состоит из серии последовательных этапов (рис. 1.3). Исследовательское направление (2–10 лет) на практике зачастую бывает гораздо продолжительнее вследствие необходимости проведения испытаний новых материалов не только в системах in vitro, но и опытах над животными. Результатами этого этапа могут быть не только научные публикации и диссертационные работы, но также и патенты. Практика показывает, что если есть возможность реализовывать одновременно все пять направлений, то суммарное время, необходимое для успешного процесса передачи технологии, может составить 8–10 лет. Однако, если приходится выполнять этапы последовательно, суммарное время почти удваивается (до 14–16 лет). Часто это происходит потому, что затраты, связанные с патентной защитой и демонстрацией технологии, обычно значительно больше затрат на исследования. При переходе от уровня исследований к последующим (патентование, маркетинг, демонстрация опытных образцов) в процесс принятия решений вовлекаются новые уровни управления; количество лиц, принимающих решения, увеличивается. Затраты на реализацию каждого последующего этапа возрастают, и при приближении к завершающим этапам процесса передачи технологии необходимые для этого объемы финансирования превосходят средства, которые выделяются университетами, фондами, мелкими компаниями. Критическим является переход от этапа 3 (маркетинговые исследования и оценка рынка) к этапу 4 (демонстрация технологии). На этом этапе потребность в финансировании возрастает на порядок. Помимо существенных финансовых затрат, переход на этот этап требует дополнительного персонала, управления, мощностей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 46 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий Рис. 1.2. Продолжительность и последовательность этапов процесса передачи технологии Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 47 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий Как правило, средства, направленные на реализацию этапа демонстрации технологии, выделяются без завершения этапа маркетинга и бизнесисследования. В маркетинге и бизнес-анализе предпринимается попытка прогноза соотношения затрат/доходов, необходимого капитала, размера рынка, времени выхода на рынок, процента проникновения на рынок, конкурентоспособности новой технологии, времени выполнения заказа по сравнению с конкурентами и т.д. Университетская и академическая наука не имеют персонала и опыта для проведения такого анализа. Для этого требуется заключить лицензионное соглашение. Зачастую происходят задержки, потому средства редко выделяются для запуска этапа 3 до тех пор, пока не будут выданы патенты (конечная точка этапа 2) и пока не будут подписаны лицензионные соглашения, но на это нужны время и деньги. Этап 1 Проведение исследований Этап 2 Патентование Этап 3 Маркетинговые исследования и оценка рынка Этап 4 Демонстрация технологии Этап 5 Организация производства Рис. 1.3. Этапы, необходимые для проведения полного цикла процесса передачи технологии Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 48 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий Опыт реализации биологических технологий показывает, что чем современней новая технология, тем труднее бывает провести маркетинговые и бизнес-оценки. Поэтому чем больше потенциал новой технологии, тем больше риск и дольше время, необходимое для принятия решение о том, что нужна поддержка для выхода на этап демонстрации технологии и проведения контроля качества продукта. Переход от этапа 4 к этапу 5 (наращивание объемов от экспериментального уровня до уровня производства) требует еще более серьезных вложений средств и оценок рынка. При этом важно знание объема производственной базы, необходимой для достижения прогнозируемых небольших доходов. Тем не менее, при этом планируемая производительность производства должна быть сопоставимой с прогнозом продаж. Поэтому выделение прибыльных ниш на рынках в первые годы наращивания производства является ключевым требованием прогнозирования соотношения прибыли/риска для новой технологии. Большие корпорации обладают опытом и знаниями, для того чтобы выполнить такие оценки, но их большие накладные расходы приводят к раздуванию доходности, необходимой для успешной работы предприятия. Маленькие компании, наоборот, имеют низкие накладные расходы, но часто не обладают способностями точно оценить многочисленные факторы, действующие при переходе к промышленному этапу производства продукта. Среди факторов, позитивно влияющих на ускорение процесса передачи технологии, можно выделить следующие: – исследователи, отвечающие за создание технологии (этап 1) и патентование (этап 2), должны принимать участие в начальных этапах оценки рынка (этап 3), а также демонстрации технологии (этап 4); – переходы между этапами 1-2-3 должны быть быстрыми и эффективными; – лицензионные соглашения должны быть гибкими, для того чтобы обеспечивать быструю реализацию этапов 2, 3 и 4 одновременно, даже если информация по проведению оценки рынка (этап 3) является неполной; – этапы с конкретными сроками реализации должны быть согласованы исследовательской командой, управленческой командой, командой маркетинга и разработки продукции, которые отвечают за этапы 3 и 4. Эти сроки должны быть согласованы вместе с бюджетами, в которые необходимо заложить премиальные стимулы, для того чтобы обеспечить приложение усилий по своевременному достижению целей; – для реализации этапов 3 и 4 следует предусмотреть достаточный объем финансовых средств; которые должны предоставляться этапами, соответствующими этапам по выполнению каждого направления; при этом увязыва– это один из путей обеспечения того, что капитал будет ориентирован на конечные результаты направлений, а не на то, чтобы его тратили для продолжения исследований. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 49 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» 1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий Не секрет, что одной из причин задержки процесса передачи технологии является продолжение выполнения исследований на этапе 1 при ограниченных ресурсах вместо перемещения программы на этапы 3 и 4. Это часто происходит в университетах и академических учреждениях, где продвижение по службе, поощрения зависят от публикаций, что является основным конечным результатом этапа 1. Если же технология создается внутри крупной коммерческой компании или корпорации, обычно действует структура управления, принимающая решения и бюджеты для этапов 2, 3, 4 и 5. Этапы и сроки часто навязываются как часть требований к выполняемой работе участвующих команд. В отличие от этого подхода, в условиях, когда технология создается внутри университета или государственной лаборатории, структура управления или бюджет для этапов 3 и 4 отсутствуют. В этом случае принцип состоит, как правило, в заключении лицензионного соглашения с компанией. Каждый этап процесса передачи технологии имеет разную степень риска, время и личные капиталовложения, связанные с ним. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 50 Г ЛА В А 2 СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Трансгенные, или генетически модифицированные, организмы (ГМО) – это организмы, постоянный генетический материал которых был изменен методами генной инженерии. Эти методы широко известны, так же как технологии рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование. При использовании данных технологий молекулы ДНК из различных источников комбинируют в одну молекулу, образуя новый генный комплекс. Такая новая молекула называется рекомбинантной ДНК. Внедрение различными методами рекомбинантной ДНК в живой организм превращает его в генетически модифицированный. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства. Такая генетическая модификация, проводимая, как правило, в научных или хозяйственных целях для получения желаемых качеств изменяемого организма, отличается целенаправленным изменением генотипа организма, в отличие от случайных изменений, характерных для естественного и искусственного мутагенеза. Следует отметить, что, как в любой новой области науки, в молекулярной биотехнологии в настоящее время существует некоторая терминологическая неопределенность. Так, если внедрение рекомбинантной ДНК происходит в хромосому, такой организм, как правило, называют трансгенным. Организмы, несущие рекомбинантную ДНК на внехромосомных элементах, например плазмидах, определяются как рекомбинантные. В то же время некоторые авторы не проводят различий между трансгенными и рекомбинантными организмами, а многие просто используют более общий термин «генетически модифицированные организмы». Возможность конструировать новые гибридные молекулы ДНК in vitro возникла благодаря сделанным в середине XX в. открытиям, таким как установление комплементарной структуры ДНК, механизма ее репликации и репарации, расшифровка генетического кода, установление механизма переноса генетической информации в клетке, механизмов работы и регуляция генов и др. Одним из наиболее значительных открытий, которые позволили развить генно-инженерные технологии, было идентификация и выделение рестрикционных эндонуклеаз, осуществляющих сайт-специфическое расщепление ДНК. До этого открытия не существовало воспроизводимого метода фрагментации ДНК. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 51 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Открытие ряда ферментов нуклеинового обмена: ДНК-лигазы, различные ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы (ревертазы), фосфатазы, полинуклеотидкиназы и другие – позволило получить инструменты для проведения различных манипуляций с фрагментами ДНК in vitro. Автоматический синтез олигонуклеотидов – коротких одноцепочечных ДНК (~10–40 оснований), используемых в основном как затравки (праймеры) для ДНК-полимераз, и разработка метода полимеразной цепной реакции существенно упростили все, сделав возможным клонирование и размножение молекул ДНК в пробирке. Другим важнейшим шагом для молекулярного клонирования было развитие методов секвенирования – быстрого определения нуклеотидной последовательности. Основы генной инженерии были заложены в 1972–1973 гг., когда П. Берг (P. Berg) получил первые рекомбинантные ДНК, а С. Коэн (S. Cohen) и Г. Бойер (H. Boyer) разработали стратегию переноса функционально активных гибридных молекул ДНК в бактериальную клетку. Таким образом, был впервые осуществлен перенос функциональной единицы наследственности из одного организма в другой и перед человечеством возникли ошеломляющие перспективы конструирования новых форм жизни с полезными функциями. Однако одним из первых откликов научного мира на создание новой технологии был запрет на некоторые биотехнологические эксперименты, считавшиеся потенциально опасными. Преобладали опасения, что при конструировании рекомбинантных ДНК случайно возможно создание организма с опасными свойствами. Группа видных ученых провела в 1975 г. знаменитую Асиломарскую конференцию по рекомбинантным молекулам ДНК для того, чтобы определить, как действовать безопасно. Впоследствии, с принятием инструкций по обеспечению безопасности генно-инженерных работ, многие ограничения были сняты, но до сих пор дискуссии о потенциальной опасности генетически модифицированных организмов остаются в центре внимания общества. Также возникает ряд тревожных вопросов о применении современных технологий для создания биологического оружия. Например, сегодня ученые способны синтезировать любые последовательности ДНК. Возникает вопрос: смогут ли террористы воссоздавать вирусы, подобные оспе, или конструировать вирусы даже более смертоносные, чем птичий грипп и геморрагическая лихорадка Эбола? Поэтому в настоящее время многие с пониманием относятся к необходимости надлежащего контроля исследований в области биотехнологий. 2.1.1. Рестриктазы и другие ферменты для молекулярного клонирования Инструментами в технологии рекомбинантных ДНК являются ферменты нуклеинового обмена и, прежде всего, эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Конструирование рекомбинантных ДНК стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 52 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи в определенном месте. Эти ферменты называются эндонуклеазами рестрикции (рестриктазы) II типа. Существует всего три типа эндонуклеаз рестрикции, но другие два не нашли широкого применения, поскольку не обладают необходимой специфичностью при расщеплении ДНК. В природе рестриктазы являются компонентом системы рестрикциимодификации (Р-М-системы), которая служит защитным механизмом от чужеродной ДНК у микроорганизмов, например при вирусной (фаговой) инфекции. В Р-М-систему входят два фермента, специфичных для каждого штамма, – ДНК модифицирующий (метилтрансфераза, или метилаза) и ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции), иногда обе эти функции объединены в одном белке. Эти два фермента способны специфически связываться с одной и той же последовательностью ДНК длиной 4–8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и характерной для каждого конкретного микроорганизма. При этом метилтрансфераза, метилируя определенный нуклеотид в пределах сайта узнавания, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы. В свою очередь, рестриктаза расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК в определенном месте участка узнавания или рядом с ним при отсутствии специфической модификации. В настоящее время охарактеризована субстратная специфичность около 3,5 тыс. рестриктаз, из них имеется 238 (прототипы), узнающих уникальные нуклеотидные последовательности. Рестриктазы, узнающие одинаковые участки ДНК, составляют группу изошизомеров и могут отличаться по свойствам, в том числе по-разному расщеплять двухцепочечную ДНК. Более половины из известных рестриктаз узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющиеся палиндромами – обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями нуклеотидов в направлении 5'–>3' на комплементарных цепях ДНК, рис. 2.1). Рис. 2.1. Нуклеотидная последовательность, содержащая сайты расщепления для различных рестриктаз до и после обработки рестриктазами. Для рестриктазы Sfi I последовательность из 5 нуклеотидных пар между узнаваемыми фрагментами может быть любой, но расщепляется всегда одинаково с образованием 5'-выступающих концов Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 53 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Различные рестриктазы образуют различную форму концов при расщеплении ДНК, которые могут быть 5'-выступающими одноцепочечными (рис. 2.1, EcoR I, Sfi I), 3'-выступающими (Pst I) или полностью двухцепочечными – «тупыми» (Sma I). Выступающие одноцепочечные концы, если они комплементарны, получили название «липких», поскольку такие концы могут гибридизоваться. Молекулы ДНК из разных источников, обработанные одной и той же рестриктазой, расщепляющей палиндромные последовательности (например, EcoR I и Pst I), будут иметь одинаковые гибридизующиеся между собой липкие концы. Наличие липких концов у фрагментов ДНК существенно облегчает их ковалентное сшивание специальным ферментом ДНК-лигазой (см. схему на рис. 2.3), который формирует фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами через 5'-фосфатную и 3'-гидроксильную группы. Сам процесс называется лигированием. ДНК-лигаза в живой клетке выполняет ту же функцию – сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации. Кроме молекулярного клонирования и физического картирования молекул ДНК (для создания рестрикционных карт ДНК), эндонуклеазы рестрикции также широко применяются в медицинской генодиагностике для выявления различных мутаций и в генетических популяционных исследованиях. Другими группами ферментов, используемых при конструировании рекомбинантных ДНК, являются ферменты матричного синтеза – ДНК- и РНК-зависимые ДНК-полимеразы и ферменты, позволяющие осуществить нужные изменения структуры концов ДНК-фрагментов: полинуклеотидкиназы, фосфатазы, нуклеазы и другие ферменты для различных манипуляций с фрагментами ДНК. 2.1.2. Полимеразная цепная реакция Появление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 г. существенно продвинуло, ускорило и удешевило молекулярное клонирование, сделав возможным быстрый синтез (амплификацию) прямо в пробирке нужных последовательностей из считанных исходных копий. Впоследствии за изобретение ПЦР американский ученый К. Мюллис (K. Mullis) получил Нобелевскую премию. ПЦР представляет собой серию из трех циклически повторяющихся стадий реакции (15–30 циклов по 1–3 мин): 1) тепловая денатурация исходной ДНК при ~94 °С; 2) отжиг ДНК-затравок (праймеров) при ~50–60 °С на получившиеся одноцепочечные матрицы; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 54 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии 3) синтез двухцепочечных ДНК при 72 °С с каждым из праймеров навстречу друг другу по противоположным цепям ДНК (рис. 2.2). Реакцию проводят в специальном приборе – термоциклере, или амплификаторе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества исходных копий ДНК в геометрической прогрессии. В качестве праймеров используются короткие (15–25 нуклеотидных оснований) одноцепочечные ДНК – олигонуклеотиды, комплементарные концам целевого фрагмента ДНК. Важнейшим компонентом ПЦР являются термостабильные ДНК-полимеразы, способные сохранять активность на протяжении всей реакции ПЦР, несмотря на воздействие высоких температур на стадии тепловой денатурации ДНК. В настоящее время имеется широкий спектр коммерческих полимераз с разнообразными свойствами, но пока наиболее используемой остается Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus с оптимумом активности при 72 °С и ее смеси с другими ДНК-полимеразами. В настоящее время ПЦР широко используется в научных и диагностических лабораториях во многих областях. Кроме простого удвоения последовательностей ДНК, метод ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), клонирование любых последовательностей в пробирке, выделение новых генов, секвенирование. Также ПЦР широко используется в биологической и медицинской практике, в первую очередь, для диагностики Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 55 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Рис. 2.2. Три цикла полимеразной цепной реакции, или амплификации ДНК. Серым цветом в исходной ДНК выделен целевой фрагмент для синтеза, который в процессе реакции ограничивается праймерами. В идеальных условиях реакции количество целевого фрагмента удваивается каждый цикл (2n), количество исходных цепей увеличивается на две каждый цикл (n + 2, где n – количество циклов) заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, степени родства, популяционных исследований, в криминалистике – везде, где нужно установить уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала. 2.1.3. Общая схема молекулярного клонирования Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме (рис. 2.3). 1. Получение нужной последовательности – ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 56 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии сейчас – синтез ДНК методом ПЦР. В настоящее время, когда секвенирование целых геномов различных организмов идет быстрыми темпами, сложно найти совсем неизвестный ген. Даже для млекопитающих, включая человека, секвенированы уже 25 геномов (по публичной базе данных NCBI Genome на август 2008 г.), из них 9 собраны полностью с установлением генной структуры. И это не считая расшифрованных геномов менее сложных организмов. Учитывая генетическое родство всех живых организмов на Земле, самая распространенная ситуация в настоящее время – когда целевая последовательность для предполагаемого клонирования известна, хотя бы частично. После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК можно амплифицировать методом ПЦР с использованием в том числе и вырожденных праймеров (с неполной комплементацией). В качестве матрицы для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой – РТ), затем обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RT-PCR). Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства дпльнейшего клонирования синтезированной последовательности (рис. 2.3). Рис. 2.3. Общая схема молекулярного клонирования на примере трансформации бактерий или дрожжей рекомбинантным плазмидным вектором Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 57 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Нужную последовательность ДНК также можно получить химикоферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами. Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного гена может плохо транслироваться в выбранном организме-рецепиенте вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим причинам. Химико-ферментативный синтез гена можно заказать в ряде биотехнологических фирм, в том числе и в России. 2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – общий термин, обозначающий молекулу ДНК, способную к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулой-носителем, подобно космической ракете-носителю, для клонируемой ДНК. 3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень (рецепиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (в основном для прокариот и дрожжей) и трансфекцией (в случае эукариот). В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина. 4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Например, высевают трансформированные клетки на селективную среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому несет использованный вектор – расти будут только колонии (клоны) рекомбинантных клеток. 5. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. 2.1.4. основные типы клонирующих векторов Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды – внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами – фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 58 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии С развитием знаний о генетических элементах и совершенствованием методов генной инженерии новые векторы под конкретные задачи начали собирать из отдельных блоков – различных хорошо охарактеризованных генетических элементов (см рис. 2.6). В настоящее время имеется огромное количество коммерчески доступных разнообразных синтетических векторов, сконструированных практически под любые задачи. Различные типы клонирующих векторов обладают разным лимитом на размер вставок чужеродной ДНК. Основные типы современных векторов рассмотрены ниже. Плазмидные векторы – кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей – три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плазмиды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке – количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно п. 2.1.5 (см. рис. 2.7). Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации. Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них. Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Емкость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клонирующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дикого типа (рис. 2.4). Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы основан на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных молекул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных ли Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 59 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии затов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Векторы на основе фага лямбда являются одними из самых распространенных для создания библиотек генов. а б в Рис. 2.4. Фаг лямбда под электронным микроскопом (а), схема его строения (б) и упрощенная генетическая карта (в). Выделенный серым цветом участок соответствует генам, несущественным для литического пути развития фага (гены, обеспечивающие существование в виде профага), вместо которых может быть встроена чужеродная ДНК Космиды – кольцевые молекулы ДНК, объединяющие свойства фага и плазмиды, содержат ориджин репликации и cos-сайты фага лямбда. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35–50 тпн. Для упаковки ДНК в фаговую головку вирусный аппарат фага лямбда требует только наличия cos-сайтов на расстоянии 36–51 тпн. Гибридные молекулы космиды с большими вставками в 35–50 тпн между cos-сайтами упаковываются in vitro в виде инфекционных вирионов при использовании экстрактов фагов дикого типа. Естественно, такие фаговые частицы нежизнеспособны, после инфекции космиды существуют в бактериальной клетке как плазмиды. Нитевидные бактериофаги – М13 (рис. 2.5), fd, f1 бактерии E. coli. Представляют собой одноцепочечную кольцевую ДНК, упакованную в белковую трубочку из одинаковых белковых субъединиц, двухцепочечная репликативная форма похожа на плазмиду. Вставки чужеродной ДНК до 1 тпн очень стабильны. Наиболее широко ранее использовались векторы на основе фага М13. До появления метода ПЦР, который позволяет секвенировать сразу двухцепочечные молекулы ДНК, одноцепочечные матрицы для секвенирования получали клонированием в М13-вектор. В настоящее время клонирование в векторы на основе М13 и fd преимущественно используют в методе фагового дисплея (получение и анализ пептидных библиотек для различных целей, например, для исследования белок-белковых, белок-пептидных, белокДНК взаимодействий, для эволюции белков in vitro, получения иммунологических реагентов нового поколения и др.). При этом чужеродную ДНК встраивают в гены белков вирусной оболочки, затем клонированные последовательности выявляются на поверхности вирусных частиц в виде гибридных белков (фьюжин-белков). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 60 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии а б Рис. 2.5. Нитевидный бактериофаг М13 под электронным микроскопом (а) и упрощенная схема его строения. На геномной карте (б) затемненные области отмечают несущественные для жизнеспособности вируса участки, куда возможна вставка чужеродной ДНК. Удлинение генома рекомбинантного фага при инсерции чужеродной ДНК приводит к образованию более длинных нитей вирионов, чем у фага дикого типа Бакуловирусы – большая и разнообразная группа вирусов. Поражают насекомых и других членистоногих, но абсолютно безвредны для позвоночных. Геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, варьирующей в размере от 80 до 180 тпн. Замена несущественной для репликации части вирусного генома позволяет клонировать чужеродную ДНК до 15 тпн. Внедрение чужеродной ДНК происходит путем гомологичной рекомбинации (двойной кроссинговер) бакуловируса с небольшим плазмидным транспортным вектором, содержащим клонированный ген. Данная система экспрессии позволяет осуществлять большинство посттрансляционных модификаций (гликозилирование, ацилирование, протеолитическое расщепление и др.), недоступных в прокариотической системе. В настоящее время векторы на основе бакуловирусов широко используются для продукции различных эукариотичеких белков в клетках насекомых. Также бакуловирусы применяются как биологические инсектициды. Для клеток высших эукариот эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др. Ретровирусные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных. Необходимо отметить, что при использовании вирусов в качестве векторов для животных клеток никогда не сохраняется нативный вирус – используются лишь некоторые регуляторные последовательности вируса для конструирования вектора. Особенности молекулярной организации векторов для доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки рассмотрены в п. 2.3.1. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 61 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клетку-мишень без нарушения ее хромосомных структур и т.д. Бактериальные искусственные хромосомы (bacterial artificial chromosomes – BAC) сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75–300 тпн. Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes – YAC) – линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов), дрожжевую центромеру (рис. 2.6). Также дополнительно содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит – 100–1 000 тпн. Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек. Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность. Рис. 2.6. Основные элементы конструкции дрожжевой искусственной хромосомы Дальнейшее развитие этого направления привело к созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (mammalian artificial chromosomes – MAC). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 62 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии 2.1.5. Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды Определяющим в выборе вектора для молекулярного клонирования является поставленная цель и предполагаемый организм-хозяин. Даже если в качестве окончательного хозяина рекомбинантной ДНК планируется совсем другой организм, генетические конструкции собирают, мутируют и нарабатывают, как правило, в E.coli с использованием специализированных бактериальных векторов, затем субклонируют в вектор для окончательного хозяина. Иногда удобно использовать челночный, или шаттл-вектор (shuttle vector), с двумя сайтами инициации (ориджинами) репликации, способный реплицироваться в обоих хозяевах, ориджины которых он содержит. Несмотря на все имеющееся разнообразие векторов, большинство укладывается в общую схему бактериального клонирующего вектора (рис. 2.7). Вектор, содержащий необходимые элементы для трансляции клонируемой ДНК (экспрессионная кассета с сигналами транскрипции и трансляции, часто репрессор промотора), называется экспрессионным. Типичный экспрессионный бактериальный вектор обычно содержит следующие элементы. 1. Сайт инициации репликации (ориджин) – необходимый элемент, то, что делает молекулу ДНК вектором и определяет его хозяйскую специфичность. Структура ориджина репликации обуславливает копийность вектора – количество молекул на клетку (1–4 для низкокопийных, 15–20 для обычных и 150–200 и более для высокопийных векторов), а также его совместимость с другими векторами. В одной клетке могут сосуществовать только вектора с ориджинами репликации из разных групп совместимости. Включение в вектор ориджина репликации одноцепочечного фага f1 позволяет получить всю конструкцию в виде одной цепи ДНК, например, для мутагенеза. 2. Селективный ген, предназначенный для отличия содержащих рекомбинантную конструкцию клеток (трансформированных) от исходных. Чаще всего используют гены устойчивости к различным антибиотикам, например, популярен ген -βлактамазы, придающий устойчивость к ампициллину. 3. Множественный клонирующий сайт (МКС, MCS), состоящий из близкорасположенных уникальных сайтов нескольких эндонуклеаз рестрикции (единственных в данном векторе) для удобства соединения с клонируемой. Иногда его называют полилинкер. В экспрессионную кассету ген вставляется с сохранением имеющейся рамки считывания или с собственным стартовым кодоном (AUG) на определенном расстоянии от рибосомсвязывающего сайта (RBS). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 63 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Рис. 2.7. Общая схема типичного экспрессионного бактериального вектора. Экспрессионная кассета изображена в увеличенном масштабе. МКС – множественный клонирующий сайт, RBS (ribosome binding site) или последовательность Шайн-Дальгарно (SD) – сайт связывания рибосом, обеспечивает связывание прокариотической рибосомы за счет комплементарности 3'-концевой части 16S рибосомальной рРНК с матричной мРНК 4. Сигнальные и регуляторные элементы экспрессии (транскрипции с последующим синтезом белка), хорошо работающие в клетке-мишени и необходимые для экспрессии клонированного гена. Прокариотические и эукариотические сигнальные и регуляторные элементы сильно различаются, но среди прокариотических, так же как и среди эукариотических, существуют универсальные элементы, хорошо работающие в широком круге хозяев, и специфические, работающие только в конкретной клетке. Составной частью любого экспрессионного вектора является экспрессионная кассета (рис. 2.7), которая включает все необходимые сигнальные и регуляторные элементы, позиционированные относительно клонируемого в МКС гена. Для бактерий это промотор, обычно строго регулируемый, регуляторные элементов транскрипции и трансляции (в том числе энхансеры и структуры, стабилизирующие мРНК), сайт связывания рибосом, терминаторы трансляции и транскрипции. Использование сильных промоторов и регуляторных элементов позволяет достигать высоких уровней экспрессии целевого продукта. Для E. coli традиционно популярны лактозный lac и триптофановый trp промоторы и их гибрид tac. Одни из самых сильных промоторов, терминаторов и других регуляторных элементов – вирусные – широко Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 64 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии используются для конструирования векторов. Например, в экспрессионных векторах для E. coli серии pET (Novagen) использованы регуляторные элементы фага Т7, для конструирования серии pQE (Qiagen) – элементы фага T5. В настоящее время имеется широкий спектр хорошо охарактеризованных сигнальных и регуляторных элементов, из которых конструируют экспрессионные вектора, и список этот регулярно пополняется. 5. Ген-репрессор транскрипции с векторного индуцибельного промотора, часто вводимый в состав векторов для более сильного ингибирования синтеза целевого белка в отсутствие индукции. Особенно это актуально при клонировании токсичных для клетки-хозяина белков. Наличие в составе вектора гена-репрессора транскрипции позволяет строже регулировать синтез клонированной ДНК и не зависеть от клеточной регуляторной системы. 6. Дополнительные фрагменты для экспрессии целевого гена в виде фьюжинов. В состав экспрессионной кассеты часто вводят различные эпитопы, при этом целевой белок синтезируется в виде N- или C-концевого фьюжина (гибридного белка). Цели могут быть различными – повышение уровня экспрессии целевого белка, его стабильности, улучшение его растворимости и сворачиваемости в нативную конформацию и другие, но чаще всего такие эпитопы (таги) вводят для аффинной очистки синтезируемого белка. Например, наличие полигистидиновой последовательности (His-tag) из 6 или 10 аминокислотных остатков позволяет проводить очистку рекомбинантного белка аффинной хроматографией с использованием иммобилизованных на твердом носителе ионов металлов (Co2+, Ni2+), фрагмент глутатион-Sтрансферазы может быть использован для очистки на смоле, содержащей связанный глутатион. Как правило, присоединяют такие белковые фрагменты через последовательности, содержащие сайты расщепления специфических протеаз. В этом случае после очистки рекомбинантного белка лишние последовательности можно удалить протеазной обработкой. 7. Редкие кодоны в составе чужеродного гена, приводящие к снижению скорости его трансляции. Только аминокислота триптофан кодируется всего одним кодоном (UGG), остальные аминокислоты, из которых состоят белки, – по крайней мере, двумя, чаще четырьмя, а иногда и шестью кодонами (лейцин, серин, аргинин). При этом живые организмы используют синонимичные си-кодоны для кодирования белков статистически не пропорционально. Из четырех кодонов для глицина GGA используется в структурных генах человека в 26 % случаев, а в Escherichia coli – в 9 %. Такая же ситуация наблюдается и для стоп-кодонов. Так, у человека частота использования кодонов UAA, UAG и UGA составляет 0,22, 0,17 и 0,61 соответственно, а у E. coli — 0,62, 0,09 и 0,30. Для каждого типа организмов существует своя предпочтительная частота использования кодонов (codon usage) и, соответственно, свой концентрационный набор изоакцепторных транспортных тРНК. Таким образом, при гетерологичной экспрессии плохая трансляция целевого гена, имеющего в своем составе редкие для клетки-мишени кодоны, может происходить вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такие кодоны. Проблему можно решить химико Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 65 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии ферментативным синтезом целевого гена с соответствующей организмурецепиенту частотой использования кодонов (оптимизация гена). В случае экспрессии в E. coli сконструированы специальные экспрессионные штаммы, компенсирующие использование редких кодонов введением дополнительных генов для дефицитных тРНК. Например, популярная серия штаммов E. coli BL21-CodonPlus (ее вариант RIL) содержит дополнительные копии генов, дефицитных для E. coli тРНК, узнающих аргининовые кодоны AGA и AGG, изолейциновый кодон AUA и лейциновый кодон CUA, для эффективной трансляции генов из организмов, имеющих АТ-богатые геномы. 2.1.6. Доставка рекомбинантной ДНК и РНК в клетку В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки и практики. Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные способы доставки ДНК в клетки-мишени. Трансформация в самом общем значении – это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, при этом составляет примерно 105–107. Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 66 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов – клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК. Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК – мобилизационными. При этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке. Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными штаммами E. coli. Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией. Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса. Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация – временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток. При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 67 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии вышается до 109–1011 для малых плазмид (~3–6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12–18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора. Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина стрептолизина-O. Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация», обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей, оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным клеткам трансформация – это превращение нормальных клеток в раковые. В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов. Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на мкг ДНК. Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов. Эффективность трансфекции удалось повысить в 10–100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 68 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии а б Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером (б) В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено, что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к ядру (рис. 2.9). Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM. Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером (Felgner, 1987) с соавторами. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток. Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 69 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии Рис. 2.9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза Рис. 2.10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного липидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.). Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК. Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран. Липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эф- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 70 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии фективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК. Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9). В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины – белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц. В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий спектр разнообразных трансфекционных реагентов – от самых простых и дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще более эффективных трансфецирующих реагентов. Микроинъекция – клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1–0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления. Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1-2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford) в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 71 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии а б Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика – до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений. Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки. Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку. После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии. Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой мо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 72 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии лекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК – основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей. Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов. 2.1.7. Проблемы экспрессии чужеродных генов Чем обусловлено такое разнообразие клонирующих векторов и организмов-хозяев, используемых для получения биотехнологической продукции? Основная задача гетерологичной экспрессии в биотехнологии – получение в больших количествах функционально активного белка в природной конформации с корректными посттрансляционными модификациями. Еще одним условием биотехнологического производства считается минимизация затрат на единицу продукции. Чем проще организм, тем проще и дешевле культивирование его клеток. Самым простым вариантом экспрессии является бактериальная экспрессия, но в прокариотических организмах невозможны многие посттрансляционные модификации. Кроме того, часто невозможно обеспечить правильное сворачивание (правильный фолдинг) многих эукариотических белков. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций. 1. Образование дисульфидных связей. Эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза. Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным. 2. Протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка. 3. Гликозилирование – основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях – особые свойства. Наиболее распространенная реакция гликолизирования – это присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликолизирование). 4. Модификации аминокислот в составе белка: фосфорилирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование, пальмитоилирование и др. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых могут осуществлять часть или все посттрансляционные модификации синтезируемых рекомбинантных белков, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 73 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков по сравнению с прокариотическими клетками. В настоящее время не существует единого алгоритма получения рекомбинантного функционально активного белка в больших количествах. Имеются только самые общие рекомендации по выбору экспрессионной системы в зависимости от размеров, структуры белка, его свойств и наличия у него посттрансляционных модификаций. Общей практикой является эмпирический подбор экспрессионной системы для каждого конкретного белка, когда пробуются все имеющиеся в распоряжении исследователя экспрессионные системы от E. coli до клеток млекопитающих (в случае сложных белков). Уровень экспрессии чужеродного гена также зависит от конструкции экспрессионной кассеты вектора. Коммерческие векторы обычно содержат в составе экспрессионной кассеты весь необходимый набор регуляторных элементов для высокоэффективной генной экспрессии в конкретной клеткемишени (или универсальные элементы для нескольких хозяев). Регуляторные элементы чужеродного гена, если таковые у него имеются, должны хорошо работать в клетке-хозяине. Помимо этого, для лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для клетки-хозяина. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют «редкие» кодоны на синонимичные «частые», что не сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена в различных системах может быть усилена до 300 раз. Иногда в структурной части генов могут присутствовать какие-либо нежелательные сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами сплайсинга или деградации в случае эукариотической экспрессии, или терминаторы транскрипции для прокариотической экспрессии, сигналы, узнаваемые ферментами модификации на уровне белка. Наличие таких скрытых («криптических») сигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в клетке-хозяине, поэтому их обычно удаляют также путем точечных замен оснований. 2.1.8. Выделение генетически модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов Поскольку эффективность введения рекомбинантной ДНК в клетку никогда не бывает 100 %, а эффективность получения стабильных трансгенных клеток вообще очень мала, всегда используются различные методы селекции для выделения трансформированных клеток. В состав рекомбинантных генетических конструкций вводят специальные гены селекции, например, гены устойчивости к антибиотикам и/или репортерные (маркерные) гены, кодирующие какой-либо легко идентифицируемый признак (окраска клеток генами флуоресцентных белков). При низкой эффективности трансфекции очень удобно использовать гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам и другим веществам, а также различные гены метаболизма, придающие толь Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 74 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии ко трансформированным клеткам способность расти на селективной среде. Если эффективность трансфекции достаточно высока, можно проводить отбор полученных трансформантов с помощью прямого анализа ДНК (например, методом ПЦР) и в этом случае можно обойтись без генов селекции. Часто репортерный ген необходим наряду с селективным геном, по которому идет отбор трансформантов, для оценки уровня экспрессии целевого гена. Полученные в одном эксперименте трансгенные организмы могут сильно различаться по уровню экспрессии чужеродного гена, вследствие различного встраивания в геном клетки-хозяина и различного состояния геномов после такого встраивания. Задача получения трансгенных организмов для хозяйственных целей включает в себя также получение коммерциализированных трансгенных организмов без каких-либо селективных и/или маркерных генов. Это обусловлено несколькими причинами: 1. Потребность минимизировать воздействие на уже сформированный в процессе длительной эволюции генетический аппарат клетки-хозяина и убрать дополнительную метаболическую нагрузку клетки на экспрессию маркерного гена. Все это необходимо для стабилизации самого трансгенного организма и его приобретенного признака, а также для повышения его жизнеспособности. 2. Озабоченность общественного мнения неконтролируемым распространением в окружающей среде селективных и маркерных генов и, прежде всего, генов устойчивости к антибиотикам. Эти опасения можно считать реальными только в случае трансгенных микроорганизмов, поскольку ни один факт природной передачи генов от высших растений или животных к микроорганизмам науке не известен. Кроме того, селективные гены взяты из природных популяций микроорганизмов, где они сейчас широко распространены в результате активного применения антибиотиков в медицинской практике. Поэтому вероятность попадания гена устойчивости к антибиотику в микрофлору человека из природного резервуара несравнимо реальнее, чем, например, при употреблении трансгенных растений. Однако, учитывая настроения общественности, разрабатываются подходы для исключения присутствия «подозрительных» генов в трансгенных формах. 3. Проблемы у потребителей ГМО, вызванные в редких случаях балластным продуктом маркерного гена, например, аллергические реакции на продукт маркерного гена у животных и человека при потреблении генетически модифицированных растений. Хотя в этом случае возникновения проблемы можно не допустить использованием в качестве маркеров генов из традиционных пищевых источников. 4. Необходимость удаления маркерного гена, уже использованного для селекции. Это важно при последовательном введении нескольких генетических конструкций в один организм, поскольку количество эффективных селективных генов ограничено. Один из экспериментальных подходов к получению безмаркерных эукариотических трансгенных организмов – котрансфекция одного организма двумя генетическими конструкциями: одна – с целевым геном, другая – с Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 75 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.1. Общие принципы конструирования новых организмов для биотехнологии маркерным. В этом случае с большой вероятностью (30–80 %) полученный селекцией трансгенный организм содержит и целевой ген, причем обе рекомбинантные конструкции интегрированы в различные локусы хромосомной ДНК. Далее маркерный ген можно удалить с помощью обычного скрещивания. Другой вариант – использование подвижных генетических элементов для перемещения маркерного гена в другой хромосомный сайт трансгенного организма. Например, при получении трансгенного растения селективный маркер был встроен между растительными подвижными мобильными Ds-элементами рядом с геном транспозазы, которая вырезает встроенную между Ds-элементами ДНК и перемещает ее в другой локус. В процессе встраивания в хромосому растения-хозяина в 50 % случаев маркерный ген находился далеко от целевого гена. Таким образом, селективный маркер может использоваться для отбора трансгенных растений, а потом удаляться скрещиванием. Разработка высокоэффективных средств доставки ДНК в клетки позволит, наверное, совсем обойтись без селективных и маркерных генов при получении трансгенных организмов. В настоящее время это практически невозможно, по крайней мере, на первых этапах сборки генетической конструкции для трансфекции, которая обычно проводится в клетках E. coli. Но на финальном этапе получения трансгенных организмов существующие способы доставки иногда позволяют получать трансгенные организмы без какихлибо маркерных генов, хотя это более дорогой и трудоемкий вариант. 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры Микроорганизмы с древних времен участвовали в биотехнологических процессах в различных сферах практической деятельности человека, таких как хлебопечение, виноделие, приготовление кисломолочных продуктов и т.д. Эта разнородная группа микроскопических организмов, искусственно объединенная на основании размера, стала базой многочисленных хозяйственных биотехнологических производств, сложившихся в промышленную микробиологию. Быстрый рост и огромное генетическое разнообразие микроорганизмов позволяют за короткий промежуток времени осуществить синтез больших количеств целевого продукта в строго контролируемых условиях. Возникновение генной инженерии в середине 1970-х гг. (перенос чужеродных генов, придающих новые полезные свойства организму хозяина) придало огромный импульс развитию биотехнологических производств. Возможность конструировать организмы с заданными свойствами видоизменила структуру и содержание промышленной микробиологии. Во-первых, существенно повысилась продуктивность промышленных микроорганизмов – продуцентов классических продуктов посредством усовершенствования имеющегося метаболического пути (введения дополнительных генов, увеличения их количества или активности). Во-вторых, внедряя в микробную клетку чужеродные гены, удалось получить микроорганизмы, синтезирую Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 76 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры щие несвойственные им вещества, например, белки крови человека (интерфероны, интерлейкины, инсулин и др.), что значительно увеличило разнообразие биотехнологической продукции. Таким образом, стало возможным преобразование клеток бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства антибиотиков, белков, жиров, аминокислот, а также для получения безопасных и дешевых вакцин. Практически любое современное биотехнологическое производство основано на использовании трансгенных организмов. 2.2.1. Рекомбинантные микроорганизмы для получения коммерческих продуктов Именно бактерии стали первыми ГМО благодаря простоте организации их генома и манипуляций с клетками. Первый патент на генетически модифицированный штамм микроорганизмов, который был способен разлагать нефть, был выдан в США в 1980 г. всего через 8 лет после работы Берга по конструированию рекомбинантной ДНК. Еще через два года был разрешен для клинического использования синтезированный в бактерии E. coli первый лекарственный препарат – рекомбинантный человеческий инсулин. Сейчас промышленная микробиология с использованием ГМ микроорганизмов развивается в основном по следующим направлениям: 1) производство продуктов биосинтеза трансгенных микроорганизмов, например, антибиотиков, гормонов, ферментов и витаминов; 2) использование биомассы микроорганизмов – производство медицинских вакцин, различных дрожжей, белково-витаминных концентратов и заквасок для получения кисломолочных продуктов и силосования кормов; 3) биотехнологии, основанные на уникальных способностях некоторых бактерий производить органические кислоты, этанол, углеводы и метан. Сюда же можно отнести и переработку некоторых отходов с возможностью получения полезных соединений, в первую очередь горючих газов (биотипливо). Использование трансгенных микроорганизмов в медицине. В настоящее время биотехнология на основе использования трансгенных микроорганизмов предлагает новые подходы к разработке и производству фармацевтических препаратов, а также позволяет выпускать в достаточных количествах широкий спектр лекарственных средств, которые раньше были малодоступны. Среди примерно 40–50 новых видов лекарств, вакцин и препаратов для диагностики, появляющихся на рынке ежегодно, 10–15 получены с помощью генно-инженерных методов, причем многие из них предназначены для лечения болезней, которые ранее считались неизлечимыми. К самому большому классу лекарств, получаемых путем микробного синтеза, относятся антибиотики. По разнообразию и показаниям к применению они занимают первое место среди продукции мировой фармацевтической промышленности. Сегодня известно более 6 000 видов антибиотиков, более 100 из которых находят применение в медицинской практике, в том числе Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 77 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры при лечении таких тяжелых заболеваний, как туберкулез, менингит, плеврит, пневмония. Отдельные антибиотики, такие как блеомицин, применяют при лечении онкозаболеваний. Объем мирового рынка антибиотиков увеличивается в последнее время на 10–20 %/год и составляет более 23 млрд дол. Вторым классом лекарственных препаратов, производимых биотехнологическим путем в микроорганизмах, являются гормоны. В медицинских целях применяются два основных типа гормонов, различающихся по молекулярному строению: стероидные и пептидные. Среди стероидных гормонов можно выделить кортизон и преднизолон, которые широко используют при лечении различных аллергических заболеваний, в том числе такого тяжелого, как бронхиальная астма, а также ревматоидного артрита и других недугов. Другой обширной группой стероидов являются половые гормоны, такие как эстроген, широко применяемые для оральной контрацепции и лечения ряда заболеваний. Пептидные гормоны сейчас практически целиком производятся путем синтеза с помощью генетически модифицированных микроорганизмов. Сюда можно отнести уже упоминавшийся инсулин, а также такие антивирусные, антиопухолевые и иммуномодулирующие агенты, как интерфероны и интерлейкины. Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты, которые в широком диапазоне могут синтезировать ГМ-микроорганизмы. Ферменты используются – для лечения самых различных патологий: протеазы и липазы – для коррекции пищеварения; протеазы – для удаления некротических тканей, протеиназы с фибринолитическим действием – для растворения тромбов, а антикоагулянты, например плазмин, эффективны при лечении инфаркта миокарда и многие другие. Важный вклад микробной трансгенной биотехнологии в медицину состоит в получении профилактических препаратов, в первую очередь это производство вакцин против различных инфекций. Необходимый антиген можно получить с помощью непатогенного (аттенуированного) микроорганизма, инактивированного генно-инженерными методами, либо экспрессией рекомбинантного антигена и таким образом избежать опасностей, связанных с применением инактивированных вакцин. К числу важных практических достижений генной инженерии необходимо отнести и получение диагностических препаратов. Использование биомассы ГМ-микроорганизмов. Согласно прогнозам, к 2050 г. население Земли возрастет до 10 млрд чел. и для обеспечения его потребности в продукции сельского хозяйства нужно будет увеличить объем производства на 75 %. При этом человеку недостает в первую очередь белка животного происхождения, который по аминокислотному составу более богат, чем растительный белок. Промышленная микробиология поставляет животноводству, по крайней мере, три вида важных веществ: кормовой белок и белково-витаминные концентраты (БВК), незаменимые аминокислоты и кормовые антибиотики. Добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию 7 т фуражного зерна и дополнительное производство 0,8 т свинины или 5 т мяса птицы. Включение 1 т ГМ кормовых дрожжей в рацион телят и поросят Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 78 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры позволяет экономить 6 т цельного молока. Эти ценные продукты получаются путем переработки ГМ-микроорганизмами подсолнечной лузги, кукурузных кочерыжек, соломы и других отходов сельского хозяйства, которые содержат клетчатку. Второй вид сельскохозяйственной биотехнологической продукции – незаменимые аминокислоты, производство которых для медицины и пищевой промышленности интенсивно развивается во всем мире. Среди них такие, как лизин и метионин, которые обязательно должны содержаться в готовом виде в пище человека и кормах животных. Метионин производят с помощью химической технологии, а лизин – в основном биотехнологически за счет ГМ-микроорганизмов. Добавление лизина в корм скоту резко увеличивает объем мясной продукции: на 1 т лизина высвобождается 40–50 т фуражного зерна и получается дополнительно более 10 т мяса. Помимо этого, в последнее время в животноводстве и растениеводстве используется около 100 биопрепаратов, таких как стимуляторы роста животных и растений, энтомопатогены и ГМ бактериальные удобрения. Применение таких средств позволяет отказаться от использования или снизить в разы количество применяемых химических средств защиты и минеральных удобрений, что приводит к повышению качества продукции и созданию экологически чистых технологий. Использование ферментов и добавок в пищевой и кормовой промышленности, произведенных с помощью ГМ-микроорганизмов, означает, что ГМ-микроорганизмы инактивированы, разрушены или удалены из конечного продукта. Генетически модифицированные дрожжи, грибки и бактерии используют для этих целей уже более десятилетия. В качестве примеров можно привести используемую в хлебопечении альфа-амилазу, применяемую при производстве фруктозы глюкозоамилазу и необходимый для ферментации сыра фермент химозин. Большинство используемых в пищевой промышленности трансгенных микроорганизмов являются производными микроорганизмов, применяемых в традиционной пищевой биотехнологии. В ряде стран трансгенные микроорганизмы разрешены также для производства микронутриентов, таких как витамины и аминокислоты, используемых в качестве продуктов питания или добавок к рациону. Примером является производство каротиноидов (используемых в качестве пищевых добавок, красителей и добавок к рациону) в ГМ бактериальных системах. В будущем в ГМ-микроорганизмы можно будет интегрировать целые метаболические пути, что позволит синтезировать совершенно новые соединения. Для нужд животноводства с помощью генной инженерии разработаны такие ветеринарные продукты, как бычий соматотропин, применяемый для повышения эффективности производства молока. В некоторых странах бычий соматотропин впервые появился на рынке более 10 лет назад. Микроорганизмы в качестве продуктов питания. В настоящее время на рынке нет коммерческих продуктов, содержащих живые генетически модифицированные микроорганизмы. В 1993 г. в Великобритании ГМ-дрожжи получили официальное одобрение для использования в пивоваренной про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 79 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры мышленности, однако попытки коммерциализовать продукт не предпринимались. К другим микроорганизмам, использующимся для производства продуктов питания (находящимся на стадии исследований и разработки), относятся сбраживающие культуры для хлебопечения и пивоварения и молочнокислые бактерии, применяемые при производстве сыра. Целью исследований и разработки также является минимизация инфицирования патогенными микроорганизмами и повышение питательной ценности и вкусовых качеств конечного продукта. Предпринимаются также попытки генетически модифицировать микроорганизмы пищеварительного тракта крупного рогатого скота с целью защиты животных от отравляющих компонентов корма. Современные методы биотехнологии используют также для создания пробиотиков – микроорганизмов, употребление определенного количества которых с пищей оказывает положительное влияние на здоровье. Биоремедиация. Известно, что основной вред окружающей среде наносят стоки химических предприятий, содержащие различные синтетические органические соединения, разложение которых в природе происходит крайне медленно. Многие из таких отходов являются ксенобиотиками – токсичными веществами, не включающимися в метаболизм живых организмов. Микробиологи изучают пути катоболизма ксенобиотиков, возможности их разложения и детоксикации. Среди огромного разнообразия бактерий можно найти отдельные организмы, использующие самые уникальные варианты путей метаболизма, включающие необычные химические соединения. Опираясь на глубокие знания физиологии бактерий, ученые создают ГМ-микроорганизмы с такой комбинацией метаболических путей, что становится возможна переработка или разложение самых необычных, в том числе токсичных, соединений. На основе этих исследований создают биотехнологические способы очистки воды от неприродных соединений, а также методы, позволяющие контролировать загрязнения окружающей среды. В настоящее время ежегодный объем продаж таких препаратов для контроля и мониторинга загрязнений составляет около 10 млн дол., а в ближайшей перспективе эта цифра может достичь 200 млн дол. Еще одна беда, стоящая перед человечеством, – загрязнение земель и водоемов нефтью и нефтепродуктами. Подобные загрязнения занимают огромные площади вокруг мест добычи нефти, нефтеперерабатывающих предприятий и портов. Нередко причинами экологических бедствий становятся аварии на судах, особенно танкерах, когда нефтью загрязняются акватории и берега рек и морей. Методы генной инженерии активно используются для разработки штаммов-деструкторов, способных быстро разлагать массивные скопления нефтепродуктов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 80 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры 2.2.2. Клеточные культуры для продукции белков В последнее время все больше растет потребность общества в разнообразных белковых препаратах. Особенно быстрыми темпами увеличивается применение фармацевтических белковых препаратов в диагностике и терапии заболеваний человека и животных. Это не только антитела и их производные, но многие белки из крови человека (цитокины, ростовые гормоны, интерлейкины, интерфероны и др.). На современном рынке присутствует около ста препаратов на основе белков человека, и это количество растет год от года. Все эти белки произведены in vitro при использовании генетически модифицированных клеточных культур, полученных генно-инженерными методами, в основном это бактериальная культура E. coli, дрожжевые Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris или культуры клеток млекопитающих. Пока наиболее экономически эффективной и хорошо охарактеризованной системой остается бактериальная. Однако благодаря прокариотическому типу данной системы эукариотические белки в ней плохо процессируются и продукция в ней ограничивается простыми структурами (пептиды, небольшие белки), где посттрансляционные модификации отсутствуют или не нужны для биологической функции. Кроме того, высокий уровень синтеза часто приводит к аггрегациии рекомбинантных белков в виде плохо растворимых телец включения (inclusion bodies), что делает необходимым этап ренатурации рекомбинантного белка для перевода в биологически активную форму. Также необходимым этапом является удаление бактериальных токсинов, присутствующих в данной системе. При этом общая продуктивность бактериальной системы остается довольно низкой – 0,1–1,5 мг/л [1]. Дрожжи как эукариотический организм не имеют этих недостатков, но практический опыт показывает, что большое количество синтезируемого продукта теряется вследствие деградации целевого белка в среде. Кроме того, в дрожжах, особенно в Saccharomyces cerevisiae, гликопротеины подвергаются гипергликозилированию, в результате которого формируются N-гликаны с очень высоким содержанием маннозы, которые кардинально отличаются от N-гликанов млекопитающих или человека. Ситуация может быть улучшена использованием метилотрофных дрожжей P. pastoris в качестве экспрессионной системы. Белковая продукция в дрожжах может достигать 6,4 г/л, но обычно находится в диапазоне 100–200 мг/л. Несмотря на эти ограничения, 43 % рекомбинантных белков, существующих на рынке, продуцируются в бактериях или дрожжах. Большинство фармацевтических биотехнологических продуктов, однако, продуцируются в различных культурах клеток млекопитающих, например, NSO, BNK, CHO. Как типы, наиболее близкие человеческим клеткам, эти системы дают высокий уровень продукции функциональных рекомбинантных белков с корректным N-гликозилированием и другими посттрансляционными модификациями. Уровень продукции культур клеток млекопитающих приблизительно составляет 1–3 г/л. Этот «золотой стандарт» требует Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 81 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры дорогой инфраструктуры и компонентов сред. Кроме того, существует риск вирусной или онкогенной контаминации. Все это приводит к сверхвысокой стоимости конечного продукта, приблизительно варьирующей от 0,3 до 10 тыс. дол. США за грамм в зависимости от количества синтезируемого белка, и к необходимости искать более дешевые альтернативы продукции целевого белка, которым могут стать целые трансгенные растения или животные. Растительные клеточные культуры. Растения всегда были основным источником биопродуктов для человека, снабжая население пищей, волокнами, древесиной и лекарствами. В области фармацевтики растения используют для получения огромного количества вторичных метаболитов с разнообразными терапевтическими эффектами: ранозаживляющие, антимикробные, противовоспалительные, психоактивные и др. Растения выработали эти субстанции в процессе эволюции, чтобы защитить себя от патогенов и хищников или привлекать опылителей. Современные биотехнологические методы позволяют продуцировать эти продукты предсказуемым образом в клеточных культурах из соответствующих лекарственных растений. Иногда это единственный путь производить препараты в промышленных масштабах, например, когда исходное растение сложно для культивирования или очень редко встречается в природе. В качестве успешных примеров можно привести алкалоиды, паклитаксел (противоопухолевый препарат) и шиконин (антимикробный и противовоспалительный). Растительные клетки как эукариотическая система обладают всеми чертами для продукции биологически активных сложных белков. Как результат, доля биологически активной формы в синтезированном растительными клетками рекомбинантном тотальном белке бывает очень высока. Так, например, в сравнительном исследовании экспрессии анти-CEA scFv, клетки табака синтезировали, несомненно, наибольшее количество функционально активного белка (92 %) от тотального рекомбинантного по сравнению с E. coli (12 %) и P. pastoris (40 %). Животные клеточные культуры существуют с 50-х гг. прошлого века, когда были выделены в клеточную культуру HeLa клетки и CHO клеточная линия. Больше пятидесяти лет развития позволило производству на основе животных клеточных культур достигнуть выдающихся успехов. По данным за 2007 г. приблизительно шестая часть наиболее популярных лекарств являются биотехнологическими продуктами. Девять из десяти наиболее популярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в США, произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по крайней мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долларов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 82 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры 2.2.3. Дрожжевые системы экспрессии Дрожжи являются очень привлекательный системой экспрессии, позволяющей сочетать дешевизну прокариотического культивирования с эукариотическим процессингом белков. Дрожжевая система экспрессии имеет следующие преимущества. Во-первых, дрожжи являются одноклеточным организмом, генетика и физиология которого детально изучены и который можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных культиваторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные так называемые 2 µм-плазмиды. В-третьих, в клетках дрожжей осуществляется большое число посттрансляционных модификаций. В-четвертых, лишь очень немногие из собственных дрожжевых белков секретируются в среду; таким образом, если гетерологичный белок секретируется клеткой, то его очистка не составит большого труда. В-пятых, поскольку дрожжи уже многие годы используют в хлебопечении и пивоварении, Департамент по контролю качества пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) включил обычные пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae в список «организмов, признанных безопасными». Таким образом, использование этих организмов для получения белков, применяемых в медицине, не требует дополнительных экспериментов, необходимых при работе с неразрешенными к применению микроорганизмами. Некоторые белки, синтезированные в S. cerevisiae, уже используются в качестве вакцин и фармацевтических препаратов, а также для диагностики. В дрожжевых клетках гликозилируются только секретируемые белки, поэтому для получения рекомбинантных белков, которые для перехода в активную форму должны подвергнуться N- или О-гликозилированию, необходимо использовать системы секреции. Для этого перед кДНК, которая кодирует интересующий исследователя белок, нужно поместить так называемый пре-про-α-фактор – лидерную (сигнальную) последовательность гена а1 фактора спаривания дрожжей. Синтезируемый рекомбинантный белок сможет в этом случае эффективно секретироваться дрожжами. К сожалению, белки млекопитающих подвергаются избыточному гликозилированию в клетках S. cerevisiae, что сильно меняет их иммуногенность. Использование других видов дрожжей, особенно метилотрофных Pichia pastoris иногда помогает решить данную проблему. 2.2.4. Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза белков Бакуловирусы инфицируют только беспозвоночных, в том числе многих насекомых. В ходе инфекционного процесса образуются две их формы. Одна представлена отдельными вирионами, которые высвобождаются из инфицированной клетки хозяина, как правило, клетки средней кишки, и спо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 83 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.2. Трансгенные микроорганизмы и клеточные культуры собны инфицировать другие клетки этого органа. Вторая состоит из множества вирионов, заключенных в белковый матрикс. Белок этого матрикса называется полиэдрином, а сама структура – полиэдроном. Синтез полиэдрина начинается через 36–48 ч после инфекции и продолжается 4-5 сут, пока зараженные клетки не лизируют и хозяйский организм не погибнет. После этого множество таких частиц высвобождается и попадает в среду, где от инактивации их защищает белковый матрикс. Если восприимчивый хозяйский организм проглатывает такую частицу, то полиэдрин солюбилизируется и высвобождаются вирионы, способные инициировать новый инфекционный цикл. Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего генома чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтезу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттрансляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме целевого рекомбинантного белка. Исходя из этого, на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных. Наиболее широко используется вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Этот бакуловирус инфицирует более 30 других видов насекомых, а также хорошо растет в культуре многих клеточных линий. Линии клеток, обычно использующиеся для работы с рекомбинантным AcMNPV, получают из гусениц Spodoptera frugiperda. Промотор полиэдрина в этих клетках чрезвычайно активен, и при их заражении бакуловирусом дикого типа синтезируются большие количества белка. Так, полученный в бакуловирусной системе экспрессии поверхностный белок ВИЧ был первым белком, использовавшимся для создания вакцины против СПИДа. Но пока данная система не получила широкого распространения, вероятно, вследствие трудоемкости процедуры и высокой стоимости получаемого продукта. 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Задачей селекционеров во все времена было получение хозяйственно ценных растений, животных, микроорганизмов. Основными методами традиционной селекции являются отбор, гибридизация, мутагенез, полиплоидия с целью получения нужного признака, который кодируется новым геном или новым комплексом генов. Существенное продвижение в понимании того, как функционируют гены, расшифровка геномов и развитие методологии генной инженерии позволили перейти от длительных и трудоемких методов традиционной селекции к прямому генетическому конструированию нужных при Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 84 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы знаков у конкретного организма. При создании трансгенного организма новый генный комплекс конструируется в пробирке и напрямую вводится в организм, фактически таким методом получения нового признака ученые просто ускоряют эволюцию. Новые методы селекции – это сочетание молекулярных и традиционных методов. Необходимо отметить, что старые методы также остаются широко востребованными при создании новых организмов. Выяснилось, что трансформированные с идентичной конструкцией ДНК трансгенные клоны, полученные параллельно в одном и том же опыте, значительно различаются по уровню экспрессии введенного гена, поскольку работает эффект положения и копийности гена. И необходимо проводить дальнейший отбор с анализом наследования полученного признака, используя традиционные методы селекции. Генно-инженерные манипуляции с геномом, сформировавшимся в процессе длительной эволюции, могут нарушать, в какой-то степени, сбалансированные генные комплексы и, соответственно, жизнеспособность полученных трансгенных организмов. Например, встраивание селективного гена, нужного только для отбора трансгенных растений, может нарушить первичную структуру какого-либо хозяйского гена и тем самым вызвать его инактивацию. Это событие, по-видимому, не так редко, особенно с учетом того, что трансгены чаще встраиваются в транскрибируемые области хроматина (эухроматин). В последующих поколениях такой инактивированный ген может перейти в гомозиготное состояние, выражаясь в непредусмотренной и обычно нежелательной фенотипической мутации. Появляется необходимость дальнейшего скрещивания и отбора для удаления нежелательных побочных мутаций у трансгенов. Иногда имеется необходимость удаления маркерных генов вообще, так что для получения новых организмов применяется сочетание старых и новых методов селекции. В настоящее время практическая генно-инженерная биотехнология развивается по двум основным направлениям. Первое направление, получившее не очень удачное название «молекулярное разведение (или селекция)» (molecular breeding), специализируется на решении новыми методами традиционных селекционно-генетических проблем повышения продуктивности хозяйственно ценных организмов и их защиты от различных биотических и абиотических стрессовых факторов. Второе направление, названное «молекулярным производством» (molecular farming), специализируется на получении и использовании трансгенных организмов в качестве биореакторов, продуцирующих ценные для промышленности и медицины органические соединения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 85 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы 2.3.1. Конструирование трансгенных растений Возможность получения трансгенных растений основана на тотипотентности их некоторых клеток, т.е. способности в определенных условиях под действием фитогормонов дифференцироваться с образованием полноценного растения. Таким образом, из сконструированных генно-инженерными методами отдельных клеток можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный генный комплекс (трансгенные растения). Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям. Кроме того, многие растения легко размножаются вегетативно. Существующими приемами микроклонального размножения in vitro из микроскопических кусочков ткани (эксплантов) можно быстро получить за короткий промежуток времени генетически однородный посадочный материал с высоким коэффициентом размножения, что важно для последующего применения трансгенного организма. Для создания трансгенного растения необходимо трансформировать культивируемые клетки, их протопласты или клетки в составе органов, отделить от нетрансформированных клеток и получить из отдельных клеток целые трансгенные растения (рис. 2.12). К настоящему времени для трансформации растений разработано несколько эффективных систем переноса рекомбинантной ДНК в клетки и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток. Векторы на основе Ti-плазмид. Бактерии рода Agrobacterium иногда называют природными генными инженерами за их способность переносить свою плазмидную ДНК в клетки зараженных растений, интегрировать ее в геном организма-хозяина и вызывать стабильную трансформацию этих клеток введенными генами. Все они приводят к образованию у двудольных растений корончатых галлов – трансформация индуцирует образование опухолей, похожих на раковые. Инфекционным агентом является так называемая Ti-плазмида (tumor-inducing plasmid) в 200–250 тнп (рис. 2.13), которая содержит все гены, необходимые для инфекционного процесса. Рис. 2.12. Схема получения трансгенного растения трансформацией эксплантов (кусочки органа растения, например фрагменты тканей семядоли) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 86 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.13. Схема Ti-плазмиды. Указаны основные гены и их группы. Сайт инициации репликации (ori) обеспечивает удвоение плазмиды при делении клетки Agrobacterium. Колечками обозначены левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК После присоединения Agrobacterium, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке, часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (Т-ДНК (transferred DNA), 12–24 тнп в зависимости от штамма), транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного конъюгации. При этом Т-ДНК транспортируется в одноцепочечной форме, и именно в такой форме она встраивается в хромосомную ДНК растения. С переносимой Т-ДНК остаются связанными два кодируемых Ti-плазмидой белка, способствующие ее вырезанию, и третий белок покрывает оболочкой переносимую одноцепочечную ДНК, предохраняя от деградации. Все белки содержат сигнал ядерной локализации (NLS), который обеспечивает перенос Т-комплекса из цитоплазмы в ядро растительной клетки. Введенные гены Agrobacterium активируются в растении, программируя разрастание ткани (формируется галл), которая начинает синтезировать и секретировать опины. Опины – продукты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров Agrobacterium – используют как источник углерода и азота, причем другие исследованные почвенные микроорганизмы не способны использовать данные соединения. Таким образом, Agrobacterium генетически трансформирует растительные клетки в «биологические фабрики» по производству для себя «продуктов питания». Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют небольшие векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами из переносимой Т-области, которая ограничена 24-нуклеотидными повторами. Вместо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 87 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы онкогенов встраивают последовательности клонируемой чужеродной ДНК и селективный маркер. Наличие сайта инициации репликации E. coli в составе Ti-вектора позволяет проводить в кишечной палочке все стадии сборки генетической конструкции. В качестве селективного маркера используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые дают возможность отбирать трансформированные клетки растений. После введения целевой ДНК рекомбинантным Ti-вектором трансформируют клетки агробактерий, несущих модифицированную Ti-плазмиду-помощницу с удаленной Т-областью, но содержащую все необходимое для переноса в растительные клетки T-ДНК части с рекомбинантной плазмиды. Такие вектора получили название бинарных, поскольку только вместе с плазмидой-помощницей они составляют пару из двух элементов для полноценного функционирования системы переноса генов в растительную клетку с помощью агробактерий. Генетически модифицированные растения получают простой инкубацией любых частей растения с суспензией рекомбинантных агробактерий. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов (эухроматин). Для внедрения больших фрагментов ДНК в клетки растений путем введения фланкирующих Т-область последовательностей из Ti-плазмиды в состав векторов для клонирования больших фрагментов ДНК получены соответствующие космидные векторы, а также векторы на основе искусственных бактериальных хромосом (ВАС), получившие название TAC (transformationcompetent bacterial artificial chromosomes). ТАС-векторы могут быть реплицированы как в клетках Е. coli, так и агробактерий, что позволяет с помощью рекомбинантных агробактерий вводить в клетки растений фрагменты ДНК длиной более 150 тнп. Другие векторы для конструирования трансгенных растений c прямым введением чужеродных генов в виде очищенной ДНК в растительные клетки также разработаны, поскольку эффективные системы переноса генов в растительный геном с помощью агробактерий работают не для всех видов растений. Эти векторы в основном предназначены для сборки эффективной экспрессионной генной конструкции в E. coli с последующим введением в растительную в клетку очищенной ДНК. Наиболее известные способы доставки рекомбинантной ДНК в растительные клетки приведены в табл. 2.1 (подробно о способах доставки ДНК в клетки см. п. 2.1.6). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 88 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Таблица 2.1 Методы введения рекомбинантной ДНК в растительные клетки Метод Использование Ti-плазмид Комментарий Высокоэффективная система, но применима не для всех видов растений Бомбардировка микрочастицами Эффективный и дешевый способ для широкого (биобаллистика) круга растений (см. п. 2.1.6) Использование вирусных Пока неэффективный способ доставки ДНК в векторов растительные клетки Микроинъекции Имеют ограниченное применение, поскольку единовременно можно сделать инъекцию лишь в одну клетку Введение ДНК в протопласты с Применяются только для введения генов в протрансфекционными реагентами топласты (клетки с удаленной клеточной стенкой), из которых могут быть регенерированы жизнеспособЭлектропорация ные растения Слияние с липосомами Растительные векторы отличаются главным образом различными сигнальными и регуляторными последовательностями, которые обеспечивают эффективную транскрипцию генов в растительных тканях, и различными селективными маркерами. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на 3'-конце мРНК. Среди эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались, к счастью, высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот. Но для обеспечения достаточного уровня работы чужеродного гена необходимы сильные регуляторные и сигнальные элементы экспрессии, в которых ключевыми являются промоторы, хорошо работающие именно в клетке-мишени. Как и в других системах, для конструирования растительных векторов популярны элементы экспрессионной системы вирусов. В настоящее время одним из наиболее широко используемых промоторов для двудольных является сильный конститутивный 35S-промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК, CaMV) из группы каулимовирусов. Также для двудольных широко используется nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий, хотя он намного слабее 35S; для однодольных – промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act). Во многих векторах для трансформации растений как селективный, так и целевой гены находятся под контролем все того же классического 35S-промотора. Наличие рядом двух копий 35S-промотора может отрица- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 89 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы тельно сказываться на уровне экспрессии, поскольку множественные копии этого вирусного промотора в геноме могут быть одной из причин «замолкания» трансгена (явление сайлесинга (gene silencing) в ряду поколений, см. п. 2.3.3). В этой связи в настоящее время ведется как поиск новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм. Особенно нужны эффективные тканеспецифичные и индуцибельные промоторы для тканеспецифичной и/или индуцированной экспрессии трансгена. Экспрессия под сильными конститутивными промоторами, с одной стороны, приводит к большому количеству целевого белка, с другой – к синтезу этого белка во всех тканях растения, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности и стабильности трансгенного растения и часто нежелательно для исследователей. Векторы для трансформации хлоропластов высших растений (транспластомные векторы) относятся к интегративным векторам. Хлоропласты содержат полноценную генетическую систему, сходную с прокариотическими, т.е. все компоненты, необходимые для экспрессии генетической информации, включая белоксинтезирующий аппарат. Геном хлоропластов (пластом) размером 130–160 тнп заключает в себе более 100 различных генов. Векторы для трансформации хлоропластов предназначены для интеграции чужеродной ДНК в пластом с помощью гомологичной рекомбинации. Представляют собой кольцевые молекулы ДНК, содержащие кроме обычного векторного набора два участка длиной по 1-2 тнп, гомологичные последовательностям ДНК хлоропластов, в которую и происходит встраивание. Экспрессионная кассета между этими гомологичными последовательностями состоит из 5'-некодирующей области с промотором, регулирующим транскрипцию (иногда включает последовательность лидерного пептида перед множественным клонирующим сайтом для целевой ДНК) и 3'-некодирующей регуляторной области с терминатором транскрипции, стабилизирующей структуру мРНК, что является одним из условий достижения высокого уровня экспрессии трансгена в хлоропластах. Для получения эффективной транскрипции клонированного гена часто используют сильный Prrn-промотор оперона рибосомальных рРНК (rrn). В зависимости от размера хлопластной ДНК растения данная векторная система позволяет вводить в геном хлоропластов фрагменты ДНК длиной до 50 тнп, содержащие до 20–30 генов. В геноме хлоропластов описано, по крайней мере, около 20 сайтов, по которым удалось получить продуктивную интеграцию вектора. Получение транспластомных растений, содержащих генетически измененные хлоропласты, является одним из перспективных направлений, поскольку хлоропласты не переносятся с пыльцой, а значит, устраняется опасность распространения трансгенов с пыльцой среди перекрестно опыляемых растений близких видов. Кроме того, сама пыльца трансгенных растений ме- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 90 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы нее токсична для насекомых, которые не являются мишенью ее токсического воздействия у растений, синтезирующих инсектициды. Для генома хлоропластов характерен высокий уровень полиплоидии – 10–100 копий на хлоропласт. Учитывая большое число самих хлоропластов на клетку, каждая отдельная клетка с трансформированными хлоропластами содержит тысячи копий трансгена, что позволяет получать очень высокий уровень экспрессии соответствующих рекомбинантных белков (до 25 % от суммарного растворимого клеточного белка). Транзиентная «временная» экспрессия в растениях – это еще один путь для синтеза чужеродных целевых белков. Преимущество транзиентной экспрессии заключается в том, что этот метод не приводит к возникновению трансгенного растения с его экологическими и другими ограничения для ГМО. Чаще всего для этого используются векторы на основе различных фитовирусов, например, вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса мозаики коровьего гороха (ВМКГ). Заражение растительных тканей производят рекомбинантными вирусами, несущими в своем составе гены целевых белков. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счет чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме зараженных клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Иногда такую технологию применяют для масштабного коммерческого производства. Для транзиентной продукции в растениях также используют векторы Ti-системы. При инфицировании целого растения или его части (листья) рекомбинантной Agrobacterium, содержащей целевой ген в составе бинарного вектора, уровень продукции чужеродного белка может достигать 10–30 % от общего растворимого белка растения в короткое время (5–10 дней). Такой способ также используется, когда требуется проверить сконструированную экспрессионную кассету перед получением стабильных трансформантов или разово наработать небольшое количество (порядка миллиграмма) рекомбинантного белка, например, для оценки его качества или доклинических испытаний. 2.3.2. Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе Биопродукция чужеродных белков в растительных клетках имеет ряд особенностей и преимуществ. Прежде всего, в клетках высших растений происходят гликозилирование и фолдинг белков, сходные с таковым в клетках млекопитающих, но получение трансгенных растений намного проще по сравнению с животными. Культивирование растений не требует дорогостоя- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 91 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы щего оборудования (ферментеры), культуральных сред и системы стерильности, стоимость выращивания растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей, насекомых или животных. Сельскохозяйственные масштабы продукции позволяют получать рекомбинантные белки и метаболиты в достаточных количествах. В отличие от животных, растительные клетки не содержат в своем составе патогенные для человека вирусы, а также прионы и, таким образом, могут служить безопасным источником рекомбинантных препаратов медицинского назначения. Хотя стоимость выделения и очистки целевого белка из растений-продуцентов может быть сопоставима с таковой для других систем, наработка сырого материала обходится значительно дешевле. В ряде случаев, например, при использовании трансгенных растений в качестве «съедобных вакцин» выделение белка в чистом виде не требуется. Гликозилирование в клетках высших растений сходно с клетками млекопитающих, но имеются и отличия, которые могут повлиять на биологическую активность синтезируемых рекомбинантных белков в растительной системе. У растений гликопротеины имеют два углеводных остатка, не встречающихся у млекопитающих – β(1,2)-ксилозу и α(1,3) -фукозу (рис. 2.14). Эти олигосахаридные остатки могут стать аллергенами для человека, поскольку в некоторых экспериментах в крови подопытных животных обнаруживались специфические иммуноглобулины IgE против растительных углеводных детерминант. Различия в гликозилировании у растений и животных могут быть особенно важны при использовании в медицине антител, синтезированных в растениях. В животных клетках ключевым ферментом, превращающим N-гликаны растений в N-гликаны млекопитающих, является β(1,4)-галактозилтрансфераза. Если ввести этот ген в растения, можно получить гликозилирование белков по типу клеток млекопитающих. Было проведено скрещивание трансгенных растений табака, синтезирующих этот фермент, с растениями-продуцентами тяжелой и легкой цепей антител. У полученного потомства, содержащего все три белка, до 30 % иммуноглобулинов имели галактозилированные N-гликаны. Таким образом, существует возможность изменить тип гликозилирования белков человека в трансгенных растениях. Вероятно, эта проблема будет решена тем или иным путем и антитела, синтезированные в растениях, будут широко использоваться в медицине. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 92 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.14. Общая схема гликозилирования белков в клетках животных и растений Уровень синтеза рекомбинантных белков в растительной клетке. Хотя идея внедрения экзогенной ДНК в растительный геном для наработки соответствующих продуктов в растении представляется весьма перспективной, этот подход не лишен и некоторых недостатков. Среди них необходимо отметить частый низкий уровень экспрессии перенесенных генов, даже при использовании очень сильных промоторов. Например, первые эксперименты по экспрессии различных человеческих белков в трансгенном табаке дали очень низкий выход – содержание сывороточного альбумина человека составило приблизительно 0,02 %, эритропоэтина – 0,003 % и b-интерферона – 0,001 % от суммарного белка листьев. Одной из причин этого, по-видимому, является увеличение скорости деградации мРНК чужеродного гена, когда ее уровень достигает порогового значения. Этот механизм, возможно, служит одним из способов защиты растения от РНК-содержащих вирусов. Повысить продукцию чужеродных белков в растениях в некоторых случаях удалось введением трансгена в геном хлоропластов, например, в этом случае человеческий сывороточный альбумин составил более 11 % от растворимого белка клеток, человеческий гормона роста – до 7 %. Второй причиной низкого уровня продукции является протеолиз чужеродных белков в цитоплазме растительной клетки. Введение в полипептидную цепь целевого белка сигнальных последовательностей, направляющих его накопление в эндоплазматической сети или секрецию в апопласт, где частота протеолиза значительно ниже, позволяет достичь повышения продуктивности трансгенных растений в 100 раз. Экспрессия целевых белков в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводненных тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Так, например, уровень синтеза гирудина, слитого с олеозином (белком из масляных телец), в семенах трансгенного рапса достигал 0,3 %. Уро Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 93 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы вень синтеза под глютелиновым промотором энкефалина человека, направленного в компартменты накопления запасных белков сигнальной последовательностью глютелина (запасной белок риса), составил 2,9 % от тотального белка в семенах арабидопсиса. Очевидно, что многие проблемы в получении высокоэффективных стабильных трансгенных растений для хозяйственных целей в настоящее время обусловлены недостатком фундаментальных знаний о функционировании генома высших растений. В частности, пока нет ясного понимания того, каким образом происходит включение и выключение генов в ДНК растений. Сайленсинг генов (gene silencing) – явление «замолкания» генов в последующих поколениях – было обнаружено уже через несколько лет после создания первых трансгенных растений. Было выявлено, что у достаточно заметной доли трансгенных растений интродуцированный ген через какое-то время теряет свою активность – «замолкает», хотя физически сохраняется в геноме. Таким образом, было установлено, что растение обладает способностью активно противостоять экспрессии чужеродной ДНК. Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивированием трансгенов. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще остаются до конца не выясненными. Проблема замолкания генов имеет большое практическое значение, так как у генетически трансформированных сельскохозяйственных культур трансгены должны функционировать стабильно. За последние годы удалось выяснить механизмы и некоторые условия, способствующие замолканию генов при интеграции в ядерный геном растений. Один из основных факторов – число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов. Откуда следуют практические рекомендации генным инженерам: трансгенные культуры должны содержать не более одного встроенного гена на гаплоидный геном; сигнальные части и регуляторные части чужеродной ДНК (промоторы, терминаторы и др.) не должны иметь длинных гомологий (более 100–300 нп) с участками хозяйского генома; фрагменты векторной плазмидной или вирусной ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конструкции перед встраиванием рекомбинантной ДНК в растительные клетки. 2.3.3. Области применения генной инженерии растений Метаболическая инженерия растений направлена на проведение трансгенной клеткой новых биохимических реакций путем введения чужеродных генов или модификацией генов клетки-хозяина. Растения представляют один из наиболее привлекательных объектов для метаболической инженерии. Имея одинаковые пути синтеза основных биологических соедине Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 94 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы ний, растения отличаются поразительным разнообразием своих конечных продуктов: сахаров, ароматических соединений, жирных кислот, стероидных соединений и других биологически активных веществ. Растения дают человечеству десятки тысяч природных продуктов, многие из которых представляют большую ценность для фармакологии и промышленности. Иногда такими продуцентами важных лекарственных веществ являются уникальные тропические и эндемические растения, недоступные для их агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира. Выделение из таких растений генов, определяющих направленный синтез специфических органических соединений, и их перенос в подобранные соответствующие растения превращают их в новые продуценты важных биологически активных веществ. Многие растения содержат предшественников биосинтеза ценных биологических соединений, однако они не имеют ферментов для их превращений в эти соединения. Часто для метаболической инженерии достаточно переноса в клетку только одного гена. Примером такого типа метаболической инженерии является получение новых растенийпродуцентов резвератрола, ценного лекарственного препарата широкого Рис. 2.15. Схема синтез резвератрола, спектра действия, замедляющего найденного в винограде ценного препастарение. Резвератрол был обнарурата антиоксидантного типа с широким жен в винограде, где фермент стилспектром действия. Исходные соединения бенсинтаза катализирует реакцию присутствуют в клетках любых растений синтеза резвератрола из трех молекул малонил-СоА и одной молекулы 4-кумарил-СоА (рис. 2.15). Переносом гена стилбенсинтазы были получены другие растения, синтезирующие резвератрол. Создание растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами поможет улучшить пищевую ценность растений. Ранее было практически невозможно с помощью селекции вывести растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза витаминов. Например, для синтезаβ -каротина (провитамина А) в растениях необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса был введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд чел., страдающих от дефицита витамина А, для них рис – основная пища. Получены трансгенные растения рапса, экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 95 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы тельно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина. Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах. Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH). Уже существует салат с увеличенным содержанием железа, обогащенная лизином кукуруза. Ждет своего запуска в практику сорт сои с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот (омега-3, омега-6 НЖК и др.), которые не синтезируются в организме человека, а попадают по пищевым цепям в основном через морепродукты из водорослей. Гены, встраиваемые в геном соевых бобов, были выделены из клеток водорослей (разработчик – компания Monsanto). Разработаны в лабораториях и другие разнообразные трансгенные формы растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами. Самый первый коммерческий успех получили растения, устойчивые к гербицидам, поскольку позволили очень успешно бороться с сорняками. Самыми распространенными являются трансгенные растения, устойчивые к глифосату (Раундап) – самому популярному гербициду, разлагающемуся в почве на нетоксичные составляющие и потому безопасному для окружающей среды. Ген был выделен из глифосат-устойчивого штамма E. coli. Выведение растений, устойчивых к вредителям и болезням, поможет резко сократить применение химических средств защиты растений и уменьшить стоимость культивирования. Одними из первых в широкую практику вошли инсектицидные хлопок и кукуруза – так называемые Bt-сорта, которые были получены введением в них гена дельта-эндотоксина из Bacillus. thuringiensis (Bt или Cry-белок). Bt-белок высокотоксичен для насекомых, но безопасен для других видов животных и человека. Он является протоксином, который расщепляется в кишечнике личинок насекомых, образуя активированный токсин. Активированный токсин, в свою очередь, специфично связывается с рецепторами в средней кишке насекомых, что приводит к лизису клеток кишечного эпителия. Данный энтомотоксин – смертельный яд для ряда насекомых (в том числе и колорадского жука), но в то же время вполне безопасен для человека и животных, поскольку в организме млекопитающих нет ферментов для его расщепления и усвоения. Взаимодействие Bt-токсина с рецепторами насекомых строго специфично. В природе найдено большое количество штаммов B. thuringiensis, чьи токсины действуют на строго определенные виды насекомых. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 96 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Ранее препараты бактерий B. thuringiensis, содержащие Bt-белок, с успехом применяли для борьбы с насекомыми-вредителями, хотя использование таких препаратов достаточно дорого и не всегда эффективно. Введение гена протоксина в растения привело к тому, что Bt-растения перестали поедаться насекомыми. Этим путем был получен трансгенный картофель, устойчивый к колорадскому жуку. Устойчивость к вирусам может обладать исключительной важностью для повышения сельскохозяйственной продуктивности. В настоящее время в различных странах мира проводят полевые испытания устойчивых к вирусам сортов батата (вирус SPFMV, sweet potato feathery mottle virus), кукурузы (MSV, maize streak virus) и африканской маниоки (мозаичный вирус). Возможно, эти культуры будут коммерциализованы в течение ближайших 3–5 лет. Из-за сложности генома пшеницы, работа над созданием сортов, устойчивых к вирусу желтой карликовости ячменя (barley yellow-dwarf virus), продвигается очень медленно и до сих пор находится на стадии лабораторных экспериментов. Разработан также устойчивый к нематодам (корневым червям) ГМ-картофель. Генно-инженерная биотехнология растений для фармакологии делает свои первые успешные практические шаги. Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для получения различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Следует отметить перспективность получения ГМ-растений, синтезирующих новые формы антимикробных пептидов. Растительные системы имеют все перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе. Некоторые белки, синтезируемые трансгенными растениями, уже производятся западными компаниями или будут выпущены на рынок в ближайшие годы. Например, авидин, трипсин иβ -глюкуронидаза, выделяемые из трансгенной кукурузы, производятся фирмой Sigma-Aldrich (США). В скором времени должны быть подготовлены к промышленному производству коллаген, липаза, лактоферрин, лизоцим, синтезируемые трансгенными растениями. Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях. Выявленно, что при экспрессии различных антигенов в растениях сохраняется их структурная идентичность и иммуногенность. Антигены, синтезируемые растениями, вызывали иммунный ответ при введении, например, HBs-антиген, синтезируемый растениями картофеля, вызывал у мышей более сильный иммунный ответ, чем дрожжевой. В настоящее время более пятидесяти различных антигенов были экспрессированы в ГМ-растениях, для некоторых из них Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 97 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы показана иммуногенность при оральном введении. Интенсивно разрабатывается концепция «съедобных вакцин» на основе трансгенных растений, чьи плоды, листья и семена годятся в пищу. В случае успеха исчезнет потребность в дорогостоящей очистке антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения. Антигены, экспрессируемые в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, ответственным за мукозную систему иммунитета. Таким образом, непрерывно разрабатываются все новые виды пищевых и технических растений с измененными свойствами – с улучшенным составом жиров, повышенным содержанием белков и витаминов, сладкие без сахара и накапливающие меньше вредных для здоровья нитратов, с повышенными декоративными свойствами. Опытные испытания проходят сотни пород деревьев, у которых часть ненужного человеку лигнина заменена полезной целлюлозой. При этом растут ГМ-деревья вдвое быстрее обычных. Трансгенные растения вырабатывают вакцины и лекарства, очищают почву от химического и радиоактивного загрязнения, синтезируют биодеградируемые полимеры для производства упаковки и белок паутины, из которого можно делать колготки и бронежилеты повышенной прочности. 2.3.4. Коммерциализация трансгенных растений и биобезопасность С момента публикации в 1983 г. первых работ по получению трансгенных растений табака прошло не очень много времени, но существующее сейчас количество самых разнообразных трансгенных растений уже не поддается учету. И, несмотря на то, что путь от лабораторного получения трансгенного растения до его коммерческого применения довольно долог, в настоящее время в сельскохозяйственном производстве общие площади биотехнологических культур достигли уже 114,3 млн га (рис. 2.16, табл. 2.2). Разрешения на коммерческое использование дожидаются сотни сортов десятков видов пищевых растений и технических растений с самыми разнообразными новыми свойствами. Новые культуры проходят длительную всестороннюю тщательную проверку в отношении биобезопасности. Самыми распространенными из трансгенных сельскохозяйственных растений является соя (51 %), за ней следуют быстро набирающая объемы культивирования кукуруза (31 %), хлопок (13 %) и рапс (5 %). Необходимо отметить, что некоторые генно-модифицированные культуры (например, ГМ-соя) уже обогнали по захваченной площади свои «традиционные» аналоги. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 98 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.16. Рост общих площадей под посевами биотехнологических культур в 1996–2007 гг. (по данным ISAAA). В 2007 г. по сравнению с 2006 г. произошло увеличение площадей на 12 % или 12,3 млн га (разрешено к публикации www.isaaa.com) По рейтингу свойств коммерциализированных трансгенных растений, составленному Международной службой по использованию агробиотехнологии (ISAAA), на протяжении всего периода культивирования с 1996 по 2007 гг. первое место занимают гербицидоустойчивые культуры, затем следуют Bt-культуры, устойчивые к насекомым-вредителям, за ними – комбинированные культуры (оба этих признака), в последние годы появились культуры, совмещающие три признака. В 2007 г. все устойчивые к гербицидам культуры (соя, кукуруза, рапс, хлопок, люцерна и др.) суммарно занимали 63 %; Bt-культуры –18 %; комбинированные культуры с двумя или тремя признаками –19 %. В 2007 г. по сравнению с 2006 г. быстрее всего увеличивались площади посевов комбинированных культур (с двумя и тремя признаками) – на 66 %; затем идут Bt-культуры – 7 % роста и устойчивые к гербицидам культуры – 3 % роста. Начинает увеличиваться доля культивируемых трансгенных растений, устойчивых к вирусам, грибкам, нематодам и другим вредителям, холоду, жаре, засухе или долго не портящихся при хранении. Новые сорта способны не только расти, но и приносить хороший урожай там, где старые сорта просто не могли выжить (слишком холодно или тепло, или сухо). Например, Северная Дакота, ранее считавшаяся совершенно не пригодной для выращивания соевых бобов, в настоящее время уже стала одним из главных поставщиков этой культуры в США. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 99 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Таблица 2.2 Посевные площади, занятые трансгенными растениями в 2007 г. (разрешено к публикации www.isaaa.com) Площадь, ГМ-растения млн га 1* США 57,7 Соя, кукуруза, хлопок, рапс, папайя, бахчевые, люцерна 2* Аргентина 19,1 Соя, кукуруза, хлопок 3* Бразилия 15,0 Соя, хлопок 4* Канада 7,0 Соя, кукуруза, рапс 5* Индия 3,2 Хлопок 6* Китай 6,8 Хлопок, томаты, сладкий перец, папайя, тополь, петуния 7* Парагвай 2,6 Соя 8* Южная Африка 1,8 Соя, кукуруза, хлопок 9* Уругвай 0,5 Соя, кукуруза 10* Филиппины 0,3 Кукуруза 11* Австралия 0,1 Хлопок 12* Испания 0,1 Кукуруза 13* Мексика 0,1 Соя, хлопок 14 Колумбия <0,1 Хлопок, гвоздика 15 Чили <0,1 Соя, кукуруза, рапс 16 Франция <0,1 Кукуруза 17 Гондурас <0,1 Кукуруза 18 Чехия <0,1 Кукуруза 19 Португалия <0,1 Кукуруза 20 Германия <0,1 Кукуруза 21 Словакия <0,1 Кукуруза 22 Румыния <0,1 Кукуруза 23 Польша <0,1 Кукуруза * Наиболее биотехнологически развитые страны выращивают более 50 тыс. га трансгенных растений (13 стран). № Страна Широкое распространение сельскохозяйственных трансгенных растений объясняется тем, что их культивирование позволило фермерам резко повысить урожаи, при этом снизить закупки гербицидов (средств борьбы с сорняками) и закупки инсектицидов. Например, проведенные в Индии и Китае в 2007 г. исследования показали, что использование Bt-хлопка дало возможность увеличить урожайность до 50 и 10 % соответственно и сократить использование инсектицидов в обеих странах до 50 % и более. Выращивание гербицидоустойчивых растений требует в 2–4 раза меньше гербицидных обработок полей. Не случайно за годы использования трансгенных растений продажи химических средств защиты растений неуклонно снижаются. Трансгенные посадки продолжают разрастаться по всему миру. В среднем за год они увеличиваются на 10–15 %. Хотя несомненным лидером в культивировании трансгенных растений по-прежнему остаются США (табл. 2.2), их доля неуклонно уменьшается, поскольку все больше стран начинают использовать ГМ сорта в сельском хозяйстве. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 100 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Численность населения планеты составляет 6,6 млрд (на 2008 г.), в год увеличиваясь примерно на 80 млн. По прогнозам ООН, к 2020 г. население Земли возрастет с нынешних 6,6 до 7,5 млрд чел., а к 2050 г. превысит 9 млрд чел. Уже сейчас продовольствия не хватает (около 800 млн чел. в мире голодают), а в дальнейшем эта проблема только обострится, так как увеличение производства продуктов питания стало отставать от прироста населения. Все возможные территории для землепользования уже освоены, традиционные способы повышения продуктивности сельскохозяйственного производства себя уже исчерпали, а дефицит продуктов питания продолжает нарастать. Так что альтернативы применению генно-инженерных сельскохозяйственных культур не видно. Генетически модифицированные продукты стали одним из достижений биологии ХХ в. Рост потребления таких продуктов считается одним из способов борьбы с голодом. Ныне во многих странах мира практически невозможно избежать употребления генетически модифицированных растений. Так, с большой долей вероятности можно сказать, что практически все продукты, произведенные с использованием кукурузного, соевого или хлопкового масла, содержат генетически измененный материал. Биобезопасность трансгенных растений остается предметов острых дискуссий в обществе. Как и все принципиально новое в нашей жизни, трансгенные растения неоднозначно воспринимаются обществом. Противники трансгенных растений утверждают, что возделывание таких растений может быть опасно как для человека, так и для окружающей среды. Большинство этих страхов, скорее всего, порождено недостаточным пониманием сущности трансгенных растений и просто неприязнью ко всему новому. Но некоторые аргументы против ГМ-растений заслуживают подробного рассмотрения. Так, противники ГМ-растений утверждают, что трансгенные растения способны негативно влиять на окружающую среду: через так называемый «горизонтальный перенос генов» в микроорганизмы; непредусмотренное воздействие на организмы, живущие в агроценозе или рядом (нецелевое воздействие); утечку трансгенов с пыльцой к диким родственникам, отрицательно влияющую на биоразнообразие. Что касается возможности переноса ДНК из ГМ-растений в микроорганизмы, наука пока таких фактов в природе не обнаружила. Если бы это на самом деле происходило так быстро и просто, как считают оппоненты генной инженерии растений, то за миллионы лет эволюции гены всех организмов совершенно перемешались бы. Преимущество белковых токсинов, продуцируемых ГМ-растениями, перед синтетическими пестицидами очевидно: большие и нестойкие молекулы белков не накапливаются в природе – быстро распадаются до аминокислот; кроме того, они более специфичны, т.е. уничтожают только определенных вредителей (бактерии, грибы, насекомые). В отличие от этого, маленькие молекулы химических пестицидов почти не обладают избирательностью, поражая все в зоне применения, и из-за высокой химической стабильности могут проходить по пищевым цепям и накапливаться на их вершине. Ярким Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 101 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы примером является запрещенный ДДТ, который после применения по пищевым цепям попадает на стол человека в концентрированном и неизмененном виде. Несостоятельными являются и утверждения, что перенос какого-либо трансгена с пыльцой придаст дикому виду такое преимущество, что он вытеснит все остальные. Дикие растения, широко используемые селекционерами для выведения новых сортов в качестве донора нужных признаков, не вытесняют окружающие. Все культурные растения не выдерживают конкуренции с дикими, они зависят от человека и способны существовать только с его помощью. Пока биоразнообразию в первую очередь угрожает не замена одного сорта (или даже десяти сортов) на другой, а превращение природных ландшафтов в сельскохозяйственные. Даже гипотетическая опасность заноса трансгенов с пыльцой в дикие популяции родственных перекрестноопыляемых видов в настоящее время может быть снята получением трансгенных растений с трансформированными хлоропластами (транспластомные растения), пыльца которых не содержит трансгенов. 2.3.5. Регулирование производства и сертификация генно-модифицированного сырья и пищевых продуктов Практически все развитые страны приняли закон о регулировании генно-инженерной деятельности. США, являясь признанным лидером не только в создании трансгенных растений, но и в их производстве, имеет жесткое государственное регулирование: от планирования лабораторных экспериментов до международного маркетинга ГМ-растений. Согласно практике, принятой в США, такое регулирование осуществляется на каждой стадии создания и внедрения ГМ-растений: планирование генно-инженерных экспериментов → полевые испытания → т оксикологическая оценка продуктов урожая → экотоксикологическая оценка производства ГМ-растений → …→ выпуск трансгенных продуктов на внутренний и внешний рынок. Основными инстанциями, регулирующими создание и внедрение ГМ-растений в США, являются: комитеты биобезопасности учреждений, создающих ГМ-растений (Institutional Biosafety Committee), Служба Инспекции здоровья животных и растений (Animal and Plant Health Inspection Service – APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), Администрация пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration – FDA), Агентство охраны окружающей среды (Environmental Protection Agency – EPA). В России в настоящее время к выращиванию на полях не разрешено ни одно трансгенное растение, но разрешен экспорт генетически модифицированной продукции. В России разрешены только испытания трансгенных растений, которые проводятся на специальных полигонах под строгим контролем. Основополагающим нормативным документом в сфере производства, импорта и реализации ГМ-продуктов является Закон РФ «О государственном Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 102 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 05.07.1996 г. № 86-ФЗ. Статья 11 Закона прямо устанавливает: «Продукция (услуги), полученная с применением методов генно-инженерной деятельности, должна соответствовать требованиям экологической безопасности, санитарных норм, фармакопейных статей, обязательным требованиям государственных стандартов РФ». На данный момент не обнаружено однозначных доказательств, что генетически модифицированные продукты способны принести вред человеку. Хотя выгода от применения ГМ-растений очевидна, существует много противников трансгенных растений, убежденных в их опасности и использующих в своих аргументах невозможность ученых дать полную гарантию безопасности подобных продуктов. В каждой стране мира вопрос об использовании трансгенных растений решается по-разному местными законодателями. Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому упаковки продуктов, при изготовлении которых использовались достижения генной инженерии, должны содержать информацию об этом, чтобы потребители самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях, например, когда соя используется при производстве мясных полуфабрикатов, производители не сообщают об этом покупателям. С 1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допустимый порог наличия таких примесей в 0,9 %, который требуется количественно точно детектировать и указывать на упаковке. 2.3.6. Трансгенные животные: технологии получения В отличие от растений, где существует возможность получения целого фертильного растения из одной трансформированной соматической клетки и вегетативное размножение, получение трансгенных животных – очень сложный и длительный процесс. Используемая стратегия состоит в следующем: 1. Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки. 2. Оплодотворенные яйцеклетки с экзогенной ДНК имплантируют в рецепиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно). 3. Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках. 4. Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию. Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее, трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 103 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы «фарминг» (pharming), относящийся к процессу получения из молока трансгенных домашних животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые, по крайней мере, близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки, не должно составлять большого труда. Несмотря на то, что первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в 1985 г. введением экзогенной ДНК в пронуклеус зигот, до настоящего времени не разработано эффективного метода, который бы мог быть использован для создания генетически модифицированных животных независимо от вида и от целей эксперимента. Разработка новых эффективных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки животных, а также совершенствование существующих подходов остается актуальной задачей. Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном животного можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгеноза: – метод микроинъекции, – опосредованный ретровирусами перенос генов, – использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток, – перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток, – использование спермиев и сперматогониев как переносчиков ДНК. Среди других способов доставки экзогенной ДНК в организм животных можно отметить использование липосом, аденовирусных векторов, а также метод высокоскоростной инъекции. Однако эти методы не нашли широкого применения вследствие их недостаточной стабильности, а также отсутствия интеграции трансгена в геном. Микроинъекции рекомбинантной ДНК в оплодотворенные ооциты многоклеточных животных пока остаются наиболее популярным способом введения чужих генов в организм животных. Несмотря на то, что метод требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования, простота и надежность окупают все его недостатки. Первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой для получения трансгенных животных явилась мышь. Донорных самок мышей с экспериментальной суперовуляцией скрещивают с самцами-производителями, через 12 ч выделяют оплодотворенные яйцеклетки и помещают их в культуру. Далее в больший их двух пронуклеусов (обычно мужской) инъецируют рекомбинантную ДНК (рис. 2.17). Пережившие инъекцию яйцеклетки пересаживают самкам-реципиентам. Только часть трансплантированных ооцитов продолжает развиваться до рождения детенышей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 104 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы а б Рис. 2.17. Микроинъекция экзогенной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки млекопитающих под микроскопом (а) и схема эксперимента (б) На частоту интеграции экзогенной ДНК при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как чистота вводимого образца, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический). Трансгенных животных в потомстве идентифицируют различными методами, чаще всего ПЦР, и скрещивают для получения трансгенных линий. Некоторые из трансгенных животных оказываются мозаичными (половые клетки не содержат экзогенной ДНК), поэтому при скрещивании трансгенным оказывается меньшая часть потомства первого поколения, чем расчетные 50 %. В ряде случаев гомозиготные линии получить не удается, поскольку 5–15 % трансгенных инсерций в гомозиготном состоянии летальны, так как инсерция иногда нарушает жизненно-важные части генома. Точный механизм, обеспечивающий интеграцию инъецированной ДНК в хромосомы клетки-мишени, неизвестен, однако анализ структуры встроенной ДНК позволяет выявить некоторые моменты. Интеграция происходит случайным образом в один хромосомный локус, который может содержать от одного до нескольких тысяч тандемных копий интегрированной ДНК. Около 30 % полученных первичных трансгенных животных, как правило, обнаруживают ту или иную степень мозаичности, что может являться следствием интеграции экзогенной ДНК после завершения первого цикла репликации. Степень интеграции экзогенной ДНК в геном, т.е. число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах 5–15 % [4]. Наиболее важным с учетом затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель общей эффективности трансгеноза, который рассчитывается как отношение числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя для млеко Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 105 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы питающих также относительно постоянна и составляет в среднем от ~0,5 % у свиней и коров до ~2 % у мышей. Ретровирусные векторы также используются для получения трансгенных животных. Инфицирование предимплантационных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами – относительно несложная эффективная процедура. Восьмиклеточную морулу (рис. 2.18) освобождают от яйцевой оболочки и помещают в культуральную чашку с фибробластами, продуцирующими рекомбинантный ретровирус. Инфицированные эмбрионы, достигшие стадии бластулы, имплантируют псевдобеременным самкам. В результате формируются трансгенные организмы, мозаичные по числу и локализации встроек рекомбинантной ДНК в геном. Поэтому для получения чистых линий далее необходим масштабный аутбридинг. Недостатком метода является ограничение вставки экзогенной ДНК ~8 тнп, вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии, а в некоторых случаях интеграция в исходный локус нестабильна. Новые лентивирусные векторы (лентивирусы принадлежат семейству ретровирусов) показали свою очень высокую эффективность при доставке ДНК в ооциты и зиготы. Инъекция рекомбинантных лентивирусных конструкций в перивителлиновое пространство свиных зигот и коровьих ооцитов привело к появлению потомства с самой высокой на данный момент долей трансгенных особей. В то же время лентивирусные векторы обладают всеми недостатками ретровирусных: малый размер вставки экзогенной ДНК и множественная интеграция в хозяйский геном, которая может привести к таким нежелательным побочными эффектам, как активация онкогенов и инсерционный мутагенез. Кроме того, для лентивирусных векторов наблюдается высокая степень мозаичности получаемого трансгенного потомства и отдельные факты сайленсинга (инактивации) лентивирусных рекомбинантных последовательностей в полученных трансгенных линиях. Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 106 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.18. Схема получения линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов Модифицированные эмбриональные стволовые клетки могут быть использованы для получения трансгенных животных. Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты (рис. 2.19). Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). В ES-клетки в культуре можно ввести целевой трансген различными методами (трансфекция, электропорация, ретровирусная инфекция и т.д.) без нарушения их плюрипотентности. Практическое достоинство этой схемы заключается в том, что она дает большие возможности для проведения селекции клеток по определенному параметру. Это может быть число копий трансгена, его локализация или характер экспрессии. Зная последовательности, окружающие конкретный сайт для желаемой интеграции, можно сконструировать вектор для встраивания целевой ДНК путем гомологичной рекомбинации. Например, заменить какой-либо ген, кодирующий легко идентифицируемый признак с целью селекции, убрав или восстановив его функцию в полученной трансгенной клетке. Таким же образом получают так называемых нокаутных мышей (knock out) – мышей с направленно инактивированным определенным клеточным геном для исследования его функций. Для осуществления гомологичной рекомбинации вектор конструируют из фрагментов целевого гена, который планируется инактивировать, часть целевого гена при этом заменяется каким-либо селективным маркером для проведения отбора клеток с интегрированной конструкцией. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 107 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.19. Получение трансгенных мышей методом реконструкции эмбрионов с помощью генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток (ES-клеток). ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши Отобранные трансгенные ES-клетки можно культивировать и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания трансгена, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. Все получаемые по такой схеме животные являются мозаиками, поэтому необходима селекционная работа по получению чистых линий. Проблему мозаичности первичных трансгенных животных можно преодолеть пересадкой ядер трансформированных ES-клеток в энуклеированные ооциты, которые затем продолжают свое нормальное развитие. В результате в каждой клетке полученного животного будет содержаться трансген. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные мышиным, пока не обнаружены у других млекопитающих и птиц, но поиски продолжаются. Перенос ядер трансформированных генеративных и соматических клеток в яйцеклетку, или соматический ядерный перенос (somatic nuclear transfer), еще один способ, используемый в практике трансгеноза. Было показано, что ядра эмбриональных клеток различных животных при переносе в энуклеированную яйцеклетку иногда способны обеспечивать развитие целого нового организма. После непродолжительного культивирования даже ядра из некоторых дифференцированных клеток способны обеспечивать развитие до жизнеспособной особи. Так, например, знаменитая овечка Долли была клонирована в 1997 г. слиянием культивируемых (3–6 пассажей) клеток эпителия молочной железы (вымени) взрослого шестилетнего животного с лишенной ядра яйцеклеткой (рис. 2.20). Хотя нельзя исключить, что для клонирования случайно была взята недифференцированная клетка, присутствующая в донорском эпителии. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 108 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы Рис. 2.20. Клонирование овцы методом переноса ядра. Эпителиальные клетки молочной железы в культуре индуцируют для перехода в фазу G0 (стадия, на которой находится яйцеклетка). Затем осуществляют слияние такой клетки с энуклеированной яйцеклеткой и выращивают эмбрионы до ранних стадий эмбриогенеза. После чего эмбрионы имплантируют в матку суррогатной матери, где происходит дальнейшее развитие. В эксперименте Я. Уилмута (I. Wilmut) по клонированию Долли было проведено 277 слияний безъядерных яйцеклеток с клетками молочной железы в фазе G0, из 29 выживших эмбрионов только один развился до жизнеспособного организма Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. В зиготах овец в течение первых трех делений, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки. Хотя технологиям клонирования еще очень далеко до совершенствования – клонированная Долли выявляла многие признаки преждевременного старения, это очень многообещающая технология получения трансгенных животных. Даже если имеются различные проблемы с первым поколением, скорее всего, второе поколение не будет иметь недостатков, приобретенных вследствие использования «старого» ядра для яйцеклетки. Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание любых трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, – это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. В настоящее время ведутся активные поиски факторов репрограммирования дифференцированных клеток для индукции плюрипотентности. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных ор Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 109 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы ганизмов путем соматического ядерного переноса станет почти рутинной процедурой, а пока это единичные удачные эксперименты. Искусственные хромосомы как трансгенный вектор. Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после генамишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до > 1 000 тнп и искусственные хромосомы человека еще большей емкости (об искусственных хромосомах см. п. 2.1.4). Данные эписомальные векторы имеют еще одно преимущество – позволяют избежать эффект положения гена при экспрессии экзогенной ДНК. Уровень экспрессии встроенного гена очень зависит от его хромосомной позиции, например, встраивание в неактивный хроматин (гетерохроматин) интактной хромосомы приводит к инактивации гена. С помощью искусственных дрожжевых хромосом (YAC), несущих несколько родственных генов или один большой ген, были получены трансгенные мыши путем микроинъекции в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных геновβ -глобина человека суммарной длиной примерно 250 тнп, экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время – точно так же, как это происходит у человека. Такое соответствие обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы. С помощью YAC-трансгеноза были получены мыши, которые синтезировали только человеческие антитела, являющиеся сложной тетрамерной конструкцией из двух пар разных полипептидных цепей. Искусственные хромосомы человека (human artificial chromosome – HAC), содержащие целиком иммуноглобулиновый локус человека с тяжелыми и легкими цепями, были внедрены в бычьи фибробласты, которые затем использовали для соматического ядерного переноса. Полученные трансхромосомальные телята экспрессировали иммуноглобулины человека в своей крови [5]. Эта система стала важным шагом в направлении животной продукции терапевтических поликлональных антител человека. Дальнейшие наблюдения за трансгенными животными показали, что рекомбинантные HACs поддерживались в большинстве особей первого поколения в течение нескольких лет. Будут ли полученные искусственные хромосомы соответствующим образом разделяться в процессе мейоза и наследоваться, еще только предстоит выяснить. Совсем недавно возникла новая перспективная технология для получения животных с выключенными генами – малые интерферирующие РНК (миРНК, siRNA), которые используют для прицельного выключения генов Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 110 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы (сайленсинга, см. п. 2.3.2). РНК-интерференция – консервативный посттранскрипционный регуляторный процесс. Двухцепочечные малые интерферирующие миРНК в 19–23 нуклеотида специфически связываются с комплементарной последовательностью своей матричной мРНК-мишени, направляя ее по пути деградации. РНК-интерференция является составной частью системы генной регуляции, а именно контролирует/супрессирует трансляцию мРНК из эндогенных и экзогенных вирусных элементов и может быть использована для терапевтических целей. Для транзиентного выключения гена синтетические миРНК трансфецируют в клетки или ранние эмбрионы. Для стабильной генной репрессии последовательность миРНК должна быть инкорпорирована в геном в составе экспрессионной генной конструкции. Очень эффективна комбинация лентивирусных векторов с миРНК для интеграции в геном. В противоположность классической нокаут-стратегии, которая требует длительного скрещивания для получения чистой линии с инактивированным геном в обоих локусах диплоидного генома, миРНК при интеграции могут легко выключить целевой ген в любой имеющейся линии животных. Несмотря на разработанный широкий спектр методик получения трансгенных животных, в настоящее время пока отсутствует надежная и эффективная технология трансгеноза животных. Самые большие проблемы связаны с беспорядочным встраиванием экзогенной ДНК в геном при использовании большинства существующих методов. Так что дальнейшие качественные улучшения технологии необходимы в области разработки прицельной модификации клеточных генов и точного встраивания экзогенной ДНК в геном. Тем более что геномы большинства хозяйственно важных организмов к настоящему времени полностью секвенированы и можно планировать будущую структуру трансгенного организма. Сочетание полностью расшифрованных последовательностей геномов с методами адресной доставки экзогенной ДНК позволит проводить целенаправленное конструирование трансгенных геномов с заранее заданными свойствами. 2.3.7. Применение трансгенных животных По применению трансгенных животных можно разделить на пять основных категорий: научные модели, модели для изучения болезней человека, источники для производства фармацевтических препаратов, источники ксенотрансплантантов и источники пищи. Большинство из обсуждаемых ниже областей коммерческого применения трансгенных животных в настоящее время находятся на ранних этапах исследований и разработки, за некоторыми исключениями. Так, с 2004 г. в зоомагазинах некоторых стран (США, Тайвань, Китай, Малайзия) продаются декоративные трансгенные рыбки, окраска которых обусловлена присутствием флуоресцентных белков из кораллов. Важной вехой в истории применения трансгенных животных стал 2006 г., когда Европейское медицинское агентство (the European Medicines Agency (EMEA)) выдало первое разрешение на коммерческое использование первого Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 111 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы рекомбинантного белка из молока трансгенного животного. Им стал рекомбинантный антитромбин III с коммерческим названием ATryn, который предназначен для профилактического лечения пациентов с врожденной антитромбиновой недостаточностью. Научные модели. Сложность генома млекопитающих, длительные периоды взросления и размножения, трудности изучения большого числа индивидуальных животных с учетом варьирования признаков делают генетический анализ этих систем затруднительным. Трансгенная технология несет в себе большие возможности, в первую очередь, для фундаментальных исследований принципов функционирования геномов и отдельных генов. Например, линии нокаутных мышей, гомозиготных по направленно-инактивированным генам, позволяют изучать детерминируемые данными генами свойства на уровне организма. Регулируемые системы экспрессии трансгенов дают возможность исследовать тонкие механизмы воздействия продуктов того или иного гена на физиологию и эмбриональное развитие животных. Модельные системы для изучения болезней человека. Используя целых животных, можно моделировать возникновение патологии, исследовать ее развитие и способы лечения. И хотя данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в медицинских аспектах, они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни, ее молекулярные основы и подсказать пути лечения. В настоящее время на мышах смоделированы такие заболевания человека, как СПИД, болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, гипертония, образование опухолей, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие. Получена дрозофила с болезнью Паркинсона. Источники для производства фармацевтических белков. Существующие методы получения в культурах клеток рекомбинантных человеческих протеинов для медицинских целей имеют ряд существенных недостатков и жестких законодательных ограничений. Одной из особенностей таких медицинских препаратов является их крайне высокая цена, обусловленная в том числе высокой стоимостью клеточного культивирования. Преодолевая эти ограничения, большое количество белков можно получать из молока трансгенных животных, несущих человеческие гены, ответственные за выработку определенного протеина, под контролем промоторов, специфичных для молочных желез. Предполагается, что выход может составить до 35 г белка из одного литра молока при относительно невысокой стоимости производства и очистки. Человеческие белки, секретируемые в молоко, гликозилируются соответствующим образом и обладают активностью, близкой к нативным белкам человека. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство. В настоящее время многочисленные белки получены в больших количествах эффективной секрецией в молоко трансгенных мышей, кроликов, овец, свиней, коз и коров. Часть рекомбинантных белковых препаратов из молока трансгенных животных уже готовится к выходу на Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 112 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы рынок (табл. 2.3). Первым препаратом из молока стал ATryn (человеческий антитромбин III), который в 2006 г. после 3-й фазы клинических испытаний был зарегистрирован как лекарство в Европейском союзе. Таблица 2.3 Терапевтические белки из молока трансгенных животных, готовящиеся к выпуску на фармацевтический рынок ЖивотПродукт Компания ноеЭтап выхода на рынок* источник ATryn, рекомбинантный антиGTC Biotherapeutics Коза ЕС: выход на рынок тромбин III человека США: фаза 3 С1 эстеразный ингибитор Pharming Кролик Фаза 3 MM-093 (AFP), альфа-фетопротеин Merrimack and GTC Коза Фаза 2 Biotherapeutics Альфа-глюкозидаза Pharming Кролик Фаза 2, ожидание Человеческий гормон роста BioSidus Корова Доклинический Альбумин GTC Biotherapeutics Корова Доклинический Фибриноген Pharming Корова Доклинический Коллаген Pharming Корова Доклинический Альфа-1-антитрипсин Pharming Корова Доклинический Лактоферрин GTC Biotherapeutics Коза Доклинический Малярийная вакцина GTC Biotherapeutics Коза Доклинический CD 137 (4–1BB) MAb, монокло- GTC Biotherapeutics Коза Доклинический нальные антитела * Фазы 2 и 3 – фазы клинических испытаний Успешная регистрация препарата ATryn продемонстрировала правильность такого подхода к продукции терапевтических белков и облегчила путь на рынок другим рекомбинантным препаратам из молока трансгенных животных, а также стимулировала научную и коммерческую активность в данной области. Другим источником продукции рекомбинантных белков является кровь трансгенных животных. Получены трансгенные бычки, продуцирующие биспецифичные антитела человека в своей крови. Эти антитела после очистки из сыворотки были очень стабильны и соответствующим образом стимулировали Т-клеточное уничтожение раковых клеток. Получение трансгенных цыплят открыло возможность использовать яйца, содержащие немало запасных белков для накопления нужных рекомбинантных белков – активных компонентов лекарственных средств. В этом случае белки можно получать в больших количествах, и их производство будет дешевым, так как сырьем для этого является всего лишь птичий корм. В институте Рослин, где была клонирована Долли, разработаны 2 линии трансгенных кур с перспективой на коммерческое применение. Одна из линий несет яйца с антителами miR24 в яичном белке, с помощью которых можно будет лечить злокачественную меланому – форму рака кожи, другая Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 113 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы производит человеческий интерферон β-1a, который может быть использован для остановки внутриклеточного размножения вирусов. Разрешение на клинические испытания препарата против рака на основе куриных яиц уже получено. В настоящее время продолжаются работы по увеличению выхода рекомбинантных белков, как на стадии производства, так и на стадии очистки. Чтобы обезопасить рекомбинантные продукты, руководство, разработанное в США и Европейском союзе для получения ГМ-животных, требует контролировать здоровье трансгенных животных, проверять корректность полученных трансгенных конструкций, характеризовать очищенный рекомбинантный белок, а также провести новую трансгенную линию через несколько поколений. В России также ведутся разработки в области получения трансгенных животных для биопродукции важных белков. Например, существует государственная программа, нацеленная на создание фармакологического производства человеческого лактоферрина путем секреции в молоко коз. Сильные антибактериальные свойства лактоферрина, содержащегося в грудном молоке, защищают новорожденных детей от инфекций, поэтому получение молока с лактоферрином в больших количествах может стать новой отраслью производства детского питания. Трансгенные животные как источники ксенотрансплантантов для человека. Хронический дефицит человеческих органов для трансплантации вынуждает ученых искать другие альтернативные источники тканей. Только в США в базе данных United Network for Organ Sharing на 2006 г. зарегистрировано более 80 тыс. чел., нуждающихся в пересадке органов. Решением этой проблемы могла бы быть пересадка человеку органов животных. Так, например, органы свиньи подходят человеку по своему строению, размеру и многим биохимическим показателям, но такие пересадки невозможны, так как эти органы будут немедленно отторгнуты иммунной системой пациента. В настоящее время ряд исследовательских центров работают над выведением генетически модифицированных свиней, органы которых могут быть использованы для трансплантации. Необходимыми условиями для успешной ксенотрансплантации являются: 1) преодоление иммунологических барьеров (гистосовместимость), 2) недопущение переноса патогенов от донорного животного человеку, 3) анатомическая и физиологическая совместимость донорного органа с человеческим. С помощью соматического ядерного переноса получены животные, у которых супрессирован пока первый иммунологический барьер – реакция отторжения немедленного типа (гиперактивное отторжение). ГМ-свиньи синтезировали человеческие регуляторы комплемента (RCAs) и/или не имели генов 1,3-α-galactosyltransferase (α-gal), кодирующих фермент, ответственный за выработку на поверхности клеток свиньи углеводных антигенов, которые приводят к гиперактивному отторжению. Первые эксперименты по пересадке свиных трансгенных почек и сердца нечеловекообразным приматам (павиа Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 114 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы ны) с иммунной супрессией показали отсутствие реакции отторжения немедленного типа, но выживаемость пересаженных органов составляла всего 2–6 месяцев. Работы по получению свиней-ксенотрансплантеров с множественными трансгенами, критичными для преодоления других иммунологических барьеров, продолжаются. Недавние исследования показали, что риск передачи человеку свиных ретровирусов чрезвычайно мал, это открывает путь для доклинических испытаний свиных ксенотрансплантантов. Кроме того, этот факт позволяет использовать свиной эндогенный ретровирус (PERV) в качестве вектора для эффективной доставки экзогенной ДНК в клетки. После селекции такие клетки могут стать родоначальниками трансгенных свиней-ксенотрансплантеров, полученных соматическим ядерным переносом. Также в рамках программы получения свиней для трансплантации несколько компаний занимаются выведением пород свиней с размерами органов, близкими к человеческим. Следует отметить, что, несмотря на многолетние исследования, пересадка человеку органов свиньи все еще является отдаленным проектом. Трансгенные животные, служащие источником пищи, еще очень далеки от коммерческого использования, хотя очень много различных вариантов уже создано. Например, в геном свиней удалось встроить несколько ускоряющих рост генов, которые также оказывают влияние на качество мяса, делая его более постным и нежным. Эта работа начата более 10 лет назад, однако в силу определенных негативных морфологических и физиологических изменений, наблюдавшихся у животных, этот вариант не был коммерциализован. Скорее всего, негативные изменения в данных трансгенных свиньях были обусловлены несовершенством использованной генетической конструкции, так что работы в этом направлении продолжаются. Предложено также большое количество модификаций молока крупного рогатого скота, заключающихся в добавлении новых белков либо в манипуляциях над эндогенными протеинами. Например, были созданы животные, продуцирующие молоко для детского питания, по своему составу максимально приближенное к материнскому молоку человека. Другой пример – недавно ученые из Новой Зеландии получили коров с повышенным содержанием в молоке казеина. Использование такого молока должно повысить продуктивность сыроваренного производства. Еще несколько групп исследователей работают над снижением содержания в молоке лактозы. Конечной целью является создание молока, пригодного для употребления в пищу людьми с лактозной непереносимостью. Пока ближе всех на пути к коммерциализации находятся фитазные трансгенные свиньи (экосвиньи, enviropigs), целью создания которых было резкое уменьшение навозного загрязнения окружающей среды. Эта линия несет ген бактериальной фитазы под транскрипционным контролем тканеспецифичного промотора слюнных желез. Секретируемая рекомбинантная Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 115 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы фитаза позволяет свиньям расщеплять растительные фитаты (инозитол гексафосфат, ИГФ – наиболее распространенная нерастворимая форма органического фосфора почвы), что уменьшает выход загрязняющих окружающую среду фекальных токсичных соединений фосфора (до 75 %). Ожидается выход этих свиней на рынок в следующие несколько лет. С учетом предполагаемого повышения потребности в рыбопродуктах ГМ-рыба может приобрести большое значение как продукт питания. Наиболее вероятно, что первым ГМ-животным на продовольственном рынке станет быстрорастущая семга (Salmo salar), в геном которой встроен ген гормона роста чавычи (Oncorhynchus tschawytscha). Такая семга растет в 3-4 раза быстрее нетрансгенных аналогов, что значительно уменьшает время выращивания. Еще, по крайней мере, 8 искусственно выращиваемых видов рыбы генетически модифицированы с целью ускорения роста. Ген гормона роста в порядке опыта встроили в геномы таких рыб, как белый амур, радужная форель, тиляпия и сом. Во всех случаях трансгены выделяли из геномов рыб других видов. Трансгенные домашние любимцы. Пока что самым успешным случаем коммерциализации трансгенных животных можно считать декоративных рыбок. Трансгенная аквариумная рисовая рыбка Oryzias latipes, яркая зеленая окраска которой обусловлена встроенным геном зеленого флуоресцентного белка из медуз, продвигается на рынок тайваньской компанией Taikong. Под торговой маркой GloFish в США продаются (5 дол./шт.) разноцветные рыбки-зебры Danio rerio, окрашенные флуоресцентными белками кораллов. При соответствующем освещении красные, зеленые и желтые рыбки начинают ярко флуоресцировать, хотя природная окраска D. rerio скромного серого цвета. В Европе, Канаде и Австралии трансгенные рыбки запрещены, видимо, вследствие общих предубеждений против трансгенных животных. Дискуссии сторонников и противников трансгенных животных продолжаются. 2.3.8. Перспективы использования генетически модифицированных организмов В течение последних 50 лет достижения генетической и молекулярной биологии обеспечили возможность создания и коммерческого использования генетически модифицированных организмов, обладающих новыми свойствами за счет преодоления межвидовых барьеров. Присущие ГМО характеристики могут оказать значительное положительное влияние на производство продуктов питания, фармакологических препаратов, ценного сырья для промышленности. Наиболее коммерциализованными из ГМО являются растения, поскольку для них процесс трансгеноза осуществляется гораздо легче и Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 116 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы быстрее. Это обусловлено способностью растений регенерировать из единственной клетки и возможностью вегетативного размножения. В настоящее время ГМ-культуры занимают около 4 % общей площади возделываемых земель в мире. Среди культивируемых ГМ-растений первое место занимает соя, за которой следуют кукуруза и хлопок. В стадии получения разрешения на культивирование находятся сотни видов растений с измененной пищевой ценностью, повышенной продуктивностью, устойчивостью к внешней среде, с измененным внешним видом и т.д. С ГМ-растениями связаны надежды на преодоление дефицита продовольствия и сырья, несмотря на растущее население нашей планеты. Традиционные способы повышения продуктивности сельскохозяйственного производства себя уже исчерпали, а дефицит продуктов питания продолжает нарастать. Единственной альтернативой остается совершить качественный скачок в производстве продуктов питания путем конструирования новых видов растений с резко увеличенной хозяйственной полезностью и устойчивостью к неблагоприятным факторам культивирования. В отличие от растений, получение трансгенных животных – очень сложный и длительный процесс, чрезвычайно тесным образом связанный с достижениями в области молекулярных и репродуктивных технологий. В настоящее время подавляющее большинство проектов по созданию трансгенных животных находится на ранних этапах исследований и разработки, за некоторыми исключениями. Необходимость создания таких животных диктуется, в первую очередь, насущными потребностями человека в фармацевтических препаратах из человеческих белков. Основной платформой для производства таких белков являются клеточные культуры животных и человека. Девять из десяти наиболее популярных биотехнологических лекарственных препаратов, продающихся в США, произведены в клеточной культуре клеток млекопитающих и, по крайней мере, продажи 23 белковых препаратов превышают один биллион долларов. Появляются новые препараты, которые нужно производить в больших количествах, чтобы удовлетворить растущие потребности общества. Ожидается, что рекомбинантные антитела станут наиболее важным и успешным продуктом, особенно для применения в онкологии. Однако количество этого препарата для удовлетворения потребностей мирового рынка просто огромно – от сотни килограммов до нескольких тонн, что превышает текущие и, вероятно, будущие возможности производства на основе клеточных культур. Установлено, что при индустриальной продукции моноклональных антител в количестве ~100 кг/год стоимость грамма рекомбинантного препарата при использовании трансгенной козы будет в 3-4 раза меньше, чем в культуре CHO-клеток с дальней экономией при увеличении масштабов производства. Для биоактивности многих человеческих белков требуется соответствующий посттрансляционный процессинг, и это главная причина использо- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 117 ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ 2.3. Трансгенные растения и животные как биореакторы вания для биопродукции животных или культивируемых животных клеток, а не бактерий, дрожжей или растений. Это относится ко многим важным биомедицинским продуктам, таким как факторы свертывания крови и антитела, которые в настоящее время не имеют другой альтернативы, чем продукция в животных клетках. Таким образом, создание трансгенных животных может решить многие проблемы современного общества. Подтверждением необходимости трансгенных организмов является бурный рост биотехнологических рынков в последние годы. Так, например, продажи на рынке биотехнологических медицинских препаратов в 2007 г. достигли более 75 млрд дол., с общим ростом в 12,5 %, что в два раза больше, чем рост глобального фармацевтического рынка, согласно докладу IMS Health, из них 56% продаж пришлось на США. В 2006 г. рынок биотехнологических медицинских препаратов вырос на 18,2 % до приблизительно 65 блн дол. (биллионов). Причем основная прибыль в 2007 г. была получена большей частью за счет продаж 22 биотехнологических продуктов, приблизительно по 1 блн дол. за каждый. Для сравнения, в 2002 г. таких «блокбастеров» было только шесть. Десятку самых популярных терапевтических агентов возглавляют эритропоэтины, далее следуют противоопухолевые, антидиабетические препараты, аутоиммунные агенты и интерфероны, согласно IMS Health. В будущем ожидается большое количество противоопухолевых препаратов в сочетании со значительной неудовлетворенной потребностью в них. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 118 Г ЛА В А 3 МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека Существует точка зрения, которую разделяет немалое число специалистов, что все заболевания человека за исключением травм связаны с генетическими дефектами. Очевидно, это крайняя точка зрения, тем не менее она отражает важность генетических факторов в определении состоянии здоровья людей. Генетические дефекты бывают разной значимости и состояния. Хотя обычно считают диабет и мышечную дистрофию заболеванием, а расщепление неба или цветовую слепоту – наследственными дефектами – все это является результатом мутаций в генетическом материале. Показано также, что предрасположенность к заболеванию также зависит от генетической конституции. Генетические дефекты или мутации в последовательности ДНК выражаются в замене одного нуклеотида другим, потере целого фрагмента или его переносе на другое положение в геноме и пр. Такие изменения могут привести к изменениям структуры (и функции) белка, который кодируется данным фрагментом ДНК или к изменению регуляторных участков генов, гибельным для клеток. Говоря о наследственных заболеваниях, мы имеем в виду мутации, которые появляются в половых клетках и передаются потомству. В соматических клетках на протяжении жизни также накапливаются мутации, которые могут стать причиной заболевания, но они по наследству не передаются. Ранее считалось, что все мутации вредны. Это связано с тем, что именно с таких мутаций, вызывающих заболевания, было начато изучение генетических характеристик человека. Но сейчас, когда прочитан практически весь нуклеотидный текст человека, стало ясно, что большая часть мутаций является нейтральной. Вредные мутации, приводящие к грубому нарушению развития организма, отсеиваются отбором – их носители не выживают или не дают потомства. Огромный прорыв в понимании, как унаследованные гены влияют на физические и психологические особенности человека, произошел за последние десятилетия благодаря открытиям, сделанным при исследовании генома человека. Установлены и диагностируются как целый ряд генетических заболеваний, так и предрасположенность к ним, причем на самых ранних этапах развития эмбриона. Большие надежды на расширение возможностей современной медицины связаны с реализацией проекта «Геном человека». Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 119 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека 3.1.1. Реализация научного проекта «Геном человека» Научный проект «Геном человека» – это международная программа, конечной целью которой являлось определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). В 1988 г. Министерство энергетики США и Национальный институт здоровья США представили обширный проект, в задачи которого входило секвенирование геномов человека, а также бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши – организмов, которые широко использовались в качестве модельных систем в изучении генетики человека. На реализацию этого проекта Конгресс выделил 3 млрд дол. (по одному доллару за каждый нуклеотид человеческого генома). Директором проекта был назначен лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон. К проекту присоединились другие страны – Англия, Франция, Япония и др. В 1989 г. по инициативе академика А.А. Баева в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека». В 1990 г. была создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д. Мирзабеков. Независимо от вклада и государственной принадлежности отдельных участников программы с самого ее начала вся получаемая ими в ходе работ информация была открыта и доступна для всех его участников. Двадцать три хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские ученые должны были исследовать структуры 3-й и 19-й хромосом. Однако вскоре финансирование работ по этому проекту было сильно сокращено, и реального участия в секвенировании наша страна не принимала. Тем не менее работы по геномному проекту в нашей стране не прекратились: программа была пересмотрена и сконцентрирована на развитии биоинформатики – математических методов, вычислительной техники, программного обеспечения, совершенствовании способов описания и храненеия геномной информации, которые бы помогли понять и осмыслить расшифрованную информацию. На расшифровку генома человека было отведено 15 лет. Однако постоянное развитие технологии секвенирования позволило завершить проект на 2 года раньше. Немалую роль в интенсификации работ сыграла частная американская компания Celera, возглавляемая Дж. Вентером (в прошлом – биолог Национального института здоровья США). Если в начальные годы осуществления проекта по всему миру секвенировали несколько миллионов нуклеотидных пар в год, то в конце 1999 г. Celera расшифровывала не менее 10 млн нуклеотидных пар в сутки. Для этого работы велись круглосуточно в автоматическом режиме 250 роботизированными установками, информация сразу же передавалась в банки данных, где систематизировалась, аннотировалась и выкладывалась в Интернет. При проведении работ в 1995 г. Вентер с соавторами разработал и опубликовал совершенно новый подход к секвенированию генома, назван Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 120 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека ный методом произвольного секвенирования полного генома (более известный как произвольное секвенирование методом дробления), который позволял собрать полный геном из частично секвенированных фрагментов ДНК при помощи компьютерной модели. Этим методом впервые был полностью секвенирован геном самореплицирующегося свободно живущего организма – бактерии Haemophilus influenzae Rd. Копии ДНК бактерии были разрезаны на куски произвольной длины от 200 до 1 600 п.о. Эти фрагменты секвенировали по несколько сот с каждого конца. Кроме того, были секвенированы и более длинные фрагменты по 15–20 тыс. п.о. Полученные последовательности были внесены в компьютер, который их сравнивал, распределял по группам и по сходству. Первыми идентифицировались неповторяющиеся последовательности, затем – повторяющиеся последовательности фрагментов. Длинные фрагменты помогали установить порядок часто повторяющихся, почти идентичных последовательностей. Затем заполнялись пробелы между полученными основными кусками ДНК. Секвенирование генома Haemophilus influenzae заняло один год и при этом была определена последовательность 1 830 137 п.о. и 1 749 генов, расположенных на 24 304 фрагментах. Это был несомненный успех, который доказал, что новая технология может быть применима для быстрого и точного секвенирования целых геномов. В 1996 г. картировали геном первой эукариотической клетки – дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном многоклеточного организма – круглого земляного червя Caenorhabolits elegans. В феврале 2001 г. рабочий вариант генома человека (выполненный на 90 %) был одновременно опубликован в журналах «Nature» – результаты HUGO и «Science» – результаты исследований компании Celera. Анализ полученного варианта генома человека выявил около 25 тыс. генов. Ранее предполагалось, что это количество должно достигать 140 тыс. (если исходить из постулата «один ген кодирует один белок»). В настоящее время представляется возможным, что один ген может кодировать 5-6 белков. Многообразие белков, кодируемых одним и тем же геном, обеспечивается несколькими механизмами: с помощью альтернативного сплайсинга, посттрансляционных превращений белков – фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многих других. В 2003 г. был опубликован окончательный вариант полной последовательности генома человека. Вся эта информация является доступной и находится в Интернете на нескольких сайтах (см.: http://jbirc.jbic.or.jp/g-compass). Однако до сих пор некоторые элементы генома не поддаются секвенированию современными технологиями, а наши знания о геноме остаются неполными. Оказалось, что лишь 30 % генома кодируют белки и участвуют в регуляции действия генов. Каковы функции остальных участков генома и есть ли они вообще, остается совершенно неясным. Около 10 % генома составляют так называемые Alu-элементы длиной около 300 п.о. Они появились неизвестно откуда в ходе эволюции только у приматов. Попав к человеку, они Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 121 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека размножились до полумиллиона копий и распределились по хромосомам самым причудливым образом. Что касается кодирующих участков ДНК, то при чисто молекулярно-компьютерном анализе они были названы генами по сугубо формальным критериям: наличию знаков пунктуации, необходимых для прочтения информации и синтеза конкретного генного продукта. При этом время и действие большинства потенциальных генов пока неясны, и для определения их функций может потребоваться не меньше ста лет. 3.1.2. Построение генетических карт хромосом Сиквенс генома – это всего лишь последовательность из одних и тех же четырех букв в бесконечной вариации. Взглянув на нее, никто не сможет мгновенно вычислить ее функцию. Однако, вставив последовательность оснований на правильное место в геноме, можно получить ключ к разгадке ее функции. Карта генома – это графическая схема, позволяющая исследователям ориентироваться в геноме, искать в нем места, которые могут быть важны и интересны. В простейшем виде карта генома представляет собой линию, по всей длине которой расположены различные ориентиры, помеченные буквами и цифрами, дающие возможность исследователю идентифицировать отдельные признаки. Карта не одно и то же, что и последовательность оснований генома. Расположение генов на карте можно вычислить без определения последовательности оснований. Приблизительная локализация генов, нарушения в которых связаны с рядом наследственных заболеваний, была установлена задолго до секвенирования генома человека при исследовании наследования различных сцепленных признаков. Методы, которые используются при этом, подробно излагаются в курсе «Генетика». Здесь же мы затронем лишь общие закономерности части из них. Как проводится построение генетические карты? Предположим, что необходимо выяснить расположение определенного гена, вызывающего заболевание, которое выражается определенными фенотипическими признаками. Сначала обследуют несколько семей, представленных несколькими поколениями, члены которых страдают этим заболеванием, чтобы узнать, с какими другими генетическими признаками связана эта болезнь. Гены любых признаков, имеющих тенденцию наследоваться вместе с предрасположенностью к болезни, с большой долей вероятности могут быть локализованы на одной хромосоме рядом с генами, вызывающими болезнь. Их выбирают в качестве маркеров для искомого гена. Определив несколько маркеров с известным расположением на хромосоме, можно с большой точностью (до нескольких миллионов п.о.) установить расположение гена, вызывающего болезнь. Затем исследования фокусируются на части генома, несущей указанный ген, и поисках гена, который имеет различную последовательность оснований у здоровых и больных людей, или гена, функции которого могут Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 122 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека быть связаны с болезнью. Именно так были идентифицированы гены, связанные с фиброзом мочевого пузыря и болезнью Гантингтона. Однако путь этот долог и трудоемок, поэтому целью генетиков остается разработка более детальных карт геномов, которые позволят с точностью находить последовательности, нужные в каждом конкретном случае. Существует два типа генетических карт – карты генетического сцепления и физические карты. Карты генетического сцепления показывают порядок расположения генов на хромосоме и относительные расстояния между ними. Впервые такую карту составили в начале ХХ в. в лаборатории Колумбийского университета, возглавляемой Томасом Г. Морганом (лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине, 1933 г.). Объектом этих классических генетических исследований были избраны плодовые мушки Drosophila melanogaster, мелкие размеры и неприхотливость которых позволяли проводить эксперименты с сотнями мух. Кроме того, они быстро размножались и оказались чрезвычайно плодовитыми – новое поколение появлялось через каждые 12 сут, и самка откладывала до 1 000 яичек. Плодовые мушки имеют 4 пары хромосом, включая пару половых. Морган заметил, что если самца с белыми глазами скрестить с красноглазой самкой, то у потомства глаза будут красными; но при скрещивании потомства друг с другом «белоглазость» проявляется вновь, но только у самцов. Морган сделал вывод, что этот признак и другие «ограниченные полом» признаки, например, дальтонизм у людей, который поражает только мужчин, должны располагаться на Х-хромосоме. Это была первая мутация, связанная с определенной хромосомой. В течение нескольких последующих лет были идентифицированы более 40 мутаций у плодовых мушек, часть из которых оказались сцепленными друг с другом. Сейчас различают четыре основных вида наследования: аутосомнодоминантный, аутосомно-рецессивный (относится к 22-м парам неполовых хромосом), а также Х-сцепленный доминантный и Х-сцепленный рецессивный. Схема эксперимента Моргана с белоглазыми мушками приведена на рис. 3.1. Этот эксперимент демонстрирует случай Х-сцепленного рецессивного наследования. Итак, гены сцепленных признаков расположены на одной хромосоме. Для определения сцепления генов группа Моргана скрещивала мутантов с нормальными мушками и полученное потомство снова и снова, пока не получали достаточное количество мушек с сохранением мутации на определенной хромосоме. Поскольку их расположение было известно, такие мутации служили маркерами. Затем самцов с новой мутацией скрещивали с самками, несущими эти маркерные мутации. Как уже было отмечено, белые глаза были результатом мутации на Х-хромосоме. Если новая мутация постоянно проявлялась у белоглазых мух, это означало, что и она расположена на Х-хромосоме. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 123 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека Рис. 3.1. Результаты скрещивания белоглазых мушек с красноглазым самцом. Черными треугольниками помечены Х-хромосомы, несущие доминирующий признак красных глаз. Белыми перевернутыми треугольниками обозначены Х-хромосомы, несущие рецессивный признак белых глаз. Серые треугольники – Y-хромосомы Однако встречались признаки, которые передавались вместе, но не всегда, например, признаки белого глаза и рудиментарного крыла. Этот эффект объясняется происходящим во время мейоза кроссинговером (обменом между генными участками хромосом). Если интересующие нас гены находятся на одной и той же хромосоме, но располагаются далеко друг от друга, в результате кроссинговера при образовании половых клеток они с большой вероятностью попадут в разные клетки. Близко расположенные гены не будут разделяться при кроссинговере. Таким образом, можно установить не только нахождение гена на определенной хромосоме, но и приблизительно определить взаимное расположение генов на ней, если учесть, как часто они проявляются в потомстве в результате скрещиваний. Пользуясь полученными результатами, сотрудники лаборатории Моргана построили первую карту Х-хромосомы плодовой мушки (рис. 3.2). Позднее были построены первые генетические карты и других 3 хромосом. По сути, они являются прототипом современных генетических карт. Карты Моргана были построены на генетических признаках, физически видимых у исследуемых мушек. Сегодня гораздо более сложные карты сцепления генов строятся на определении наследования специфических последовательностей ДНК. В частности, для этого используется метод, основанный на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 124 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека Рис. 3.2. Примерный вид первой генетической карты, показывающей расположение пяти признаков на хромосоме плодовой мушки Для возникновения аллелей достаточно, чтобы два гомологичных гена отличались всего одним нуклеотидом. Если вероятность появления такой замены (мутации) больше 1 %, то говорят, что имеет место генетический полиморфизм. Замена всего одного нуклеотида может вызвать значительное изменение свойств кодируемого белка, по сравнению с нормальным. Однако множество однонуклеотидных замен не приводит к синтезу измененных генных продуктов. Более того, замены, происходящие в некодирующих областях (а в человеческом геноме они составляют около 90 %), не приводящие ни к каким изменениям, распределены по всей длине хромосомы и представляют собой полиморфные сайты, которые используются в качестве маркеров для генетического маркирования. Но сначала эти полиморфные сайты нужно обнаружить. Метод состоит в следующем. ДНК расщепляют с помощью определенной рестриктазы по специфическим местам. Если в сайте рестрикции находится однонуклеотидная замена, рестриктаза его не узнает и расщепления не происходит. В то же время она по-прежнему узнает и расщепляет интактный сайт в другой хромосоме. Таким образом, в результате обработки рестриктазой двух этих аллелей получается набор разных продуктов (фрагментов ДНК разной длины), которые затем опознаются с помощью гибридизации со специфичным зондом (см. пример на рис. 3.8). Явление встречающегося в популяции измененного сайта рестрикции, приводящее к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов. Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. В настоящее время идентифицированы тысячи ПДРФ-локусов, благодаря чему значительно увеличилось число аллелей, которые можно использовать для генетических исследований. Определение аллелей ПДРФлокуса, присутствующих на хромосомах данного индивидуума, называется генотипированием (ДНК-типированием). Наследование ПДРФ-локусов происходит в соответствии с законами Менделя и можно проследить их передачу в пределах родословной. Используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хромосомную локализацию этого гена. С их помощью были изолированы гены таких наследственных заболеваний, как миодистрофия Дюшена и муковисцидоз. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 125 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека Рис. 3.3. Карта генома хромосомы Micobacterium tuberculosis. На внешней окружности показано расположение генов, кодирующих соответствующие белки, общие для штаммов CDC1551 (клинический) и H37Rv (лабораторный). Каждая из внутренних окружностей отражает различия между этими штаммами. Например, вторая окружность показывает локализацию синонимных замен, пятая – обнаруженные в штамме CDC1551 вставки и т.д. [1] (с разрешения American Society for Microbiology) Другим типом полиморфных локусов являются так называемые короткие тандемные повторы (STR, от англ. short tandem repeats). Дело в том, что по геному человека равномерно распределены примерно 100 000 блоков динуклеотидных повторов, содержащих до 40 CA/GT-элементов. Любой такой блок, локализованный в определенном участке хромосомы, передается из поколения в поколение с сохранением числа повторяющихся элементов. В геноме встречаются также повторы (AT)n, (ATG)n, (ATCG)n. Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, проводят скрининг геномной библиотеки человека, содержащий вставки небольшого размера (около 1 000 п.о.), используя подходящий олигонуклеотидый зонд. Для (CA)n-повторов обычно используют зонд (CA)15. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину повтора и нуклеотидные последовательности фланкирую- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 126 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека щих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийными, проводят гибридизацию с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и осуществляют амлификацию СА-повторов. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученных от большого числа индивидуумов. Длина ПЦР-продуктов (применяют примерно 200 п.о.) определяется с помощью полиакриламидного гель-электрофореза. Если длина амплифицированного таким образом сегмента одинакова для всех исследуемых образцов ДНК, значит повтор не полиморфен и наоборот, если образуются ПЦР-продукты разной длины, это указывает на полиморфизм по данному STR (STR-полиморфизм, STRP). Различающиеся по длине повторы данного локуса представляют собой аллели, которые встречаются с частотой 20 % и более. Использование STRPлокусов для картирования геномов, по сравнению с ПДРФ-локусами, имеет ряд преимуществ: 1) для их идентификации нужна информация о нуклеотидной последовательности только пары праймеров, которая может храниться в компьютерной базе данных; 2) эти локусы равномерно распределены в геноме; 3) их частоты очень высоки, что обеспечивает высокую гетерозиготность; 4) они без труда идентифицируются после ПЦР-амплификации. Физическая карта целой хромосомы или ее области дает непосредственное представление о расположении генов в ДНК, что облегчает их идентификацию и характеристику. Существующие в настоящее время, после завершения секвенирования генома человека, геномные карты совмещают черты обоих типов карт. Созданы электронные сайты, где специалисты могут получить информацию о содержании различных хромосомных карт, включая их полное графическое изображение, о методах исследования генома и программном обеспечении. На рис. 3.3. показана карта хромосомы Micobacterium tuberculosis. Сравнение последовательностей клинического штамма CDC1551 и лабораторного H37Rv позволило выявить мутации (замены и вставки), ответственные за патогенность клинического образца, что в свою очередь позволяет улучшить метод диагностирования, понять механизм возникновения заболевания и предложить соответствующую эффективную терапию [1]. 3.1.3. Практическое значение результатов секвенирования генома человека С результатами секвенирования генома человека связаны надежды на возможность лечения генетических заболеваний. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз, Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 127 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры этих генов расшифрованы, и сами они клонированы. Это позволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение. Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического заболевания теперь может осуществляться для постоянно растущего числа генов. При этом типичным подходом является использование исследований при помощи гибридизации или ПЦР-анализа. Можно протестировать здорового человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и определить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучного сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя являются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, рисковать ли им, чтобы иметь детей. В любом случае раннее начало профилактического лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или отодвинуть начало его проявления. В настоящее время в практику медико-генетического консультирования введены десятки систем для генодиагностики наиболее распространенных наследственных заболеваний. Установленная последовательность генома поможет идентифицировать новые гены и выявить среди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям. Как было отмечено ранее, в ходе выполнения проекта «Геном человека» были установлены последовательности целого ряда организмов – бактерий, среди которых немало патогенных, дрожжей, круглого червя Caenorhabolits elegans (нематоды), дрозофилы, мухи, москита, мыши, крысы, собаки, шимпанзе, рыбы-собаки и растений – арабидопсиса, тополя и двух видов риса. Полученная информация (большую часть которой еще предстоит осмыслить) открыла новые возможности для развития сравнительной геномики. Оказалось, к примеру, что из 269 генов человека, мутации которых приводят к болезням, 177 генов имели родственные гены в геноме дрозофилы. Сравнение мышиного генома с человеческим показало, что около 200 геномных блоков у человека и мыши содержат одинаковые гены (хотя и в разных хромосомах). Количество генов у нематоды только в 4-5 раз меньше, чем у человека, и часть из них также являются общими. Это позволяет изучать функции новых генов человека и последствия мутаций известных генов, прослеживая изменение свойств организма в опытах с экспериментальными животными и экстраполируя полученные результаты на человека. В процессе прочтения генома был выявлен еще один механизм генетического разнообразия, так называемый однонуклеотидный полиморфизм (фактор СНП, по английской транскрипции). СНП – это изменение «буквы» генетического кода без «последствий для здоровья». Считается, что у человека СНП встречается с частотой 0,1 %, т.е. каждый человек отличается от других одним нуклеотидом на каждую тысячу нуклеотидов. У шимпанзе, представляющей собой более древний вид и к тому же гораздо более гетерогенный, число СНП при сравнении двух разных особей достигает 0,4 %. Но если Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 128 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.1. Геном человека различия в СНП не сказываются на здоровье особей, то чем они интересны и важны? Оказалось, что практическое значение СНП велико. Известно, что самые распространенные лекарства эффективны не более чем для четверти нуждающегося населения. Минимальные генетические отличия, обусловленные СНП, определяют эффективность лекарств и их переносимость в каждом конкретном случае. Например, в одном из генов, кодирующих синтез рецептора адреналина, выявлено 13 СНП, которые могут комбинироватьcя друг с другом, давая 8 192 различных варианта (гаплотипа). Среди астматиков довольно популярно лекарство албутерол, которое взаимодействует с указанным рецептором адреналина и подавляет приступ удушья. Однако из-за разнообразия гаплотипов людей лекарство действует не на всех, а некоторым больным оно вообще противопоказано. Это обусловлено СНП: люди с последовательностью букв в одном из генов ТЦТЦЦ (Т – тимин, Ц – цитозин) не реагируют на албутерол, если же концевой цитозин заменен на гуанин (ТЦТЦГ), то реакция есть, но частичная. Для людей же с тимином вместо концевого цитозина в этом участке – ТЦТЦТ – лекарство токсично! Необходимо отметить, что развитие и достижения геномики человека, в свою очередь, обеспечили новые возможности для развития целого ряда других научных направлений (рис. 3.4). Рис. 3.4. Связь геномики человека с другими научными направлениями Определение нуклеотидной последовательности человека является событием исторического масштаба, но между тем необходимо знать не только порядок следования звеньев в цепи ДНК и не только взаимное расположение генов и их функции. Важно выяснить характер связей между ними, который определяет, как гены будут работать в конкретных условиях – внешних и внутренних: ведь многие болезни человека обусловлены не дефектами в самих генах, а нарушениями их согласованных действий, системы их регуляции. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 129 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, удастся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы, бактерии, паразитические микроорганизмы) или изменения в содержании важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого заболевания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные методы молекулярной диагностики обладают высокой специфичностью и чувствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффективными и недорогими для рутинного применения. По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд дол., в 2000 г. – около 5 млрд дол. В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был примерно 80 млн дол., к 2000 г. – 600 млн дол., к 2004 г. – 2 млрд дол. Любой диагностический тест должен быть высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени, чувствительным для определения малых количеств мишени и достаточно простым и надежным, позволяющим получать однозначные результаты в условиях обычной медицинской лаборатории. Различают два основных метода молекулярной диагностики – иммунодиагностика, основанная на сродстве антитела к антигену, и ДНК-диагностика, основанная на гибридизации нуклеиновых кислот (спаривании комплементарных фрагментов ДНК) и ПЦР. 3.2.1. Методы иммунодиагностики – основные закономерности и разнообразие В основе любого иммунодиагностического исследования лежит высоко специфичное и эффективное взаимодействие антиген – антитело (рис. 3.5). Таким образом, связывание антитела с антигеном-мишенью (появление в образце комплексов АТ~АГ) свидетельствует о наличии анализируемого антигена (инфекционного агента или целевого биологически активного соединения). Задача состоит в том, чтобы о своем наличии такие комплексы «сообщали» каким-либо визуальным сигналом, т.е. необходимо каким-то образом «пометить» антитело. Долгое время в качестве меток в иммуноанализе использовали радиоактивные изотопы. Они обеспечивали высокую чувствительность анализа, однако обладали рядом недостатков: нестабильностью (использовали высокоактивные короткоживущие изотопы), невозможностью автоматизации анализа, опасностью для персонала лабораторий и производства. Альтернативой радиоиммуноанализу стал так называемый иммунофер- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 130 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики ментный анализ, общую схему которого можно представить следующим уравнением: АГ (или АТ) + АТ~Е (или АГ~Е) → АГ ~ АТ~Е + S → P, где Е – это фермент; АТ~Е – антитело, меченное ферментном (химически синтезированный комплекс); S – субстрат данного фермента; Р – продукт ферментативной реакции, обладающий каким-либо визуальным признаком (окраской, флуоресценцией или люминесценцией). Рис.3.5. Взаимодействие антиген – антитело По интенсивности полученного от продукта сигнала судят о наличии и количестве молекулы-мишени. Широко распространенной разновидностью иммуноферментного анализа является так называемый ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA, по английской транскрипции названия метода). Схема такого анализа приведена на рис. 3.6. Поскольку иммуноферментный метод получил весьма широкое распространение, поиск ферментов, как можно более полно удовлетворяющих всем требованиям, продолжается и в настоящее время. Весьма перспективными оказались биолюминесцентные ферменты – люциферазы – белки, одним из продуктов реакций которых является квант света в видимой области спектра. Все люциферазы считаются оксигеназами, т.е. катализируют реакции окисления субстрата молекулярным кислородом. Перспективность аналитического использования люцифераз обусловлена высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции. Например, для люциферазы, выделенной из светляков, он составляет около 90 %. В настоящее время известно огромное количество различных биолюминесцентных животных, в основном морских, изучены их биолюминесцентные системы, клонированы гены люцифераз, установлены структуры и синтезированы молекулы субстратов. Особое место среди биолюминесцентных белков занимают Са2+-активируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Мо- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 131 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики лекула фотопротеина представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из односубъединичного полипептида (молекулярная масса около 20 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата, 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком. Биолюминесценция инициируется ионами кальция и возникает вследствие окислительного декарбоксилирования связанного с белком субстрата. Рис. 3.6. Схема проведения ELISA: Е – репортерный фермент; S, Р – субстрат и визуально определяемый продукт фермента соответственно В Институте биофизики СО РАН была клонирована кДНК одного из фотопротеинов – обелина гидроидного полипа Obelia longissima, сконструирован штамм E.coli – суперпродуцент апобелка и разработана высокоэффективная технология его выделения, позволяющая получать 50–70 мг высокоочищенного рекомбинантного обелина. Было показано, что белок стабилен при хранении в растворе и лиофилизованном виде, а также при проведении химических и генно-инженерных модификаций. Синтезированные конъюгаты с другими белками (авидином, иммуноглобулинами и др.) и гаптенами (биотином, тироксином) были использованы в качестве меток для иммуноанализа целого ряда диагностически важных веществ (альфафетопротеинов, гормонов различной природы, антител на инфекционные агенты) и продемонстрирована их перспективность и преимущества по сравнению с другими метками. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 132 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики Это высокая чувствительность анализа, сравнимая с изотопной меткой (благодаря высокому квантовому выходу реакции (25–30 %) определяют атомолярные количества фотопротеина); практически полное отсутствие фонового сигнала вследствие высокой специфичности фотопротеина к ионам Са2+; практически неограниченный линейный диапазон зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации фотопротеина (при насыщающей концентрации Са2+ величина светового потока прямо пропорциональна количеству белка, поскольку он непосредственно участвует в реакции); простота запуска (надо только добавить раствор Са2+) и высокая скорость реакции (отсутствие дополнительных субстратов или кофакторов, биолюминесцентная реакция происходит в течение нескольких секунд); отсутствие токсичности. Наличие коммерчески доступных современных высокочувствительных фотометров, в том числе и планшетного формата, позволяет надеяться, что в самое ближайшее время биолюминесцентный иммуноанализ найдет широкое практическое применение в медицинской диагностике. На рис. 3.7 показан пример использования обелина как репортера в ИФА тиреотропного (ТТГ) гормона в сыворотке. Можно видеть, что результаты биолюминесцентного определения этого гормона в сыворотках пациентов хорошо коррелируют с результатами РИА. Если чувствительность иммуноферментного анализа обеспечивается ферментативной реакцией репортера и чувствительностью инструментов для измерения соответствующего сигнала, то его специфичность зависит от аффинности иммуноглобулинов к молекуле-мишени. Для получения иммуноглобулинов к данной мишени его очищенный (в случае белков) или дезактивированный (в случае патогенного организма) препарат используют для иммунизации экспериментальных животных. Антитела, которые при этом образуются в сыворотке (антисыворотке) животного (мыши, кролика и др.), представляют собой смесь иммуноглобулинов к различным антигенным детерминантам (эпитопам) мишени. Такую смесь антител называют поликлональными антителами. Их использование для некоторых методов диагностики имеет два недостатка: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, отличающиеся единственной детерминантой. В настоящее время используются моноклональные антитела, получаемые с помощью технологии гибридом. Эта технология состоит в создании клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, высокоспецифичные к одному эпитопу антигена-мишени. Известно, что В-лимфоциты, продуцирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. В то же время клетки миеломы прекрасно пролиферируют и при их слиянии с лимфоцитами могут образовываться гибридные клетки, обладающие требуемыми свойст- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 133 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики 60 100 µU/мл, BLIA Биолюминесценция вами. Кратко процедура получения гибридных клеток состоит из следующих этапов: 1) клетки селезенки иммунизированных антигеном животных смешивают с взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазе (HGPRT–) в 35 %-м растворе полиэтиленгликоля, и высевают в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ); 2) на 10–14-е сут в среде остаются только слившиеся клетки селезенкимиеломы (остальные гибриды и исходные клетки погибают); 3) полученные гибриды выращивают на полной среде без ГАТ и идентифицируют с помощью иммунного анализа, затем субкультивируют, чтобы получить отдельные клоны. 10 50 40 30 20 10 1 0 0.1 1 10 [ ТТГ ], µМЕ/мл 100 0 10 20 30 40 50 60 µU/мл, RIA Рис. 3.7. Схема (вверху) и результаты (слева) биолюминесцентного иммуноанализа ТТГ сэндвич-типа. Справа – корреляция результатов биолюминесцентного (BLIA) и радиозотопного (RIA) методов определения содержания ТТГ в сыворотках пациентов (R = 0,96, n = 39) Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность иммуноанализа. Часто для определения одной мишени применяют два моноклональных антитела на разные эпитопы (сэндвичанализ): первое антитело используют для первичной сорбции антигена на поверхности, а второе, меченное ферментом, – для обнаружения антигена (см. пример на рис. 3.7). Существующий рынок иммунодиагностикумов, поставляемых различными зарубежными и отечественными фирмами, чрезвычайно разнообразен (табл. 3.1). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 134 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики Таблица 3.1 Важнейшие антигены определяемые коммерческими иммуноферментными диагностикумами Полипептидные гормоны Маркеры опухолей Цитокины Лекарственные препараты Различные соединения Инфекционные заболевания Хорионический гонадотропин Гормон роста Лютеинезирующий Фолликулстимулирущий Тиреотропный гормон Пролактин Канцероэмбриальный антиген Специфичекий антиген предстательной железы Рецептор интерлейкина-2 Рецептор фактора роста эпидермиса Альфафетопротеин Интерлейкины 1–8 Колониестимулирующий фактор Теофиллин Гентамицин Циклоспорин Тироксин Витамин В12 Ферритин Продукты распада фибрина Tau-белок Хламидиоз Герпес Краснуха Гепатиты А, В, С, D Легионеллез СПИД Клещевой энцефалит Рассмотренные нами варианты иммуноанализа представляют собой так называемые гетерогенные методы, когда иммунокомплекс формируется на поверхности, а непрореагировавшие и неспецифичные компоненты удаляются с помощью промывок. Существует другая группа методов, не требующих разделения компонентов (гомогенные методы). В основе гомогенного ИФА лежит потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ либо, наоборот, восстанавление активности фермента в результате реакции АГ-АТ. Как правило, эти методы не являются количественными и применяются для получения ответа «да» – «нет» (например, диагностирование беременности). 3.2.2. Методы диагностики, основанные на ДНК-гибридизации Иммуноанализ имеет свои ограничения: в случае диагностирования инфекционного заболевания с помощью него невозможно различить антитела индуцированные в результате прививки и в ответ на инфицирование; если Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 135 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики речь идет об особо опасных инфекциях, когда антитела не успевают образоваться или не образуются вовсе; если поражается иммунная система (СПИД); иногда он не в состоянии обеспечить необходимую чувствительность и т.д. Незаменимыми и весьма эффективными в таких случаях являются методы, основанные на детекции определенных нуклеотидных последовательностей, – ДНК-гибридизационный анализ. Инфекционные агенты (бактерии, вирусы и пр.) представляют собой живые организмы, их информация заключена в генетическом материале. Фрагмент ДНК, детерминирующий данный биологический объект, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером. Процедура любого гибридизационного анализа состоит в следующем: 1) иммобилизация одноцепочечной ДНК-мишени на твердой подложке (мембранный фильтр, поверхность планшета и т.п.); 2) спаривание меченной комплементарной последовательности (ДНКзондом) с ДНК-мишенью при определенных условиях (температуре и ионной силе); 3) удаление несвязавшегося ДНК-зонда; 4) детекция гибридных молекул зонд-мишень. Таким образом, в процедуре ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции полученных гибридов (рис. 3.8). Специфичность анализа определяется ДНК-зондами, а чувствительность – методами детекции. В зависимости от ситуации используют зонды различной длины (20–100 нуклеотидов). Они представляют собой продукты химического синтеза или клонирования. Рис. 3.8. Один из вариантов проведения ДНК-гибридизационного анализа. В качестве метки используют изотопы, специфические гаптены, последовательности ДНК, белки Для получения зондов клонированием проводят следующие процедуры: 1) расщепляют ДНК патогенного микроорганизма эндонуклеазой и клонируют в плазмидном векторе; 2) проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штам Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 136 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики мов; 3) плазмиды, гибидизующиеся только с ДНК патогенного штамма, используют для получения видоспецифичных зондов. Эти зонды дополнительно проверяют на отсутствие перекрестной гибридизации с ДНК из различных организмов и на модельных образцах для определения чувствительности метода. Химический синтез олигонуклеотидов еще 20 лет назад представлял собой сложную экспериментальную задачу, связанную с большими затратами времени и реактивов, поэтому олигонуклеотиды были достаточно дороги. В настоящее время получение олигонуклеотидов осуществляется с помощью автоматических синтезаторов, и исследователь должен только правильно определить, какая именно нуклеотидная последовательность необходима для решения поставленной задачи. Во всех синтезаторах синтез осуществляется твердофазным методом, т.е. первый нуклеозид иммобилизован на поверхности нерастворимых полимерных частиц, а растущая цепочка экспонирована к реакционной смеси, в которой находятся все необходимые реагенты. Частицы упакованы в колоночных реакторах, через которые последовательно прокачиваются растворы веществ, обеспечивающих протекание процессов синтеза. С целью создания оптимальных гидродинамических параметров колонки частицы имеют сферическую форму и одинаковые размеры. Ключевыми мономерами для синтеза являются четыре производных нуклеозид-фосфорамидита (рис. 3.9), в которых все функциональные группы заблокированы защитными группами. 5'-гидроксильная группа каждого мономера защищена диметокситритильной группировкой (DMTr), которая легко удаляется при кислотной обработке, например, трихлоруксусной кислотой (ТХУ). По 3'-положению находится метилированная фосфитамидная группа. Рис. 3.9. Мономеры для твердофазного фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов (синтоны) Экзоцикличные аминогруппы, находящиеся в составе гетероциклических оснований В (гуанина, аденина и цитидина) заблокированы группировками (ацильные остатки), которые удаляются в щелочных условиях по окончании синтеза. Такие мономеры называются синтонами. Схема химического синтеза олигонуклеотидов приведена на рис. 3.10. Рассмотрим несколько примеров проведения гибридизационного анализа (рис. 3.11). На неподвижной матрице в качестве зонда иммобилизовали 20-звенный олигонуклеотид ЗI, комплементарный участку ДНК вируса гепатита С. В качестве неподвижной фазы использовали поверхности планшетов или полимерных частиц. Иммобилизацию проводили с помощью ковалентной пришивки. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 137 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики Рис.3.10. Схема химического синтеза олигонуклеотидов: Р – нерастворимый полимер или стекло – частицы, на поверхности которых фиксированы первые нуклеотиды и растущая олигонуклеотидная цепь; В1, В2… – нуклеотидные основания; DMTr – диметок-ситритил Рис. 3.11. Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином или стрептавидином Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 138 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики В качестве ДНК-матрицы использовали синтетический 30-звенный олигонуклеотид МI*, несущий на 3’-конце остаток биотина (*) (рис. 3.11, вариант А). После гибридизации и удаления непрореагировавших молекул (с помощью промывок) обнаружение образовавшихся комплексов проводили с помощью конъюгатов – стрептавидин-щелочная фосфатаза или стрептавидин-обелин. Известно, что стрептавидин из стрептококка или его аналог авидин из белка куриных яиц обладают чрезвычайно высоким сродством к биотину (Кд = 10–15 М). Эти белки состоят из 4 одинаковых субъединиц, каждая из которых имеет сайт связывания с биотином. Таким образом, стрептавидин (или авидин) часто используют в качестве стабильного и специфического мостика для формирования межмолекулярных комплексов, в том числе и при иммуноанализе. Образовавшиеся комплексы со щелочной фосфатазой обнаруживали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность продукта ее реакции с субстратом. Комплексы с обелином обнаруживали, измеряя интенсивность светового потока, возникающего при добавлении ионов Са2+. На этом же рисунке показан другой вариант обнаружения гибридов (рис. 3.11, вариант Б) с помощью наращивания дуплекса ферментативным удлинением зонда с помощью Taq-полимеразы в присутствии биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата (dUTP*). Другой вариант проведения гибридизационного анализа показан на рис. 3.12. В данном случае при проведении ПЦР были использованы химически синтезированные праймеры, имеющие на концах биотиновые группы. Полученные при этом биотинилированные ампликоны иммобилизовали на поверхности, предварительно активированной стрептавидином. Для обнаружения ампликонов использовали зонд, состоящий из двух частей – химически синтезированного фрагмента, комплементарного определенному участку матрицы, и поли-А-фрагмента, присоединенного с помощью терминальной трансферазы. После гибридизации полученные дуплексы обнаруживали с помощью обелиновой метки, представляющей собой химически синтезированный конъюгат обелина с олигонуклеотидом dT30. Рис. 3.12. Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Специфический зонд содержит поли-Апоследовательность, метка представляет собой химический конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом dТ30 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 139 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики Современные методы позволяют проводить диагностику на исходном материале (клинические образцы крови, кала, мочи, смывах слизистых) без дополнительной очистки. Если концентрация ДНК-мишени слишком мала, ее амплифицируют с помощью ПЦР. Первым сертифицированным методом такого рода был метод определения Chlamidia и gonococci в 1988 г. Сейчас целый ряд фирм производят диагностические наборы для обеспечения нужд медицинских аналитических лабораторий. Некоторые коммерческие диагностикумы, производимые в США, представлены в табл. 3.2. Таблица 3.2 Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США Организм ЧувствиВремя Специфичтельность, ность, % анализа % Chlamydia trachomatis 4ч 96 100 Neisseria gonnorhoeae Mycobacterium tuberculosis MRSA 1-2 ч 99,2 99,3 3,5 ч 91 98 1,5 ч 91,7 93,5 Group A Streptococci 24 ч 94,8 100 Group B Streptococci 1,5 ч 94 95,9 82–95 98–100 99 99 Gardnerella, Trichomonas vaginalis, and Can- 45 мин dida spp. E. coli O157:H7 8ч Образец Производитель Вагинальный мазок Моча Digene Слюна Gen-Probe Becton Dickinson Мазок из носа Infectio Diag. Inc Фаренгиальный Gen-Probe мазок Вагинальный Infectio Diag. Inc мазок Вагинальный мазок Becton Dickinson Вода Qualicon, Inc Приведенные данные показывают, что современные диагностикумы являются высокочувствительными, скоростными и надежными. В России также существует ряд фирм, производящих аналогичные диагностические наборы, одним из крупнейших является ООО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Однако необходимо отметить, что, к сожалению, удельный вес импортных диагностикумов на российском рынке значительно выше отечественных. Помимо обнаружения инфекционных агентов, ДНК-диагностика применяется для выявления генов наследственных заболеваний. ДНК-анализ используют для выявления носителей генов заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Ранее для определения специфических мутаций использовали биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты устанавливают мутации непосредственно в последовательности гена без экспрессии и изучения кодируемого белка. В настоящее время разработан целый Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 140 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики ряд различных методов скрининга гензаболеваний. Ранее был рассмотрен метод, основанный на выявлении измененных сайтов рестрикции (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Такие мутации приводят к образованию набора рестрикционных фрагментов ДНК, который отличается от набора фрагментов нормальной ДНК. Этот подход успешно используется для диагностики тяжелейшего наследственного заболевания – серповидноклеточной анемии. Серповидноклеточная анемия – заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, соотвествующем шестой аминокислоте в β-цепи молекулы гемоглобина. В результате вместо валина на этом месте находится глутаминовая кислота, что приводит к искажению конформации гемоглобина и, как следствие, неэффективному переносу кислорода, осуществляемому этим белком. Индивиды, гомозиготные по мутантному гену (S/S), имеют эритроциты серповидной формы и страдают тяжелой анемией, приводящей к поражениям сердца, легких, мозга и других органов. Индивиды, гетерозиготные по данному гену (A/S), являются носителями данного заболевания и страдают от него только в экстремальных условиях при снижении снабжения организма кислородом. Оба гетерозиготных родителя с вероятностью 25 % произведут на свет дитя, гомозиготное по этому признаку, т.е. больного серповидноклеточной анемией. Один из используемых тестов основан на рестрикционном анализе β-глобинового гена (рис. 3.13). Рис. 3.13. Выявление мутантного гена, ответственного за развитие серповидноклеточной анемии: Р1, Р2 – праймеры для амплификации; AA – гомозиготность по нормальному β-глобиновому гену; AS – гетерозиготность; SS – гомозиготность по гену анемии Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 141 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики В нормальном гене интересующий нас участок имеет последовательность CCTGAGG, в мутированном – CCTGTGG . В первом случае последовательность представляет собой сайт для рестрикцирующей эндонуклеазы Cvn1, а во втором – этот сайт отсутствует. Тестируемую ДНК амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих сайт Cvn1. Амплифицированный фрагмент обрабатывают Cvn1 и разделяют продукты рестрикции с помощью гель-электофореза. При этом получают различный набор полос: нормальный ген содержит 3 сайта рестрикции и гомозиготный образец (А/А) демонстрирует 4 фрагмента на электрофореграмме. Мутантный ген содержит 2 сайта рестрикции, и гомозиготный образец (S/S) имеет 3 рестрикционных фрагмента, один из которых обладает большой молекулярной массой. Гетерозиготный образец имеет суммарный набор фрагментов того и другого гена. Таким образом, генетический статус обследуемого устанавливают довольно быстро без гибридизационного анализа продуктов амплификации. Если однонуклеотидные замены не приводят к изменению сайтов рестрикции известных рестриктаз, их можно устанавливать с помощью других методов. Один из них сочетает ПЦР и метод лигирования («сшивки») олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ. Схема проведения такого анализа показана на рис. 3.14. Рассмотрим случай, когда в определенном положении произошла замена T→ G. Вначале синтезируют короткие олигонуклеотиды, комплементарные участкам, прилегающим к данному сайту справа и слева и помеченные разными гаптенами: зонд X помечен биотином, а Y – дигоксигенином (дигоксигенин – стероид, выделенный из наперстянки)). Обе ДНК амплифицируют и проводят отжиг с обоими зондами. Нормальная ДНК-мишень гибридизуется с обоими зондами полностью и при добавлении ДНК-лигазы ковалентно сшиваются. В мутантной ДНК зонд Х не образует пару с концевым нуклеотидом и ДНК-лигаза не может сшить эти два фрагмента. На следующей стадии проводят денатурацию ДНК и переносят полученные смеси в пластиковую лунку, на поверхности которой иммобилизован стрептавидин. Биотинилированные молекулы ДНК связываются со стрептавидином, а весь несвязавшийся материал удаляют промывкой. Затем в лунку вносят антитела к дигоксигенину, помеченные каким-либо ферментом, например пероксидазой. При внесении хромогенного субстрата в лунках с нормальной ДНК, где произошло лигирование, произойдет окрашивание субстрата. (Узнаете вариант ELISA?) Если окрашивания не наблюдается, значит, лигирования не произошло и мы имеем мутированную ДНК. Используя две пары зондов, комплементарных нормальному и мутированному сайту, можно определить генетических статус индивида – является ли он гомо- или гетерозиготным носителем данной мутации. ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом, осуществляемым в автоматизированном режиме. Более простой вариант этого метода – это метод лигазной цепной реакции. Для реакции используют большие избытки обоих индикаторных зондов X и Y и термостабильную ДНК-лигазу. Лигирование проводят при 65 ºС, затем денатурируют Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 142 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики образовавшиеся гибриды при 95 ºС и вновь понижают температуру до 65 ºС для гибридизации свободных нелигированных зондов с ДНК-мишенью. Цикл повторяют 20 раз. Если комплементарность мишени и зондов полная, то за это время накопится достаточное количество продуктов лигирования для обнаружения электрофорезом или ELISA. При неполной комплементарности продуктов лигирования не будет. Рис. 3.14. Определение однонуклеотидной замены методом ПЦР-ЛОЗ: Б – биотин; Д – дигоксигенин S – субстрат; Р – окрашенный продукт Молекулярная диагностика – это быстро развивающееся направление. Основные его принципы сформированы, но разработка новых технических деталей (миниатюризация образцов, высокоэффективный анализ с использо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 143 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.2. Методы молекулярной диагностики ванием технологий наночипов и пр.) могут существенно повысить его эффективность. Увеличение количества ДНК-мишени с помощью ПЦР позволила на несколько порядков повысить чувствительность анализа и открыла возможность детектирования, например, нескольких частиц вируса СПИДа, или проведения ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве материала небольшое число клеток околоплодной жидкости. В заключение необходимо отметить, что возможности, которые предоставляет анализ с помощью ПЦР, предъявляют повышенные требования к условиям его проведения. Существует даже английская поговорка «Garbage in, garbage out», иными словами, нуклеиновый анализ хорош ровно настолько, насколько высоко качество реагентов, составляющих реакционную смесь. Важнейшим условием успешного анализа является устранение возможности контаминаций. Далее приведены основные правила проведения ДНКанализа: – обеспечение «чистого» пространства для проведения анализа: помещения с пониженным давлением воздуха; фильтрующие пипетки, блокирующие аэрозоли наконечники к пипеткам, UV-оборудованный ПЦР-блок; – использование оборудования для защиты персонала: одноразовые перчатки и лабораторные костюмы, которые не выносятся из аналитического блока, для предотвращения попадания примесных ДНК или нуклеаз из внешней среды; – использование технологии «горячего старта» для минимизации событий ошибочных праймингов; – использование контролей в каждом тесте: внешние позитивные и негативные контроли отслеживают правильность условий анализа и контаминации, внутренний контроль отслеживает наличие ингибиторов в реакционной смеси. 3.3. Основы молекулярной терапии Установление локализации и последовательности гена, мутации которого вызывают конкретные заболевания, а также самой мутации и современные способы ее тестирования позволяют диагностировать заболевание в неои даже пренатальный период развития организма. Это дает возможность смягчить проявление генетического дефекта с помощью медикаментозного лечения, диеты, переливания крови и т.д. Однако такой подход не приводит к исправлению самого дефекта и, как правило, наследственные заболевания не излечиваются. Ситуация осложняется еще и тем, что мутация одного гена может давать самые разные последствия на организм. Если мутация гена вызывает изменения активности фермента, который он кодирует, то это может привести к накоплению токсичного субстрата или, наоборот, к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки. Хорошо известным примером такого заболевания является фенилкетонурия. Его Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 144 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии вызывает мутация в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, катализирующего превращение фенилаланина в тирозин. В результате повышается уровень эндогенного фенилаланина в крови, что вызывает неправильное формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток центральной нервной системы и, как следствие, тяжелую умственную отсталость. Если мутация затрагивает ген структурного белка, то это может приводить к серьезным нарушениям на уровне клеток, тканей или органов. Примером такого заболевания является кистозный фиброз. Делеция в гене, кодирующем белок, который называется транспортер кистозного фиброза, приводит к синтезу дефектного белка (отсутствие фенилаланина 508) и нарушениям транспорта ионов хлора сквозь клеточные мембраны. Одним из наиболее вредных последствий этого является то, что слизь, которая выстилает и защищает легкие, становится ненормально густой. Это затрудняет доступ к клеткам легких и способствует накоплению вредных микроорганизмов. Клетки, выстилающие воздухоносные пути легких, погибают и заменяются фиброзной рубцовой тканью (отсюда название болезни). В результате пациент погибает от нарушения дыхания. Наследственные заболевания отличаются сложными клиническими проявлениями, и их традицинное лечение имеет в основном симптоматический характер: для лечения фенилкетонурии назначают безаланиновую диету, дефектные белки заменяют функциональным внутривенным введением, для компенсации утраченных функций проводят трансплантацию костного мозга или других органов. Все эти меры, как правило, малоэффективны, дороги, длительны, и лишь немногие пациенты доживают до старости. Поэтому разработка принципиально новых видов терапии очень актуальна. 3.3.1. Генная терапия Генной терапией называется генетическая инженерия соматических клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К 80-м гг., когда были разработаны методы получения отдельных генов и созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали рутинными эксперименты по переносу генов на мышах, перспективы генной коррекции стали реальными. В 1990 г. в США доктором У. Френч Андерсоном (W. French Andrson) были предпринята первая попытка генотерапии для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у трехлетней девочки Ашанти де Силва (Ashanthi da Silva). Это заболевание вызывается мутацией в гене, кодирующем аденозанаденилазу (АДА). Дефицит этого фермента способствует накоплению в крови аденозина и дезоксиаденозина, токсическое действие которых приводит к гибели В- и Т-лимфоцитов периферической крови и, как Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 145 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии следствие, иммунодефициту. Дети с таким заболеванием должны быть защищены от любых инфекций (содержаться в специальных стерильных камерах), поскольку любая болезнь может оказаться смертельной. Через 4 года после начала лечения у ребенка наблюдалась экспрессия нормально функционирующей АДА и облегчение симптомов ТКИД, что позволило ей покинуть стерильную камеру и жить нормальной жизнью. Таким образом, была продемонстрирована принципиальная возможность успешной генетической терапии соматических клеток. Начиная с 90-х гг. проходят испытания генной терапии целого ряда генетических заболеваний, среди которых такие тяжелейшие, как гемофилия, СПИД, разные виды злокачественных новообразований, муковисцидоз и др. На данный момент поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека. Разнообразие генетических заболеваний предопределило развитие множества подходов генной терапии. При этом решаются 2 главные проблемы: средство доставки терапевтического гена; способ обеспечения адресной доставки к клеткам, предназначенным для коррекции. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo и in vivo (рис. 3.15). а б Рис. 3.15. Схема проведения генной терапии ex vivo (а) и in vivo (а) Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально функционирующих клеток в организм. Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Рассмотрим эти подходы подробнее. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 146 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии Генная терапия ex vivo включает следующие этапы: 1) получение дефектных клеток больного и их культивирование; 2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции; 3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток; 4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту. Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться. Средством переноса генов, созданного самой природой, являются вирусы. С целью получения эффективных векторов для доставки генов в основном используют две группы вирусов – аденовирусы и ретровирусы (рис. 3.16). В генной терапии применяют варианты генетически обезвреженных вирусов. Рассмотрим устройство и использование конструкций на основе ретровирусов. Напомним, что геном ретровируса представлен двумя идентичными одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести участков: два длинных концевых повтора (LTR) на 5' и 3' концах, некодирующая последовательность Ψ +, необходимая для упаковки РНК в вирусную частицу, и три участка, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), обратную транскриптазу (pol) и белок оболочки (env) (рис. 3.17, а). Рис. 3.16. Вирусы, применяемые для создания терапевтических векторов Напомним, что жизненный цикл ретровируса включает следующие стадии: 1. Инфицирование клеток-мишени. 2. Синтез ДНК копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы. 3. Транспорт вирусной ДНК в ядро. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 147 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии 4. Встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина. 5. Транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного на участке 5'-LTR. 6. Трансляция белков Gag, Pol и Env. 7. Образование вирусного капсида и упаковки двух РНК-цепей и молекул обратной транскриптазы. 8. Высвобождение вирионов из клетки. Ψ+ а б Рис. 3.17. Генетическая карта типичного ретровируса (а) и карта ретровирусного вектора (а) При получении ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, удаляют большую часть гена gag и полностью гены pol и env, а вместо них встраивают «терапевтический» ген Т и при необходимости маркерный селективный ген Rg с собственным промотором (рис. 3.17, б). Транскрипция гена Т будет контролироваться все тем же сильным промотором, локализованным на 5'-LTR участке. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы и максимальный размер ДНКвставки примерно 8 тыс. п.о. Полученную таким образом конструкцию можно саму по себе использовать для трансформации, но ее эффективность и последующая интеграция в геном клетки-хозяина крайне низки. Поэтому была разработана методика упаковки полноразмерной РНК ретровирусного вектора в интактные вирусные частицы, которые с высокой частотой проникают в клетку и гарантированно встраиваются в геном хозяина. Для этого была создана так называемая «пакующая» клеточная линия. В двух разных участках хромосом этих клеток вшиты ретровирусные гены gag и pol-env, лишенные способности паковаться из-за отсутствия последовательностиΨ + (δΨ+) (рис. 3.18). То есть оба эти фрагмента транскрибируются, но при этом образуются лишенные РНК пустые капсиды. При трансфекции РНК вирусного вектора в такие клетки она встраивается в хромосомную ДНК и транскрибируется с образованием полноразмерной РНК ретровируса, и в таких условиях в капсидах упаковывается Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 148 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии только РНК вектора (только в ней имеется Ψ +-последовательность). Образующиеся интактные вирусные частицы используют для эффективной доставки ретровирусного вектора в клетки-мишени. Рис. 3.18. Схема получения упакованного вирусного вектора Ретровирусы активно инфицируют только интенсивно делящиеся клетки. Для переноса генов их обрабатывают очищенными частицами упакованного ретровирусного вектора или совместно культивируют с производящей их клеточной линией, а затем осуществляют селекцию для разделения клеток-мишеней и пакующих клеток. Трансдуцированные клетки тщательно проверяют на уровень синтеза продукта терапевтического гена, отсутствие компетентных по репликации ретровирусов, отсутствие изменений способ Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 149 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии ности клеток к росту или функционированию. Наиболее пригодными для проведения генной терапии являются клетки костного мозга. Это связано с наличием в нем тотипотентных эмбриональных стволовых клеток, которые могут пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток – В- и Т-лимфоциты, макрофаги, эритроциты, тромбоциты и остеокласты. Именно эти клетки применяют для лечения целого ряда наследственных заболеваний, среди них уже упомянутый нами тяжелый комбинированный иммунодефицит, болезнь Гоше, серповидноклеточная анемия, талассемия, остеопороз и др. Помимо тотипотентных стволовых клеток костного мозга, которые трудно выделять и культивировать, используют стволовые клетки из пуповинной крови (предпочтительное использование для генотерапии новорожденных), а также клетки печени – гепатоциты – для лечения гиперхолестеролемии. При генной терапии in vivo особенно важно обеспечить доставку терапевтического гена к дефектным клеткам. Такую адресную доставку могут обеспечить модифицированные векторы, созданные на основе вирусов, способных инфицировать специфические виды клеток. Рассмотрим подход, разработанный для лечения уже упомянутого выше кистозного фиброза. Поскольку легкие являются открытой полостью, терапевтические гены к ним доставить относительно легко. Клонированный вариант здорового гена был введен в инактивированный аденовирус (рис. 3.19). Специфика этого типа вируса заключается в том, что он инфицирует выстилку легких, вызывая простуду. Сконструированный таким образом вирус испытывали, распыляя его в нос и легкие экспериментальных животных, а затем людей-пациентов. В некоторых случаях наблюдалось введение и экспрессия здорового гена, и восстановление нормального переноса ионов хлора. Возможно, этот подход (введение нормального гена с помощью носовых аэрозолей) в ближайшем будущем будет широко использоваться для лечения симптомов кистозного фиброза в легких. Кроме ретро- и аденовирусов в экспериментах по генной терапии используют и другие типы вирусов, например вирус Herpes simplex. Особенностью этого двунитевого (152 тыс. п.о.) ДНК-вируса является его способность специфически поражать нейроны. Известно множество генетических заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему – опухоли, метаболические нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Вирус простого герпеса I типа (HSV) является весьма подходящим вектором для терапии таких заболеваний. Капсид этого вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Предложено несколько способов переноса терапевтического гена с помощью HSV-векторов и проведены успешные испытания на экспериментальных животных. Вирусные векторы имеют несколько недостатков: высокая стоимость, ограниченная клонирующая емкость и возможная воспалительная реакция. Так, в 1999 г. в результате развившегося необычайно сильного иммунного ответа на введение аденовирусного вектора погиб 18-летний доброволец, Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 150 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии принимавший участие в испытаниях препарата. В 2002 г. у двух детей во Франции во время лечения от иммунодефицита (введением терапевтических генов в стволовые клетки с помощью ретровирусов) развилось состояние, похожее на лейкемию. Поэтому разрабатываются невирусные системы доставки генов. Самый простой и неэффективный способ – это инъекция плазмидной ДНК в ткани. Второй подход – это бомбардировка тканей микрочастицами золота (1–3 мкм), конъюгированными с ДНК. При этом терапевтические гены экспрессируются в тканях-мишенях и их продукты – терапевтические белки – поступают в кровь. Основным недостатком этого подхода является преждевременная инактивация или разрушение этих белков компонентами крови. Рис. 3.19. Схема получения вектора на основе аденовируса Доставку ДНК можно осуществить, упаковав ее в искусственную липидную оболочку. Полученные таким образом сферические частицы-липосомы легко проникают через клеточную мембрану. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, однако пока эффективность такой доставки невысока, поскольку большая часть ДНК подвергается лизосомному разрушению. Также для доставки генетической конструкции синтезируют конъюгаты ДНК с различными молекулами, способными обеспечить ее сохранность, адресную доставку и проникновение в клетку. В последние годы проводятся интенсивные эксперименты по созданию искусственной 47-й хромосомы, которая позволила бы включить большое количество генетического материала с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких терапевтических генов. Это дало бы возможность использовать геномный вариант терапевтического гена и тем са Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 151 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии мым обеспечить его стабильность и эффективную длительную экспрессию. Проведенные эксперименты показали, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей терапевтические гены, вполне реально, однако пока непонятно, каким образом вводить такую огромную молекулу в ядро клетки-мишени. Основными проблемами, которые стоят перед генной терапией, помимо риска тяжелой иммунной реакции, являются трудности длительного хранения и функционирования терапевтической ДНК в организме пациента, мультигенность многих болезней, делающая их трудной мишенью для генной терапии, а также риск использования вирусов в качестве векторов. 3.3.2. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов Помимо рассмотренных нами способов лечения генетических заболеваний с помощью введения в дефектную клетку терапевтических генов, активно разрабатываются лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот: антисмысловые олигонуклеотиды, РНК-ферменты (рибозимы), олигонуклеотиды, корректирующие мутации in vivo. Эти средства направлены прежде всего на лечение заболеваний, связанных с гиперпродукцией белков (рак, воспаления, вирусные и паразитные инфекции). Уменьшить продукцию можно снижением уровня транскрипции или трансляции. Этого можно достичь несколькими способами: гибридизацией соответствующего олигонуклеотида со специфическим геном или мРНК, блокированием фактора транскрипции белка, уменьшением количества мРНК в результате расщепления РНК-ферментами и т.п. Рассмотрим принципы некоторых из них. Рибоолигонуклеотид, который связывается с определенной мРНК и тем самым ингибирует трансляцию кодируемого ею белка, называется «антисмысловой» мРНК. Этот механизм используют некоторые бактерии для регулирования генов (рис. 3.20). На практике применяют искусственно сконструированные гены, у которых ДНК-вставка находится в такой ориентации, чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНКмишени (рис. 3.21). Было показано, что возможно использование синтетических антисмысловых олигонуклеотидов, однако их терапевтический эффект будет сильно зависеть от их устойчивости к действию клеточных нуклеаз, системы доставки и специфичности их гибридизации. Для определения наиболее эффективных сайтов-мишеней на специфической мРНК производят тестирование набора антисмысловых олигонуклеотидов длиной 15–20 оснований с культурой клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Состав синтезированных белков определяют электрофорезом и устанавливают, введение какого олигонуклеотида приводит к снижению синтеза белка-мишени. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 152 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии Рис. 3.20. Регулирование гена бактериоферритина (bfr) с помощью антисмысловой РНК Рис. 3.21. Ингибирование трансляции мРНК синтетическим антисмысловым олигонуклеотидом Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 153 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии Для защиты от нуклеазного расщепления синтезируются модифицированные олигонуклеотиды, при этом не утратившие способность гибридизоваться. На рис. 3.22 приведены структуры модифицированных нуклеотидов, эффективность которых интенсивно изучается. Например, показано, что олигонуклеотиды с заменой свободного кислорода фосфодиэфирной связи на серу (структура б) эффективно гибридизуются с комплементарной РНК-мишенью и полученные РНК-ДНК дуплексы активируют внутриклеточную рибонуклеазу Н. Этот эндогенный фермент, гидролизует РНК-последовательность в таких гибридах. С такими олигонуклеотидами уже проведены многообещающие клинические испытания, в которых мишенями являлись РНК цитомегаловируса, ВИЧ, некоторых РНК, ответственных за развитие рака. а б г в д Рис. 3.22. Модификации олигонуклеотидов: а – нормальная фосфодиэфирная связь; б – тиофосфатная связь; в – фосфамидная связь; г – 2'-O-метилрибоза; д – С-5-пропинилцитозин Для эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов их часто пакуют в липосомы, в свою очередь модифицированные специфическими лигандами, обеспечивающими адресную доставку (такой прием мы уже встречали, когда рассматривали способы невирусной доставки терапевтических генов). К настоящему времени проведен ряд испытаний и показана высокая терапевтическая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для подавления нежелательной пролифирации гладкомышечных клеток (осложнения после ангинопластики, коронарного шунтирования, атеросклероз), для лечения вирусных инфекций и малярии. Принцип действия и строение рибозимов – природных РНК, обладающих нуклеазной активностью, показан на рис. 3.23. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 154 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии Рис. 3.23. Расщепление мРНК под действием рибозимов. Стрелкой показан сайт расщепления Обнаружено, что эти короткоцепочечные РНК способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов, расщепляя их мРНК [8]. Модифицируя субстрат-связывающую последовательность, можно получать рибозимы, специфичные к определенной мРНК. Рибозимы можно синтезировать непосредственно в клетке транскрипцией синтетического олигодезоксирибонуклеотида, кодирующего каталитический домен и фланкирующие его гибридизующиеся участки. Такой олигонуклеотид встраивают в эукариотический экспрессирующий вектор и помещают в клетку. Образующаяся РНК самопроизвольно приобретает активную конформацию, так называемую форму «головки молотка». Множество рибозимов различной структуры и активности синтезировано химически. Например, в лаборатории нуклеиновых кислот Института химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН (Новосибирск) проводятся многолетние исследования по получению синтетических рибозимов, обладающих повышенной активностью и стабильностью. Для повышения защиты от преждевременного расщепления внутриклеточными нуклеазами получают различные производные рибозимов – с метилированными 2'-гидроксильными (см. рис. 3.22, г) группами, бинарные конструкции и т.п. Строение молекулы рибозима существенным образом влияет на его эффективность. На рис. 3.24 показана кинетика расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости mdr1 с помощью синтезированных рибозимов разной структуры. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 155 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии а б Рис. 3.24. Расщепление 190-звенного 5'-концевого фрагмента MDR1 мРНК модифицированными бинарными (1,3) и полноразмерными (2,4) рибозимами: а – структура РНК с выделенным специфическим сайтом; б – накопление продуктов расщепления (материалы предоставлены А.Г. Веньяминовой, ИБХиФМ, Новосибирск) Особое место в молекулярной терапии занимают так называемые методы активирования пролекарств. Например, одним из способов генной терапии рака является уничтожение опухолевых клеток с помощью активированного производного ганцикловира (GCV, производное гуанозина), продукта гена тимидинкиназы, из уже упомянутого нами вируса простого герпеса HSVtk. Опухолевые клетки трансфецируют in vivo геном HSVtk под активным промотором и через несколько дней вводят ганцикловир, который фосфорилируется вирусной тимидинкиназой до монофосфата, а затем киназами клетки-хозяина до трифосфата. Это производное ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, что приводит к гибели пролифилирующих клеток. Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат проникает в соседние немодифицированные клетки и таким образом уничтожается дополнительно до десятка опухолевых клеток. Ген, приводящей к гибели собственной клетки, называется геном «самоубийства» (в нашем случае это ген тимидинкиназы), а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества (в данном случае это ганцикловир). Этот подход был использован и для создания других вариантов комбинации ген– активатор–пролекарство, но эффективность системы GCV-HSVtk уже доказана рядом доклинических испытаний. Генная терапия является новой лечебной дисциплиной, становление которой происходит на наших глазах. Несмотря на некоторые успехи и многообещающие перспективны, существует ряд проблем, которые еще пред Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 156 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии стоит преодолеть. Часть проблем лежит далеко не в плоскости медицины и молекулярной биологии. Речь идет о проблемах этических и политических. Как вы уже заметили, мы рассматривали методы генетической терапии только соматических клеток. Это означает, что произведенные коррекции ограничиваются определенным органом или тканью, «исправленные» гены не будут передаваться следующему поколению. Изменения генотипа зародышевых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток) или оплодотворенных клеток должны передаваться из поколения в поколение. В настоящее время генная терапия соматических клеток отнесена к стандартным методам медицинского вмешательства. В противоположность этому генная терапия зародышевых клеток является технологически гораздо более сложной, проблематичной и непредсказуемой. Поэтому эксперименты в этой области во многих странах запрещены. В конце 80-х гг. в США были установлены правила, регулирующие испытания в области генетической терапии соматических клеток. Они гарантируют беспристрастный и репрезентативный отбор больных и их информированность (насколько опасно лечение, какова вероятность его успеха и пр.), конфиденциальность сведений о больных и произведенных исследованиях, осуществление всех манипуляций должным образом без причинения вреда, как конкретным больным, так и человеческой популяции в целом. Поскольку лечение соматических клеток приводит к улучшению состояния и значительному продлению жизни больных с генетическими заболеваниями, но «улучшенный» ген не передается по наследству, существует мнение, что это приведет к накапливанию генетических заболеваний в человеческой популяции. Однако, по данным популяционной генетики, для существенного повышения частоты вредного гена в результате эффективного лечения требуются тысячи лет. 3.3.3. Клонирование человека Вряд ли в наше время найдется человек, незнакомый с фантастическими рассказами и фильмами о человеческих клонах, творящих то добро, то зло, используемых недальновидными политиками или тупыми солдафонами. Современный уровень знаний и методы манипулирования с генетическим материалом, получение различных трансгенных животных создают впечатление, что клонирование человека – дело не столь отдаленного будущего. Привлекательность идеи получения копий животных с улучшенными полезными свойствами или копий гениальных людей, или просто живой копии погибшего дорогого человека подогревает интерес к проблеме. Процедура клонирования млекопитающих в принципе заключается в следующем: в энуклеированную (лишенную ядра) яйцеклетку вводят ядра соматических клеток донора и развивающиеся яйцеклетки на стадии бластоцист вносят в матку суррогатной матери. При этом будет получено потомство с тем же генотипом, что и у донора, или, другими словами, его генетический клон. Именно так была получена клонированная овечка Долли. Однако, как показали многочисленные эксперименты, проблема клонирования не так проста, как пер Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 157 ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ 3.3. Основы молекулярной терапии воначально думали, имеется множество «подводных камней» и рано строить рассчитанные под клоны коровники. Разговоры же о клонировании человека лишены оснований и безответственны. Нерешенными остаются главные вопросы. 1. Способны ли ядра соматических клеток полностью и эквивалентно заменить ядра зародышевых клеток в их функции обеспечения нормального развития зародыша? Соматические клетки – это специализированные клетки, прошедшие определенный цикл развития, затрагивающий, в том числе, и модификацию ДНК (изменения в некодирующих повторах, укорачивание теломер и пр.). Тщательный молекулярно-генетический анализ функционирования ядер пересаженных соматических клеток показал, что 4 % генов работают неправильно, включаются не в том месте, не в то время или не включаются вовсе. Как возвратить изменившиеся ядра клеток в исходное состояние, «поймать» такую соматическую клетку, ядро которой не утратило свой потенциал? 2. Какова вероятность полного сходства потомков? Даже если удастся получить нормально развивающиеся эмбрионы, условия их развития в матке различных приемных матерей будут различаться. Существующие определенные пределы колебаний проявления данного гена в фенотипическом признаке неизбежно приведут к тому, что одинаковые гены будут проявляться поразному и вероятность получения полного сходства потомков крайне мала. 3. Даже если развивающиеся яйцеклетки трансплантировали сотне приемных матерей и получили хотя бы одну-единственную живую и точную копию индивида (процент успеха крайне низок!), встанет вопрос: а что с остальными зародышами? Часть неизбежно погибнет, а остальные – уроды? И как поступить с этими искусственно созданными несчастными? Запрет такого рода исследований как аморальных является вполне естественным. В нашей стране на манипуляции с человеческими зародышами принят мораторий. Репродуктивное клонирование человека запрещено, но вопрос о терапевтическом клонировании остается открытым. Суть его заключается в следующем: ядро соматической клетки пациента трансплантируется в яйцеклетку донора, выращивается до стадии бластоцисты, внедряется в стенку матки. Внутри содержится так называемая внутренняя клеточная масса из эмбриональных стволовых клеток, из которых развиваются органы и ткани зародыша. Предполагается, что благодаря их колоссальному потенциалу к развитию в разных направлениях, из них можно будет получать «запчасти» для пересадки пациенту – хозяину ядра. Но что это за запчасти, если 4 % генов будут работать неправильно? Ведь известно, что при пересадке эмбриональных стволовых клеток приблизительно у 30 % реципиентов развиваются опухоли. И, кроме того, не надо забывать об этических проблемах, связанных с поисками доноров яйцеклеток и суррогатных матерей. В такой ситуации многие ученые высказываются в пользу проведения масштабных работ в этом направлении на экспериментальных животных и объявлении хотя бы временного моратория на использование этой техники в клинике и призывают проявлять максимум осторожности и аккуратности при решении проблем, связанных с клонированием человека. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 158 Г ЛА В А 4 КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений Биотехнология как наука базируется на использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве. В свете современных представлений биотехнология растений – это соединение методов культуры клеток и тканей растений с методами молекулярной биологии и техникой рекомбинантных ДНК. Созданная система – клетки и ткани высших растений, выращиваемые вне организма на искусственных питательных средах в строго контролируемых условиях – позволяет изучать рост, клеточную дифференцировку и развитие растительного организма, разрабатывать новые клеточные технологии для промышленности и сельского хозяйства [6]. Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно называется биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная инженерия. Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей, состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология. Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуждаемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изолированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него. 4.1.1. Тотипотентность растительной клетки Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности [11]. Тотипотентность (лат. Totus – весь, potentia – сила) – это свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма. Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 159 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется. Однако клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих, в условиях культивирования могут сохранять плюрипотентность – способность дифференцироваться во все типы клеток как собственно зародыша, так и экстраэмбриональных тканей. Такие клетки получили название эмбриональных стволовых клеток. У растений в природных условиях (in vivo) тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому – вегетативное размножение, в том числе наблюдаемое в результате развития растений из клеток листьев бегонии, узумбарской фиалки или каланхое. Тотипотентность у растений реализуется и при заживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растений в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. callus – толстая кожа, мозоль). Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов. Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению. Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов. 4.1.2. Исторические этапы развития методов культивирования in vitro Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при прививках. Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, индуцированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Трекулу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 160 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений Тотипотентность теоретически постулирована клеточной теорией, сформулированной в независимых работах Шлейдена (1838), проведенных на растительных объектах, и Шванна (1839) – на растительных и животных объектах. Классические эксперименты были выполнены немецкими ботаниками Фёхтингом (1878) и Рехингером (1893). Фехтинг выявил наличие полярности у изолированных (даже очень тонких) фрагментов стеблей, которые во влажных условиях формировали в апикальной части почки, а в базальной – каллус или корни. Рехингер определил, что даже минимальные размеры эксплантов способны продуцировать почки и регенерировать целые растения, однако этот размер ограничен. При культивировании фрагментов из почек тополя и ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал, что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный слой) способность к регенерации перестает проявляться. Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга. Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение асептических условий. Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы. Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных, палисадные клетки из листьев яснотки). В условиях культивирования такие клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют стимулы, исходящие от целого организма или его частей. Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 161 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений Выполненные в те годы работы по культивированию изолированных тканей растений на экстрактах из растительных тканей не были продуктивными. Лишь значительно позже, в 40–50-е гг., при использовании жидкого эндосперма кокосового ореха – кокосового молока, было показано, что растительные экстракты могут оказывать стимулирующее действие на рост изолированных органов и тканей в условиях культивирования, но только при их добавлении к основному составу синтетических сред. На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались. Практическое применение культуры изолированных зародышей для преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате были выращены гибридные растения. В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта. Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред. Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании) отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно долго. Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей. Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 162 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений Основные объекты культивирования в работах Готре – камбиальная ткань стебля древесных и травянистых растений, ткань корнеплодов и клубней. В основе минерального состава среды была использована питательная смесь Кнопа. Готре заменил жидкую среду на твердую – агаровую и ввел в состав культуральных сред фитогормон ауксин – индолилуксусную кислоту (ИУК). Наличие этих компонентов в среде способствует длительной пролиферации культивируемых каллусных тканей. В работах Готре каллусная ткань, индуцированная из камбия, могла продолжать развитие в течение 18 месяцев. После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений. Ауксины были открыты в 20-е гг. как факторы тропизмов растений. Природный ауксин в растениях представлен в основном в виде р-индолил-3уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК. Этот фитогормон был открыт в 1926 г. Вентом. В начале 30-х гг. Ф. Кегль выделил его в чистом виде и установил химическое строение. В 60-е гг. был выделен второй представитель этого класса фитогормонов – фенилуксусная кислота (ФУК). Другой класс фитогормонов – цитокинины – открыли в 1955 г. Скуг и Миллер, изучая рост каллуса сердцевинной паренхимы табака. Путем щелочного гидролиза ДНК животного происхождения они получили кинетин, который оказался способным вместе с ауксином стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы и камбия табака. На среде с ИУК без кинетина клетки не делились. В дальнейшем различные концентрации и соотношения цитокининов и ауксинов стали использоваться для каллусогенеза и индукции морфогенеза в культуре изолированных тканей растений. В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений [4, 6]. В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки. В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 163 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.1. Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов. В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений. В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны сомаклональные варианты табака. Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.). Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей. 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro Любая ткань растений – это сообщество клеток, и если она изолирована (выделена) из целого организма, то лишена его регулирующего воздействия и питания. Следовательно, одним из принципов метода культуры тканей (клеток) является воспроизведение in vitro условий, близких или идентичных тем, в которых клетки находятся на материнском растении, для обеспечения их полноценного питания и развития. Тогда при строгом соблюдении этих условий в культуре тканей размножаются (регенерируют) идентичные исходному генотипу клетки и растения. Это одно из направлений использования. Однако если такие условия достигаются и воспроизводятся не в полной мере, то клетка оказывается в относительно иных физико-химических условиях, что приводит к временному и качественному изменению в реализации ее генетической информации. Смещая в эксперименте временную реализацию генетической информации (с помощью гормональных воздействий), можно наблюдать ее модификацию, а под влиянием различных экстремальных трансформирующих факторов возможно ее изменение в нужном направлении. Клетка в условиях культуры in vitro проявляет цитогенетическую неустойчивость, в результате этого возникают клетки с генетической гетерогенностью, появляются мутанты с измененным морфогенезом, которые могут быть исходным материалом для селекции. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 164 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro 4.2.1. Состав питательных сред и роль их отдельных компонентов Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям неорганические элементы: макроэлементы в миллимолярных концентрациях (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера), микроэлементы – в микромолярных (железо, бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также органические элементы: витамины, углеводы, аминокислоты и другие (например, гидролизат казеина, мезоинозит и др.) [12]. В зависимости от консистенции существует деление на жидкие и твердые питательные среды. Для приготовления твердых питательные сред используют агар-агар (0,7–1 %), который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. Обычная его концентрация – 8–10 г на литр среды. Агар обеспечивает диффузию питательных элементов из среды в культивируемые ткани. Вместо агара можно использовать биогели. Необходимо учитывать, что клетки растений и отдельные компоненты среды (витамины, фитогормоны, агар) чувствительны к определенным концентрациям водородных ионов. Например, агар в кислой среде теряет способность образовывать гель. В зависимости от объектов культивирования рН среды может варьировать от 5,2 до 6,6. Неорганические элементы. Для роста растений в первую очередь необходимы углерод, кислород и водород. Если кислород и водород присутствуют в воздухе, то источником углерода для культуры изолированных тканей являются органические соединения. Но кроме этого для обеспечения полноценного метаболизма и его регуляции в изолированной культуре необходим ряд макро- и микроэлементов неорганического происхождения. Макроэлементы присутствуют в среде в концентрациях порядка 10–3 М. Наиболее значимы из них азот, фосфор, натрий, калий, магний, кальций и сера. Микроэлементы составляют в среде концентрации 10–6 М. Присутствие их обязательно при культивировании ткани в жидкой среде. По некоторым данным, отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40 % в первом пассаже и приводит культуру к гибели в течение двух следующих пересадок. На агаризованой среде растения не так остро реагируют на отсутствие микроэлементов, так как в агаре содержатся многие микро- и некоторые макроэлементы. Наиболее важными микроэлементами являются железо и медь, потому что они участвуют в регуляторных процессах и окислительно-восстановительных превращениях, входят в состав важных коферментов. Далее следуют марганец, цинк, молибден, кобальт и бор. Органические составляющие сред. Согласно многочисленным данным, хорошим источником азота является мочевина, особенно для тканей подсолнечника, табака, топинамбура и др. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 165 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты (а-аланин, глутаминовую кислоту, глицин, аргинин, аспарагиновую кислоту) или гидролизат казеина – источник аминокислот. В культуре изолированных тканей растений действие аминокислот значительно варьирует для разных тканей и разных физиологических состояний вводимых в культуру эксплантов. Полностью заменить нитраты как источник азота способны аланин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гликокол, аспарагин, пролин. Формы аминокислот также по-разному влияют на рост: D-формы – токсичны, L-формы – пригодны. Аминокислоты, внесенные в питательную среду в дополнение к нитратам, могут оказывать стимулирующее, угнетающее и формативное действие на рост культуры тканей. Это зависит как от самой аминокислоты, так и от ее содержания в среде. Очень часто исследователи заменяют смесь аминокислот гидрлизатом казеина. Последний способен увеличивать содержание никотина в культурах табака и подавлять биосинтез липидов во многих каллусных и суспензионных культурах. Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений, так как в большинстве случаев последние неспособны к автотрофному питанию. Культуры тканей, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеводного питания. При изолировании и помещении на питательную среду кусочков хлорофиллоносных тканей они, как правило, теряют хлорофилл. При выращивании на свету одни ткани остаются лишенными хлорофилла (галловая опухоль партеноциссуса, ткани сердцевинной паренхимы табака и др.). Другие ткани зеленеют на свету, но не способны обеспечивать себя полностью углеводами за счет фотосинтеза, и их необходимо выращивать на питательной средах, содержащих сахар. При помещении кусочка ткани, изолированного из растения, на питательную среду без сахара его содержание в ткани начинает уменьшаться. Трата сахаров зависит от сезонных изменений в самой ткани (ткани, взятые весной, теряют сахаров больше) и от содержания ауксинов в среде. При образовании каллуса старая ткань быстро теряет сахара, а в новообразующейся их количество возрастает. При помещении ткани на питательную среду, снабженную сахаром, ткани поглощают и трансформируют сахара. Количество поглощенного сахара и в особенности его превращения в другие формы зависят как от источника сахаров в среде, так и от типа ткани. Наилучшим источником углеродного питания для большинства тканей является сахароза, обычно применяемая концентрация ее в питательной среде составляет 2–5 %. Чаще всего в качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 3 %. Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. После сахарозы наиболее употребляемым источником углеродного питания для культивирования тканей растений является глюкоза. Из 33 исследованных культур (травянистых и древесных) 85 % имели отличный и хороший рост на среде с Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 166 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro глюкозой. На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. Ее успешно используют для своего роста 2/3 культур фруктозу. Галактоза заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений. В отличие от изолированных корней, которые могут расти только на среде с сахарозой, другие ткани, обладающие активными гидролитическими ферментами, могут использовать для питания самые разнообразные сахара и полисахариды. Способность ткани усваивать те или иные сахара зависит от ее происхождения. Перенос ткани с более бедной сахаром среды на более богатую обычно не вызывает нежелательных явлений, обратный перенос приводит к некрозам тканей. Основное действие сахарозы состоит в увеличении уровня образования метаболитов, использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к росту выхода вторичных метаболитов в культурах. Влияние изначально высоких концентраций сахарозы, вероятно, состоит в увеличении осмотического потенциала среды. Необходимо отметить влияние условий стерилизации на действие сахаров. При автоклавировании сахароза дает следы глюкозы и фруктозы, а в среде с сахарозой, которая не подверглась специальной очистке, наблюдается образование веществ, стимулирующих рост тканей. Выращивание хлорофиллоносных и лишенных хлорофилла тканей на свету или в темноте изменяет как содержание растворимых сахаров в ткани, так и соотношение разных их групп. Различия в спектральном составе света также сказываются на углеводном метаболизме тканей. Витамины принадлежат к активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей. Известно, что в процессе роста растения синтезируют необходимое им количество витаминов. Несмотря на это, исследования показывают, что при внесении витаминов в питательную среду рост ткани улучшается. Большая часть витаминов входит в состав ферментов, катализирующих многие метаболически важные реакции. Витамины делятся на водорастворимые и жирорастворимые. В состав сред чаще всего включают водорастворимые витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. При внесении полной смеси витаминов стимулирующее действие может определяться синергизмом между отдельными витаминами. По наблюдениям Хендерсона, смесь витаминов наиболее активна после слабого роста ткани в предыдущем пассаже. Действие витаминов на рост культуры тканей зависит от способности ткани синтезировать их в оптимальном или субоптимальном количестве и от состава других компонентов питательной смеси, с которыми витамины могут взаимодействовать синергически или антагонистически. Интересно, что клеточная суспензия, полученная путем помещения ткани в жидкую среду, при Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 167 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro пассировании значительно более чувствительна к недостатку витаминов, чем сама ткань. Исключение из среды холина и аскорбиновой кислоты приводит к увеличению одиночных суспендированных клеток. Следует отметить, что в каждом конкретном случае место отдельного витамина в сложной цепи метаболизма различно. Клетки растений и животных более чувствительны, чем микроорганизмы, к присутствию посторонних ингредиентов, поэтому требуют химически чистых компонентов среды. Вместе с тем некоторые питательные среды содержат натуральные биологические добавки: жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана, картофельный отвар и др. Они являются поставщиками более сбалансированных питательных компонентов по сравнению с искусственными средами. В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения в среды добавляют иногда такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицитин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифамгащин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны. Наличие макро- и микроэлементов в составе культуральных сред определяется потребностями объектов культивирования. Широко применяемые в настоящее время среды Гамборга В5 и Мурасиге и Скуга (МС) (табл. 4.1, табл. 4.2) содержат по сравнению со средами Уайта значительно большие количества калия, фосфора и микроэлементов [12, 14]. Таблица 4.1 Примеры составов наиболее употребляемых питательных сред для культивирования растительных клеток тканей Составные компоненты NH4NО3 KNO3 СаС12·2Н2О СаС12 MgSO4·7 H2О КН2РО4 (NH4)2SO4 Ca(NO3)2·4 H2О Na2 SO4 NaH2PO4·H2О KC1 KI H3BO3 MnSO4·4 H2О MnSO4·H2О Концентрация компонентов в среде, мг/л Уайта МС В5 Нича N6 (Chu) – 1 650 – 720 – 80 1 900 2 500 950 2 830 – 440 150 – 166 – – – 166 – 750 370 250 185 185 170 68 400 – 134 – 463 300 – – – – 200 – – – – 19 – 150 – – 65 – – – – 0,75 0,83 0,75 – 0,8 1,5 6,2 3 10 1,6 5 22,3 – 25 – – – 10 – 3,3 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 168 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro Продолжение табл. 4.1 Составные компоненты ZnSO4·7 H2О NaMoO4·2 H2О MoO3 CuSО4·5H2О CoCl2·6H2О Fe(SO4)3 FeSO4·7 H2О Nа2ЭДТА·2 H2О Органические вещества: Никотиновая кислота Пиридоксин гидрохлорид Тиамин гидрохлорид Биотин Инозит Глицин Фолиевая кислота Сахароза pH Концентрация компонентов в среде, мг/л Уайта МС В5 Нича N6 (Chu) 3 8,6 2 10 1,5 – 0,25 0,25 0,25 – 0,001 – – – – 0,01 0,025 0,025 0,025 – – 0,025 0,025 – – 2,5 – – – – – 27,8 27,8 27,8 27,8 – 37,3 37,3 37,3 37,3 0,5 0,01 0,01 – – 3 – 20 000 – 0,5 0,5 0,1 – 100 2 – 30 000 5,8 1 1 10 – 100 – – 20 000 5,5 5 0,5 0,5 0,05 100 2 0,5 20 000 – 0,5 0,5 1 – – – – 50 000 5,8 В настоящее время существует большое количество различных прописей питательных сред для культивирования изолированных тканей и клеток. Их состав зависит от задач культивирования, видов растений и типов эксплантов. Наиболее часто используемая среда Мурасиге и Скуга, впервые была составлена и предложена в 1962 г. Кроме того, в настоящее время широко известны среды Уайта, Нича, В5, N6 и др. (табл. 4.1), отличающиеся набором отдельных составляющих компонентов и их соотношением. Существуют и коммерческие препараты питательных сред, выпускаемые иностранными и российскими фирмами. Таблица 4.2 Состав среды Мурасиге-Скуга Компоненты NH4NО3 KNO3 СаС12·2Н2О MgSO4·7 H2О КН2РО4 KI H3BO3 MnSO4·4 H2О ZnSO4·7 H2О NaMoO4·2 H2О CuSО4·5H2О CoCl2·6H2О Конечная концентрация в среде, М 2,06·10-2 1,88·10-2 3,00·10-3 1,50·10-3 1,25·10-2 5,00·10-6 1,00·10-4 9,99·10-5 2,99·10-5 1,00·10-6 1,00·10-7 1,00·10-7 Концентрация запасного раствора, мг/л Объем запасного раствора на 1 л среды, мл 33 000 38 000 8 800 7 400 3 400 166 1 246 4 460 1 720 50 5 5 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 50 5 169 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro Продолжение табл. 4.2 Компоненты FeSO4·7 H2О Nа2ЭДТА·2 H2О Мезоинозит Гидролизат казеина Витамины: РР В6 В1 Аминокислоты: Глицин Источник углеводов: Сахароза Конечная концентрация в среде, М 1,00·10-4 1,00·10-4 Концентрация запасного раствора, мг/л Объем запасного раствора на 1 л среды, мл 5 560 7 460 5 2,06·10-2 10 000 2,06·10-2 2,06·10-2 2,06·10-2 500 500 500 2,06·10-2 2 000 8,80·10-2 Добавление в виде порошка Предварительный разогрев в воде до растворения Агар-агар П р и м е ч а н и е. pH = 5,8 1 30 г/л 7 г/л МС – самая универсальная среда, пригодная для образования и роста каллуса, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Среда Гамборга и Эвелега применима для бобовых растений и злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации. Среда Нича рекомендуется для индукции андрогенеза в культуре пыльников. 4.2.2. Гормоны и регуляторы роста – необходимые компоненты питательных сред Помимо источников углерода, азота и других минеральных компонентов, среда для культивирования тканей многоклеточных организмов, таких как растения, должна содержать специфические стимуляторы и регуляторы роста: фитогормоны или их синтетические аналоги [11]. Известно около 5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, однако на практике применяется лишь несколько десятков. Известны три класса фитогормонов, действующих преимущественно как стимуляторы (ауксины, гибберелины, цитокинины), и два класса фитогормонов, оказывающих главным образом ингибирующее действие (абсцизовая кислота, этилен). Ауксины – производные аминокислот: ИУК – триптофана, ФУК – фенилаланина. Природный ауксин в растениях встречается в основном в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксином) – ИУК, второй представитель этого класса фитогормонов — фенилуксусная кислота, однако его роль в фиторегуляции значительно меньше ИУК. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 170 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro Ауксин играет важную роль в процессах регенерации при размножении каллусных клеток; в процессе образования придаточных и боковых корней, луковиц, при заложении вегетативных почек. Механизм действия ауксина на рост клетки связывают с активацией + Н – выкачивающего насоса в плазмолемме. Происходит подкисление клеточной стенки, что приводит к разрыву целлюлозных и пектиновых полимеров. Это облегчает растяжение растущей клетки под действием тургорного давления. Избыток ауксина разрушается ИУК-оксидазой. Синтетические ауксины. Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют не ИУК, а синтетические ауксины, так как они в растениях не разрушаются ИУК-оксидазой. Молекулы синтетических ауксинов имеют разную структуру, но содержат ароматическое или гетероциклическое кольцо, боковая часть которого представлена остатком алифатической кислоты. По действию синтетические ауксины относят: к сильным – индолил-3-масляная кислота (ИМК), а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); слабым – фенилуксусная кислота (ФУК), фенилмасляная (ФМК). Гиббереллины обнаружены в 20-е гг. японскими исследователями в виде продуктов обмена веществ Fusarium moniliforme – конидиальной (споровой) стадии сумчатого гриба (аскомицета) Gibberellafujikuroi. Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиббереллановым скелетом из 19-20 С-атомов. В тканях растений одновременно встречаются несколько гиббереллинов, а в процессе онтогенеза их набор и соотношение изменяются. Подобно ауксинам, гиббереллины оказывают множественные действия: стимулируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, камбия), вызывают рост плодов. Рост в фазе растяжения стимулируется одновременно действием гиббереллинов и ауксина. В других случаях гиббереллины могут выступать как антагонисты ауксина, например задерживать рост придаточных корней. Для практических целей наиболее часто используют гибберелловую кислоту (А3). Цитокинины были открыты как фактор, регулирующий деление клеток в культуре изолированных тканей и названный кинетином (от слова «кинез» – деление). Другой природный цитокинин назван зеатином, так как был выделен из семян кукурузы в стадии молочной спелости. Сейчас известно еще 12 цитокининов, их химическое строение близко к строению зеатина. Показана высокая кининовая активность и у дифенилмочевины и ряда ее производных. В процессе эволюции этот класс фитогормонов, так же как и ауксины, начал формироваться очень рано. Цитокинины широко распространены в растительном мире: от водорослей до цветковых растений. Соединения с цитокининовой активностью обнаруживаются уже у бактерий. Цитокинины представляют собой N-замещенные производные аденина и синтезируются в растении из двух главных предшественников — мевало Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 171 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro новой кислоты и 5'-АМФ. Возможен синтез цитокининов из продуктов распада некоторых тРНК, содержащих модифицированный аденозин. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды. Во многих случаях для проявления действия цитокининов необходимо присутствие ауксина или одновременно и ауксина, и гиббереллинов. Под действием кинетина происходит рост активности многих ферментов. Применение фиторегуляторов в культуре изолированных тканей (табл. 4.3). Фитогормоны в культуре изолированных тканей необходимы для дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому чтобы получить каллусные ткани, в состав питательных сред обязательно должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды. Таблица 4.3 Фитогормоны и их синтетические аналоги, наиболее часто используемые в культуре изолированных тканей (данные Н.В. Зобовой) Ауксины 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота р-хлорфеноксиуксусная кислота Индол-3-уксусная кислота Индол-3-ацетилаланин Индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота Индол-3-ацетилглицин Индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль ά-нафтилуксусная кислота Цитокинины Аденин 6-бензиламинопурин N-бензил-9(2-тетрагидропиранил)-аденин 6-γ-γ-диметилаллиламинопурин 1 ,3-дифенилмочевина Кинетин Зеатин На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани, Автономность этих клеток по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью их продуцировать. Чаще всего в качестве источника ауксинов в питательных средах используется 2,4-Д (2,4-дихлорфенокисиуксусная кислота), ИУК (индолилуксусная кислота), НУК (ά -нафтилуксусная кислота). Для получения рыхлого, хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используется кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберел Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 172 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro ловая кислоты, флороглюцинол, 2,2-диметилгидразид янтарной кислоты. Из гиббереллинов в составе культуральных сред используют гибберелловую кислоту как наиболее доступную для индукции побегообразования у цитрусовых и для поддержания роста суспензионных культур. Цитокинины в состав сред включают для стимуляции клеточного деления в каллусных и суспензионных культурах, в культурах протопластов, при регенерации проростков из соматических эмбриоидов или стеблевых почек. Абсцизовую кислоту применяют при культивировании протопластов. 4.2.3. Стерилизация питательных сред Богатая питательная среда – прекрасный субстрат для развития в ней микроорганизмов. Для обеззараживания питательных сред используют химическое воздействие (дезинфекция), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен для применения. В биотехнологии широко используют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.) [1, 8]. Как известно, отдельные компоненты питательных сред также поразному реагируют на термическое воздействие. Особенно термолабильны органические соединения: витамины, углеводы, гормоны и др. Сложные сахара и полисахариды при автоклавировании частично гидролизуются. Степень гидролиза зависит от источника углерода, температуры и продолжительности автоклавирования. При высоких температурах происходит карамелизация сахаров. Растворы, содержащие аминокислоты и восстанавливающие сахара, при термическом воздействии приобретают коричневатый цвет вследствие сахароаминных реакций. Все эти процессы сильно зависят от рН используемой среды. Существует сложная зависимость между рН среды, содержанием ионов, температурой, продолжительностью автоклавирования, с одной стороны, и степенью термодеградации питательных сред – с другой. Во избежание нежелательных деструктивных изменений компонентов питательных сред (субстратов) применяют по возможности более мягкие режимы стерилизации (табл. 4.4) или раздельную стерилизацию компонентов. Высокие, но кратковременные температурные режимы инактивируют споры бактерий, оказывая минимальное влияние на биологически активные компоненты среды. В лабораторных условиях стерилизацию питательных сред и некоторых других объектов проводят в автоклавах паром под давлением, соблюдая необходимые режимы. В отдельных случаях прибегают к сухожаровой стерилизации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 173 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro Таблица 4.4 Режимы стерилизации питательных сред Температура, °С 121 126 134 140 150 160 170 Пар под давлением Время, мин Давление, атм 15 1 10 1,4 3 2 – – – – – – – – Сухой жар, мин – – – 180 150 120 60 Установлено, однако, что температура выше 121 оС может быть причиной нарушения качества сред и, как следствие, плохого роста культур. К тому же в принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов питательных сред, что при прочих равных условиях позволяет уменьшать время стерилизации, так как укорачивается период прогрева проб (табл. 4.5). В последнее десятилетие широкое распространение для получения стерильных воздуха и различных жидкостей приобрела мембранная фильтрация. Это разновидность холодной стерилизации, которая эффективна для стерилизации термолабильных веществ [2, 8]. Таблица 4.5 Рекомендуемые интервалы стерилизации разных объемов сред (t = 121 оС) [8] Объем среды, мл 25 50 100 250 500 1 000 2 000 4 000 Минимальное время стерилизации, мин 20 25 28 31 35 40 48 63 Промышленный выпуск мембранных фильтров был начат с конца 40-х гг. прошлого столетия. Согласно Р.Е. Кестингу (1971), наиболее распространенными процессами являются обычная фильтрация (макрофильтрация – ·10 –2–10 мкм), ультрафильтрация (10–3– 1–103 мкм), микрофильтрация (2 2·10–2 мкм), диализ (10–3мкм–1 нм). Если для макрофильтрации применяются обычные бумажные или стеклянные фильтры, то для остальных используются нитроцеллюлозные, ацетилцеллюлозные, поливинильные, полиамид Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 174 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro ные, фторуглеродные мембраны толщиной менее 0,1 мкм с высокой степенью пористости и с диаметром пор в пределах 10–4–10 мкм. Для стерилизации в биотехнологических целях достаточно микрофильтрации. 4.2.4. Основные требования к условиям культивирования Все манипуляции с культурой изолированных тканей растений проводятся в стерильных условиях. Комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости – и конечного продукта [2, 8]. Асептика предусматривает влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер – от франц. barbotage – перемешивание) и пр. К механической защите относятся удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов; герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической – обработка рабочих поверхностей и биообъектов химическими антисептиками. В производственных условиях источниками микробов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, из которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства Культивирование изолированных тканей растений происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1 000–10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, особенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой. Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей – 25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 175 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.2. Условия и методы культивирования тканей in vitro гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, например, как ткань мандрагоры. Каллусные ткани получают в темноте или при рассеянном свете, а для успешного морфогенеза их переносят в помещения с интенсивным освещением 1 000–4 000 лк. Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер. 4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений Методы культивирования изолированных клеток, органов и тканей находят широкое применение в экспериментальной биологии и используются во многих биотехнологических процессах, в которые включены высшие растения. Если биологической основой культуры изолированных тканей является тотипотентность растительных клеток, то обеспечение этого процесса складывается путем подбора питательных сред определенного состава, регуляторов роста и технических (физических) условий введения в культуру и собственно процесса культивирования (выбор экспланта, стерилизация, освещенность, температура и др.). 4.3.1. Основные направления использования Культура клеток и тканей растений может использоваться в двух основных направлениях: 1) размножение или поддержание жизни у неизмененных по сравнению с донорами клеток, тканей, растений; 2) целенаправленное воздействие на изменение генетического статуса клеток и отбор в селективных условиях нужных вариантов. Возможности культуры изолированных клеток и тканей растений весьма обширны [9–11]: 1) получение вторичных метаболитов, продуцируемых отдельными клетками и тканями некоторых полезных растений (алкалоидов, глюкозидов, стероидов и т.д.), используемых для производства лекарств; 2) клеточная и тканевая селекция форм с полезными хозяйственными свойствами; 3) генетическое улучшение сельскохозяйственных растений; 4) ускоренное (микроразмножение) ценных и уникальных генотипов и поддержание жизнеспособности ослабленных клеток и тканей; 5) освобождение (оздоровление) посадочного материала от вирусной инфекции; 6) сохранение генофонда в условиях криоконсервации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 176 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений С использованием методов культивирования также решается большое число теоретических проблем, в том числе: – особенности старения растительной клетки; – процессы цитодифференцировки и морфогенеза; – роль фитогормонов, углеводов, витаминов, минеральных веществ при каллусогенезе, органогенезе, морфогенезе; – взаимоотношения клеток высших растений с клубеньковыми бактериями и микоризными грибами; – механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды: абиотическим (засолению, кислой среде, низким температурам и т.д.), биотическим (патогенам разного происхождения, вызывающим болезни растений); – регуляция вторичного обмена; – механизмы опухолеобразования; – механизмы сомаклональной изменчивости; – популяционные взаимоотношения в клеточной культуре. 4.3.2. Проблемы культивирования изолированных тканей Успех в применении культуры клеток и тканей зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференциацию и регенерацию из них взрослых растений, что определяется многими факторами, прежде всего используемыми гормонами. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений, поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизмов морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе процессов. Высокая способность к образованию растений-регенерантов при культивировании in vitro тканей и клеток растений является необходимым условием эффективного применения многих клеточных технологий. В старых пересадочных культурах может протекать процесс, получивший название «привыкание». Он связан с усилением клеточной дедифференцировки, приобретением автономности по отношению к гормонам и превращением каллусных клеток в клетки химических опухолей. «Привыкание» тканей препятствует в большинстве случаев получению растений-регенерантов. Утрата регенерационной способности наблюдается также при длительном пассировании у гормонозависимых, т.е. нормальных, каллусных тканей. Новообразование растений в культивируемых каллусных культурах в значительной степени определяется генотипом и физиологическим статусом экспланта. В связи с этим способ отбора генотипов и эксплантов, эффективных к образованию морфогенетических структур в культуре in vitro, представляет собой актуальную задачу. Решение ее сопряжено с разработкой ряда физиологических проблем, одной из которых является изучение особенно- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 177 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений стей целого растения, обуславливающих поведение его органов и тканей в культуре in vitro. Имеются данные, которые указывают на связь способности к регенерации растений в культуре первичных эксплантов с модификацией клеточного метаболизма, функционированием меристем и морфогенезом растения, которые, в свою очередь, определяются гормональным балансом. Есть данные о положительном влиянии кустистости и об отрицательном влиянии скороспелости растений картофеля на число побегов в первичном каллусе клубневых дисков. Склонность к образованию многочисленных придаточных корней в природе находит отражение в высоком уровне ризогенеза в каллусной культуре. У гороха отмечен высокий коэффициент корреляции между азотфиксацией (нитрогеназная активность, интенсивность образования клубеньков, число клубеньков) и каллусо- и корнеобразованием. Предполагается, что общая причина формирования клубеньков на корнях растений и образования каллуса в культуре in vitro заключается в способности генотипа к пролиферации клеток, определяемой балансом фитогормонов. Показана связь между полиэмбрионией семян in vivo и числом соматических эмбриоидов в культуре in vitro у ржи. Выявлено большое сходство при формировании эмбриоидов в семени пиона (Paeonia anomala L.) in vivo и в культуре in vitro (образование эмбриоидов из клеток эпидермиса, характер их развития, форма эмбриоидов и др.). Отмечена отрицательная корреляция между частотой образования нередуцированных пыльцевых зерен и способностью к андрогенезу в культуре пыльников у картофеля. Возможно, это свидетельствует о сцеплении генов, контролирующих формирование эмбриоидов и первое деление при образовании реституционных ядер. У раннеспелых сортов в культуре первичного каллуса, полученного из развивающихся зародышей, уровень множественной регенерации растений ниже, чем у позднеспелых. Одной из причин низкого уровня множественной регенерации растений в группе раннеспелых сортов может быть более быстрое развитие зародышей, что определяет более короткий период компетентности их клеток. В работах, проведенных на злаках, показано влияние на процесс регенерации в культуре in vitro отдельных генов, вовлеченных в контроль гормонального баланса растений. Для пшеницы установлено влияние генов, обуславливающих короткостебельность, и гена, определяющего чувствительность к длине дня на рост каллуса, на соматический эмбриогенез и регенерацию растений. У ячменя выявлена сопряженность высокой регенерационной способности с числом рядов в колосе. Известно, что древесные, и особенно хвойные, деревья характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях активируются, окисляя фенолы растений, различные фенолазы. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентив Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 178 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.3. Направления и возможности использования культуры изолированных тканей растений ных почек, которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако несмотря на все трудности, исследователи все чаще привлекают в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений. В целом исследования влияния отдельных характеристик целого растения на поведение его частей в культуре in vitro малочисленны и фрагментарны. 4.4. Клональное микроразмножение растений В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Эти способы имеют свои преимущества и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести генетическую пестроту получаемого посадочного материала и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами: 1) не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.); 2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10–15 лет; 3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (существует возможность накопления и передачи инфекции); 4) операции при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок отличаются трудоемкостью и сложностью; 5) разработанные технологии не эффективны для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения – клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке) неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Для обозначения растений, полученных бесполым размножением, в 1903 г. Уэббер из Министерства сельского хозяйства США ввел термин клон от греч. clon – черенок (побег), пригодный для размножения. Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки. Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 179 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений 4.4.1. Этапы и методы клонального микроразмножения растений Процесс клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа: 1 – выбор растения-донора (донор – растение, часть которого вводится в культуру), изолирование эксплантов (эксплант – ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов (микропобегов); 3 – укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2–10 оС); 4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (рис. 4.1) [12, 14]. Рис. 4.1. Схема клонального микроразмножения растений: I путь – активация развития существующих меристем; II путь – индукция возникновения адвентивных почек; 1 – выбор исходного экспланта; 2 – получение стерильной культуры; 3 – образование адвентивных почек на первичном экспланте; 4 – рост почек и формирование микропобегов; 5 – размножение микропобегов; 6 – укоренение микропобегов; 7 – депонирование растений-регенерантов; 8 – акклиматизация растений к грунту; 9 – высадка регенерантов в поле Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 180 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений Существует много методов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, способствовало созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. В литературе предложены следующие методы микроразмножения растений: активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля); индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта; индукция соматического эмбриогенеза; дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Первый метод, используемый при клональном микроразмножении растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Это может быть достигнуто двумя путями: 1. Удаление верхушечной меристемы стебля (снятие апикального доминирования) и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормональной среде. Апикальное доминирование – подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки. 2. Добавление в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин (2-iр) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного материнского экспланта (инокулюм (трансплант) – часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду) и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков (рис. 4.2). Рис. 4.2. Активация развития уже существующих в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования: 1 – снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in vitro на безгормоналыюй среде; 2 – индуцированное развитие многочисленных пазушных побегов под действием веществ цитокининового типа действия Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 181 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу (рис. 4.3). Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней – ценного безвирусного семенного материала. Формирование растения капусты из пазушной почки показано на рис 4.4. а б в Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием: а – микропобег – объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании); б – микрочеренок на питательной среде; в – развитие растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой) а б в Рис. 4.4. Формирование растения капусты из пазушной почки на агаризованной питательной среде (фото Н.В. Зобовой): а – введение в культуру пазушной почки; б – развитие побега; в – формирование регенеранта Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 182 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений Второй метод – это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта. (Адвентивный – добавочный побег. Развитие растений из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот. Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры). Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют β -индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или α-нафтилуксусную кислоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) – из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок – из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты – из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный – из сегментов листовых пластинок; петуния – из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей. Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок. Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги – в субэпи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 183 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений дермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин, этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов. Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматический эмбриогенез (рис. 4.5). Основное отличие образования зародышей in vitro и in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном счете имеют тенденцию к развитию в проросток. Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови еще в середине 50-х гг., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда и некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная). Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются Рис. 4.5. Образование растений путем соматического за счет добавления в питательную среду ауксиэмбриогенеза на сегментах нов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной листовых пластинок сенпокислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриолии (фото Н.В. Зобовой) нальные. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды. Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией. Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, не требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, потому что соматические зародыши представ Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 184 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений ляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена. Четвертый метод клонального микроразмножения – дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Каллус – неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток. Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации. Практически он мало используется в целях получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Наряду с генетическими изменениями наблюдаются изменения растений и по морфологии: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму. Однако несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет свои положительные стороны и преимущества. Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при определенных благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, отличаются генетически и морфологически друг от друга. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях. Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, эписции, драцены, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители рода Бразика, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен. Разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов. В целом методы клонального микроразмножения, несомненно, имеют ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: – получение генетически однородного посадочного материала; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 185 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений – освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; – высокий коэффициент размножения (105–106 – для травянистых, цветочных растений, 104–105 – для кустарниковых и древесных, 104 – для хвойных); – сокращение продолжительности селекционного процесса; – ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; – размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; – возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; – возможность автоматизации процесса выращивания. 4.4.2. Оздоровление посадочного материала растений Одно из преимуществ клонального микроразмножения – получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала растений. Это можно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения [10, 12, 13]. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции (рис. 4.6). Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые было высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с 50-х гг. предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, Рис. 4.6. Схема мест что в больном растении вирус распространяется с отстаформирования растиванием от быстрорастущих молодых органов, особенно в тельных меристем на побеге: 1 – верху- молодых недифференцированных тканях, где конценшечные; 2 – боковые; трация вируса может снижаться, вплоть до полного от3 – промежуточные сутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время. Строение точки роста растений имеет свою специфику: средний диаметр дистальной ее части, представленной апикальной меристемой, у разных растений составляет до 200 мкм, высота – от 20 до 150 мкм (рис. 4.6). В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 186 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, не допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки. В принципе, возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля (рис. 4.7, рис. 4.8). Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. а б в Рис. 4.7. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а – меристема после ведения в культуру; б – начало развития адвентивных почек; в – формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой) Рис 4.8. Последовательность получения растений, свободных от вирусов через культуру апикальных меристем: 1 – инфицированное вирусом растение, 2 – сегменты стебля; 3 – вычленение апикальной меристемы из пазушной почки; 4 – культивирование апикальной меристемы; 5 – растение, развившееся из апикальной меристемы; 6 – тестирование растений на присутствие вирусов; 7 – размножение в культуральных условиях растения, свободного от вирусов; 8 – размножение свободных от вирусов растений в грунте Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 187 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, через их – на нуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности. Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температуре действует на вирусы через метаболизм растений. Под действием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет и наоборот. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру – 37 °С, освещенность лампами дневного света – 5 тыс. лк, фотопериод – 14–16 ч/сут при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %. Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10–12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако существуют растения, например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vitro. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro. Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект от воздействия высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличивать коэффициент размножения на 50–60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений. Использование термотерапии в сочетании с меристемной культурой дает возможность оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от вирусного хлороза, 90 % земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % картофеля. Растения на наличие вирусов, как правило, проверяют с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов. Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина Д-рибофуранозил1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название – вирозол) концентрацией 20–50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 188 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.4. Клональное микроразмножение растений При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений увеличивался до 80 % по сравнению с 40 % на контроле. Положительные результаты получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений. 4.5. Культура каллусных тканей Каллусная культура – это неорганизованно пролиферирующая ткань, возникающая из дедифференцированных клеток. «Каллус–мозоль» может образовываться на растении при поранении. Это естественный процесс, который можно наблюдать в природе. На месте ранения часть ткани утрачивает прежние связи с организмом, для их восстановления необходимо нарастание клеточной массы. То же происходит и на изолированных кусочках ткани (эксплантах) в культуре in vitro [14]. При помещении фрагмента ткани или органа растения на питательную среду соответствующего состава может происходить дедифференциация соматических клеток с образованием каллусной ткани (рис. 4.9, рис. 4.10). Рис. 4.9. Получение каллусной ткани из различных эксплантов: фрагментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинок а б в Рис. 4.10. Каллус, образованный в культуре незрелых зародышей ячменя (а, б) и пшеницы (в) (фото Н.В. Зобовой) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 189 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей Первый этап дедифференциации клетки связан с ее вхождением в клеточный цикл, что происходит под действием фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Три фазы роста клеток: 1 – деление, 2 – растяжение, 3 – дифференцировка (утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря способности к делению). Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки должны как бы возвратиться в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки. Если дедифференцировка специализированной клетки обуславливается индукцией деления под влиянием цитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой делений, деспециализацией клетки и только после этого – с индукцией делений, приводящей к каллусообразованию. Одни цитокинины в среде (сердцевинной паренхимы табака) блокируют клеточный цикл, клетки только старятся, как и без гормонов, но не растут; а у семядолей подсолнечника в таких же условиях каллус образуется. Как правило, для индукции каллусной ткани необходимо присутствие двух гормонов: ауксинов (дедифференцировка и подготовка к делению) и цитокининов (пролиферация – деление). Но, например, зрелые и незрелые зародыши пшеницы и ячменя дают каллусообразование только с ауксинами (2,4-Д). Вероятно, это связано с наличием у последних достаточного количества эндогенных цитокининов, о чем свидетельствует их прорастание на среде МС без гормонов, т.е. идет увеличение массы стебля и корня – процесс, активируемый цитокининами. Есть достаточно экспериментальных данных о влиянии эндогенных фитогормонов, т.е. гормонального статуса донорного растения, на процесс индукции каллусов в культуре изолированных тканей растений. Имеются данные, что не только ауксины и цитокинины вызывают деление клеток, приводящее к образованию каллуса, но и так называемые элиситоры (от англ. Elect – выбирать) – метаболические вещества, индуцирующие защитные системы растений. Элиситоры – это БАВ, дерепрессирующие гены и, как следствие, активирующие клеточные деления, сравнительно быструю дедифференцировку специализированных клеток, сопровождающуюся активацией белкового синтеза. Отмечено, что при повреждении растительных тканей продукты деградации клеточных стенок действуют как гормоны, которые распространяются по растению, связываются со специфическими рецепторами на клеточных мембранах и инициируют каскад защитных механизмов – такие молекулы называются эндогенными элиситорами. Эффект, вызываемый действием одних и тех же гормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 190 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей Компетентность ее в рассмотренных примерах определяется степенью дифференцировки клеток. Переход клетки in vitro из дифференцированного состояние к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигенной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и депрессии генов, лежащий в основе дифференцировки, происходит легче, чем у однодольных. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмиранию каллусных клеток, первичный каллус через 4–6 недель переносят на свежую питательную среду (пассирование). При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет. Культура каллусной ткани моркови, полученная Готре более 50 лет назад, до сих пор растет в коллекции. 4.5.1. Особенности каллусных клеток Каллусные клетки имеют как сходства с нормальными клетками, так и отличия от них [6]. Сохранение свойств оригинальных нормальных клеток: – синтез вторичных метаболитов; – морозо- и жаростойкость, устойчивость к низким и высоким температурам; – фотопериодическая реакция (сохраняется активность фитохрома); – устойчивость к осмотически активным веществам, к засолению и т.п. Отличия от нормальных клеток: – изменение состава белков. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа; – физиологическая асинхронность, гетерогенность по возрасту. Присутствуют молодые клетки в G1-фазе, старые – в G2 и в S-фазах цикла клеточных делений; – более длительный клеточный цикл, чем у растений, произрастающих в открытом грунте; – неограниченный, анархический рост; – слаборазвитые митохондрии, как и в меристематических клетках (в них мало крист, что влияет на активность аэробного дыхания); – особенности энергетического обмена. Потребляют меньше кислорода по сравнению с нормальными (ДК более 1), т.е. в них снижен эффект Пастера (понижение процесса брожения под действием кислорода). Это роднит кал- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 191 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей лусные клетки с другими быстро делящимися клетками меристематическими и раковыми; – повышенное потребление углеводов (в 19 раз) из-за аэробного гликолиза (бескислородное расщепление углеводов в присутствии кислорода); – сдвиг в обмене углеводов в направлении пентозофосфатного пути, который является источником пентоз, необходимых для делящихся клеток. Перечисленные особенности каллусных клеток позволяют очень эффективно использовать их в получении вторичных метаболитов и селекции растений. 4.5.2. Генетика каллусных клеток Однотипно образующиеся каллусные клетки в процессе культивирования формируют каллусную ткань, которую характеризует гетерогенность по клеточному составу, что выяснено с 60-х гг. прошлого века. Каллусная ткань может содержать клетки следующих типов: паренхимные, меристематические, некротические, а также отдельные клетки или зоны проводящей системы. Культура каллусных тканей обладает не только гетерогенностью по степени дифференцированности клеток, но и гетерогенностью по цитогенетическим характеристикам, которая может быть обусловлена двумя причинами: 1. Клетки исходного экспланта имеют разную плоидность. В условиях in vitro эти клетки индуцируются к делению и становятся источником отдельных клеточных линий. 2. Клетки исходного экспланта имеют одинаковую плоидность, характерную для меристематических клеток растения, но в условиях культивирования плоидность отдельных клеток может измениться. Установлено, что примерно у 90 % из числа изученных покрытосеменных растений в процессе дифференцировки клеток происходит их полиплоидизация. Такие растения относят к полисоматическим или миксоплоидным, т.е. к растениям, которые одновременно содержат диплоидные и полиплоидные клетки. Это, например, бобовые, пасленовые и т.д. Виды растений, клетки которых при дифференцировке сохраняют исходный уровень плоидности, относят к неполисоматическим, например, Crepis capillaris, Ipomoea batatas (батат), Ipomea purpurea, a также ряд видов Lilium (лилии). Выделены и промежуточные виды, такие как подсолнечник и топинамбур, у которых содержание полиплоидных клеток обнаруживают только в некоторых тканях и не у всех растений. Следовательно, у большинства растений только в апикальных меристемах, т.е. в кончиках корешков и верхушках побегов, клетки характеризуются нормальным клеточным циклом: за синтезом ДНК происходит деление ядра, а затем и всей клетки с образованием двух дочерних клеток. Таким образом, в апикальных меристемах плоидность поддерживается на одном уровне и характеризует цитотип данного растения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 192 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей Клетки с различным уровнем плоидности образуются в результате эндомитоза и эндоредупликации. Оба эти процесса являются такими формами митоза, при которых не происходит деление ядра и клетки, но содержание ДНК в ядре увеличивается в геометрической прогрессии. В условиях культивирования in vitro эндомитоз и эндоредупликация могут иметь место и у неполисоматических видов растений. Например, после года культивирования часть диплоидных клеток каллусной ткани Crepis capillaries (крепис) становится полиплоидной. В условиях культивирования в большей степени, чем у интактных растений, наряду с полиплоидизацией происходит образование анеуплоидных клеток и клеток со структурными изменениями хромосом. Индукторами онтогенетической изменчивости клеток в культуре могут быть различные компоненты питательной среды. Наиболее хорошо изучена роль фитогормонов. При этом необходимо подчеркнуть, что действие одного и того же фитогормона в разных культуральных системах может приводить к неодинаковой реакции клеток. Так, в экспериментах по культивированию сегментов корня гороха на среде, содержащей синтетический ауксин-2,4-Д, наблюдалось деление диплоидных клеток. При добавлении в питательную среду кинетина начинали делиться тетраплоидные клетки. В других экспериментах показана роль 2,4-Д как фактора полиплоидизации. Так, в суспензионной культуре гаплопаппуса при наличии в питательной среде 2,4-Д в течение шести месяцев культивирования происходило превращение диплоидной культуры в тетраплоидную. Как правило, увеличение продолжительности культивирования, независимо от состава питательной среды и происхождения культуры, ведет к повышению цитогенетической нестабильности. 4.5.3. Морфогенез в каллусных тканях Существует несколько путей, по которым может пойти каллусная клетка после ее дедифференцировки: 1) вторичная регенерация целого растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов; 2) утрата способности к вторичной дифференцировке и регенерации растений, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти без гормонов – опухолевая (это явление чаще наблюдается у старых культур); 3) нормальный онтогенез каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и умиранием. Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза). Интереснее регенерация. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существуют различные типы морфогенеза: органогенез – корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенери Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 193 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей руют отдельные органы, а затем уже из них – целые растения, исключение – корневой органогенез (рис. 4.11). В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение. а б в г Рис. 4.11. Морфогенез в каллусных тканях, сформированных в культуре незрелых зародышей ячменя (а–в) и пшеницы (г): а – ризогенез; б, г – стеблегенез; в – стеблеи ризогенез (формирование регенеранта) (фото Н.В. Зобовой) Тотипотентность – это способность любой клетки воспроизвести целое растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток, сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых клетках гены в сильной степени репрессированы. В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичной дедифференцировки. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую. Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние факторы: внутренние – вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние – состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 194 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки [7, 11]. Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллусной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды. Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах. Дополнительные стимулы морфогенеза – азотнокислое серебро, нитрат аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы аммония -NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая – ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей. Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400–1 000 клеток регенерирует. Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки. Морфогенез начинается с того, что под влиянием условий среды детерминированная клетка обособляется от каллусных клеток, образуя утолщенную стенку [4]. Клетка-инициаль при соматическом эмбриогенезе дает начало зиготе, а при органогенезе – меристематическому очагу. От недетерминированных каллусных клеток инициальная отличается более крупным ядром и меньшими размерами вакуоли. Ядро обычно занимает центральное положение. В инициальных клетках содержатся большие количества крахмала, иногда липидов. Некоторое время инициальная клетка находится в лаг-фазе, что необходимо для переустройства и подготовки к последующим быстрым делениям. Затем эти клетки делятся по типу дробления, образуя сферическую массу мелких изодиаметрических клеток. При органогенезе эту массу называют меристематическим очагом, а при соматическом органогенезе – глобулярным проэмбрио. В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой и флоральный органогенез. В глобулярном проэмбрио развивается биполярная структура. Можно выделить несколько последовательных стадий формирования эмбриоидов из каллусной ткани – глобулярную, сердечка, торпедовидную, соматического зародыша. Меристематические очаги или проэмбрио могут возникать на периферии каллусной ткани или быть погруженными в нее. Обычно не наблюдается определенной закономерности в их локализации, исключение составляет стеблевой органогенез в каллусной ткани, полученной из сердцевидной паренхи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 195 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.5. Культура каллусных тканей мы табака. Меристематические очаги здесь локализуются только в нижней части каллусной ткани. Некомпетентные клетки делятся, но скорее (чаще) всего становятся гормононезависимыми. Многие в силу генетических особенностей используют гормоны, но не регенерируют, занимая промежуточное положение между «привыкшими» и свежими каллусами. 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей Манипуляции в культуре изолированных тканей растений (с использованием или без культуры каллусных клеток) чаще всего осуществляют в соматических тканях. Реализация тотипотентности соматических клеток лежит в основе вегетативного размножения растений. Отрезки стеблей, корней и листья растений разных таксономических групп способны к регенерации новых побегов и корней. При культивировании in vitro эти возможности могут быть значительно увеличены, а у растений, не проявляющих регенерационной способности в природных условиях, индуцированы. 4.6.1. Прямой и непрямой пути органогенеза Если при культивировании развитие корней, стеблевых или цветочных почек происходит из клеток экспланта без образования каллуса, то такой путь органогенеза называют прямым. Путь формирования морфологических структур, приводящих к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре, называют непрямым органогенезом [11]. Пример прямого органогенеза in vivo и in vitro – образование стеблевых почек у льна. Так, если у 15-дневных проростков льна удалить верхушку стебля, то через определенный промежуток времени из эпидермальных клеток гипокотиля происходит образование многочисленных стеблевых почек. Позже одна из почек доминирует в развитии и дает полноценный стебель. Если сегмент гипокотиля льна размером примерно 15 мм поместить на агаризованную культуральную среду с фитогормонами, то развитие может получить до 170 проростков, формирующихся как из эпидермальных, так и из субэпидермальных клеток. Возможные пути преобразования, включая органогенез, при культивировании изолированной ткани представлены на рис. 4.12. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 196 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей ЭКСПЛАНТ Корни КАЛЛУС Стеблевые почки Корни Цветочные почки «Привыкшая» ткань Эмбриоиды РАСТЕНИЯ Эмбриоиды Рис. 4.12. Возможные пути преобразования при культивировании изолированных тканей Предрасположенность клеток культивируемой ткани к определенному пути органогенеза в условиях in vitro может зависеть от многих факторов: – таксономической принадлежности и генотипа исходного растения; – онтогенетического возраста растения; – локализации ткани, использованной в качестве экспланта; – действия физических факторов при культивировании; – длительности культивирования; – состава питательной среды. Рассмотрим примеры, подтверждающие эти положения. Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений. У двудольных растений каллусную ткань, способную к органогенезу, можно индуцировать не только из меристематических клеток, но и из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. Например, у злаков каллус можно получить из зародышей, гипокотиля, корневых и стеблевых апексов, сегментов молодых листьев, молодых соцветий. Возможности получения растений-регенерантов у злаков еще более ограничены. Регенерация растений происходит в основном из каллуса, индуцированного из молодых зародышей и молодых соцветий. Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуре тканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных и мутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса и других растений. Выявлены соответствующие доноры с высоким морфогенным потенциалом в культуре in vitro. Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетического состояния растения выявлена, в частности, при изучении культивирования листовых эксплантов эчеверии (семейство Толстянковых) и табака. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 197 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта. Уровень эндогенных фитогормонов определяет и зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, использованной в качестве исходного экспланта. Особенности органогенеза изучены в зависимости от таких физических факторов, как температура, содержание кислорода в культуральной системе, продолжительность и качество освещения. Результаты многих экспериментов однозначно продемонстрировали, что с увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу – образованию корней. Что касается факторов питательной среды, определяющих особенности регенерации в культуре ткани, то в наибольшей степени на индукцию стеблевых почек и корней влияет фитогормональный баланс. При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности: 1. Определенное превышение концентрации кинетина над ауксином в неорганизованно растущей каллусной культуре приводит к образованию стеблевых почек и побегов. 2. Увеличение концентрации ауксина способствует развитию корней. 3. Среднее, близкое к равному, соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани. Процессы органогенеза на клеточном уровне могут носить продолжительный характер и быть асинхронными. В каллусной культуре образование меристематических зон происходит в основном в базальной ее части, контактирующей с питательной средой. Клетки меристематических зон характеризуются интенсивным синтезом РНК и белка и становятся источником формирующихся зачатков органов. Этот процесс контролируется экзогенными фитогормонами, содержащимися в питательной среде, и эндогенными, синтезируемыми самими клетками. Возможность индуцирования процессов органогенеза и регенерации растений из стеблевых почек в культуре in vitro используется для массового размножения растений. 4.6.2. Соматический эмбриогенез При культивировании in vitro и из клеток экспланта, и из клеток каллуса могут развиться соматические зародыши, или эмбриоиды, которые, как и стеблевые почки, при прорастании дают целые растения. В зависимости от пути образования эмбриоидов (из экспланта или каллуса) по аналогии с органогенезом различают прямой и непрямой путь соматического эмбриогенеза. Морфологические различия между стеблевыми почками и эмбриоидами заключаются в следующем. Эмбриоиды развиваются из соматических Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 198 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей клеток как автономные структуры. Для соматических зародышей, как и для зиготических, характерна биполярность [9] (рис. 4.13). а б в г Рис. 4.13. Морфологические особенности зиготических (а) и соматических (в) зародышей по сравнению со стеблевыми почками, развивающимися in vivo (б) и in vitro (г) Стеблевые почки, развивающиеся и у интактных растений, и в культуре in vitro, монополярны и не автономны, так как связаны сосудистыми тканями с органом растения или каллусной тканью. Пример соматического эмбриогенеза in vivo – адвентивная полиэмбриония у цитрусовых. В одном семени может развиваться до сорока зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния половых клеток и несет признаки материнского и отцовского растения. Остальные зародыши – неполовые, развиваются из клеток нуцеллуса, окружающего зародышевый мешок, и несут признаки только материнского растения. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используют для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, где происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток. Образование структур, подобных зародышевым, впервые описал Ф. Стюард в 60-е гг. Культивирование клеток корня моркови в жидкой среде с кокосовым молоком приводило к их быстрому делению и образованию клеточных агрегатов. Внутри этих агрегатов происходила дифференцировка элементов ксилемы, после чего формировались корневые зачатки. При переносе культуры на агаризованную среду наблюдалось образование из этих структур побегов, развивающихся в целое растение. Источником эмбриогенного каллуса у моркови могут быть разные органы: корень, листья, стебель, зиготические зародыши. Интересной моделью для изучения соматического эмбриогенеза является лютик – Ranunculus sceleratus. На среде, содержащей кокосовое молоко, в соматических тканях и пыльниках формируется эмбриогенный каллус. В течение трех недель как внутри каллуса, так и на его поверхности образуются эмбриоиды, по своему строению напоминающие зиготические зародыши. Такие же эмбриоиды могут формироваться и из клеток суспензионной культуры. При пассировании соматических зародышей на свежую Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 199 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей среду индуцируется развитие проростков, у которых по всему стеблю из отдельных эпидермальных клеток без дополнительной индукции формируются многочисленные эмбриоиды. У злаков в условиях культивирования эмбриогенный каллус может быть получен из щитков молодых зародышей, помещенных на поверхность агаризованной среды, содержащей 2,4-Д. Соматический эмбриогенез у злаков на примере культурного ячменя был впервые описан в 1970 г. Норстогом. Различают критические стадии в развитии и прорастании эмбриоидов, индуцированных в каллусной культуре: 1. Дедифференциация клеток экспланта. Этот период связан с активацией генов, контролирующих деление клеток. В культуральную среду необходимо вводить ауксины (например, для злаков) или ауксины в сочетании с цитокининами (для хвойных), стимулирующие как процесс дедифференциации, так и образования эмбриогенных групп клеток. 2. Развитие эмбриоидов, происходящее в зонах эмбриогенных клеток и контролируемое генами, последовательно экспрессирующимися на разных стадиях эмбриоидогенеза. На данном этапе культивирования концентрация ауксинов в питательной среде или снижается, или полностью исключается. 3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. В этот период требования к среде и условиям культивирования могут быть различными в зависимости от культивируемого объекта. Так, для развития растений из эмбриоидов цитрусовых в культуре нуцеллуса необходим гиббереллин, а у винограда культивирование проводят при пониженной температуре (t = 4 °С). Чтобы индуцировать прорастание соматических эмбриоидов у злаков и цикламена, необходимо использовать безгормональную среду или среду с низким содержанием ауксинов [10]. Возможность получения соматических зародышей у растений используют для получения искусственных семян или при клональном размножении растений. 4.6.3. Сомаклональная изменчивость Морфогенез и регенерация растений в культуре соматических клеток достаточно часто сопровождается изменениями регенерантов по сравнению с растениями, введенными в культуру. Австралийскими исследователями Ларкиным и Скоукрофтом растениярегенеранты предложено называть сомаклонами (от сома – тело), а проявление генетической изменчивости у растений, регенерировавших в результате культивирования in vitro, – сомаклональной изменчивостью. По определению Бутенко [7], сомаклональные варианты – фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельного геномов растительных клеток, от истинных генных мутаций отличаются большой частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 200 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей Сомаклоны, у которых проявляется генетическая изменчивость, относят к сомаклональным вариантам. Приняты следующие обозначения для растений-регенерантов или, соответственно, для сомаклонов и их самоопыленных потомков: R – растение-регенерант; R1 R2 и т. д. – первое, второе и последующие самоопыленные поколения растения-регенеранта; SC – сомаклон; SC1, SC2 и т. д. – первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона. Сомаклональная изменчивость характеризуется высокой частотой мутирования. По данным корпорации DNA Plant Technology (США), до 15 % регенерированных в культуре тканей растений томатов имели в потомстве генетические изменения. При исследовании числа хромосом у растенийрегенерантов различных сортов пшеницы структурные изменения хромосом обнаружены примерно у 25 % регенерировавших растений. Сомаклональные изменения наследуются и связаны с простыми генными мутациями. Однако в настоящее время неизвестен конкретный генетический механизм, приводящий к нестабильности культивируемых клеток. В различных исследованиях обнаружены многочисленные кариологические нарушения у регенерантов – полиплоидия, анеуплоидия, фрагментирование хромосом, хромосомные мосты, транслокации, делеции, инверсии, многочисленные хромосомные аберрации. Условия in vitro являются стрессом для культивируемых клеток и тканей. Это связано с изоляцией от целого организма его фрагментов и помещением их в новые условия. В процессе культивирования наблюдается цитогенетическая и генетическая гетерогенность клеточных культур, что определяется: – клеточной гетерогенностью исходных эксплантов, связанной с уровнем их полисоматии (миксоплоидии); – условиями культивирования, где ведущая роль в индуцировании клеточной изменчивости принадлежит фитогормонам. Вследствие этого растения, регенерировавшие в условиях in vitro из развивающихся соматических эмбриоидов или из стеблевых почек, могут характеризоваться фенотипической и генетической изменчивостью. Так, спектр фенотипического разнообразия у растений-регенерантов более выражен, чем у их потомков, полученных после самоопыления. Это связано с физиологическими нарушениями, происходящими в процессе культивирования на искусственной питательной среде и приводящими к подавлению роста и развития растений, снижению их фертильности. Например, у регенерантов ячменя и пшеницы можно наблюдать формирование сдвоенных колосьев, супротивно расположенных листьев. Такие нарушения, как правило, не наследуются. На основании изучения сомаклонов выявлены следующие механизмы, которые могут объяснить сомаклональную изменчивость: 1) грубые кариологические нарушения (изменения числа хромосом – полиплоидия, анеуплоидия; хромосомные перестройки – транслокации, де Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 201 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей леции, инверсии, дупликации), которые хорошо определяются цитологическими методами анализа; 2) хромосомные перестройки, не выявляемые при цитологическом анализе и квалифицируемые как точковые мутации; 3) соматический (митотический) кроссинговер и обмен сестринских хроматид (наиболее хорошо изучено у томатов); 4) изменчивость цитоплазматических геномов; 5) амплификация и редукция генов; 6) активация ранее репрессированных (молчащих) генов; 7) активация мобильных элементов (изучено у отдельных моделей – люцерны, табака, кукурузы) [11]. Таким образом, под термином «сомаклональная изменчивость» понимают разнообразный спектр генетической, цитогенетической, молекулярной изменчивости, обусловленный изменениями в ядерном или цитоплазматических геномах в результате культивирования in vitro. Выявлено несколько причин генетической нестабильности культивируемых клеток. В большинстве случаев генетической основой сомаклональной изменчивости являются мутации единичных или небольшой группы генов доминирующего или рецессивного характера в ядерном, пластидном или митохондриальном геномах [12, 14]. Другой причиной может являться длительное пассирование тканевых и клеточных культур, приводящее к накоплению в них генетических изменений. Каждый из указанных выше механизмов, обусловливающих изменчивость у сомаклонов, в определенной степени связан с другими и зависит от нарушений клеточного цикла, которые индуцируются действием фитогормонов, содержащихся в культуральной среде [5, 11, 13]. Экспериментально установлены следующие закономерности: 1. Регенеранты, развившиеся в результате непрямого эмбриогенеза или органогенеза, характеризуются большей изменчивостью, чем регенеранты, полученные в результате прямого эмбриогенеза или органогенеза. 2. С длительностью культивирования частота сомаклональной изменчивости у регенировавших растений увеличивается. 3. Степень изменчивости по частоте цитогенетических нарушений у сомаклонов определяется жизнеспособностью растений. Для выявления у сомаклонов изменений в виде точковых мутаций производят их скрещивание с исходными линиями и прослеживают расщепление в ряду поколений. Значительная часть сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы, томатов, риса обусловлена стабильными генетическими изменениями следующего характера: – у сомаклонов мягкой пшеницы и риса, например, выявлены изменения по биохимическим и морфологическим признакам, находящиеся под моногенным (состав глиадинов, цвет зерновок) и полигенным (высота растений, сроки колошения, урожайность) генетическим контролем; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 202 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей – сомаклоны могут иметь изменения по ряду признаков, которые в потомстве группируются независимо; – мутации у сомаклонов могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными; – мутации, обнаруженные у сомаклонов мягкой пшеницы, могут затрагивать гены, локализованные во всех семи гомеологических группах хромосом мягкой пшеницы; – у сомаклонов томатов обнаружены новые генные мутации, ранее не индуцированные в результате химического или радиционного мутагенеза; – одиночные генные мутации у сомаклонов могут проявляться с относительно высокой частотой (в среднем в одном растении на каждые 20–25 растений-регенерантов). Изменчивость митохондриального генома обнаружена у сомаклонов разных растений. Наиболее хорошо это явление изучено у растений кукурузы, регенерировавших из каллусной ткани незрелых зародышей. Анализ митохондриальной ДНК показал, что в структуре мт-ДНК сомаклонов произошли изменения, которые определяли их высокую чувствительность к грибу Helminthosporium maydis и которые не были выявлены у растений семенных поколений. Примером изменчивости пластидного генома, вызванной его делециями, служат многочисленные данные по получению альбиносов среди сомаклонов пшеницы, риса, ячменя, сорго, кукурузы. Амплификация (увеличение дозы гена, приводящее к возрастанию количества соответствующего фермента) описана в клетках суспензионной культуры люцерны. Была выделена клеточная линия, которую по сравнению с исходной характеризовала более высокая устойчивость к гербициду фосфинотрицину. Таким образом, сомаклональную изменчивость можно рассматривать как один из источников увеличения генетического разнообразия растений. 4.6.4. Гормоннезависимые растительные ткани Ткани, образованные «привыкшими» клетками, которые приобретают способность расти без гормонов (становятся автономными по отношению к экзогенным цитокининам и ауксинам), называются гормоннезависимыми. Еще их называют химическими опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь тератомы, хотя в отдельных случаях формируются и регенеранты. В таких тканях, как и в опухолевых, наблюдается интенсивный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во внесении их в питательную среду. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 203 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.6. Органогенез в культуре соматических тканей Кроме «привыкших» тканей существуют опухоли растительного происхождения, вызванные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, возникающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее распространенными в природе и представляющими интерес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, индуцированные у двудомный растений агробактериями (Agrobacterium tumefaciens). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у растений – бородатый корень (Agrobacterium rhizogenes) и стеблевой галл (Agrobacterium rubi), сходный с корончатым галлом [3, 8, 12]. Общим свойством химических и природных опухолей растений является их гормоннезависимость. Внешне и те, и другие ткани сходны с каллусными. У «привыкших» тканей гормоннезависмость достигается в результате изменения активности генов, отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построении молекул гормонов, следовательно, в конечном счете отвечающих за синтез гормонов. Таким образом, изменения в данном случае носят эпигенный характер, хотя нельзя исключить и возможность мутации. В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в растительную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс. В 40-х гг. Браун показал, что ткани корончато-галловой опухоли даже в отсутствие агробактерий (например, после гибели под воздействием высоких температур) сохраняют опухолевые свойства. На искусственной среде эти ткани продолжают активно пролиферировать. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и продуцируют несколько цитокининов. В 1977 г. Чилтон показал, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Ти-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительную ядерную ДНК. Таким образом, сегмент Типлазмиды интегрируется в хромосому и становится частью наследственного аппарата трансформированной (опухолевой) растительной клетки. Гормоннезависимость, являющаяся следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации клеток. Путь синтеза этих гормонов в опухолевых клетках более простой и короткий, чем в нормальных и «привыкших» клетках. Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез галлами нового класса веществ, не встречающихся в природе, – опинов. Они содержатся только в тканях корончатых галлов и служат их маркерами. Они являются ростовыми веществами агробактерий, однако опухоли продуцируют их и в отсутствие микроорганизмов. Общие свойства «привыкших» и опухолевых клеток: гормоннезависимость и отсутствие регенерации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 204 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.7. Суспензионные культуры Суспензию клеток можно получить из каллуса при помещении его в жидкую питательную среду на качалку или непосредственно из ткани экспланта с помощью пектиназы и встряхивания. Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате образуется клеточная суспензия [11, 14]. Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об/мин. Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, который легко фрагментируется на отдельные клетки или небольшие агрегаты и получается на средах с 2,4-Д. Облегчает суспендирование исключение из питательной среды ионов кальция, цитокининов или уменьшение их концентрации и увеличение ауксинов. Еще более – добавление в среду пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий между собой отдельные клетки Основным условием культивирования клеточных суспензий является постоянное встряхивание или перемешивание среды. Иначе опять формируется каллусная ткань! Деление поддерживается присутствием ауксинов и цитокининов, которые необходимы для индукции и роста каллусной ткани. Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 сут. Обычно длительность культивирования составляет 14–16 дней. При этом плотность возрастает от 10 000 до 1 000 000 кл/мл. Для субкультивирования суспензия берется в конце экспоненциальной фазы, метаболиты – лучше в стационарной. Назначение суспензий – получение вторичных метаболитов (лекарства, парфюмерия, биомасса, селекция и протопласты). Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве [2, 3, 8]. Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 205 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.7. Суспензионные культуры Характеристики суспензии – жизнеспособность, плотность в суспензии, степень агрегированности, скорость роста. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз. В зависимости от целей исследования условия культивирования и состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии преобладала определенная фракция клеток. Обычно в суспензии различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты, средние агрегаты, крупные агрегаты. При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки для красителей, по активности ферментов. Жизнеспособность определяется по окрашиванию метиленовой синью или синей Эванса (0,5 %-м раствором синей Эванса или 0,01 %-м раствором флуоресцеинацетата). Прижизненные красители клетки не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не проникают. Жизнеспособность культуры определяют соотношением количества жизнеспособных клеток к общему количеству в миллилитре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характеризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при окрашивании препаратов красителями [11]. Суспензия считается жизнеспособной, если более 70 % клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если более 50 % его клеток не окрасились. Культивирование суспензий осуществляется в периодическом или непрерывном (проточном) режиме. Клетки не удаляются в закрытой системе, частично удаляются – в открытой. Для промышленного производства применяют ферментеры. Во многих случаях изучение особенностей размножения и роста клеток связано с необходимостью использования синхронизированных клеточных популяций. Как правило, клеточная популяция суспензионных культур не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда течение клеточного цикла блокируется в определенном периоде под влиянием или физических факторов, например, пониженной температурой, или химических соединений. Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК: тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими веществами клеточный цикл про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 206 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.7. Суспензионные культуры должается только до Gi-периода и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу клеток к синтезу ДНК, а затем и делению. Другой способ синхронизации заключается в создании условий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды, например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накапливаются в Gi- или Ог-периоде клеточного цикла. Затем пассирование суспензии на среду с недостающим компонентом приводит к синхронизации клеточного деления. С помощью индукции синхронизации клеточных делений удается повысить митотический индекс с 2-3 до 30–35 %. 4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток Получение культуры отдельных изолированных клеток очень ценно для генетических и физиологических исследований, практического использования в клеточной селекции. Так, получение клона потомства одиночной клетки помогает установить причины генетической неоднородности каллусных клеток. Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, тканей растений, из каллусных тканей или культуры протопластов после восстановления клеточной стенки. Для получения одиночных клеток иногда достаточно отстаивания суспензионной культуры (10–15 мин в колбе) или использования мацерирующих ферментов, центрифугирования в градиенте сахарозы либо фильтрования через сито. Первые работы по изоляции клеток растений и получению изолированных клонов было выполнено в 1954 г. в Висконсинском университете, США. Отдельные клетки выделяли из рыхлой каллусной ткани табака, культивированной в жидкой питательной среде при постоянном встряхивании на шейкере. Трудности связаны с тем, что отдельные клетки не делятся в тех условиях, при которых растет каллусная ткань. Предварительные эксперименты показали, что при помещении отдельной изолированной клетки в культуральную среду ее деления не происходило. Однако клоны из таких клеток удалось получить Мьюиру с соавторами с использованием метода ткани-«няньки». В этом случае изолированную клетку переносили на фильтровальную бумагу, смоченную питательной средой и помещенную на поверхность хорошо растущей каллусной ткани. Каллусная ткань индуцировала и поддерживала деление клетки, а затем и развитие клеточного клона. В тех же целях используют суспензионные культуры клеток [12] (рис. 4.14). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 207 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток Рис. 4.14. Использование в качестве «няньки» культуры суспензионных клеток при выращивании одиночных клеток: 1 – колонии клеток; 2 – фильтровальная бумага; 3 – алюминиевая сетка; 4 – пенополиуретан; 5 – суспензия клеток Для индукции клеточных делений одиночных клеток можно использовать кормящий слой (активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений), отделенный от культивируемых одиночных клеток полупроницаемой мембраной. Стимулирует клеточное деление и кондиционирование среды, для чего в нее добавляют питательную среду интенсивно делящейся культуры клеток. Кондиционирующий фактор получают при фильтровании клеточной суспензии в экспоненциальной фазе роста через бактериальный фильтр. Позже был разработан метод массового культивирования отдельных изолированных клеток – метод плейтинга (от the plate – чашка) [11]. Метод состоит из следующих процедур: – получение клеточной суспензии в жидкой питательной среде из хорошо растущей каллусной ткани; – фильтрование суспензии через сито для удаления крупных клеточных агрегатов; – приготовление 0,6–1 %-й агаровой среды того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии; – нагревание агаровой среды до жидкого состояния и перемешивание ее с равным количеством суспензии, которую необходимо разлить в чашки Петри слоем около 1 мм; – определение местоположения отдельных клеток с использованием инвертированного микроскопа и нанесение пометок об их наличии на крышках чашек; – культивирование в темноте при t = 25 °С; – наблюдения за развитием одноклеточных клонов. В экспериментах Бергмана около 20 % изолированных каллусных клеток табака делилось и образовывало колонии. При данном способе культивирования, даже при недостаточно сбалансированном составе питательной среды, может происходить деление отдельных клеток. Это обусловлено тем, что в соседних колониях, образованных из мелких клеточных агрегатов, синтезируются ростовые вещества, которые выделяются в среду и стимулируют клеточное деление. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 208 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.8. Культура отдельных изолированных клеток, или культура одиночных клеток Метод микрокамеры разработан Джонсом в 1960 г., который может быть использован при оптимальной сбалансированности состава питательной среды для культивирования отдельной изолированной клетки. Метод включает следующие процедуры: – на предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом расстоянии наклеивают два покровных стекла; – между покровными стеклами наносят квадрат из парафинового масла; – в камеру из парафинового масла помещают каплю питательной среды с изолированной клеткой; – сверху камеру накрывают третьим покровным стеклом; – за развитием клеточной колонии наблюдают под микроскопом. Использование микрокамеры Джонса позволило Вэсилу и Хильдебрандту в 1965 г. продемонстрировать возможность получения из изолированной клетки табака нормально развивающегося и достигшего цветения растения. Таким образом, впервые экспериментально была доказана тотипотентность клетки растения. К указанному методу близок способ Ю.Ю. Глеба – в микрокаплях. 4.9. Культура протопластов Протопласт – клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Протопласт имеет характерную сферическую форму, его поверхность защищена только плазмолеммой. 4.9.1. Изоляция протопластов Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ [11]. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений: – невысокая производительность; – возможность использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом; – трудоемкость и длительность. Другой метод выделения протопластов – энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 г. Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 г. Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 209 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов По сравнению с механическим энзиматический метод обладает следующими преимуществами: – одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн из грамма ткани или клеток); – клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу; – клетки не повреждаются; – метод сравнительно быстрый. Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток. Выделение протопластов проводят в три этапа: 1) обработка ферментами; 2) выделение протопластов из клеточных стенок; 3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков. В зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Для выделения протопластов используют разные ткани растения, а также каллусные и суспензионные культуры. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев. Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3–0,8 моль/л. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур [12]. Лучше всего – в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 210 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов Рис. 4.15. Схема получения и культивирования протопластов из клеток растений Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды – 5,4–5,8, температура – 22–28 оС, невысокая освещенность (не более 2 000 лк). Общее представление об этапах получения, культивирования in vitro протопластов и регенерации из них растений дано на рис. 4.15. 4.9.2. Тотипотентность протопластов Сразу после того, как отмыты ферменты, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Че Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 211 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов рез 2–4 дня протопласт может утратить сферическую форму, и произойдет полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от происхождения протопластов и культуральных условий может отмечаться отсутствие синтеза клеточной оболочки в течение нескольких недель или месяцев. Одним из факторов культуральной среды, обусловливающим синтез клеточной стенки, является сахароза. В ее отсутствие синтеза клеточной стенки не происходит. Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом. Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2–10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии могут стать источником растенийрегенерантов. Первое сообщение о регенерации растений в культуре протопластов мезофилла табака было опубликовано в 1971 г. японскими исследователями. Наиболее хорошо отработаны методы изоляции и культивирования протопластов у представителей семейства Solanaceae и отдельных видов Brassica. Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, и хвойные. 4.9.3. Требования к составу сред при культивировании протопластов Для культивирования протопластов могут быть использованы модификации сред Мурасиге и Скуга или Гамборга (В-5) с добавлением комплекса витаминов и фитогормонов. До того как протопласты синтезируют клеточную стенку, необходимо обеспечить в среде соответствующий уровнь осмотического давления для поддержания стабильности протопластов. В качестве осмотиков используют сахара: глюкозу, маннитол, сорбит, ксилозу, сахарозу или их разные сочетания. После регенерации клеточной стенки и развития клеточных колоний осмотики из среды исключают. Другой важный фактор успешного культивирования протопластов – плотность их высева, которая может составлять 104–103 протопластов на 1 мм среды. Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирова- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 212 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов ние единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г. Во втором – суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1 %-м агаром при температуре не выше 45 оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28 оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами, и они поддерживают и стимулируют их рост. Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами. На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора: видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения, способ и условия выделения протопластов, плотность высева протопластов, состав питательной среды. 4.9.4. Использование культуры протопластов Отсутствие клеточной стенки у протопластов обусловливает им свойства, отличные от целых клеток. Благодаря тому, что протопласты способны поглощать макромолекулы и органеллы, их используют в качестве реципиентов при трансформации, а также в экспериментах по клеточной селекции и мутагенезу. Изолированные протопласты служат источником для выделения неповрежденных и функционально активных субклеточных и цитоплазматических структур и органелл (хлоропластов, ядер, хромосом). Способность протопластов сливаться друг с другом нашла применение для получения соматических гибридов. И все же проблема соматической гибридизации в норме нескрещивающихся видов растений еще не решена. Даже если будут разработаны удобные методы отбора соматических клеток, останутся проблемы генетической и физиологической несбалансированности. Наиболее вероятно, что слиянием протопластов в практической селекции будут пользоваться только для переноса отдельных хромосом или хромосомных фрагментов, которые удается сохранить после ряда делений и спонтанной элиминации хромосом одного из видов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 213 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов Слияние протопластов – парасексуальная гибридизация. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние протопластов – своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая, гибридизация [11]. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински. Техника парасексуальной гибридизации может позволить: – скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов); – получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого; – слияние трех и более клеток; – получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей; – перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение; – получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др. Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков – скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т.д. Наличие косегрегации генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов. Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических. При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 г., протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах формируются агрегаты из 2-3 протопластов либо цепочки из 5-6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток обуславливает возвращение сферической формы у слившихся протопластов. В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, способствуя их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт. Чаще для индукции слияния протопластов используют методику ПЭГ – высокие значения рН – высокая концентрация Са2+, которая дает до 50 % Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 214 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов слившихся протопластов (рН – 9–11, концентрация Са2+ – 100–300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция – их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой. При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния – АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов. Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флуоресценции – желто-зеленый и красный. Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 г. (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Р.Г. Бутенко в 1975 г. Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной: 1. Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений. 2. Внеядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов. 3. Возникают гибридные клетки и растения в результате слияния более чем двух родительских клеток. Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид – продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цитоплазматический гибрид) – растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток про Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 215 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов водится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках. При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы. Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения-регенеранты. В результате соматической гибридизации можно получить межвидовые, межродовые, межтрибные, межсемейственные, межцарственные отдаленные гибриды. Для отдаленных гибридов характерно: 1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей. 2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом). 3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток. 4. Ограниченная морфогенетическая способность. Конструирование клеток. Протопласты широко используются в качестве реципиентов для клеточных органелл. В 1973 г. И. Потрикусс и Ф. Хоффман успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты табака. Ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт можно несколькими методами: – использованим в трансплантации сэндвич-метода в условиях слабого деплазмолиза протопласта; – переносом клеточных органелл посредством липосом; – слиянием одно- и многоламелльных частиц с мембранами протопластов, в присутствии таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д.; – переносом органелл путем микроинъекций. Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью, т.е. наличием собственной ДНК и способностью делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может ис- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 216 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.9. Культура протопластов пользоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения. Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл, поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты – фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цитоплазматического материала (микропротопласты). Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим конструированием следует понимать не только введение отдельных органелл. Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический материал, как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом. Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроорганизмов, создавая таким образом искусственные ассоциации. Однако необходимо учитывать и следующее явление (по аналогии с сомаклональной изменчивостью): у растений, регенерировавших в результате культивирования протопластов, также проявляется изменчивость. Ее называют протоклональной изменчивостью, а регенерировавшие растения – протоклонами. Спектр изменчивости у протоклонов выражен в большей степени, чем у сомаклонов, так как протопласты в большей степени, чем клетки, подвержены воздействиям экзогенных факторов, спектр которых более широк [11]. 4.10. Культура гаплоидных тканей Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Уровень спонтанного возникновения гаплоидов очень низкий – примерно один гаплоид на 105–106 растений. Для повышения частоты образования гаплоидов используют разные приемы: – воздействуют на процессы опыления и оплодотворения радиационным излучением или химическими веществами; – опыляют растения чужеродной пыльцой, индуцирующей к развитию неоплодотворенную яйцеклетку; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 217 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.10. Культура гаплоидных тканей – выполняют отдаленные скрещивания с такими генотипами, когда обеспечивается двойное оплодотворение, но в процессе развития зародышей происходит элиминация хромосом опылителя, что приводит к развитию гаплоидного зародыша материнского генотипа (метод гаплопродюссера); – культивируют изолированные пыльники; – культивируют неоплодотворенные завязи и семяпочки. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. По внешнему виду гаплоиды сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение. Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений. Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная ее проблема – низкая совместимость или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эффективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах; каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и регенерация растений из каллусных тканей. 4.10.1. Культура пыльников Известны несколько методов создания гаплоидов в культуре изолированных тканей растений, имеющих свои преимущества и недостатки: 1) использование (введение в культуру) гаплоидных тканей нативного растения (пыльники, пыльцевые зерна, семяпочки); 2) гаплопродукции – создание условий для получения гаплоидной ткани на интактном растении (отдаленная гибридизация, приводящая к элиминации (абортированию) одного из родительских генотипов), а затем доращивание недоразвитого семени или зародыша. Гут и Магешвари, впервые занявшиеся культурой пыльников, вызвали рост гаплоидных клеток действием кинетина, а рост диплоидных клеток – включением в среду ауксина, индолилуксусной кислоты (ИУК) с кинетином. Затем последовали сообщения разных авторов о получении ими гаплоидов риса, рапса, ячменя, паслена черного, томата, эгилопсов, спаржи и других культур. В 70-х гг. из пыльцевых зерен уже получили гаплоиды 23 видов 5 семейств и 4 межвидовых гибрида. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 218 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.10. Культура гаплоидных тканей В процессе культивирования пыльников в условиях in vitro имеет место андрогенез – развитие эмбриоидов, а затем и растений из мужских половых клеток (микроспор). Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу. Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1 /2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества, неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов, ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей, в питательные среды добавляют активированный уголь. Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре о 4–6 С в течение 2–8 сут. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре (25+2) оС. На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидный зародыш (сначала формируется 40–50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики. В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов) [10] (рис. 4.16), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты. Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по ряду морфологических признаков. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов, и растений-регенерантов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 219 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.10. Культура гаплоидных тканей Рис. 4.16. Схема формирования андрогенных эмбриоидов Как показали опыты, таким способом образуются не только гаплоидные, но и диплоидные и полиплоидные растения. Первые формируются из микроспор или из каллуса микроспоры, а диплоиды – из спонтанно удвоенных ядер, из клеток гаплоидного каллуса. Пыльники капусты благоприятно реагируют на смесь кинетина и 2,4-Д, пыльники риса – на 2,4-Д или 1-нафтилуксусную кислоту (НУК). Исключительно активный рост пыльцы индуцирован у дурмана и рода Brassica кокосовым молоком, а у дурмана – и соком сливы. Эти продукты оказались для названных растений эффективнее, чем какие-либо синтетические индукторы. У многих видов наилучший выход микроспор обеспечивается при предобработке культивируемых пыльников низкими температурами. У ячменя, например, обработка в течение 7–14 дней при 7 оС дает оптимальные результаты. 4.10.2. Использование гаплопродюссеров и отдаленной гибридизации при получении гаплоидных тканей Отдаленная гибридизация – важный метод формообразования и улучшения существующих сортов. Основная его проблема – низкая совместимость или полная несовместимость скрещиваемых видов. Для ее преодоления эффективны различные модификации методов культуры тканей: своевременное изолирование и доращивание гибридных зародышей на питательных средах; каллусогенез при культивировании незрелых гибридных зародышей и регенерация растений из каллусных тканей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 220 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.10. Культура гаплоидных тканей Недостатки отдаленной гибридизации можно превратить в достоинства и использовать их в позитивных целях, например, для получения гаплоидных тканей. Дело в том, что при отдаленной гибридизации очень часто образуется неполноценный (гаплоидный) потомок, поскольку генотип одной из родительских форм часто не сливается с другим родительским геномом и абортируется. В результате этого образуется гаплоидная клетка, а развивающийся из нее зародыш оказывается щуплым, невыполненным, мало способным к формированию полноценного растения, что можно исправить с помощью культуры тканей. Для ячменя успешно используется метод гаплопродукции на основе межвидовой гибридизации культурного ячменя (Н. vulgare) с луковичным – Н. bulbosum. Показаны преимущества этого метода в сравнении с культурой пыльников. Существенное влияние на эффективность гаплопродукции оказывает ряд факторов: генотип исходных форм, степень дифференцировки незрелых гибридных зародышей, обработка гибридных колосьев растворами физиологически активных веществ, сроки посева и опыления исходных форм, состав питательных сред для доращивания зародышей способы колхицинирования и др. Для получения гаплоидов пшеницы материнскими формами служат сорта и линии яровой и озимой пшеницы, в качестве опылителей используют Т. timopheevi, T. militinae, Т. tuigidum, Т. dicoccum, овес Ae. ovata, Ae. triaristata, рожь Памирская и др. – источники комплексной устойчивости к болезням и абиотическим стрессам, высокобелковости. В зависимости от комбинации завязываемость зерен варьирует от 0 до 66,4 %. In vitro прорастает от 5 до 100 % зародышей, регенерация зеленых растений составляет от 5 до 93,8 %. Использование таких подходов – действенный инструмент обогащения генофонда культурных растений и создания новых сортов. Дигаплоиды столового картофеля получают путем опыления сортов пыльцой примитивных культурных диплоидных видов, способных индуцировать гаплопартеногенез. Из пыльцы полученных дигаплоидов в культуре микроспор отбирают формы со спонтанно удвоенными наборами хромосом и выраженными благоприятными генами, которые затем попарно скрещивают между собой. Слитые протопласты гибридов, сочетающие благоприятные гены, дают тетраплоиды с заданным генотипом. Установлены некоторые причины нежизнеспособности гибридных семян. Удачным развитием этих работ стало использование метода эмбриокультуры для повышения эффективности отдаленной гибридизации. Для получения в культуре гаплоидных тканей фертильных растенийрегенерантов вводится дополнительный этап – удвоение хромосом. Для удвоения числа хромосом гаплоидов (диплоидизации) используют колхицин, антибиотики, декапитацию (срезание) верхушек; нередко самоудвоение наблюдают в культуре каллуса при эндомитозе. Образующиеся диплоидные клетки «забивают» гаплоидные и анеуплоидные ввиду более энергичного деления и роста. Растения, регенерировавшие из таких клеток и тканей, называют дигаплоидами. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 221 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.10. Культура гаплоидных тканей 4.10.3. Возможности гаплоидных технологий Гаплоидные растения представляют интерес для генетики и селекции, так как каждый ген у гаплоида представлен единственным аллелем и рецессивные аллели у таких растений проявляются наряду с доминантными. Фенотип гаплоида полностью отражает их генотип, поэтому среди таких растений удобно отбирать формы с ценными мутациями. Гаплоидная технология, отдаленная гибридизация с последующей эмбриокультурой, клеточная селекция, клональное микроразмножение, основанные на культивировании клеток, тканей и органов, уже вносят реальный вклад в селекцию растений. Гаплоидные технологии значительно расширяют возможности селекции. Главное преимущество выращивания растений из пыльцы – быстрое создание чистых линий, что особенно важно для двудомных видов и облигатных перекрестников. Для планируемых скрещиваний селекционеры могут поддерживать родительские формы в культуре ткани вегетативно. В селекции на гетерозис создание линий не требует нескольких лет инбридинга. Выращивание гаплоидов in vitro позволяет получать гомозиготные константные линии из гетерозисных гибридных популяций в короткие сроки и тем самым ускорять отбор положительных вариантов. Возможна оценка перспективных популяций на ранних этапах селекционного процесса. К тому же гаплоидные клетки удобны для решения многих задач теоретического плана и для генно-инженерных манипуляций. От изучения гаплоидных клеточных линий генетики надеются получить более точные данные о природе генных мутаций и цитоплазматической наследственности. 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам Культура растительных клеток и тканей представляет собой биологическую систему, в которой отсутствуют регуляторные механизмы, действующие на уровне целого организма. Исследования, проведенные на однородном клеточном материале, наряду с пониманием иерархии систем регуляции физиологических процессов позволяют получить более определенные результаты по анализу действия абиотических и биотических стрессовых факторов на растительную клетку. Это отвечает требованиям современного селекционного процесса, где неотъемлемым элементом является повышение устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. Традиционная селекция ведется на уровне организмов, но процесс эффективно ускоряется при использовании тканевых и клеточных культур. В условиях in vitro можно задавать различные параметры, адекватные тем, в каких позже придется жить взрослым растениям, в том числе и экстремальные условия выращивания. В культивируемых in vitro клеточных популяциях обнаружена тенденция к высокой наследственной изменчивости ка- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 222 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам чественных и количественных свойств клеток. Особый интерес у исследователей вызывают работы по получению растений-регенерантов из каллусных и суспензионных культур, прошедших отбор в стрессовых условиях. Отбор на селективных средах может быть прямой и непрямой. Прямая селекция заключается в том, что в питательную среду добавляют в качестве селективных агентов факторы, к которым необходимо получить устойчивые линии, – повышенное содержание солей – NaCl, Na2SO4, AlCl3, K2SO4; водный стресс, отсутствие O2; продукты метаболизма фитопатогенов и т.д. Непрямая селекция заключается в получении растений, синтезирующих защитные соединения при этих стрессовых факторах. Предложена следующая схема получения устойчивых линий клеточных культур: воздействие стрессора на культуру клеток будет приводить к частичной гибели популяции, но часть клеток может выжить, причем тем меньшая часть, чем сильнее стрессовое действие. Выжившие клетки переносят на свежую питательную среду, и культура будет толерантной к этому стрессору. 4.11.1. Использование токсинов фитопатогенов в отборе форм растений, устойчивых к болезням Традиционных методов селекции недостаточно, чтобы улучшить генофонд растений в направлении устойчивости к наиболее опасным патогенам; требуются новые подходы, которые в сочетании с классическими методами позволили бы добиваться дальнейших успехов в создании новых устойчивых к биотическим стрессам, особенно к болезням, сортов сельскохозяйственных культур. Один из таких подходов – использование клеток и тканей растений для создания исходного для селекции на устойчивость к инфекционному стрессу материала. Имеется много примеров реализации таких подходов. Клеточную селекцию моркови проводили с использованием культурального фильтрата гриба Alternaria radicina, для чего применяли различные схемы селекции. Для формирования растений проростки переносили в пробирки на жидкую и агаризованную питательные среды. Растения-регенеранты контрольного варианта и полученные после клеточной селекции были проверены на устойчивость к патогену A. radicina. Для этого растения из пробирок были помещены на питательную среду, содержащую 95 %-й культуральный фильтрат гриба. Растения, полученные после клеточной селекции, обладали повышенной устойчивостью к метаболитам гриба А. radicina. К настоящему времени созданы линии картофеля, томатов, пшеницы, моркови, риса, устойчивые, соответственно, к фитофторозу, альтернариозу, септориозу, ирукуляриозу и т.д., где в качестве селективного фактора используется культуральный фильтрат гриба. Особую актуальность приобретают научные работы, посвященные селекции на устойчивость к корневым гнилям зерновых, из-за широкого распространения и высокой вредоносности данной болезни. В отборе форм ярового ячменя, устойчивых к корневым гнилям и перспективных для селекции на устойчивость к данному заболеванию в условиях Восточной Сибири, ис Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 223 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам пользовано однократное добавление токсических метаболитов корневых гнилей (20 %) в селективные среды на стадии пролиферации каллусных тканей. Выжившие каллусы обладали способностью к стеблегенезу и ризогенезу. Полученные на их основе растения регенеранты в своем большинстве отличались устойчивостью к поражению возбудителями корневой гнили. 4.11.2. Выделение солеустойчивых форм растений путем прямой и непрямой селекции в культуре ткани Одним из факторов внешней среды, которые приводят к значительному снижению урожайности многих сельскохозяйственных культур, является засоленность почв. В связи с общим ухудшением экологической обстановки в мире и широким применением искусственного орошения возрастает потребность в селекции солетолерантных форм растений. В частности, такая проблема весьма актуальна и для районов рисосеяния. Скрининг уже имеющихся в местных сортах и популяциях вариантов дает положительные результаты, но существует необходимость дальнейшего повышения солеустойчивости риса, которая в целом значительно ниже, чем у других зерновых, например пшеницы и ячменя. Механизмы солетолерантности еще недостаточно изучены, несмотря на большое количество исследований. Затрудняет селекцию солетолерантных растений и значительная вариабельность типов засоленности. Большие возможности для изучения стрессоустойчивости (в том числе и солеустойчивости) дает применение культуры растительных клеток. Как правило, при прямом отборе солетолерантных клеточных линий используют питательные среды, содержащие в качестве селективных агентов какую-либо соль. У ряда культур уже получены путем прямой селекции клеточные линии и растения-регенеранты, обладающие свойством солеустойчивости и сохраняющие его при регенерации и семенном размножении. Кроме прямого отбора возможны и непрямые методы селекции на устойчивость к стрессам (в том числе и к засолению). Хорошо известна, например, защитная роль пролина при воздействии на бактериальные и растительные клетки ряда неблагоприятных факторов внешней среды: холодового и теплового шока, водного стресса, повышенного содержания солей и др. В связи с этим представляет интерес получение клеточных линий растений, способных в ответ на стрессовые воздействия накапливать значительные количества пролина, обеспечивая таким образом неспецифическую защиту организма. Процесс селекции устойчивых вариантов в культуре тканей растений обычно состоит из двух основных этапов: собственно отбора устойчивых клеточных линий на соответствующих селективных средах и регенерации растений из полученных клеточных вариантов. Путем прямой селекции на среде, содержащей 1 % хлористого натрия, получена серия регенерантов. Для проведения селекции стрессоустойчивых вариантов риса непрямым путем, т.е. путем отбора устойчивых к аналогам пролина клеточных линий с последующей регенерацией растений, была изучена чувствительность каллусных культур риса дикого типа к двум его ана Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 224 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам логам. При этом обнаружена чрезвычайно высокая устойчивость исходных каллусных линий риса к обоим аналогам. Удалось получить солетолерантные каллусные линии и растения риса путем прямой (отбор и регенерация на NaCl-содержащих средах) и непрямой (на средах с аналогами пролина) селекции в культуре ткани нескольких сортов риса, несмотря на обнаруженную чрезвычайно высокую естественную устойчивость каллусной культуры риса к аналогам пролина. В Красноярском НИИСХ разработаны технологии создания регенерантов ячменя в культуре незрелых зародышей с использованием стадии каллусных тканей и селективных сред (высокие концентрации соли и низкие рН) и получены десятки линий-регенерантов, у которых подтверждена устойчивость к засолению и кислотности почв. Однако применение селекции позволяет получать клеточные линии и растения, обладающие защитой от солевого стресса. Особенно перспективен этот подход к сортам, имеющим низкую солеустойчивость, так как такой метод повышает общую неспецифическую защиту клетки и значительно увеличивает ее устойчивость стрессам организма. Одним из методов получения мутантов с повышенным синтезом аминокислот является отбор вариантов, устойчивых к соответствующим аналогам. Ранее путем селекции на устойчивость к одному из аналогов пролина – L-азетидин-2 карбоновой кислоте – были получены солетолерантные клеточные линии табака и сои. Выделенные регенеранты отвечали повышенным синтезом пролина при помещении в среды с NaCl и обладали повышенной осмостойкостью. Другим аналогом пролина является L-оксипролин, который также позволяет получить солеустойчивые растения [15]. Выработка у растений солеустойчивости важна не только в сельском хозяйстве, но и хозяйстве городском. Применение противогололедных реагентов, в частности, технической соли, на улицах городов неблагоприятно для роста и развития растений. Используя культуру in vitro на селективных средах можно в течение короткого времени провести скрининг больших популяций клеток овсяницы и полевицы – основных газонных трав на признак солеустойчивости. Отмечается наследование толерантности к NaCl и перекрестная устойчивость к бишофиту (MgCl2) – основной противогололедной соли [16]. Также применяются новые селективные среды с ионами Ва2+ для отбора солеустойчивых клеточных линий [17]. 4.11.3. Отбор холодоустойчивых форм В настоящее время актуальной проблемой является повышение устойчивости теплолюбивых растений к действию пониженных положительных температур (холодоустойчивости). Известно много работ, в которых показано повышение холодоустойчивости посредством химических или физических воздействий. Однако имеются лишь единичные работы, использующие методы и технологии in vitro в целях получения холодоустойчивых форм теплолюбивых растений. В условиях in vitro можно задавать различные пара Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 225 ГЛАВА 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ 4.11. Получение растений, устойчивых к различным стрессовым факторам метры, адекватные тем, в каких позже придется жить растениям, в том числе и экстремальные условия выращивания, например пониженные температуры. Это также одна из реальных задач в сельском хозяйстве, так как ее решение позволит успешно культивировать растения в районах с частыми весенними заморозками. Таким способом созданы более холодоустойчивые линии табака, риса, томата. Каллусные культуры получали из различных частей стерильных этиолированных растений огурца. Холодовое повреждение (жизнеспособность) клеток каллусных тканей определяли по восстановлению трифенилтетразолия хлорида, по прижизненному окрашиванию метиленовым синим с последующим подсчетом числа живых и мертвых клеток в гемоцитометре (камере Фукса – Розенталя) и по приросту каллусной ткани в течение 10 дней после охлаждения. В качестве критерия жизнеспособности растительных клеток использовали состояние их митохондрий, оцениваемое по восстановлению ТТХ. Из каллусов первого пассажа, выдержанных в течение 24 ч при оптимальной (25 °С) и пониженной (3 °С) температуре, экстрагировали продукт восстановления ТТХ – формазан. Поскольку различные органы теплолюбивых растений обладают неодинаковой холодовой чувствительностью, предполагали, что и каллусные линии, полученные из этих органов и сохраняющие эпигенетические особенности, различаются по чувствительности к охлаждению. Для оценки соотношения живых и мертвых клеток в клеточных культурах использовали также прижизненное окрашивание красителями с последующим подсчетом окрашенных и неокрашенных клеток. Способность растительных клеток переносить действие стресса отражается в образовании новой каллусной ткани после переноса в оптимальные условия. Через 10 сут после сублетального охлаждения (3 °С, 24 ч) каллусов первого пассажа измеряли параметры роста линий различного происхождения. Каллусы, полученные из семядольных листьев, показали наибольший прирост линейных размеров. Наименьший прирост к исходному размеру наблюдали у охлажденных каллусных линий, полученных из гипокотиля. Это, вероятно, также связано с эпигенетическими особенностями клеток культур. Измерения чувствительности к охлаждению каллусных линий в I–IV пассажах позволили выявить тенденцию к постепенному повышению холодоустойчивости. В результате систематически действующего стрессового фактора происходит адаптация клеточных культур к пониженным температурам и повышение жизнеспособности клеток после стрессового воздействия. Все исследованные факторы (различные экспланты и условия выращивания) оказывают существенное влияние на холодоустойчивость каллусных линий. Сравнивая устойчивость каллусов различного происхождения, можно заключить, что наиболее устойчивыми к пониженным температурам являются каллусные линии, полученные из семядольных листьев и апикальной зоны побега. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 226 Г ЛА В А 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века Разработка и освоение новых, экологически чистых материалов, включающихся в биосферные круговоротные циклы, соответствует концепции экологически безопасного устойчивого промышленного развития. В «Повестке дня XXI века», принятой в 1991 г. на специальной конференции ООН по окружающей среде и развитию, акцентировано внимание на необходимость разработки и внедрения новых экологически безопасных технологий и материалов [1]. Связано это с тем, что охрана окружающей среды является неотъемлемым компонентом устойчивого развития. Помимо того, что в результате активной хозяйственной деятельности в настоящее время под угрозой находятся все биотические и абиотические компоненты окружающей среды, в Повестке дня отмечается, что на фоне увеличения населения планеты во все более широком масштабе возрастает производство и потребление химических веществ. В связи с этим неуклонно увеличивается количество проблем, связанных с охраной окружающей среды. Несмотря на все возрастающие усилия по предотвращению накопления отходов и содействию их рециркуляции, масштабы ущерба, причиняемого окружающей среде в результате чрезмерного потребления, количество образующихся отходов и степень неустойчивого землепользования по-прежнему увеличиваются. Среди провозглашенных Повесткой дня приоритетов программы обозначена необходимость «… предотвращения, прекращения и обращения вспять процесса деградации окружающей среды с помощью соответствующих методов использования биотехнологии и других технологий при одновременном обеспечении процедур безопасности как одного из неотъемлемых компонентов настоящей программы». Конкретные цели предусматривают скорейшее осуществление конкретных программ, содержащих конкретные задачи: 1) применение производственных процессов, предусматривающих оптимальное использование природных ресурсов на основе рециркуляции биомассы, регенерации энергии и минимизации производства отходов; 2) поощрение применения биотехнологий с уделением особого внимания биологическому восстановлению земельных и водных ресурсов, обработке отходов, охране почв, лесовосстановлению, лесонасаждению и восстановлению земель; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 227 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века 3) использование биотехнологий и биотехнологической продукции для сохранения целостности окружающей среды с целью обеспечения долгосрочной экологической безопасности. Для успеха реализации целей, намеченных «Повесткой дня XXI века», необходимо содействие и объединение усилий соответствующих международных и региональных организаций, частного сектора, неправительственных организаций, а также академических и научных учреждений, деятельность которых должна включать следующие направления: – разрабатывать экологически безопасные альтернативные варианты производственной деятельности и совершенствовать производственные процессы, наносящие ущерб окружающей среде; – разрабатывать практические методы минимизации спроса на экологически нерациональные синтетические химические вещества и максимального использования экологически устойчивой продукции, в том числе органической; – изыскивать пути сокращения образования отходов, обработки отходов перед удалением и использование материалов, поддающихся биологическому распаду; – разрабатывать методы удаления веществ, загрязняющих окружающую среду; – поощрять применение новых биотехнологий в интересах экологически устойчивого освоения минеральных ресурсов. Развитие науки и техники приводит к все более широкому внедрению высокомолекулярных полимерных соединений синтетического, а также природного происхождения. Разнообразие полимеров, варьирование в широких пределах их стереоконфигурации и молекулярной массы, возможность получения композитов в разнообразных сочетаниях с различными веществами, – все это является основой для получения широчайшего спектра новых материалов с новыми ценными свойствами. Полимерные материалы необходимы для различных сфер человеческой деятельности. Синтетические полимерные материалы стали неотъемлемой частью современной жизни; они заменяют сегодня сталь, древесину и стекло. По прогнозам, потребление этих материалов на душу населения увеличится к 2010 г. в США, Западной Европе и Японии с 24,5 кг до 37,0 кг. Все возрастающее использование человеком синтетических пластмасс стало глобальной экологической проблемой. 5.1.1. Полимеры: определение, виды, области применения Термин «полимер» состоит из слов: «поли» – много и «мер» – единица, таким образом, полимер – это молекула, состоящая из множества единиц. По отношению к воздействию температуры полимеры подразделяются на два типа: термоотверждаемые и термопластичные. Термопластичные полимеры могут быть использованы для получения изделий различной конфигура Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 228 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века ции из расплавов путем формования, прессования, экструзии. Термопласты не имеют межмолекулярных связей и, как правило, состоят из линейных полимерных цепей. Термоотверждаемые полимеры полимеризуются, приняв свою окончательную форму и не могут быть переформованы с целью изменения формы в результате нагрева. Как правило, полимерные цепи в этом типе полимеров имеют ковалентные межмолекулярные связи. В зависимости от способа получения, полимеры классифицируется как аддитивные (полимеры, полученные ступенчатой полимеризацией) и конденсационные. Аддитивные полимеры (полиэтилен, полиметилметакрилат) синтезируются в реакции присоединения свободного радикала из ненасыщенных мономеров, содержащих двойные углеродно-углеродные связи. Конденсационные полимеры образуются путем совместной реакции двух полимеров, в результате которой выделяется вещество с небольшим молекулярным весом, например вода. Примерами конденсационных полимеров являются полиамиды. Некоторые конденсационные полимеры могут подвергаться гидролизу в организме и разрушаться. Термин «полимерные материалы» является обобщающим. Он объединяет три обширных группы синтетических пластиков, а именно: полимеры; пластмассы и их морфологическую разновидность – полимерные композиционные материалы (ПКМ) или, как их еще называют, армированные пластики. Общее для перечисленных групп то, что их обязательной частью является полимерная составляющая, которая и определяет основные термодеформационные и технологические свойства материала. Полимерная составляющая представляет собой органическое высокомолекулярное вещество, полученное в результате химической реакции между молекулами исходных низкомолекулярных веществ – мономеров. Полимерами принято называть высокомолекулярные вещества. Физически полимеры являются гомофазными материалами, они сохраняют все присущие гомополимерам физико-химические особенности. Пластмассами называются композиционные материалы на основе полимеров, содержащие дисперсные или коротковолокнистые наполнители, пигменты и иные сыпучие компоненты. Наполнители не образуют непрерывной фазы. Они располагаются в полимерной матрице. Физически пластмассы представляют собой гетерофазные материалы с изотропными (одинаковыми во всех направлениях) физическими макросвойствами. Пластмассы могут быть разделены на две основные группы – термопластические и термореактивные. Термопластические пластмассы после формирования могут быть расплавлены и снова сформованы; термореактивные, сформованные раз, уже не плавятся и не могут принять другую форму под воздействием температуры и давления. Почти все пластмассы, используемые в упаковках, относятся к термопластическим, например, полиэтилен и полипропилен (члены семейства полиолефинов), полистирол, поливинилхлорид, полиэтилентерефталат, найлон (капрон), поликарбонат, поливинилацетат, поливиниловый спирт и др. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 229 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века Наиболее распространенными полимерами углеводородной природы являются полиэтилен и полипропилен. Полиэтилен получают полимеризацией этилена; полипропилен – стереоспецифической полимеризацией пропилена (пропена). Полиолефины – это класс полимеров одинаковой химической природы (химическая формула – (СН2)-n) с разнообразным пространственным строением молекулярных цепей, включающий в себя полиэтилен и полипропилен. В мире ежегодно производится порядка 180 млн т полимеров, полиолефины составляют примерно 60 % от этого количества. В будущем полиолефины будут окружать нас в гораздо большей степени, чем сегодня. Комплекс свойств полиолефинов, в том числе такие, как стойкость к ультрафиолету, окислителям, к разрыву, протыканию, усадке при нагреве и к раздиру, меняется в очень широких пределах в зависимости от степени ориентационной вытяжки молекул в процессе получения полимерных материалов и изделий. Около 60 % всех пластиков, используемых в настоящее время для упаковки – это полиэтилен, главным образом благодаря его низкой стоимости, но также благодаря его отличным свойствам для многих областей применения. Полиэтилен высокой плотности (ПЭНД – низкого давления) имеет самую простую структуру из всех пластиков, он состоит из повторяющихся звеньев этилена. -(CH2CH2)n- полиэтилен высокой плотности. Полиэтилен низкой плотности (ПЭВД – высокого давления) имеет ту же химическую формулу, но отличается тем, что его структура разветвленная. -(CH2CHR)nполиэтилен низкой плотности, в котором R может быть -H, -(CH2)nCH3 или более сложной структурой с вторичным разветвлением. Самым крупным направлением переработки пластмасс является производство тары и упаковки. Удельный вес этого сегмента в РФ в объемах потребления пластмасс сопоставим с показателями в Европе (38 %) и США (29 %). Наибольшим спросом на внутреннем рынке пользуются тара и упаковка из полиэтилена и полиэтилентерефталата. Следом идут упаковочные материалы на основе полипропилена, полистирола и поливинилхлорида. В России обеспечение спроса внутреннего рынка на тару и упаковку осуществляется в основном за счет отечественных производителей. Экспортная составляющая в суммарном спросе на продукт невелика. У рынка полимерной тары и упаковки есть дальнейшие перспективы развития, обусловленные как наращиванием объемов производства, так и улучшением качества продукции. Среднегодовые темпы роста внутреннего спроса на тароупаковочные материалы в РФ в перспективе до 2015 г. прогнозируются на уровне 4,5 %. Рынок промышленных изделий из пластмасс является быстроразвивающимся, среднегодовые темпы роста потребления изделий производственного назначения составляют 12 %. Эта тенденция относится не только к промышленной упаковке, но и к полиэтиленовым пакетам. Общая емкость рынка синтетической упаковочной пленки в России составляет свыше 100 тыс. т/год. Области применения пластмасс широки и включают практически все сферы человеческой деятельности (сельское и коммунальное хозяйство, строительство, транспорт, медицину); основная область применения пласт Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 230 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века масс – тара и упаковочная продукция, включая затаривание пищевых продуктов и напитков. На Российском рынке сформировались следующие основные сегменты продукции из пластмасс в период с 2000 по 2007 гг.: тара и упаковка с долей 30–40 %, изделия и детали производственного назначения – 15–18 %, пленки – 16–17 %, профильно-погонажные изделия – 5–18 %, изделия культурно– бытового и хозяйственного назначения – 10–14 %, трубы – 4–9 %, листы – 2–3 %. Крупнейшими потребителями изделий из пластмасс являются: строительство – 26 %, производство упаковочных материалов для пищевых продуктов – 25 %, домашние хозяйства – 10 %. Среднегодовые темпы роста спроса внутреннего рынка на период до 2015 г. на изделия из пластмасс составят 6,0–10,0 %. Рис. 5.1. Прогноз развития рынка потребления различных типов пластиков в 2007–2011 гг., тыс. т (представлено с учетом данных «European Bioplastics»): – синтетические, биоразрушаемые; – биопластики, не биоразрушаемые; – биопластики, биоразрушаемые По прогнозам, рост потребления пластиков неизбежен, при этом наибольший прирост объемов выпуска, как полагают, придется на новый вид пластиков – разрушаемые биопластики. На рис. 5.1 с использованием данных рабочей группы «European Bioplastics» представлены ситуация и прогноз по развитию рынка пластасс разных типов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 231 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века 5.1.2. Проблема накопления и пути утилизации полимерных отходов Синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен, полиуретан) совершили революцию в нашем образе жизни, но их применение создает ряд проблем. Во-первых, синтетические полимеры получают из невозобновляемых ресурсов; во-вторых, – применение не разрушаемых в природной среде пластиков и их накопление ведут к загрязнению окружающей среды и создают глобальную экологическую проблему. Объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс, главным образом полиолефинов (полиэтиленов и полипропиленов), получаемых в процессах нефтеоргсинтеза огромны, к настоящему моменту они достигли 180 млн т в год и ежегодно возрастают примерно на 25 млн. При этом основная их часть складируется на свалках, так как повторной переработке в развитых странах подвергается не более 16–20 %. В настоящее время для очистки окружающей среды от пластмассовых отходов активно разрабатываются два основных подхода: захоронение и утилизация. Захоронение пластмассовых отходов – это «бомба замедленного действия» и перекладывание сегодняшних проблем на плечи будущих поколений. Кроме того, под полигоны и свалки твердых бытовых отходов ежегодно отчуждается до 10 тыс. га земель, в том числе и плодородных, изымаемых из сельскохозяйственного оборота. Возможные пути сокращения гигантских отходов синтетических пластиков – это утилизация, которую можно разделить на ряд главных направлений: сжигание, пиролиз, рециклизация и переработка. Однако как сжигание, так и пиролиз отходов тары и упаковки и вообще пластмасс кардинально не улучшают экологическую обстановку. Более того, сжигание – это дорогостоящий процесс, к тому же еще и приводящий к образованию высокотоксичных, а также супертоксичных (таких, как фураны и диоксины) соединений. Повторная переработка пластмасс в определенной степени решает этот вопрос, но это требует значительных трудовых и энергетических затрат, так как для этого необходимы следующие действия: отбор из бытового мусора пластической тары и упаковки, разделение собранных отходов по виду пластиков, мойка, сушка, измельчение и только затем переработка в новое полимерное изделие. Необходимость проведения мероприятий для рециклизации пластмассовых отходов, в особенности из тары и упаковки, в ряде стран закреплена законодательно. В странах ЕС законодательные инициативы и акты обязывают производителей пластмассовой упаковки использовать при этом до 15 % в качестве сырья вторичные пластмассы. Так, для Германии эта квота составляет 50 % и должна увеличиться до 60 %. Связано это с тем, что захоронение и сжигание не решают проблемы рецикла многомиллионных синтетических отходов, и их аккумуляция в биосфере грозит глобальной экологической катастрофой. Переход на новые типы материалов, которые разрушаются в природной среде естественным путем до безвредных продуктов, становится насущной проблемой. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 232 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века Переход на такие материалы в настоящее время становится все более предпочтительным по мере роста цен на нефть и другие виды нефтехимического сырья. Полимеры, получаемые из природного сырья или синтезируемые микроорганизмами (так называемые биополимеры, или биопластики), в отличие от нефтепродуктов, практически не вносят вклад в пополнение парниковых газов и глобальное потепление. Одним из преимуществ использования биоразлагаемых полимеров на биооснове – помочь обновить «углеродный цикл» или «реинкарнацию углерода» (рис. 5.2). Полимеры из нефти также могут рассматриваться как возобновляемые, так как потребуется более миллиона лет для превращения растительной биомассы в ископаемые источники топлива, которые используются в качестве сырья в производстве синтетических полимеров. В связи с тем, что объемы потребления пластиков намного выше уровня восполнения ископаемых углеродсодержащих ресурсов, в «углеродном цикле» возникает большой дисбаланс. Рис. 5.2. Цикл углерода полимеров, полученных из нефти, и биополимеров. Путь возобновляемых ресурсов (пунктирные стрелки); путь ископаемых (невозобновляемых) ресурсов (черные стрелки); путь возобновляемых и невозобновляемых ресурсов (сплошные стрелки) Напротив, биодеградируемые полимеры, полученные из растительных возобновляемых материалов, таких как зерно и зерновой крахмал, могут быть произведены и превращены в биомассу за сравнимые временные промежутки (рис. 5.2). Поэтому страны, развивающие это направление, автоматически освобождаются от квот на выбросы, налагаемых Киотским протоколом. Так, Евросоюз взял на себя обязательства с 2008 по 2012 гг. сократить объем выбросов СО2 в атмосферу на 8 % относительно уровня 1990 г. Аналогичное обязательство приняла на себя и Япония, в этот период она планирует сократить выбросы углекислого газа на 6%. В 2000 г. ЕС приняла стандарт EN 13432, регламентирующий требования к биоразлагаемым полимерам. По решению Европейской Комиссии Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 233 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века №2001/524/WE он приведен в соответствие с директивой №94/62/WE. Стандарт внедряет критерии оценки и процедуры, касающейся возможности естественного гниения биоразлагаемых синтетических материалов в компостных ямах, а также их обработку без присутствия кислорода (т.е. рециклинг органических веществ, а не сжигание). На рис. 5.3 схематично представлен путь трансформации биополимеров в процессах компостирования. Экстракция Использование компоста для выращивания растений Сбор отходов Ферментация Полимеризация, конверсия Рис. 5.3. Схема производства, потребления и утилизации биополимеров, полученных из возобновляемых источников, включающая стадию компостирования: 1) путь от сбора урожая до получения продукта; 2) путь от сбора урожая до утилизации биополимеров; 3) путь от сбора урожая до сбора урожая Путь от урожая через получение, использование к переработке полимеров тем или иным способом можно образно назвать «от колыбели к могиле» [3]. Если продукт либо упаковка компостируются, образуется гумус и диоксид углерода. Диоксид углерода используется растениями в ходе фотосинтеза, а гумус возвращается в землю в качестве удобрений для получения питательных веществ, потребляемых растениями. Цикл процессов от сбора урожая до возвращения продуктов преобразования полимеров в землю для выращивания новой биомассы и до следующего сбора урожая относится к процессу «от колыбели к колыбели». Обычно после использования пластики, полученные из нефти, особенно пластики, используемые в упаковке и сельском хозяйстве, содержат примеси, снижающие возможность повторного использования; таким образом, они заканчивают существование на мусорных свалках, где влага и кислород присутствуют в небольшом количестве или Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 234 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.1. Освоение экологически чистых материалов – актуальное направление критических технологий XXI века совсем отсутствуют. Поэтому на мусорной свалке они разлагаются крайне медленно. Напротив, биоразрушаемые пластики под воздействием почвенных и водных микроорганизмов трансформируются до гумуса и далее до диоксида углерода и воды (конечных продуктов распада органики) в срок от несколько месяцев до десятков суток в ходе компостирования. Сроки, необходимые для разложения тароупаковочных материалов в естественных условиях, могут составлять многие годы и десятилетия. Разложение в природной среде синтетических полимерных материалов составляет десятки и сотни лет, в то время, как использование биополимеров приводит к значительному сокращению этих сроков. Скорость разложения материалов зависит от ряда факторов – вида полимера, влажности, температуры, светового воздействия, микробной составляющей среды и др. Наиболее высокой способностью к биодеструкции обладают полимеры, которые содержат химические связи, легко подвергаемые гидролизу. Присутствие заместителей в полимерной цепи часто способствует повышению биодеструкции, зависящей также от степени замещения цепи и длины ее участков между функциональными группами, гибкости макромолекул и т. д. На скорость разрушения полимеров влияет также величина их молекул. В то время как мономеры или олигомеры могут легко гидролизоваться и окисляться микроорганизмами, полимеры с большой молекулярной массой более стабильны. Биодеструкцию большинства технических полимеров инициируют процессы небиологического характера, такие как термическое и фотоокисление, термолиз, механическая деградация и т.п. Процессы биологической деструкции биопластиков могут протекать в аэробных условиях с образованием диоксида углерода и воды, а также в аноксигенной среде, без участия кислорода, с образованием метана и воды. Компостирование – преимущественно аэробный процесс и может рассматриваться как природный путь переработки отходов. Компост может производиться не только в больших масштабах на коммерческих компостирующих мощностях, но и в малом масштабе, например на заднем дворе небольшой фермы. Таким образом, утилизация синтетических материалов – огромная экологическая проблема, и рассматриваемые проекты как захоронения и компостирования, так и возможной реутилизации химических пластиков не оптимистичны [4, 5]. Полагают, что это технически невозможно, так как для транспортных и непищевых упаковок возможно применение до 25 % вторичных пластмасс, но не для упаковок пищевых продуктов. Нельзя не отметить, что сбор и повторная переработка полимерной тары и упаковки неизменно приводит к ее удорожанию, а качество рециклизованного полимера и изделий при этом снижается. Если предположить, что значительная часть тары и упаковки будет в будущем использована повторно, для этого необходимо знать, какая кратность переработки является допустимой и когда неизбежно изделия попадут на свалку. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 235 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов Радикальным решением проблемы «полимерного мусора», по мнению специалистов, является создание и освоение широкой гаммы полимеров, способных при соответствующих условиях биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. Именно биоразлагаемость высокомолекулярных соединений и будет тем приоритетным направлением, которое позволит исключить значительное число проблем «пластмассового мусора», возникающего при использовании полимерной тары и других изделий из неразрушаемых синтетических полимеров. Нельзя не отметить также, что, помимо глобальной экологической проблемы, связанной с накоплением полимерных отходов, необходимость перехода на разрушаемые пластики, получаемые из возобновляемых источников, диктуется экономической ситуацией. Связано это с тем, что до 98 % мирового объема полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья – нефти, газа, продуктов переработки угля, запасы которых истощаются. Критический рост цен на нефть и нефтепродукты, наблюдаемый в настоящее время, приводит к тому, что стоимость синтетических пластиков повышается. Так, за период с июня 2005 г. по июнь 2008 г. цены на нефть выросли с 53–54 до 130 дол. США за баррель и полипропилена, соответственно, с 940–950 до 1350–1400 дол. США за тонну (по данным фондовой биржи Нью-Йорка). Происходящий в настоящее время повсеместно рост цен на термопластичные пластмассы неизбежно приведет к повышению спроса на биопластики. По состоянию на второй квартал 2008 г. в Европе наибольший рост показал полипропилен, стоимость которого повысились на 25 евро/т. Цены на линейный ПВД, полиэтилен для выдувного формования и полиэтилен для инжекционного формования повысились на 10 евро/т, что не прогнозировалось. Пленочный полиэтилен ПВД и ПНД подорожали почти так же. Поливинилхлорид подорожал на 5 евро/т. Цены на полистирол возросли 20 евро за тонну. Производители полимеров предвидят, что последующий рост цен на нефть может послужить новым толчком к росту цен на контрактные поставки для этилена и пропилена. В цепочке потребления стирола также намечаются ценовые изменения. Производители планируют увеличить цены на полистирол на 70 евро/т и 150 евро/т на вспененный полистирол (ПСВ-С). На этом фоне необходимость перехода на новые типы материалов становится еще более востребованной. В настоящее время все большее значение приобретают экологичные материалы, получаемые из возобновляемого сырья, источником которого служит биомасса растений. Биополимеры представляют собой продукты синтеза на основе сахара, крахмала, целлюлозы, лигнина и растительных масел. В течение «жизненного цикла» биополимеров (от синтеза до полной деструкции) образуется значительно меньше углекислого газа, чем у синтетических пластмасс из нефтехимического сырья. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 236 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов Производство полимеров на основе растительного сырья – это путь сбережения энергии. Например, в сравнении с полиэтиленом при производстве тонны биопластика экономится от 12 до 40 ГДж энергозатрат. Биоразлагаемые пластики из натурального сырья облегчают проблему захоронения, компостирования пластиковых отходов, в частности тарных материалов, имеющих весьма короткий жизненный цикл и составляющих значительную часть твердых бытовых отходов. Наконец, развитие «зеленых» технологий способствует развитию агропромышленного комплекса. Все это служит основанием для бурного роста интереса в мире к биополимерам и биотопливу. В США распространено выражение «thinking outside the oil barrel» – думать за пределами нефтяного барреля, для русского уха привычнее «вне нефтяной трубы». Потребности мирового рынка во всевозможных полимерных материалах и изделиях из них продолжают быстро расти, особенно это касается Китая, Индии и других стран Юго-Восточной Азии. В Европе спрос на пластики растет более медленными темпами, там идет в основном структурная перестройка элементов производства полимеров и изделий из них. Оценка сложившейся ситуации по разработке и освоению биодеградируемых пластиков позволяет выделить три основных направления в этой области: – получение пластмасс на основе воспроизводимых природных полимеров, – придание биоразлагаемости широко используемым в настоящее время высокомолекулярным синтетическим материалам, – синтез биоразрушаемых полиэфиров гидроксикарбоновых кислот. 5.2.1. Перспективы получения и утилизации разрушаемых полимеров на основе возобновляемых природных источников Получение биопластмасс на основе природных биоразлагаемых полимеров типа крахмала, целлюлозы, хитозана или протеинов представляют собой, как правило, создание композиционных материалов с различными добавками. Так, для получения биоразрушаемой водорастворимой пленки из смеси крахмала и пектина в состав композиции вводят в качестве пластификаторов глицерин или полиоксиэтиленгликоль. Получаемые из таких композитов биоразлагаемые пленки используют в сельском хозяйстве и в качестве упаковки. Для снижения себестоимости материалов такого типа, как правило, используют неочищенный крахмал, смешанный с поливиниловым спиртом, тальком и другими добавками. Водостойкие биоразлагаемые композиции получают из смеси эфиров крахмала и полиоксиэтиленгликоля. Биоразлагаемые подгузники, гигиенические подушечки, хорошо впитывающие жидкость, получаются на основе гидрофильной композиции, содержащей деструктированный крахмал, пропитанный сополимером этилена с виниловым спиртом и алифатическими по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 237 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов лиэфирами. Пленка на основе такого материала обладает высокой прочностью, сохраняет свойства при выдержке при температуре 50 оС в течение 3 месяцев. Такая пленка используется в сельском хозяйстве для мульчирования и при упаковке пищевых продуктов. На основе крахмала фирма Biotec GmbH для различных областей применения производит компостируемые пластические массы (литьевой биопласт в виде гранул для литья изделий разового назначения; пеноматериалы для упаковки пищевых продуктов; гранулы для получения компостируемых раздувных и плоских пленок Biofle и др.). Высокая экологичность и способность разлагаться в компосте при 30 оС в течение 2 месяцев с образованием благоприятных для растений продуктов распада делает применение таких материалов весьма перспективным. В качестве возобновляемого природного биоразлагаемого начала при получении термопластов активно разрабатываются и другие композиты, – целлюлоза/хитин или целлюлоза/крахмал. Например, полимеры, полученные взаимодействием целлюлозы с эпоксидным соединением и ангидридами дикарбоновых кислот, полностью разлагаются в компосте за 4 недели. На их основе формованием получают бутыли, разовую посуду, пленки для мульчирования. Для придания более высокой биоразлагаемости материалам на основе сложных эфиров целлюлозы в композицию рекомендуется вводить полиэфиры лимонной кислоты либо ацетат целлюлозы, частично переэтерифицированный 6-гидроксикапроновой кислотой. Компостируемые материалы, получаемые из смеси растительных и натуральных исходных продуктов, где основным компонентом является целлюлоза или ее производные, широко применяются в настоящее время в качестве исходного сырья для изготовления одноразовых изделий для упаковки и предметов первой необходимости. В последнее время особое внимание разработчиков привлекают композиции, содержащие хитозан и целлюлозу. Из них получают биоразлагаемые пластики, пленку с хорошей прочностью и водостойкостью, когда в смеси содержится 10–20 % хитозана. Из тройной композиции – хитозан, микроцеллюлозное волокно и желатин – получают пленки с повышенной прочностью, способные разлагаться микроорганизмами при захоронении в землю. Природные белки или протеины также используются для получения биоразлагаемых пластиков, предназначенных для упаковки сухой и влажной пищи и др. Для получения биоразлагаемого упаковочного материала пищевых продуктов, парфюмерии и лекарственных препаратов используют метакрилированный желатин, казеин, производные серина, кератиносодержащие натуральных продуктов. Так, фирмой Showa (Япония) разработан биодеструктируемый термопластичный полимер для внешнего корпуса телевизоров и персональных компьютеров. В целом, данное направление по использованию природных полимеров с целью создания биоразлагаемых пластиков интересно прежде всего тем, что ресурсы исходного сырья возобновляемы. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 238 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов 5.2.2. Придание биоразрушаемости высокомолекулярным синтетическим полимерам Второе направление ориентировано на придание свойства биоразрушаемости синтетическим полимерам, выпускаемым в огромных количествах, – полиэтилену, полипропилену, поливинилхлориду, полистиролу и полиэтилентерефталату. Названные синтетические полимеры и изделия из них при захоронении могут храниться «вечно», поэтому вопрос возможности придания им способности биоразлагаться чрезвычайно актуален. Для это в структуру пластиков можно вводить молекулы, содержащие в своем составе функциональные группы, способствующие ускоренному фоторазложению полимера, получать композиции с биоразлагаемыми природными добавками, способными в определенной степени инициировать распад основного полимера, а также направленно синтезировать биодеградируемые пластические массы на основе промышленно-освоенных синтетических продуктов. К фоторазлагаемым полимерам относятся сополимеры этилена с оксидом углерода. Винилкетоновые мономеры являются фотоинициаторами разложения полиэтилена и полистирола. Введение их в количестве 2–5 % в качестве сополимера к этилену или стиролу позволяет получать пластики со свойствами, близкими к полиэтилену или полистиролу, но способные к фотодеградации при действии ультрафиолетового излучения в пределах 290–320 нм. Светочувствительные добавки – дитиокарбамата железа и никеля позволяют получать разрушаемые в почве пленочные материалы. С целью ускорения фото- и биоразложения из полиэтилена, полипропилена или полиэтилентерефталата в них вводят пульпу целлюлозы, алкилкетоны или фрагменты, содержащие карбонильные группы. Такие пленки сохраняются в течение 8–12 недель, прежде чем они начнут фото- и биоразлагаться. Следует, однако, отметить, что в последнее время проблема решения вопроса биоразлагаемости синтетических полимеров приемом введения в их состав природных компонентов не находит существенного развития, о чем свидетельствует сокращение количества публикаций по данному вопросу. Приоритетным направлением получения биоразлагаемых синтетических пластиков в настоящее время является синтез соответствующих полиэфиров и полиэфирамидов. Разлагаемые сополиэфиры получают на основе алифатических диолов и органических дикарбоновых кислот. На основе такого полиэфира в 1995 г. фирма BASF освоила полностью биоразлагаемый пластик Ecoflex F, применяемый для изготовления мешков, сельскохозяйственной пленки, гигиенической пленки, для ламинирования бумаги. Механические свойства Ecoflex F сравнимы с полиэтиленом низкой плотности. Из него получают пленку с высокой разрывной прочностью, гибкостью, водостойкостью и проницаемостью водных паров. Он перерабатывается методом экструзии с раздувом и с охлаждением на валках, как полиэтилен низкой плотности, его способность к деформации позволяет получить тонкие пленки (менее 20 мкм), которые не требуют специальной обработки. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 239 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов Фирмой BASF также освоен выпуск биоразлагаемых пластиков на основе полиэфиров и крахмала. Начиная со второй половины 90-х гг. фирма BAYER AG выпускает новые компостируемые биоразлагаемые в аэробных условиях термопласты ВАК-1095 и ВАК-2195 на основе полиэфирамида. Данный материал имеет высокую адгезию к бумаге, что позволяет широко использовать его для изготовления влаго- и погодостойкой упаковки, используемой в пищевой промышленности, и в сельском хозяйстве. Другой алифатический полиэфирамид ВАК-2195 легко перерабатывается литьем под давлением. Он может содержать наполнители: целлюлозу, древесную муку, крахмал, придающие ему достаточную жесткость и прочность. С целью понижения стоимости материалов на основе полиэфиров и полиамидов фирмы используют для их выпуска имеющиеся свободные производственные мощности, а в качестве исходного сырья применяют хорошо освоенные промышленностью продукты. Переработка таких композиций в конечные изделия ведется на стандартном оборудовании. Указанным подходом можно в сжатые сроки освоить выпуск новых экологически безопасных полимеров и в значительной степени решить задачу понижения цены биоразлагаемых пластиков, тем самым в значительной степени уменьшить проблему полимерного мусора из отходов тары и упаковки и сократить захоронения полимеров в землю. По данным фирмы BASF, потенциальный рынок Западной Европы на компостируемые биодеструктируемые материалы из полиэфирамидов, сополиэфиров и их смесей с крахмалом составляет 200 тыс. т/год. Прозрачный, с хорошей формуемостью биоразлагаемый сополиэфир для получения пленок, листов синтезируют полимеризацией с раскрытием цикла и переэтерификацией лактида с ароматическими полиэфирами на основе тере(изо)фталевой кислоты и алифатических диолов. В последнее время активно разрабатываются биоразлагаемые композиции, содержащие в своих составах как полиэфир-полиамидные, так и уретановые, карбонатные группы и в особенности фрагменты гидроксикарбоновых кислот. Это позволяет получать на их основе широкую гамму компостируемых изделий, обладающих высокими физико-механическими свойствами и приемлемой ценой. В настоящее время большинство крупных зарубежных компаний, работающих в области производства полимерной продукции, предлагают серию модификаций синтетических материалов, способных к биоразложению. Так, немецкая компания Bayer представила новый биоразлагаемый полиэфирамид, который имеет полукристаллическую структуру и производится с помощью литья под давлением. Сырье для его производства – гексамителен диамин, бутандиол и адипиновая кислота. Получаемая таким образом пленка обладает определенной степенью прозрачности. Она может быть полу- или полностью прозрачной. Процесс биологического разложения упаковки происходит в течение трех месяцев после контакта с бактериями и почвенными грибами. Этот материал предполагается использовать в производстве мешков для мусора, упаковки пищевых продуктов, а также при выпуске одноразовой посуды. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 240 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов Американская компания Easten Chemical недавно приступила к производству сложного полиэфира Eastar Bio COPE. Его также предполагается использовать для производства пищевой упаковки, мешков и пакетов для садоводческого и сельскохозяйственного назначения. Материал имеет полукристаллическую основу, хорошие свойства прозрачности, а его барьерные характеристики по кислороду выше, чем у полиэтиленовой пленки. При разложении этот вид упаковки разлагается на диоксид углерода, биомассу и воду – с той же скоростью, с какой разлагается обыкновенная газета. Швейцарская фирма DuPont объявила о коммерческом производстве материала Biomax, представляющего собой гидробиоразлагаемый полиэфир. Он обладает свойствами обычного полиэтилентерефталата и лишь немного дороже в производстве по сравнению со своим химическим аналогом. Ряд компаний уже сейчас предлагают материалы, в которых можно регулировать параметры биоразложения. Например, британская компания Symphony Environment Ltd. выпустила на рынок биополимер на полиэтиленовой основе, в котором степень разложения контролируется особыми добавками. В зависимости от количества и качества предварительно добавляемых веществ полное разложение упаковки может варьироваться в сроках от трех месяцев до пяти лет. 5.2.3. Синтез биоразрушаемых биополимеров Третье направление получения разрушаемых биопластиков ориентировано на производство полимеров на основе гидроксикарбоновых кислот. Анализ литературных источников по разработке биоразлагаемых полимеров за последние годы указывает на активное развитие этого нового направления. Полиэфиры на основе гидроксикарбоновых кислот (гликолевой, молочной, валериановой, масляной) разлагаются в природной среде под воздействием экзодеполимераз почвенной и водной микрофлоры, так как являются для нее субстратом роста. Для получения полиэфиров этих кислот используются их димерные производные – гликолиды, лактиды в случае гликолевой и молочной кислот либо β-, γ- или ε-лактоны для остальных указанных кислот. Сложные полиэфиры алифатических гидроксикарбоновых кислот различного строения привлекают внимание как материалы для создания изделий, используемых в различных областях, включая медицину, смежные с ней и другие области. Важной особенностью этих полимеров и изделий из них является их высокая биосовместимость и подверженность биодеградации через механизм биодеструкции макромолекулярной цепи, причем конечными продуктами распада полимеров во многих случаях являются безопасные для организма продукты, в том числе углекислый газ и вода. При развитии технологии производства и удешевлении этих полимеров можно ожидать, что они могут стать перспективными для создания разрушающихся во внешней среде упаковочных материалов и других изделий, которые должны разрушаться по истечении срока эксплуатации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 241 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов В настоящее время известно около 100 полимеров алифатических гидроксикарбоновых кислот или их сополимеров различного строения. Наиболее исследуемыми являются низшие представители этой группы: Н [-O-C-(CH2)n-C-]k RO Степень полимеризации этих полимеров (n) в большинстве случаев колеблется в пределах 100–30 000. Важной особенностью полимеров алифатических гидроксикарбоновых кислот с разветвленной цепью является их оптическая активность, во многом определяющая свойства этих полимеров и их способность к биодеструкции. Полимеры гидроксикарбоновых кислот могут быть получены биотехнологически, а также синтетическим путем. В последнем случае полимеры получают ионной или гидролитической полимеризацией их 6-членных циклических диэфиров (например, гликолида и лактида) или лактонов, например, ε-капролактона (6-гексанолида). К полимерам гидроксикарбоновых кислот примыкает полидиоксанон, получаемый синтетически полимеризацией п-диоксанона и образующий полимер 2-(2-гидроксиэтокси)пропионовой кислоты. Одним из самых перспективных биодеградируемых пластиков для применения в упаковке в настоящее время является полилактид – продукт конденсации молочной кислоты. Это обусловлено прежде всего тем, что получение лактида и полилактида возможно как синтетическим способом, так и ферментативным брожением декстрозы сахара или мальтозы, сусла зерна или картофеля. Полилактид в компосте биоразлагается в течение одного месяца, усваивается он также микроорганизмами морской воды. При соответствующей пластификации полилактид становится эластичным и имитирует полиэтилен, пластифицированный поливинилхлорид или полипропилен. Срок службы полимера увеличивается с уменьшением мономера в его составе, а также после ориентации, которая повышает прочность, модуль упругости и термостабильность. Несмотря на все перечисленные достоинства полилактида, широкое внедрение его как полимера бытового и технического назначения до последнего времени сдерживается небольшими объемами выпуска, низкой производительностью технологических линий и, как следствие, высокой стоимостью продукции. В связи с этим в настоящее время вопросам удешевления получаемой биоразлагаемой продукции уделяется значительное внимание. Активную работу по совершенствованиюи технологии производства молочной кислоты проводит американская фирма Cargill Inc, которая освоила выпуск биоразлагаемого полимера «Eco-Pla», листы из которого сравнимы по ударопрочности с полистиролом. Покрытия и пленки из полилактидов отличаются высокой прочностью, прозрачностью, блеском, приемлемой температурой экструзии более 200 °С, имеют низкий коэффициент трения. Фирмой Cargill Inc. в результате прове- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 242 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.2. Разрушаемые полимеры – способ избавления от синтетических полимерных отходов денных работ освоено производство полилактида ферментацией декстрозы кукурузы мощностью до 6 тыс. т/год, а в перспективе планируется расширить производство до 50–150 тыс.т/год и снизить стоимость полилактида с 250 до 2,2 дол./кг. Для удешевления полимера молочной кислоты японской фирмой Mitsui Toatsu освоена опытно-промышленная установка получения полилактида в одну стадию. Образующийся продукт представляет собой термостойкий полимер со свойствами, лучшими, чем пластик, полученный по двухстадийному процессу. При этом цена нового материала составляет 4,95 дол./кг. Исследованием технологии получения полимеров на основе полимолочной кислоты, начиная с 1991 г., активно занимается финская фирма Neste, где всесторонне изучаются физико-механические свойства полилактида с молекулярной массой 5000–10 000 и разрабатываются области применения такого полимера. Наряду с полилактидами и полигликолидами из полиэфиров, способных к биоразложению, особе место занимают в настоящее время полимеры гидроксипроизводных жирных кислот микробиологического происхождения, так называемые полигидроксиалканоаты (ПГА). Интерес к полигидроксиалканоатам растет с конца 80-х гг. Это новый класс природных полиэфиров, которые не подвержены быстрому небиологическому гидролизу, при этом их свойства (молекулярный вес, кристалличность, механическая прочность и разрушаемость) могут существенно варьировать. Полигидроксиалканоаты перспективны для применения в пищевой промышленности (упаковочный и антиоксидантный материал), сельском хозяйстве (обволакиватели семян, удобрений, пестицидов, разрушаемые пленки, тара для тепличных хозяйств) и в других сферах, включая медицину и фармакологию. Физико-химические свойства полигидроксиалканоатов, разнообразие и возможность получения на их основе композитов с различными материалами выдвигают данные полимеры в разряд наиболее перспективных из материалов XXI в. 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы Как показывает анализ литературы, биоразлагаемые полимеры, особенно полученные из биологических источников, в силу достаточно высокой стоимости пока не играют значительной роли на мировом рынке пластмасс. На рис. 5.4 представлены объемы выпуска разрушаемых биопластиков в странах-лидерах – США, Японии и странах ЕС (источники – различные мировые базы данных). Европейские страны с самым большим потреблением – это Германия, Англия, Франция, Италия и Нидерланды. Бельгия, Норвегия, Австрия, Испания, Швейцария ориентированы сегодня также на создание индустрии биопластиков, и эта тенденция расширяется. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 243 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы По некоторым прогнозам, объем мирового производства полимеров вырастет со 180 до 258 млн т за период 2005–2010 гг. Таким образом, практически пропорционально увеличатся объемы полимерных отходов, только часть которых поступает на вторичную переработку, а в основном они скапливаются на полигонах захоронения или несанкционированных свалках (по обочинам дорог, в оврагах и на берегах рек). Согласно прогнозу, доля биополимеров за тот же период вырастет с полутора процентов до 4,8 %, в абсолютных цифрах с 4 до 12,5 млн т. Свою оценку также проводила компания Toyota. Японцы полагают, что в связи с ростом интереса к возобновляемым источникам сырья к 2020 г. уже четверть мирового рынка пластмасс будет приходиться на биопластики, а это около 30–40 млн т. Мировое потребление биоразлагаемых материалов в 2001–2003 гг. удвоилось и достигло 40 тыс. т. По прогнозам, эта тенденция сохранится и в будущем, особенно с учетом постоянно растущих цен на нефть. Анализ литературы свидетельствует также о бурном росте интереса к исследованиям и патентованию технологий синтеза биопластиков; число патентов в сфере получения и технологии переработки биополимеров неуклонно растет. Если в 80-х гг. прошлого столетия в год регистрировалось несколько десятков патентов, в 90-х – цифра возросла до сотен патентов в год; в 2000–2001 гг. – порядка тысячи. Другие Рис. 5.4. Мировой рынок разрушаемых биопластиков (конец XX в.) Огромный интерес к разрушаемым биопластикам наблюдается в Японии. В 2000 г. объемы их выпуска составляли лишь 2000 т, то в 2006 г. – возросли до 50 тыс. т, а к 2010 г. эту цифру планируется довести до 200 тыс. т. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 244 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы Сегодня в Токио функционирует более 200 компаний, специализирующихся на производстве разрушаемых биопластиков. В странах ЕС внедрение биоразлагаемой упаковки поддерживается на законодательном уровне. Так, во Франции в стадии принятия закон, согласно которому с 2010 г. на территории страны можно будет использовать только биоразлагаемую пластиковую упаковку. Правительство Голландии запланировало выделение средств в размере нескольких миллиардов евро для введения в широкое использование ряда упаковочных материалов, способных к биологическому разложению. В Дании и Ирландии введен специальный налог для розничных сетей, использующих полиэтиленовые пакеты. А в Германии, наоборот, предприятия, поставляющие на рынок товары в биоразлагаемой упаковке, освобождены от налога на утилизацию отходов до 2012 г. Аналогичные схемы уже действуют в Великобритании и Италии. В России, к сожалению, в настоящий момент отсутствует сколько-нибудь внятная политика в области утилизации полимерных отходов. До сих пор не принят закон «Об упаковке и упаковочных отходах». Не существует инфраструктуры раздельного сбора мусора и промышленного изготовления компостов. В опубликованном докладе Института перспективных миссий о разлагаемых полимерах на биологической основе подчеркнуто, что к 2010 г. на долю этих материалов будет приходиться 1–2 % европейского рынка полимеров, а к 2020 г. – не более 5 % (рис. 5.5). Исследования, проведенные Freedonia Group Inc., показали, что спрос на биоразлагаемую упаковку в США возрастет и к 2010 г., достигнув 610 млн дол. В секторе биопластиков отмечается непрерывный рост: по оценкам IBAW (международная ассоциация производителей и потребителей биопластиков), европейское потребление биопластиков удвоилось с 2001 года и в 2003 составило 40 тыс. т, особенно динамичным было развитие рынка в Великобритании, Италии и Нидерландах. Рис. 5.5. Перспективы роста производства разрушаемых биопластиков Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 245 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы Лидирующую позицию может занять упаковка на основе поликапролактона и полигидроксиалканоатов (ПГА). Спрос на упаковку из материалов на основе крахмала составит 18 % в год. Из-за их положительных характеристик и преимуществ (разрушаемости в окружающей среде) биопластики становятся альтернативой синтетическим пластмассам. Поскольку большой объем стандартной пластмассы может быть вытеснен биопластиком, характеристики и прогнозы рынка для стандартного пластика важны для рынка биопластика. Самый высокий спрос ожидается на упаковку из полимеров монокарбоновых кислот для изготовления пленочной продукции, бутылей, а также жестких упаковок для овощей, фруктов, кисломолочных продуктов и хлебобулочных изделий. Потенциал биопластика в основном зависит от его стоимости. COPA (Комитет сельскохозяйственной организации в Европейском Союзе) и COGEGA (Общий комитет сельскохозяйственного сотрудничества в Европейском Союзе) провели оценку потенциала биопластиков и наиболее перспективных секторов их применения в европейской экономике (рис. 5.6). Мешки для Биодегра- Компоорганичес- дируемая ненты ких отховсхододля дов защитная шин пленка Пленки, 100 % биодеградируемые Упаковочная пленка Упаковка Предметы овощей быта Рис. 5.6. Прогноз потенциальных сегментов рынка биопластиков Следует отметить, что применение биополимеров ограничивается из-за необходимости преодоления присущих им негативных качеств. Например, для изделий из целлюлозы характерна хрупкость; полимеры на основе крахмала влагочувствительны, полилактиды не термопластичны и изделия из них проницаемы для паров воды и кислорода. Но это не может остановить прогресс в бурно развивающейся индустрии биопластиков. Биополимеры и композиты на их основе становятся не специальным уникальным продуктом, а экономически значимым товаром, который становится все более привлекательными и доступным. Этому способствуют агропромышленная интегра Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 246 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы ция, прогресс в биотехнологии, генной инженерии и селекции, а также рост производственных мощностей. Среди факторов, позитивно влияющих на расширение сфер и объемов разрушаемых полимеров, следует выделить экономические, технологически, политические и социальные. 5.3.1. Биоупаковка – альтернатива синтетическому пластику В середине прошлого века человечество пережило революцию синтетических материалов, после которой синтетические пластики стали доминировать на рынке материалов, так как они наиболее активно используемые сегодня материалы. Например, только полиэтиленовых пакетов используется ежегодно более десятка миллиардов. Полимерные изделия повсеместно используются также в быту и технических отраслях. В середине 90-х гг. прошлого столетия стали появляться сообщения о создании так называемых биопластиков, – материалов, получаемых из природных соединений, например, крахмала. Такой пластик разлагается в природной среде микроорганизмами. Широкомасштабное внедрение биопластиков пока не началось; главным фактором, сдерживающим наращивание масштабов производства и применения биопластиков, остается их большая, чем синтетических материалов, стоимость. Однако в начале XXI в. удалось снизить затраты на производство биопластика, и термин biodegradable polymer становится неотъемлемой частью процесса производства упаковки. Одна из активно использующих полимерные материалы отраслей относится к сфере производства упаковки. Пластиковая упаковка активно применяется во всех сферах нашей жизни, в нее пакуются как бытовые, так и пищевые продукты. Именно поэтому огромная часть неразлагаемых отходов приходится на долю упаковочной индустрии. У рынка полимерной тары и упаковки есть перспективы развития, обусловленные как наращиванием объемов производства полимеров, так и улучшением качества продукции. Среднегодовые темпы роста внутреннего (в РФ) спроса на тароупаковочные материалы в перспективе до 2015 г. прогнозируются на уровне 4,5 %. Бурное развитие рынка полимерных упаковок и тары, а также крупногабаритных изделий, элементов автомобилей и пр. ставит задачу поиска новых, высокопрочных материалов. Особо быстрыми темпами растет рынок крупногабаритной пластмассовой тары (КПТ), вытесняющей традиционно используемые металлические емкости больших объемов (до 1 000 л и выше). В настоящее время в мире ежегодный прирост производства КПТ составляет около 5–7 % в таких крупных странах-производителях (США, Германия). Российский рынок крупногабаритной пластмассовой тары также непрерывно увеличивается, на 5–6 % в год. В 2002 г. общий объем российского рынка КПТ составил 38,5 млн [5]. Если стеклянная тара, как правило, находится в потребительском цикле, а бумажная подвергается разложению в естественных условиях, то упаковка из синтетических полимеров, составляющая 40 % бытового мусора, практически Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 247 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы «вечна» – она не подвергается разложению и вопрос о том, как быть и что делать с пластмассовым мусором становится глобальной экологической проблемой. От решения вопроса пластмассовых отходов в значительной степени будет зависеть экологическая ситуация в мире и, по всей видимости, темпы и направления развития производства синтетических пластмасс в наступившем XXI столетии. 5.3.2. Современное состояние и направление работ по разрушаемым биопластикам Работы по биополимерам в настоящее время становятся все более актуальными. Биополимеры подразделяются на две категории: это полимеры, продуцируемые биологическими системами (например, микроорганизмами) и полимеры, синтезируемые химически, но на основе исходного сырья биологического происхождения (аминокислот, сахаров, жиров). В первую очередь предлагается их использовать в упаковочной индустрии, где срок службы большинства изделий исчисляется всего лишь несколькими месяцами или даже днями. (Зачем же тогда применять материал, по прочности рассчитанный на сотни лет?) К тому же, как показывают результаты многочисленных исследований, именно полимерная упаковка – бутылки, контейнеры, коррексы, коробки, блистеры и пакеты – составляет основную долю твердых бытовых отходов. Среди наиболее перспективных сфер применения разрушаемых биопластиков: легкая и пищевая промышленность, сельское и коммунальное хозяйство (пакеты, пленки, бутыли, поддоны, пластыри, сетки, мешки, одноразовая посуда, одежда, технический текстиль и ткань, флаконы для парфюмерно-косметических товаров, детские игрушки, цветочные горшки, подпорки для растений, торфяные мешки, удобрительные ленты, покрывающие и всходозащитные пленки, корпуса компьютеров, орг-, видео-, аудиотехники, мобильных телефонов и т.п. Конструирование биополимеров за последние десять-пятнадцать лет превратилось в одно из основных междисциплинарных исследований. Главной целью данного направления работ является: 1) поиск и изучение новых биополимеров; 2) получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, синтезирующих полимеры с заданными свойствами. Среди применяемых и активно разрабатываемых в настоящее время новых биоразрушающихся полимеров – алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируретаны, полимеры молочной и гликолевой кислот (полилактиды и полигликолактиды, силикон, полиэтилентерефталат и с недавних пор ПГА). Биодеградирующие полимеры привлекают производителей и экологов тем, что разлагаются в сжатые сроки – от нескольких месяцев до нескольких лет, с образованием безопасных для окружающей природы веществ, таких как вода, биомасса, углекислый газ или метан (в за- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 248 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы висимости оттого, какой процесс разложения имел место – анаэробный или аэробный). Следует отметить, что наблюдаемый в последние годы интерес к биодеградирующим полимерам связан не только с ухудшением экологической обстановки: серьезные опасения специалистов вызывает неуклонное уменьшение мировых запасов нефти и газа. Поэтому возобновляемое растительное сырье могло бы стать решением проблемы. Не случайно, что в Европе происходит бум в области развития биотоплива и биополимеров. «За последние несколько лет исследователи и производители биоразлагаемых полимеров значительно продвинулись вперед, – заявил Стив Мойо (Steve Mojo), исполнительный директор Нью-йоркского Института биодеградирующей продукции. – Разработаны эффективные технологии производства, благодаря чему пять лет назад биоразлагаемые полимеры уже появились на рынке». Сегодня по многим физическим и техническим характеристикам биопластики не уступают традиционным пластмассам и вместе с тем безопасны для окружающей среды. Но так как эта индустрия находится на этапе становления, то все еще существует множество заблуждений. Так, некоторые ошибочно полагают, что все полимеры, полученные из растительного материала, являются биодеградирующими, – это не так: способность к разложению в естественных условиях зависит не только от «натуральности» сырья, а от целого ряда свойств, в частности, от молекулярной структуры материала. Также неверно думать, что все полимеры, способные к биоразрушению, получают из природных компонентов: основой для их производства может служить и синтетическое сырье. Например, биоразлагаемый полимер Ecoflex компании Basf (Германия) изготавливают из углеводорода. Позже на основе этого материала компания разработала композиционный Ecovio, при производстве которого наряду с «синтетикой» используется возобновляемое сырье (полилактид). Согласно результатам исследований European Bioplastics (европейской ассоциации производителей, поставщиков и потребителей биопластиков и других биоразлагаемых материалов), в 2007 г. в мире было изготовлено 262 тыс. т биополимеров. При этом 80 % получены из растительного сырья и являются биоразрушаемыми; 12 % было изготовлено из натуральных компонентов; 8 % произведены из синтетического сырья, способного к биодеградации. Основным потребителем биоупаковки является пищевая индустрия. В Европе с 2000 г. действует стандарт EN 13432, регламентирующий требования к биодеградирующим полимерам, принятый ЕС. 5.3.3. Факторы, влияющие на развитие производства разрушаемых биопластиков Каковы же перспективы развития упаковки на основе биопластиков? Существует ряд факторов, с одной стороны, сдерживающих ее применение, с другой, – стимулирующих её. Сдерживает массовый переход на использова Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 249 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы ние биопластика его довольно затратное производство. Следует отметить, что и потребители пока не готовы покупать товары в экологически чистой упаковке, которая дороже обычной, синтетической. Однако с увеличением объемов производства синтетических пластиков с каждым годом возрастают расходы на их утилизацию. Выявляются также негативные моменты от использования таких материалов для упаковки напитков и пищевых продуктов. Так, сравнительно недавно установлено, что ряд материалов, используемых, в частности, для производства пластиковых контейнеров, может стать причиной возникновения серьезных заболеваний, включая онкологические. Это связано с использованием бисфенола-A при изготовление синтетической упаковки. Как заявили ученые Медицинской академии Бостона, это вещество со временем накапливается в организме человека. Согласно подсчетам, каждый год во всем мире для упаковки пищевых продуктов и напитков производится 2,8 млн т бисфенола. В результате проведенных исследований последствий использования тары с применением бисфенола британские производители отказались от производства емкостей, содержащих бисфенол. Ранее исследователи пришли к выводу о том, что фталаты (эфиры фталевой кислоты), которые используются в производстве виниловой пищевой упаковки, медицинских трубок и детских игрушек, наносят вред развитию ряда функций у новорожденных мальчиков. Токсичное вещество 2-ЕНА обнаружено в полимерных крышках для детского питания учеными из университета Вюрцбург (Германия). Эти новые данные требуют более осторожного подхода к синтетической упаковке, особенно при наблюдаемом в настоящее время расширении ее применения в пищевой промышленности. Подобная информация, наряду с ужесточающимися законами по переработке отходов, в частности в странах ЕС, побуждают предпринимателей, работающих в сфере производства упаковки, обращаться все более активно к биопластикам. В Германии, например, в мае 2005 г. введены новые правила, регулирующие утилизацию упаковки. Директива German Packaging Directive предполагает освободить от налогов предприятия, поставляющие на рынок товары в биоразлагаемой упаковке. Поправка, которая была принята Верховной палатой немецкого парламента, вошла в силу в январе 2005 г. Она гарантирует для сертифицированных упаковочных материалов на биооснове исключение из ключевых разделов Положения – вплоть до 2012 г., а это значит, что они изымаются из ряда перечней по возврату и утилизации отходов. По словам Харальда Каэба, председателя Ассоциации биоразлагаемых пластиков IBAW и автора изменений в Положении, это решение устраняет решающую помеху к использованию биоупаковки в Германии. «Определенно, это послужит толчком для использования биополимеров», – заявил он. Аналогичные схемы уже действуют в Великобритании и Италии. В ряде стран Западной Европы налоговые льготы для производителей, использующих биоразлагаемые материалы при производстве упаковки, являются Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 250 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы основным стимулом для развития этого направления. С 2006 г. некоторые голландские упаковочные предприятия полностью перешли на использование биоразлагаемых материалов. Правительство стимулирует этот процесс. Для этого в бюджете предусмотрено выделение средств в размере нескольких миллиардов евро. Уже сегодня в странах ЕС начинают использовать биопластики для упаковки бутербродов, изготовления одноразовой посуды, а также пакетов для мусора. Нельзя не отметить, что развитие производства биоразлагаемых полимеров требует значительных инвестиций в исследования, сельскохозяйственные работы, строительство заводов. Несмотря на это, многие европейские и американские компании готовы идти на эти траты. Их заинтересованность поддерживают и розничные операторы целого ряда развитых стран. Крупнейшие продуктовые сети Европы уже с 2003–2005 г. используют биоразлагаемую упаковку, в первую очередь для натуральных продуктов, овощей, фруктов, салатов и деликатесов. В Великобритании это Tesco, Sainsburis, Marks & Spenser; во Франции –Carrefour, Monoprix, Migros; в Италии – Esselunga, IPER, Coop;в Китае – Migro, Coop; в Голландии – Albert Heijn и другие. Например, бельгийская сеть супермаркетов Delhaize в 2006–2007 гг. использовала более 7 млн PLA-контейнеров для салата, а позже она прекратила использовать традиционные пакеты, заменив их одноразовыми биоразлагаемыми на основе крахмала. Информацию об особенностях биодеградирующего упаковочного материала и способах его утилизации можно увидеть на этикетках и информационных стендах над витринами. Прогрессивные производители продуктов питания тоже внедряют биоупаковку. Этот маркетинговый ход помогает привлекать внимание к марке и добиваться лояльности «экологично» настроенной европейской аудитории. Так, макароны под маркой Birkel’s Bio фасуются только в пакеты из биоразлагаемого пластика на основе целлюлозы. Birkel стала первой немецкой компанией, сделавшей ставку на коммерческое использование биоупаковки. Французский производитель Richard Laleu внедрил новый материал – PLAфольгу Biophan – в качестве упаковки для сыра. Финская Huhtamaki стала пионером на рынке биоразлагаемой одноразовой посуды, создав линию BioWare (стаканы для холодных напитков, тарелки, контейнеры и ножи) из вторичного сырья (макулатура) и биополимера NatureWorks PLA. В 2006 г. немецкая аптечная сеть Ihr Platz предложила покупателям линию оздоровительных напитков Vitamore в ПЛ-бутылках с крышками из полимера MaterBi на основе крахмала. В конце 2007 г. компания Biota Brands of America (США), заявляющая, что она заботится об окружающей среде, вывела на рынок инновационный продукт – энергетическую воду Biota Spring Water. Новинка разлита в запатентованные биоразлагаемые бутылки Planet Friendly. Greenery, один из ведущих европейских концернов на рынке фруктов, овощей и грибов, в конце 2004 г. впервые применил биоразлагаемую упаковку Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 251 ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.3. Разрушаемые биопластики: реалии и перспективы для своих продуктов. Опыт оказался удачным, и в ближайшее время компания планирует полностью отказаться от традиционной полимерной упаковки. Австралийское подразделение концерна Cadbury Schweppers заказывает биодеградирующие коррексы для коробок под шоколадные конфеты. А Nestle уже два года поставляет в Австралию конфеты из молочного шоколада Dairy Box («Молочная коробка»), коррексы для которых изготовлены из полимолочной кислоты PLА, они моментально разлагаются при контакте с водой. С недавнего времени Dairy Box появились и в Европе. Ирландская компания Tipperary Water в дополнение к своим кулерам для воды предлагает биоразлагаемые одноразовые стаканчики из полилактида. На начальном этапе, в августе 2004 г., в Ирландии и Великобритании было продано 500 тыс. стаканчиков, и всего за три года объем продаж увеличился почти до 30 млн штук в год. Еще один пример из Ирландии: компания Alcan Packaging разработала новую слоистую пленку для упаковки мюсли британской компании Jordans. Пленка из целлюлозы фирмы Natureflex и материала Mater-Bi компании Novamont рассчитана на компостирование в домашних условиях. В Дании и Ирландии введен налог для продуктовых сетей на использование ПЭ пакетов, а в Италии, Франции, ряде штатов США с 2010 г. использование небиоразлагаемых пакетов будет вообще запрещено. В результате этих мероприятий в Западной Европе в 2006 г. было потреблено 19,5 тыс. т биоразлагаемой упаковки, в США – 16 тыс. т. С июля 2008 г. в Китае запрещено использование в качестве упаковки тонкой полипропиленовой пленки. Согласно недавно опубликованному распоряжению городской администрации Лос-Анджелеса, начиная с первого июля 2010 г., во всех супермаркетах, продуктовых магазинах, а также магазинах одежды запрещается использование пластиковых пакетов. Взамен предполагается использовать бумагу или иные биоразлагаемые материалы. Целью этого запрета является улучшение экологической обстановки в городе. В настоящее время в магазинах Лос-Анджелеса покупателям раздается 2,3 млн полиэтиленовых пакетов в год. Среднее время использования одного такого пакета составляет 20 мин. Упаковка, создаваемая на основе биоразлагаемых материалов, появилась и в странах СНГ. Например, в России финская компания Huhtamaki планирует построить завод для производства различных видов упаковки и одноразовой посуды на основе технологии BioWare. Для выпуска некоторых изделий специалисты этой фирмы используют пластик, создаваемый из полимера молочной кислоты (полилактида, ПЛ). Нельзя не отметить при этом, что в настоящее время ПЛ-упаковка дороже аналогичных изделий из полипропилена. В России в целом, к сожалению, пока рано говорить о производстве и широком спросе у населения на биоразлагаемую упаковку. Однако уже сегодня необходимо задуматься о неизбежности перехода на биоразлагаемые пластики, безвредные для человека и окружающей среды. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 252 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Сферы применения разрушаемых биопластиков расширяются. Это связано с тем, что, во-первых, появляются новые виды этой продукции с новыми ценными коммерческими свойствами. Второе обстоятельство объясняется тем, что по мере совершенствования технологий, биопластики становятся дешевле и, следовательно, доступнее для потребителя. В конце 2007 г. три немецкие компании – Institute for Recycling of the University for Applied Sciences Braunschweig, Fraunhofer Institute for Chemical Technologies и CTC Clean Tech Consulting GmbH – провели совместное исследование и выяснили, что в мире существует не менее 73 видов биоразрушающихся биопластиков. В числе их производителей – компании Albis, Basf, Biomer, Biopearls, Biotec, Dow, Enmat, GoodFellow, Hycail, Mazzucchelli, Metabolix, Monsanto, NatureWorks, Novamont, Plantic, Polyfea, P&G, Solvay и другие. Полный список и технические характеристики полимеров опубликованы в Интернете на сайте www.bioplastics24.com. Естественно, что не все разработки «приживутся» на рынке, но даже само их количество свидетельствует о значительном интересе к данной проблеме. 5.4.1. Природные источники сырья для синтеза разрушаемых биопластиков Биопластики, производимые на основе природных материалов, например из крахмала, появились в середине 70-х гг. ХХ в. Эти полимеры, полученные из растительных волокон, растений и целлюлозы, до недавнего времени доминировали на рынке среди биоразрушаемых пластиков. Источником сырья для производства биопластиков такого типа служат злаковые растения и картофель. Так, из кукурузы можно получить до 80 % крахмала от зеленой биомассы растения. Биопластик из крахмала разлагается в почве под воздействием микроорганизмов до конечных продуктов, – диоксида углерода и воды. Однако крахмал растворяется в воде, поэтому изделия из него деформируются при контакте с влагой. Существует иной путь получения более функционального биопластика для упаковки. Это использование крахмалсодержащего сырья для микробиологической трансформации его в молочную кислоту (лактид). Далее мономеры лактида подвергают полимеризации с образованием полилактида (полимолочной кислоты, ПМК) – биопластика, обладающего по сравнению с крахмалом более высокими прочными свойствами. Еще один путь производства биопластиков основан на использовании микроорганизмов, способных синтезировать в специфических условиях роста полимерный материал, подобный полипропилену. Это линейные термопластичные полиэфиры, так называемые полигидроксиалканоаты (ПГА), которые в настоящее время становятся лидирующим классом среди биопластиков. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 253 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Полностью биоразрушаемые пластики производят также из природного сахаросодержащего сырья. В ходе многочисленных экспериментов по их производству использовали самые разные растения – от картофеля, пшеницы, бобовых, подсолнечника, сахарной свеклы до древесины тополя и осины. Одни оказались непригодными, а другие, такие как пшеница, кукуруза, сахарная свекла, – весьма перспективными. В настоящее время используются такие природные полимеры, как целлюлоза, натуральный каучук, полисахариды, полипептиды, хитин, эпоксидированные масла, лигнин, поллулан, сложные полиэфиры и др. Большой интерес вызывает крахмал как относительно недорогое по цене сырье, который экстрагируют из картофеля, пшеницы, кукурузы, риса. Однако полимеры на основе крахмала имеют существенный недостаток – нестойкость к воздействию воды. Распространенным решением этой проблемы является внедрение композиционных материалов с добавлением природных или синтетических компонентов для усиления водостойкости. Так, компания Rodenburg Biopolymers первой в мире предложила биопластик Solanyl по цене, сопоставимой с обычными синтетическими пластиками. Solanyl – это разлагаемый микроорганизмами пластик, в основу которого входят субпродукты промышленной переработки картофеля. Начиная с ноября 2001 г., самый большой в Европе завод по производству биопластика производит около 47 000 т продукта в год. Подобное производство создано в Нидерландах. Объем поставляемого Rodenburg Biopolymers фермерами сырья для производства этого биопластика составляет около 400 000 т/год. Области применения пластика определяются тем, что его уникальные свойства превосходят свойства альтернативных материалов. Solanyl может обрабатываться серийным оборудованием, выпускаемом для прессования под давлением и получения пленки. Среди производителей, предлагающих биопластики для упаковки на основе растительного крахмалсодержащего сырья, – итальянская фирма Novamont SpA и английская компания Environmental Polymers Group (EPG). В Италии запущены в производство четыре композиции материала марки Mater-Bi, нетоксичного полиацеталя на основе крахмала. Novamont – ведущий итальянский производитель биопластика. Mater-Bi – это полностью биоразлагаемый, поддающийся биохимическому распаду биопластик, по своей степени устойчивости и прочности не уступающий традиционным разновидностям пластика, содержит в своем составе природное сырье, отличается низким уровнем выброса в атмосферу парниковых газов и пониженным потреблением энергоресурсов. Компанией разработана серия материалов марки Mater-Bi®. Так, пленочная продукция этой марки успешно опробована одной из ведущих британских сетей супермаркетов в процессе фасовки и упаковки фирменной линии натуральных овощей и фруктов. Ламинированная пленка, представляющая собой синергическую комбинацию биоразлагаемого пластика – это новая упаковка злаковых завтраков, выпущенная компанией Jordans Cereals. На смену традиционным пластиковым пакетам приходят па Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 254 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков кеты, производимые из слоев «NatureFlex» (Innovia Films) и Mater-Bi®. Данная комбинация гарантирует идеальные механические и изолирующие свойства биоразлагаемой упаковки, рекомендуемой к использованию в сегменте обезвоженных продуктов питания с длительными сроками годности. Экструзионное покрытие – особая разновидность Mater-Bi, разработанная в целях осуществления ламинирования способом экструзии. Переработка материала осуществляется на основе использования стандартного промышленного оборудования, при этом по своей природе он напоминает традиционные полиолефины по своей устойчивости, скорости производства и плотности. Благодаря прекрасным герметизирующим и адгезивным свойствам материала, он рекомендуется к использованию в упаковке самого разнообразного товарного ассортимента, в том числе и в фармацевтической промышленности. В Австрии и Швеции McDonald’s предлагает в своих ресторанах вилки и ножи, созданные из кукурузы, компания Goodyear выпустила первые биошины Biotred GT3, а магазины Carrefour во Франции, Esselunga в Италии и Co-Op в Норвегии продают свои товары в биопластиковых пакетах из того же Mater-Bi. В Италии планируют также производить биопластик из сахарной свеклы, который разрушается водными микроорганизмами за 10 дней при комнатной температуре. Австралийская компания CRC заявила о создании биопластика из кукурузного крахмала. Новый материал разрабатывался в течение шести лет по заказу International Food Manufacture and Packaging Science. Биопластик будет применяться для упаковки сухих пищевых продуктов. Разработчики заявляют, что из «сиропной массы» можно создавать полимерные пакеты, тарелки, стаканы, ложки и вилки. Например, сделанные из пластика на основе кукурузы вилки находят широкое применение в разных странах. К тому же у биопластика, созданного из кукурузного крахмала, есть еще одна примечательная особенность – изделия из него можно производить с расчетом срока самораспада. Некоторые виды биопластмассы на основе крахмала могут служить в течение нескольких месяцев, некоторые – в течение нескольких лет. Ученые из Университета Айовы (США) разработали технологию, направленную на повышение прочностных свойств биопластика с помощью наноклея. Руководитель команды исследователей Дэвид Грэвелл заявил, что новый пластик будет широко востребован в производстве тары и упаковки для пищевых продуктов, и даже, возможно – цветочных горшков. Обычно при изготовлении биопластиков свернутые белки сои или кукурузы с помощью глицерина «выпрямляют» в длинные цепочки, которые затем формируют пластик. Теперь же в ходе этого завершающего этапа производства в пластик добавили наночастицы клея. Дальнейшая обработка биопластика (плавление и производство готовых изделий) происходила на специальном оборудовании от фирмы Trexel Inc. Англичане работают над созданием особого типа поливинилового спирта, который способен к биоразложению в горячей и холодной воде. Этот материал предполагается использовать для производства упаковочной плен- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 255 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков ки методом экструзии с раздувом. Предлагаемая компанией EPG технология включает запатентованную технологию экструзии и собственные разработки биодеградантов на основе поливинилового спирта (PVON). При этом представители компании сообщают, что свойства изготавливаемой упаковочной пленки будут соответствовать или даже превышать физические характеристики пленки из поливинилхлорида и полиэтилена, а по своей стоимости смогут конкурировать с другими биоматериалами. Разрабатываемые биологические пластики способны не только к биоразложению, но также позволяют создавать упаковку, препятствующую развитию болезнетворных микроорганизмов в продуктах. Одной из самых опасных возбудителей человеческих болезней является бактерия под названием листерия. Развиваясь в различных пищевых продуктах даже при весьма низких температурах, она может стать причиной серьезного заболевания, при котором возможен даже смертельный исход. В университете Клемсон разработана биопластмасса, содержащая в качестве наполнителя низин, препятствующий развитию патогенов. Низин является антибиотиком полипептидного типа, производным молочнокислых бактерий Streptococcus lactis, при этом он безвреден для человека. Промышленным производством биопластиков занимаются японский автоконцерн «Toyota» и американская компания «Cargill Dow». Объемы производства такого экологически чистого пластика до недавнего времени не превышали 100 тыс. т в год. Toyota намерена кардинально изменить ситуацию. Как заявил глава биотехнологического подразделения компании Кодзабуро Цукисима, в 2007 г. компания построила завод мощностью до 50 тыс. т биопластика в год, а к 2020 г. производство будет увеличено до 20 млн т, благодаря чему Toyota собирается зарабатывать на биопластике по 38 млрд дол. в год. Стоимость полимера будет снижена до 2 долларов с нынешних 5–10 долларов за килограмм, таким образом, по цене он сравняется с синтетическими пластиками. Toyota производит биопластики из сахарного тростника, кукурузы и тапиоки – муки из маниоки. Данный материал горит при низких температурах, не выбрасывая в атмосферу вредные газы. Помимо упаковки, Toyota планирует использовать детали из этого биопластика в своих автомобилях. Уже в настоящее время элементы из биопластика входят в комплектацию двух моделей Toyota – минивэна Raum и седана Prius. В настоящее время один кг биопластика стоит 500–1 000 йен, что в 5 раз больше цены обычного пластика, производящегося из нефти. Япония потребляет около 14 млн т пластика в год – примерно десятую часть объема, производящегося во всем мире. Из этих 14 млн т только 10 тыс. т приходится на биопластик. Другой гигант автомобилестроения в Японии – компания Mazda Motor Corp. ориентируется на производствоо биопластика из непищевого сырья. Для выполнения данного проекта и его доведения для промышленной реализация компания привлекла специалистов из университета города Хиросима. Разработчики этого проекта акцентируют, что для производства биопластика не будет использоваться пищевое сырье, т.е. производство биопластика не Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 256 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков нанесет ущерба пищевой промышленности. В качестве сырья планируется использовать отходы деревообрабатывающей промышленности, опилки и прочие отходы. Помимо упаковки, биопластик будет использован при производстве бамперов и отдельных элементов центральной консоли. Ожидается, что «пластик из опилок» будет массово применен при производстве очередного поколения Mazda-3, появление которого намечено на 2013 г. На данный же момент компания демонстрирует достигнутые результаты на экспериментальном Mazda Premacy Hydrogen RE Hybrid. В этом же автомобиле Mazda показывает другую экологически чистую технологию – получение тканей для отделки салона из отходов деревообрабатывающей промышленности. Как заявили представители компании Mazda, помимо упаковочного биопластика, ими создан высокопрочный и жаростойкий биопластик, пригодный для применения в создании внешних поверхностей автомобилей. Кроме того, он может использоваться в качестве внутренних деталей транспортных средств. Недавно разработанный биопластик в три раза прочнее и имеет на 25 % большую жаростойкость, чем сравнимый с ним давно существующий биопластик, используемый для электрооборудования. В отличие от обычного полипропиленового пластика на нефтяной основе, новый биопластик имеет сравнительно большую твердость, что поможет экономить материал и делать детали более тонкими. Нельзя не отметить, что в настоящее время в Японии происходит настоящий бум производства биоразлагаемых полимеров. Если в 2000 г. объемы производства экологически безопасного материала составляли лишь 2000 т, то сегодня это уже около 50 тыс. т, а к 2010 г. эксперты прогнозируют увеличение и до 200 тыс. т. В настоящее время только в Токио существуют более 200 компаний, специализирующихся на разработке биопластиков. В России, как отметил аналитик ИК «Проспект» Дмитрий Царегородцев, отечественными учеными также запатентована технология изготовления биопластика из древесины. Однако производится он в очень малых количествах и используется как сырье для прозаичных продуктов: крахмала и водки. За рубежом разработками в области создания биоупаковки занимаются не только коммерческие, но и различные научные организации. Так, бразильские ученые создали съедобную липкую пленку. После двенадцати месяцев работы исследователи из государственного университета Кампинас, СанПаулу нашли уникальный материал для такой пленки – муку амаранто (питательный хлебный злак, который выращивается в Южной Америке). Эта упаковка перерабатывается биологическими методами, т.е. деградирует в почве под воздействием микроорганизмов, при этом имеет высокий уровень содержания белка. Кроме того, разработанная пленочная упаковка высокопрозрачна и обладает свойствами, которые позволяют хранить свежие фрукты и овощи значительно дольше, чем обычно. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 257 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков 5.4.2. Синтез, свойства, области применения разрушаемых биопластиков на основе молочной кислоты Лидером по объемам выпуска среди разрушаемых биопластиков до настоящего времени оставался полилактид (полимер молочной кислоты). Этот пластик может быть получен синтетическим способом и ферментативным брожением сахаросодержащих субстратов. В промышленности молочную кислоту получают гидролизом 2-хлорпропионовой кислоты и ее солей (100 °C) или лактонитрила CH3CH(OH)CN (100 °C, H2SO4) с последующим образованием эфиров, выделение и гидролиз которых приводит к продукту высокого качества. Известны другие способы получения молочной кислоты: это окисление пропилена оксидами азота (15–20 °C) с последующей обработкой H2SO4; взаимодействие CH3CHO с СО (200 °C, 20 МПа). Полилактид получают полимеризацией оптически активного лактида в растворе при 100–150 °C или в массе при 140–200 оC. Получают лактид также биотехнологическим способом, ферментативным брожением декстрозы сахара или мальтозы, сусла зерна или картофеля (рис. 5.7). Далее лактид подвергают полимеризации. Для придания ПМК термостойкости и повышения механических свойств, как правило, получают сополимеры полилактидов с полигликолидом. Рис. 5.7. Сырье и этапы производства полилактидов По данным исследовательской компании Pira, в 2007 г. доля полилактида в общем объеме производства всех биодеградирующих пластиков составила 43 %. Сферы применения полилактида весьма широки. Из полилактидов производят различные изделия: одноразовую посуду, обертку для конфет, пленочные материалы, упаковку типа блистерной, продукцию из вспененного материала (табл. 5.1). Пленочные материалы из биопластиков используют для мульчирования, так как они тут же в почве и перегнивают. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 258 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Упаковка из полилактида полностью разрушается за 45 дней в условиях промышленного компостинга при соблюдении ряда требований (температура не менее 60 °С, определенный уровень влажности, наличие бактерий и др.). В естественной среде процесс деградации будет длиться дольше, причем упаковка может разрушиться не полностью. Свойства ПЛ представлены в табл. 5.2. Таблица 5.1 Области практического использования полилактидов Способы переработки ПМК и типы изделий Нетканые материалы, волокна Ориентированные пленки Пленка/экструзия Эластичная пленка/экструзия, раздув Герметизирующие покрытия Инжекционное формование Пена Конечные продукты Средства личной гигиены, защитная одежда, фильтровальные материалы Этикетки, лента Посуда, упаковка пищевых и иных продуктов, пленка для мульчирования Пленка для заворачивания продуктов питания, мусорные мешки, термоусадочная пленка Подносы и лотки для пищевых продуктов Жесткая тара, упаковка для молочных продуктов Грейферы, лотки для мясных продуктов Таблица 5.2 Свойства полилактидов Свойства Физические свойства Удельный вес, г/см3 Показатель текучести, г/10 мин (190 ºС/2,16 К) Прозрачность Механические свойства Сопротивление разрыву при растяжении, фунтов/дюйм2 (МПа) Предел текучести при растяжении, фунтов/дюйм2 (МПа) Модуль упругости при растяжении, тыс. фунтов/дюйм2 (ГПа) Удлинение при растяжении, % Ударная прочность по Изоду с надрезом, фут-фунт/дюйм (Дж/м) Полимер на основе молочной кислоты 1,24 4–8 Прозрачный 7 700 (53) 8 700 (60) 500 (3,5) 6,0 0,24 (12.81) Фирмой «Cargill» освоено производство полилактида ферментацией декстрозы кукурузы мощностью до 6 тыс. т в год. В перспективе фирма планирует расширить производство до 50–150 тыс. т и снизить стоимость полилактида с 250 до 2,2 дол. за кг. Стоит отметить, что из всех представленных проектов, как полагают аналитики, наиболее успешным на данное время является проект, разработанный Cargill Dow, совместным предприятием, созданным двумя компаниями: сельскохозяйственной корпорацией Cargill Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 259 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Corporation и одним из лидеров в производстве химических продуктов компанией Dow Chemical. Cargill Dow является ведущим предприятием в производстве полимолочной кислоты – полимера, изготавливаемого из возобновляемых сельскохозяйственных ресурсов: зерновых и сахарной свеклы. В его основе лежит растительный сахар. Разработанный Cargill Dow полимер обладает хорошей прозрачностью, прочностью, влагостойкостью и так же, как и ПЭТ, не пропускает запахи. Возможная сфера применения – это различные упаковочные пленки, жесткие контейнеры и даже покрытия. Специалисты компании утверждают, что упаковка из ПЛ-полимера способна полностью разлагаться в течение сорока пяти суток при условии создания соответствующей структуры компостирования. По утверждению представителей Cargill Dow, разработанная ими технология предлагает усовершенствованный контроль структуры полимеров. Преимущество данной технологии заключается в возможности использовать в качестве сырья самые различные сельскохозяйственные сахаросодержащие культуры, которые произрастают в тех или иных регионах мира. В Европе можно использовать пшеницу или свеклу, в Америке – кукурузу или бобы. Благодаря этой технологии используются практически любые сельскохозяйственные культуры, содержащие натуральный сахар. Несмотря на все перечисленные достоинства полилактида, широкое внедрение его как полимера бытового и технического назначения до последнего времени сдерживается низкой производительностью технологических линий и, как следствие, высокой стоимостью продукции. Однако в отличие от многих своих конкурентов, биополимеры от компании Cargill Dow обрели довольно ощутимый коммерческий успех. Ряд европейских и американских компаний уже объявили о возможности использования новых полимерных материалов, в том числе для производства различных видов упаковки. Говоря о биоупаковке, создаваемой из биопластика, стоит еще отметить, что существуют и разрабатываются идеи производства не просто одноразовой биоупаковки, а пищевой упаковки, содержащей особые, убивающие патогены бактерии. Полилактид применяют для производства как одноразовой посуды, так и разнообразной упаковки, поскольку он не вреден для здоровья человека. Такие процессы активно осваивает крупная японская корпорация Ajinomoto; молочную кислоту получают сбраживанием сырья на основе пшеницы, такой биопластик идеально подходит для изготовления гибких упаковочных материалов. Эксперты Biodegradable Plastics Society полагают, что этот биопластик получит дальнейшее развитие на рынке полимерных материалов Азии. Однако ПМК уступают обычным полимерным материалам по теплостойкости, поэтому упаковка из этого материала не может быть заполнена содержимым с температурой 50 оС и выше, так как она начинает деформироваться. Кроме того, барьерные характеристики ПМК по отношению к кислороду хуже (ниже в 10 раз), чем у полиэтилентерефталата (ПЭТ), полипропилена, поливинилхлорида (ПВХ). Поэтому тара из ПМК чаще всего используется для упаковки сухих и некоторых замороженных продуктов, а также Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 260 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков жидкостей с небольшим сроком хранения. Высокий коэффициент диффузии СО2 не позволяет применять бутылки из ПМК для розлива газированных напитков и ограничивает области их использования розливом молока, фруктовых соков, воды, растительного масла. Сегодня еще рано говорить о массовом потреблении биоразлагаемых полимеров – пока они используются ограниченно, тем не менее масштабы их производства и способы улучшения технологических свойств постоянно совершенствуются. Так, недавно в Японии на основе ПЛ разработали биополимер, способный выдерживать нагревание до 300 °С и выше. Описаны пластики, полученные из возобновляемого сырья, для разрушения которых не нужен промышленный компостинг – достаточно воздействия воды или солнечного света. Канадская компания Cascades создала новую полистирольную упаковку Bioxo на основе TDPA-добавок (Totally Degradable Plastic Additives). Этот упаковочный материал полностью разрушается в течение трех лет на обычной свалке – необходимо лишь наличие кислорода, ультрафиолетового излучения и случайного механического воздействия. Фирма NNZ производит упаковочную пленку для букетов, которую можно закопать в саду, и она не только «самоустранится», но и удобрит почву. Летом 2007 г. бразильская фирма Braskem объявила о скорой коммерциализации технологии производства полиэтилена из этанола на основе сахарного тростника. По словам представителей фирмы, инновационный материал не просто похож на традиционные синтетические пластмассы – он идентичен им. К 2009 г. Braskem планирует построить завод по производству биополиэтилена мощностью 200 тыс. т в год. Основным промышленным производителем полилактидов сегодня является предприятие NatureWorks (им владеет компания Cagrill), имеющее завод биополимеров в штате Небраска (США). Это производство эксплуатируется лишь на 50 % от заявленной годовой мощности в 140 тыс. т (именно о таком показателе шла речь на открытии предприятия в 2003 г.). Используется только одна из двух производственных линий, а для запуска второй необходимы дополнительные инвестиции. Их обеспечит японская фирма Teijin, которая приобрела у компании Cagrill половину акций NatureWorks. Запуск второй линии и переход на полную мощность (возможно, даже ее превышение) запланированы на конец 2008 – начало 2009 г. NatureWorks – далеко не единственный игрок, намеренный расширить присутствие на рынке. Компания Cereplast, специализирующаяся на производстве пластичных масс из растительного сырья, объявила, что в 2008 г. в американском штате Индиана заработает ее новый завод мощностью 225 тыс. т в год. Сначала в ограниченных объемах, а к началу 2010 г. предприятие выйдет на полную мощность и, если все сложится по плану, станет крупнейшим в мире по производству биопластмасс. Департамент биотехнологий японской корпорации Toyota разработал опытный завод производительностью 1 тыс. т ПЛ в год. Эксперты компании ожидают, что к 2020 г. производство биодеградирующих пластиков превратится в глобальный бизнес стоимостью 38 млрд дол., и решили своевременно занять «место под солнцем». Промышленное предприятие Hucail в Нидерландах завершает работу по строительству завода, где Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 261 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков ежегодно будет изготавливаться не менее 50 тыс. т полилактида. В США сельскохозяйственный концерн ADM совместно с компанией Metabolix планирует построить производственный комплекс по изготовлению растительного полиэстера PHA мощностью 50 тыс. т. Procter&Gamble Chemicals тоже намерена запустить в Европе производство ферментативного PHA. В Китае уже функционирует завод по производству ПЛ, им управляет компания Tianan. Бельгийский концерн Solvay заявил о намерении инвестировать в производство поливинилхлорида (ПВХ) из биоэтанола (возобновляемого сырья на основе сахарного тростника) с годовой производительностью в 60 тыс. т. Согласно проекту, строительство производственного комплекса должно быть завершено к 2010 г. 5.4.3. Полигидроксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры гидроксипроизводстных алкановых кислот: синтез, свойства, области применения Помимо полилактидов, перспективными разрушаемыми биопластиками являются полиэфиры алкановых кислот, так называемые полигидроксиалканоаты (ПГА) – термопластичные разрушаемые линейные полиэфиры микробиологического происхождения (англоязычная аббревиатура – PHA). По сравнению с полилактидами, ПГА имеют ряд весьма существенных преимуществ: – ПГА в отличие от ПМК, получают методом прямой ферментации, их производство не требует серии технологических этапов (синтез мономеров, полимеризация, добавление пластификаторов и модифицирующих компонентов) (рис. 5.8); – сырьем для синтеза ПГА могут быть сахара, органические кислоты, спирты, смеси СО2 и Н2, продукты гидролиза растительного сырья, промышленные отходы производства сахара, пальмового масла, водородсодержащие продукты переработки бурых углей и гидролизного лигнина; – ПГА – это семейство полимеров различной химической структуры, образованных мономерами с длиной С-цепи от С4 до С12 и выше, от высококристалличных термопластов до резиноподобных эластомеров; – свойствами ПГА (кристалличность, механическая прочность, температурные характеристики, скорости биораспада) можно управлять, варьируя в процессе ферментации состав среды и задавая ту или иную химическую структуру; – ПГА подвергаются переработке из различных фазовых состояний (порошки, растворы, гели, расплавы) общепринятыми методами; – ПГА не гидролизуются в жидких средах, так как деградация ПГА является истинной биологической и происходит клеточным и гуморальным путями; более того, скоростью деградации ПГА можно управлять. Биотехнологический процесс получения полимеров этого класса заключается в культивировании штамма-продуцента в жидкой питательной Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 262 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков среде при постоянной аэрации стерильным воздухом и перемешивании в специфическом режиме при избытке углеродного субстрата в среде и несбалансированном росте, когда процесс синтеза основных (азотсодержащих) клеточных макромолекул ограничен каким-либо компонентом субстрата. В качестве продуцента используются штаммы бактерий различных таксономических групп, характеризующиеся способностью синтезировать полимеры различной химической структуры и позволяющие использовать разнообразные субстраты. Важным технологическим свойством данного продуцента является возможность замены ростового субстрата без существенной замены технологического процесса и оборудования. В качестве ростового субстрата могут использоваться: кристаллические сахара, гидролизаты растительных биомасс, органические кислоты, газовые смеси Н2 + СО2 + О2 (источником водорода может быть электролиз воды, при этом одновременно процесс обеспечивается кислородом, а источником углерода служит экспанзерная углекислота биохимических производств. В России ведущим коллективом, разрабатывающим технологии синтеза ПГА на различных субстратах, является Институт биофизики СО РАН, в котором создано первое в РФ опытное производство этих полимеров, разработана и впервые в биотехнологической практике реализована технология синтеза ПГА на синтез-газе, получаемом из бурых углей КАТЭК, а также газификацией гидролизного лигнина. Рис. 5.8. Потенциальное исходное сырье и этапы производства ПГА С ПГА связаны большие надежды, так как помимо термопластичности аналогично полипропилену и полиэтилену, эти биопластики обладают антиоксидантными и оптическими свойствами, пьезоэлектрическим эффектом и характеризуются высокой биосовместимостью. Помимо полигидроксибутирата, перспективны сополимерные ПГА, которые в зависимости от набора и соотношения мономеров имеют различные базовые свойства (степень кристалличности, температуры плавления, пластичность, механическую прочность и др.). Интерес к ПГА растет с конца 80-х гг. Это новый класс биоразрушаемых и биосовместимых полиэфиров, физико-химические свойства которых в зависимости от состава могут существенно варьировать. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 263 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Основные структуры полигидроксиалканоатов можно иллюстрировать следующим образом: n = 1 R = водород – поли (3-гидроксипропионат), R = метил – поли (3-гидроксибутират), R = этил – поли (3-гидроксивалерат), R = пропил – поли (3-гидроксигексаноат), R = пентил – поли (3-гидроксиоктаноат), R = нонил – поли (3-гидроксидодеканоат), n = 2 R = водород – поли (4-гидроксибутират), n = 3 R = водород – поли (5-гидроксивалерат). Исходя из длины углеродной цепи гидроксикислот, образующих полимеры, полиоксиалканоаты подразделяют на три основные группы: – короткоцепочечные (short-chain-length, SCL), состоящие из кислот с длиной углеродной цепи от 3 до 5 углеродных атомов; – среднецепочечные (medium-chain-length, MCL), в составе которых от 6 до 14 атомов углерода; – длинноцепочечные (long-chain-length, LCL) с содержанием кислот С17 и С18. Данное разделение полимеров на группы базируется на существующем представлении о субстратной специфичности ПГА-синтаз, акцептирующих определенные гидроксикислоты при строительстве полимерной цепи в процессе полимеризации. Последовательность реакций биосинтеза ПГА следующая: на первом этапе происходит транспорт источника углерода, необходимого для синтеза полимеров, из внешней среды в клетку, который катализируется специфическими ферментными транспортными системами, локализованными в цитоплазматической мембране или расположенными диффузно внутри клетки. Вторая фаза, включающая комплекс анаболических и катаболических реакций, конвертирует компоненты в гидроксиацил коэнзим-А, тиоэфир которого является субстратом для ПГА-синтазы. На третьем этапе ПГА синтаза (ключевой фермент биосинтеза данных полимеров) использует тиоэфиры как субстраты и катализирует образование эфирных связей между ними при участии КоА. Данное представление не допускает, что ПГА синтаза для образования полимеров также использует другие тиоэфиры гидроксикислот. Вторая фаза – очень существенна для процесса в целом, так как во время нее источник углерода конвертируется в субстраты, необходимые для синтеза ПГА. Многие бактерии способны превращать КоА последовательно в ацетацетил Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 264 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков КоА и далее – в D(-)-3-гидроксибутирил-КоА, дающий начало полигидроксибутирату. Впервые ПГА были идентифицированы французским микробиологом Maurice Lemoigne в 1925 г. Lemoigne открыл полигидроксибутират (ПГБ), один из самых изученных в настоящее время. Представитель семейства ПГА. ПГБ – термопластик высокой кристаллизации. Интерес к этому материалу появился в связи со следующим обстоятельством, – разразившийся осенью 1973 г. нефтяной кризис и последующий рост цен на нефть как не возобновляемого источника энергии и сырья привел стран-участниц OPEC, контролирующих рынок пластмасс, к пониманию необходимости поиска альтернативных нефтехимическому синтезу полиолефинов способов получения пластиков. В 1976 г. в Великобритании концерн ICI первым развернул коммерческие исследования микробиологического процесса получения полигидроксибутирата на сахаросодержащих субстратах, извлекаемых из растительных биомасс. Но не только возможность синтеза ПГБ из возобновляемого сырья стимулировала и поддерживала эти исследования. Большой интерес вызвало сообщение о том, что бактериальный полигидроксибутират термопластичен аналогично полипропилену. Выявленные другие свойства ПГБ – биоразрушаемость и биосовместимость, пьезоэлектрические свойства и возможность использования в качестве источника оптически активных молекул не только поддерживали, но и усиливали интерес ICI к бактериальному процессу получения полиоксибутирата, несмотря на то, что нефтяной кризис стал спадать. В последующие годы интерес к изучению процесса биологического синтеза полиоксибутирата возрастал. Было установлено, что ПГБ синтезируется с различными выходами многих прокариотических микроорганизмов (к настоящему времени их насчитывается свыше 300) с использованием различных субстратов. Однако для промышленного применения было выделено всего несколько высокопродуктивных и перспективных микроорганизмов, эффективно синтезирующих полиоксибутират с использованием ряда субстратов: сахаров, метанола, углеводородов, смесей водорода и углекислоты (водородокисляющие бактерии Alcaligenes eutrophus (недавно переименованные в Ralstonia eutropha), Alcaligenes latus, азотфиксаторы Azotobacter vinelandii, псевдомонады Pseudomonas oleovorans, метилотрофы Methylomonas, Methylobacterium organophilum. Полигидроксибутират и другие ПГА ассоциируются в клеточной цитоплазме в виде включений (гранул), количество и размер когторых зависит от валового содержания оплимера в клетке (рис. 5.9). Процесс синтеза и гранулообразования ПГА в клетках включает несколько этапов [8]: растворимая ПГБ-полимераза (синтаза) взаимодействует с возрастающими концентрациями 3-оксибутирил-КоA в цитоплазме, приводя к праймингу фермента. По мере роста длины цепи олигомеры далее формируются в мицеллы. Мицеллоподобные частицы дают границу раздела фаз с полимеразой, расположенной внутри. Фермент затем быстро продолжает ПОБ синтез, вытесняя большее количество ПГБ в возрастающую гранулу. Авторами установлено также, что минимальные условия, необходимые для активации синтеза ПГБ, заключаются в наличии 3-гидоксибутирил-КоA как субстрата и ПГБ-полимеразы. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 265 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Рис. 5.9. Клетки Ralstonia eutropha B 5786 из различных фаз роста периодической культуры в ходе аккумуляции ПОБ: 1 – клетки без полимера, 4-часовая культура; 2 – 10-часовая культура, 26 % ПОБ; 3 – 40-часовая культура, 54 % ПОБ; 74-часовая культура, 85 % полимера; данные Т.Г. Воловой [9] Деполимеразы, вызывающие деструкцию полимера, синтезируются микроорганизмами как внутриклеточно, так и внеклеточно. Внутриклеточная деградация полимера исследована не так детально, как синтез и внеклеточная деградация полимера, хотя этот процесс может играть решающую роль для физиологии бактерий, продукции полимера в клетке, его качественного состава. Гидролиз полимера осуществляется последовательно ферментами ПГА-деполимеразой, (Д)-оксибутират дегидрогеназой и ацетоацетил-КоАсинтазой (кетотиолазой). Продуктом деградации ПОБ являются мономеры, димеры и короткоцепочечные полимеры Д(-)-3-оксибутирата в соотношении 80–85 %, 15–20 % и следовых количествах соответственно. Димеры и мономеры Д(-)-3-оксибутирата, образованные на первом этапе деградации ПГБ, гидролизуются под действием димер-гидролаз (эстераз) до мономеров. Мономеры 3-оксибутирата превращаются под действием НАД-зависимой оксибутиратдегидрогеназы в ацетоацетат. Ацетоацетат вступает в трансферазную реакцию с сукцинил-КоА, катализируемую тиофоразой (ацетоацетат: сукцинил-КоА КоА-трансфераза), в результате которой образуется ацетоацетилКоА. Под действием кетотиолазы ацетоацетил-КоА превращается в ацетилКоА, который поступает на энергетические и анаболические нужды клетки. Чистый полигидроксибутират, однако, весьма хрупок и мало устойчив к растяжению. Недостаточные эластичность и термостабильность ПГБ затрудняют процессы его переработки, что ограничивает возможные области применения. Однако после ПГБ был выделен полимер, свойства которого отличались от ранее изученного полигидроксибутирата. Детальный хромато- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 266 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков графический анализ показал присутствие в полимере, помимо доминирующей гидроксимасляной кислоты, гидроксивалериановой, гидроксигексановой кислот в качестве минорных компонентов. Это был первый обнаруженный гетерополимерный ПГА. Открытие способности микроорганизмов к синтезу гетерополимерных ПГА явилось сильным импульсом для расширения исследований данных биополимеров. Было обнаружено, что присутствие гидроксивалерата в ПГА существенно влияет на характеристики полимера, снижая температуру плавления и кристалличность материала, делая его, по сравнению с полигидроксибутиратом, более эластичным, упругим и удобным для переработки. Изменение соотношения мономеров в ПГА сопровождается существенными изменениями термомеханических и волоконных свойств материала. После этого поиск микроорганизмов, способных синтезировать гетерополимерные ПГА, был широко развернут во многих странах. Достаточно быстро было установлено, что ряд микроорганизмов в определенных условиях роста, помимо гомогенного полигидроксибутирата, способен синтезировать различные полигидроксиалканоаты, содержащие в качестве мономерных единиц сополимеры ПГБ и других гидроксипроизводных углеводородных кислот, – гидроксивалериановой, гидроксигексановой и т. д., до мономеров, состоящих из углеродных цепей различной длины, до С12. К настоящему моменту описано свыше 100 различных ПГА, однако пока реально получаемые и исследуемые ПГА – это гомогенный полигидроксибутират и сополимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата (ПГБ/ПГВ). Выявлено, что ПГА различного химического состава обладают различной структурой и базовыми физико-химическими свойствами. В Институте биофизики СО РАН синтезирован спектр ПГА различной химической структуры и показано, как при этом изменяются физико-химические свойства материала (табл. 5.3). Таблица 5.3 Свойства полигидроксиалканоатов различного состава Полимер 3ПГБ 3ПГБ/ПГВ: мол. % ГВ 9 мол. % ГВ 14 мол. % ГВ 25 мол. % ГВ 3ПГБ/4ПГБ: 3 мол. % 4 ГБ 10 мол. % 4ГБ 64 мол. % 4ГБ 90 мол. % 4ГБ 4-ПГБ 3ПГГ/3ПГО Температура Модуль Температура кристалллиза- Юнга, плавления °С ГПа ции, °С 179 2 3,5 Кристаллличность, % 70 Прочность на растяжение, МПа 40 170 162 150 137 –1 – – – 2,9 1,9 1,5 0,7 69 62 56 – 38 37 35 30 166 159 50 50 53 61 –7 – – – –36 – – 30 100 149 – 45 – – – – 30 28 24 17 65 104 10 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 267 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Линейная структура молекул ПГА придает им свойство термопластичности и изменения прочности (возрастание по направлению растяжения). При нагревании молекулярные цепи в ПГА легко сдвигаются относительно друг друга, в результате этого материал размягчается и приобретает текучесть. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов (прессования, экструзии и др.) получать из ПГА разнообразные изделия и материалы. Следует отметить, что при переработке и прессовании широко используемых в настоящее время многих синтетических пластиков необходимы различные добавки (стабилизаторы, наполнители, красители и пр.). Этого не требуется при переработке ПГА, которые по физико-механическим свойствам сходны с полипропиленом и полистерином, однако обладают лучшими газобарьерными свойствами (например, по отношению к кислороду) и большей устойчивостью к ультрафиолету, характеризуются также хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью, при этом проницаемость водяного пара через них в 3 раза ниже по сравнению с полипропиленом. Из ПГА возможно получение гибких пленок различной толщины, в том числе полупроницаемых мембран, нитей, нетканых материалов, различных объемных форм (рис. 5.10), а также гелей и клеев. Совокупность свойств, характерных для ПГА, делает их перспективными для применения в различных сферах, – медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, радиоэлектронике и других сферах. Уже сейчас сферы применения ПГА – самые различные. Предназначены они, в основном, для изготовления упаковочного материала и тары для бытовых отходов, пищевой промышленности, косметологии, а также сельского хозяйства. Большой интерес к этим полимерам в настоящее время сложился в США. Хорошие перспективы и широкий рынок изделий из ПГА существует в косметологии, это получаемые экструзией различной формы флаконы, банки, бутыли, контейнеры и коробки. Применяют ПГА для изготовления пишущих ручек, игрушек, спортивных изделий. Отдельные ПГА образуют прочные гели и латексы. На их основе возможно изготовление клеев, наполнителей, в т.ч. для стабилизации красителей. Ламинаты ПГА с бумагой и другими полимерами хорошо зарекомендовали себя для изготовления мешков и пакетов для хранения разрушаемого мусора, а также одноразовой посуды. Такие композиционные материалы быстро разрушаются в компостах и почве. Расплавами ПГА ламинируют бумагу и картон; производят нетканые материалы, различные предметы личной гигиены (памперсы, прокладки, салфетки, тампоны и пр.). Полигидроксибутират и его сополимеры с гидроксивалератом используют для получения термоплавких адгезивных материалов, а длинноцепочечные ПГА – в качестве устойчивых при прессовании адгезивов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 268 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков Рис. 5.10. Экспериментальные образцы изделий, полученные в Институте биофизики СО РАН из ПГА (фото Т.Г. Воловой) ПГА исследуются и внедряются в различные сферы, включая необычные, например, предназначенные для использования в морской воде, где они, как установлено, подвержены биодеградации. Моножильные крученые нити из сополимеров ПГБ/ПГВ используются для изготовления рыболовных сетей, крабовых ловушек, канатов, а также в практике морской аквакультуры. Данные изделия достаточно прочны и в то же время разрушаются в морской воде. Биодеградируемые пленки из «Биопола», покрытые поливинилом, используются для выращивания морских водорослей. Такие изделия сохраняют исходные прочностные свойства в течение 3 месяцев, а смеси поликапролактона с ПГА препятствуют прикреплению водорослей в ходе эксплуатации, тем самым создавая условия для выращивания морской фауны, получения морепродуктов. ПГА имеют широкие перспективы для применения в сельском хозяйстве, это пленочная продукция и емкости для тепличных хозяйств, покрытия семян, удобрений и ядохимикатов и др. До недавнего времени высокая стоимость ПГА не позволяла применять их достаточно широко, и обоснованными были только специальные сферы (медицина и фармакология). В связи с тем, что до 40 % затрат на производство ПГА связано с затратами на углеродсодержащее сырье для выращивания микроорганизмов, основное внимание уделяется расширению и удешевлению сырьевой базы этого производства. Сырьем для получения ПГА могут быть самые разные субстраты, обладающие различной степенью восстановленности, энергосодержанием и стоимостью (табл. 5.4). В этом списке – индивидуальные соединения (сахара различной природы, спирты, кислоты, уг- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 269 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков лекислота, углеводороды), а также комплексные субстраты, включающие отходы различных промышленных и сельскохозяйственных производств. Таблица 5.4 Затраты и стоимость сырья для синтеза полигидроксибутирата Субстрат Глюкоза Сахароза Метанол Этанол Уксусная кислота Декстроза Водород Тростниковый сахар Меласса Молочная сыворотка Гемицеллюлозные экстракты Стоимость субстрата, дол. США /т 220–493 290 110 440 370–595 360 500 200 220 71 69 Выход полимера, т/т субстрата 0,38 0,40 0,18 0,50 0,33–0,38 0,33 1,0 0,33 0,42 0,33 0,20 Стоимость субстрата, дол. США /т полимера 580–1300 720 610 880 1220–1560 1180 500 660 520 220 340 Практически неисчерпаемым источником сырья для крупнотоннажного получения ПГА являются растительные биомассы, образуемые в огромных количествах ежегодно. Отходы различных сельскохозяйственных культур, содержащие полисахариды различной структуры и состава, могут быть гидролизованы с получением спектра водорастворимых сахаров. Среди них – кукурузные и соевые гидролизаты, гидролизаты вегетативной биомассы хлопчатника, целлюлозы, содержащие ксилозу и др. Использование для этих целей промышленных и сельскохозяйственных отходов позволяет решать две задачи, – снижать стоимость ПГА и сокращать объемы отходов, загрязняющих окружающую среду. Такие производства в настоящее время осваивают или планируют освоить практически все развитые страны, однако решающим для начала широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. Для этого привлекаются моноуглеродные субстраты (сахара, оргкислоты) и отходы ряда производств (производства сахара; пальмового масла, гидролизаты растительных биомасс). Прогнозные оценки зарубежных экспертов по потенциальной стоимости ПГА в зависимости от типа используемого сырья, технологии синтеза и объемов производства составляют от 2,9 до 8,3 тыс. дол США/т. Среди факторов, указывающих на то, почему эти фирмы не завоевывают российский рынок, можно указать: высокая стоимость продукта, что особенно актуально для отечественного рынка вследствие низкого среднего уровня дохода относительно стран Северной Америки, Западной Европы и Юго-Восточной Азии; направленность их усилий на за- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 270 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков воевание потребителя в уже освоенных ими регионах. Ожидается рост интенсивности конкурентной борьбы на международном рынке биополимеров и возможное общее снижение уровня цен на них в связи с организацией производства биодеградируемых полимеров в Германии и Голландии, а также Японии и ряде других развитых стран. В настоящее время все чаще появляются работы, рассматривающие в качестве сырья для ряда биотехнологических производств угли и продукты их переработки. В связи с огромными запасами и относительно низкой стоимостью данный субстрат представляет интерес и для будущих крупнотоннажных производств микробных биопластиков. Такие исследования начаты. Недавно опубликована работа по изучению продукции среднецепочечных полигидроксиалканоатов несколькими культурами Pseudomonas на средах, содержащих в качестве источника углерода продукты переработки углей – смеси гуминовых кислот. Установлено, что бактерии Ps. oleovorans способны синтезировать ПГА, содержащие гидроксигексаноат, гидроксидеканоат и гидроксидодеканоат, а бактерии Rhodobacter rubber – смеси гидроксибутирата и гидроксивалерата. Показано, что продукты гидролиза углей, полученные биологическим путем на основе культуры Trichoderma, является для Ps. oleovorans, по сравнению с продуктами химического гидролиза углей, более выгодным субстратом. В перспективе возможна организация двух-, трехэтапных биотехнологических процессов, в ходе которых на первых стадиях угли будут трансформироваться до водорастворимых продуктов, например, грибными культурами, а далее эти субстраты можно будет использовать для синтеза ПГА. Возможен другой путь использования низкосортных бурых углей в качестве исходного сырья для биосинтеза ПГА. На базе авторских штаммов водородокисляющих бактерий, обладающих резистентностью к СО (монооксиду углерода) в Институте биофизики СО РАН разработан процесс синтеза ПГА на газовом субстрате в присутствии СО и выявлен механизм СОрезистетности бактерий. Этими работами была обоснована возможность привлечения синтез-газа для получения ПГА. В Институте химии и химической технологии СО РАН оптимизирован процесс газификации углей КанскоАчинского месторождения с целью получения газового субстрата, пригодного для эффективного синтеза ПГА. Это позволило впервые в биотехнологической практике реализовать процесс синтеза биоразрушаемых полимеров на продуктах переработки углей (рис. 5.11), что открывает перспективу создания уникальной индустрии биопластиков с использованием минеральноэнергетической базы Сибири. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 271 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков C СО2 + СО + Н2 О2 Рис. 5.11. Процесс синтеза биоразрушаемых полимеров на продуктах переработки углей (фото Т.Г. Воловой) В настоящее время в сфере коммерциализации ПГА активно работают многие фирмы и промышленные компании. Первой промышленной корпорацией, начавшей освоение промышленного производства ПГА, была ICI в Великобритании; фирмы Zeneka Seeds и Zeneka Bio Product с 1992 г. начали выпуск полиоксибутирата и сополимеров оксибутирата с оксивалератом (товарное название продукта «Биопол®»). За основу был принят процесс, считающийся в то время лучшим, с использованием мутантного штамма водородных бактерий Alcaligenes eutrophus, способного усваивать глюкозу. При масштабах производства в 10–15 тыс. т в год цена Биопола достигала 16 000 дол. CША /т. Это на порядок выше стоимости полиолефинов. Широкое применение Биопола с такой стоимостью в качестве упаковочного материала проблематично и, по мнению специалистов, оправдано в специальных, например биомедицинских целях. В 1996 г. ZENEKA, переуступила свои права концернам Monsanto и Astra (США). Сегодня среди производителей малотоннажных производителей полиоксиалканоатов Монсанто КO, Metabolix Inc., Tepha, Proctor & Gambel, Berlin Packaging Corp., Bioscience Ltd., BioVentures Alberta Inc., Merk), выпускающих полимеры под марками Biopol®, BiopolTM, TephaFLEXTM, DegraPol/btc®, NodaxTM. Такие производства осваивают или планируют практически все развитые страны, однако решающим для начала широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. Большие надежды возлагаются на генетически модифицированные организмы, включая высшие растения. В рамках объединенного проекта ведущих производителей ПГА Metabolix и Monsanto In, с 2001 г. ведутся работы по созданию трансгенных растений для синтеза полимера; к 2008 г. планируется начать крупномасштабный выпуск «Биопола®» с использованием генетически модифи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 272 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков цированных растений. В связи с тем, что работы, ориентированные на оптимизацию технологии синтеза и снижение стоимости ПГА, проводятся весьма активно, области применения этого биопластика становятся приемлемыми и обоснованными не только для биомедицины. Линейка продуктов из ПГА (Metabolix) варьируется по величине молекулярной массы от 1 000 до 1 000 000 Да, а относительное удлинение при разрыве – от 5 до более чем 1 000 %. ПГА применяется в производстве биоразлагаемой упаковки и формованных изделий, нетканых материалов для одноразовых салфеток и средств личной гигиены, пленок и волокон, клейких веществ и покрытий, связующих материалов для металлических и керамических порошков и водостойких покрытий для бумаги и картона. Наиболее привлекательным коммерческим свойством ПГА является разрушаемость в биологических средах до конечных продуктов, безвредных для биоты: в аэробных условиях до СО2 и Н2О, в анаэробных условиях – до СН4 и Н2О. Тонкостенные предметы из ПГБ медленно разрушаются в течение нескольких лет в земле при средней температуре 8–15 °C. В компосте – более быстро, а при использовании дополнительных средств при температуре 50–65 °C предметы из ПГБ разрушаются в течение нескольких недель. В 2008 г. компания Metabolix (Кембридж, штат Массачусетс) выпускает на рынок новую линейку разрушаемых биопластиков под маркой Mirel. Компания Metabolix Inc выпускает на рынок три новых марки Mirel: Mirel P1001 и P1002 для литья под давлением и Mirel P2001 – аналог бумажной упаковки. Mirel P1001 для литья под давлением должен заменить термопласты типа пенопласта, а Mirel P1002 заменяет полиолефины типа полипропилена. Эти марки сырья могут перерабатываться на обычном литьевом оборудование. Mirel P2001 планируется использовать для производства одноразовых бумажных чашек и различной упаковки для продуктов. Metabolix Inc в кооперации с компанией Archer Daniels Midland Company (ADM) в конце 2008 г. в городе Клинтон штат Айова в целях коммерциализации своей ферментационной технологии запускают производство этого типа разрушаемого биопластика объемом 55 тыс. т/год. Для разработки нового продукта подписан договор с австралийским Центром исследования сахара. Затраты на производство оцениваются менее 3,67 дол. США за кг биопластика. Metabolix активно сотрудничает с компанией British Petroleum в целях дальнейшего развития прямого производства пластиков с использованием сахаросодержащих продуктов переработки проса. Технология получила поддержку на государственном уровне от Департамента сельского хозяйства США и в рамках Программы разработки перспективных технологий Департамента торговли США. Новые типы разрушаемых пластиков семейства полигидроксиалканоатов (ПГА) разрабатываются компанией Procter & Gamble, стратегия которой, в отличие от Metabolix, нацелена на разработку другой разновидности ПГА-биополимеров, производимых ферментацией сахаров и жирных кислот и выпускаемых под маркой NodaxTM. Эти биопластики представляют собой сополимеры гидроксибутирата и гидроксигексаноата (ПГБГ) и тройные сополимеры гидроксибутирата/гидроксигексаноата/гидроксидеканоата. По сравнению с Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 273 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.4. Объемы производства и области применения разрушаемых биопластиков полимерами типа Biopol биополимеры Nodax схожи с ПЭНП и характеризуются наличием боковых ответвлений от основной цепи, при этом содержание мономеров в ПГА варьируется в диапазоне от 2 до 24 % в зависимости от числа атомов углерода в боковых ответвлениях – от 6 до 24 атомов (С6–С24). Как следствие, биопластики Nodax имеют меньшую, по сравнению с Biopol, температуру плавления и стеклования, кристалличность, что облегчает переработку полимера. Их барьерные свойства такие же, как и у полиэтилена высокой плотности. Промышленного производства в настоящее время нет. Прогнозная цена Nodax от 2,50 до 3,8 дол./кг. 5.5. Перспективы развития индустрии и рынка разрушаемых биополимеров В Европе внедрение биоразлагаемых упаковочных материалов и создание благоприятных условий для развития индустрии биополимеров – вопрос государственной важности. В ряде стран Западной Европы, в частности в Германии, основным стимулом для развития этого направления являются налоговые льготы для производителей, использующих биоразлагаемые материалы в производстве упаковки. В Дании и Ирландии введен налог на продуктовые сети за употребление полиэтиленовых пакетов. Ограничения или запреты на их использование начинают действовать, помимо США и ЕС, в таких государствах, как Бангладеш, Сингапур, Тайвань и ряде штатов Индии. Кнессет Израиля обсуждает законопроект, возбраняющий раздачу бесплатных ПЭТ-пакетов в торговых заведениях. Китайские власти заявили, что с 1 июня 2008 г. нельзя будет производить тонкие пакеты из синтетических полимеров и использовать их в розничных точках. Австралия намерена ввести аналогичный запрет к концу 2008 г. Однако ситуация с пакетами – лишь частный случай, можно взглянуть и шире. Представитель Министерства сельского хозяйства Франции Жульет Турин (Juliet Turinne) в ноябре 2007 г. выступила в Берлине перед участниками 2-й Европейской конференции по использованию биополимеров. Она рассказала, что французские власти не только понимают необходимость внедрения биоразлагаемых полимеров, но и предпринимают конкретные шаги в этом направлении. Во-первых, они создают благоприятные условия для развития сельскохозяйственного производства сырья для биополимеров. Вовторых, планируют в ближайшее время внедрить систему налогов и сборов, которая бы стимулировала производителей к использованию биоразлагаемой упаковки. Соответствующий закон, ранее отклоненный Европейской комиссией, сейчас находится на стадии доработки и усовершенствования. Втретьих, разрабатываются стандарты оформления этикетки для биоразлагаемых продуктов с целью информирования потребителей, стимулирования продаж и правильной утилизации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 274 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЫХ МАТЕРИАЛОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА, ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ 5.5. Перспективы развития индустрии и рынка разрушаемых биополимеров Министерство Германии по охране окружающей среды проявило политическую инициативу, направленную на создание оптимальных условий для компостинга биоразлагаемых полимеров. Планируется разработать, а затем реализовать национальную стратегию переработки органических отходов. Федеральное правительство Германии намерено представить разработанную стратегию на европейском уровне. В странах Евросоюза органические отходы составляют порядка 38 % всего городского мусора, что в количественном выражении составляет порядка 120 млн т в год. В России ситуация с внедрением биоразлагаемых полимеров пока не внушает оптимизма. Производители упаковки считают, что это «дело неопределенно далекого будущего». Сегодня в РФ в связи с отсутствием у общества информации и мнений о разрушаемых биопластиках необходимо начать формирование мнения о необходимости перехода на разрушаемые пластики, далее – создать условия для появления заинтересованности в таких производствах у производителей пластмасс. Поэтому организация первого производства разрушаемых биопластиков в Красноярском регионе может стать важным элементом для постепенной переориентации рынка пластиков в РФ. Наличие у коллектива исследователей Красноярского научного центра СО РАН и Сибирского Федерального университета приоритетного научного задела в различных областях биотехнологии ПГА, созданной научно-практической основы, включая первое в РФ опытное производство биопластиков, и с учетом уникальной энергетической и сырьевой базы Сибири в перспективе могут обеспечить Красноярскому региону уникальную возможность лидерства на рынке биоразрушаемых пластиков в РФ. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 275 Г ЛА В А 6 СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Традиционная биотехнология зародилась десять-двенадцать тысяч лет назад, когда закончилось последнее оледенение. Веками человек использовал микроорганизмы для выпечки хлеба, приготовления пива, сыра, выращивания сои, производства вина, витаминов. Интерес к производству пищевых продуктов не ослабевает и в наше время, но эти производства перешли на новый уровень с использованием всех новейших достижений современной биологии. Разрабатываются биотехнологии получения экологически чистой пищи для обеспечения сбалансированного питания как на основе высших растений, так и с помощью микробиологического синтеза. 6.1.1. Продукты биотехнологического производства Продукты биотехнологии являются результатом функционирования биологических систем для технических и промышленных процессов. Сюда относятся как традиционные организмы, так и организмы, явившиеся результатом генной инженерии. Растения являются наиболее дешевым продуцентом белков и других продуктов питания. Стоимость белка, полученного путем сельскохозяйственного культивирования сои или кукурузы, составляет менее 1 дол./кг. В то время как использование в настоящее время микробных клеток в закрытых системах (ферментерах) и особенно культивируемых клеток животных в качестве продуцентов фармацевтических белков обходится в сотни и тысячи раз дороже. Поэтому исследования последних лет имели целью, с одной стороны, показать возможность получения биологически эквивалентных форм того или иного белка в трансгенных растениях, а с другой, – повысить содержание белка и облегчить и удешевить его последующую очистку. К настоящему времени уже показано, что растения могут производить белки животного происхождения, такие как энкефалин, моноклональные антитела, специфичные для бактерий, вызывающих зубной кариес. Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту. Из других белков животного происхождения, которые представляют интерес для медицины, показана продукция в растениях человеческого Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 276 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта β-интерферона. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы В-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины против такого заболевания, как холера. Причем в случае холеры иммунизация вполне эффективно происходит при пероральном приеме вакцины. Генетическая инженерия метаболизма растительных жиров уже привела к новым коммерческим продуктам. Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты – основной компонент растительного масла. В 1995 г. была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-членными жирными кислотами также и до 45 % 12-членной жирной кислоты – лауриновой. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики. Дальнейшее изучение специфики биохимического синтеза жирных кислот, по-видимому, приведет к возможности управлять этим синтезом с целью получения жирных кислот различной длины и различной степени насыщения, что позволит значительно изменить производство детергентов, косметики, кондитерских изделий, затвердителей, смазочных материалов, лекарств, полимеров, дизельного топлива и многого другого, что связано с использованием углеводородного сырья. Однако одной из бурно развивающихся отраслей биотехнологии считается технология микробного синтеза ценных для человека веществ. По прогнозам, дальнейшее развитие этой отрасли повлечет за собой перераспределение ролей растениеводства и животноводства, с одной стороны, и микробного синтеза, с другой, в формировании продовольственной базы человечества. Львиную долю продуктов, созданных на основе современных биотехнологий (генетической инженерии), составили фармацевтические белки, прежде всего инсулин, альфа-интерферон, антиген вируса гепатита В, эритропоэтин, фактор стимулирования гранулоцитов и многие другие вещества. В этих молекулах заключена такая мощь, что у множества разнообразных заболеваний, еще пять лет назад бывших неизлечимыми, появляется совершенно иной прогноз. Например, достигнут существенный прогресс в борьбе с раком и возрастной слепотой – заболеваниями прежде неизлечимыми. Несколько лет назад в стадии клинических испытаний находилось менее 10 противораковых препаратов, большинство из которых представляли собой высокотоксичные средства химиотерапии. Сегодня испытания с участием людей проходят более 400 противораковых лекарств, и почти все они – целевого действия, на основе биотехнологий и с минимальными побочными эффектами. На основе биотехнологий создано 230 лекарственных препаратов и сопутствующих продуктов, включая лекарства от бессонницы, множественного склероза, острой боли, хронической болезни почек, недержания, язв полости рта и рака. Ни для одного раздела медицины биотехнология не сделала так много, как для онкологии. С появлением новых лекарств, которые уничтожают Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 277 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта только клетки опухоли, почти не повреждая здоровые ткани, изменилась вся парадигма лечения рака. Теперь медицина рассматривает рак как хроническое, поддающееся лечению заболевание. Только в 2004 г. FDA одобрила четыре целевых препарата против рака – Avastin, Tarceva, Iressa и Erbitux. Применение Avastin от компании Genentech позволяет продлить жизнь пациентов с раком легких, груди и кишечника – первейшая задача для всякого препарата от рака. Создано и выпущено на рынок множество новых биотехнологических продуктов, повышающих урожайность сельскохозяйственных культур и продуктивность сельскохозяйственных животных. Продуктами биотехнологии являются возобновляемые источники энергии – различные виды биотоплива. Налажено производство этанола из сырья, содержащего сахарозу, глюкозу, фруктозу, другие моно- или олигосахариды, крахмал или целлюлозу, с помощью дрожжей или бактерий. В настоящее время этанол все в большей мере применяется в качестве экологически чистого моторного топлива. Поставлено производство бутанола и ацетона с использованием бактерий-бродильщиков рода Clostridia. Технология производство водорода испытана пока только в масштабе лаборатории. Получение метана, или биогаза, осуществляемое смешанной микробной культурой, устраняет отходы, угрожающие планете, и производит ценное газообразное топливо, заменитель природного газа. Перспективно производство длинноцепочечных углеводородов (бионефти) из биомассы углеводородсинтезирующих одноклеточных водорослей. Эти водоросли могут быть выращены в биореакторе в виде чистой культуры. Их можно также культивировать в составе природных экосистем в озерах, прудах или лагунах. Продолжают развиваться процессы получения традиционных биотехнологических продуктов, к которым можно отнести антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений, ферменты, аминокислоты, витамины и т.д. Молекулы антибиотиков очень разнообразны по составу и механизму действия на микробную клетку. При этом в связи с возникновением устойчивости патогенных микроорганизмов к старым антибиотикам постоянно существует потребность в новых. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами. Микроорганизмы способны осуществлять реакции трансформации, в которых те или другие соединения превращаются в новые продукты. Условия протекания этих реакций мягкие, и во многих случаях микробиологические трансформации предпочтительнее химических. Пример существующих крупномасштабных промышленных биоконверсий – производство уксуса из этанола, глюконовой кислоты из глюкозы. Широко используется микробная модификация стероидов, которые являются сложными полициклическими липидами. Теперь с использованием биоконверсии получают кортизон, гидрокортизон, преднизолон и целый ряд других стероидов, что в сотни раз снижает себестоимость производства стероидов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 278 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Пока получение ферментов с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки продуцируют более 2 тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки. В мире производится около 20 ферментов в объеме 65 тыс. т (а существует, как предполагают 25 000 ферментов). Например, промышленным способом производят такие ферменты, как амилаза, глюкоамилаза, протеаза, инвертаза, пектиназа, каталаза, стрептокиназа, целлюлаза, липаза, целлюлаза, оксидаза и др. Использование иммобилизованной глюкозоизомеразы для непрерывного получения глюкозы является наиболее крупным процессом такого рода в мире. Микробные ферменты активно используют в клинической диагностике при определении уровня холестерина в крови и мочевой кислоты. Ферменты предлагают использовать для очистки канализационных и водопроводных труб и во многих других сферах человеческой деятельности. Ферменты для медицинских или аналитических целей должны быть высокоочищенными. Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов. Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза. За рубежом 60 % мощностей по производству аминокислот занимает глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получают в промышленном масштабе – итаконовая, молочная, уксусная, лимонная. Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту получают микробиологическим путем. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроорганизмы являются также ценным источником получения никотиновой кислоты (витамин РР). Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят) и могут использоваться в разных отраслях промышленности, сельского хозяйства, медицине. Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoс. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований – сефадексов и других молекулярных сит. Одним из перспективных биодеградируемых полимеров, синтезируемых бактериями, являются полигидроксиалканоаты. Область ис- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 279 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта пользования этого класса полимеров широка – от сельского хозяйства до медицины. С молекулярной биотехнологией человечество связывают самые большие надежды и по возможности точной диагностики, профилактики и лечения множества инфекционных и генетических заболеваний, и по значительному повышению урожайности сельскохозяйственных культур, и по многим другим до сих пор нерешенным проблемам. К сожалению, львиную долю стоимости производства зачастую составляет не наращивание биомассы, а последующие процессы выделения и очистки продукта. Стоимость очистки тем выше, чем ниже концентрация вещества в клетках. Это особенно важно в случае фармацевтических препаратов, требующих высокой степени чистоты. В данной главе будет рассматриваться последняя стадия получения целевого продукта – его выделение. Эта стадия существенно различается в зависимости от локализации продукта и его химической природы. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой продукт локализуется в клетке, то необходимо использовать более сложный подход к его извлечению из клетки. 6.1.2. Общие принципы разделения веществ Независимо от локализации целевого продукта, на первом этапе его очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Иногда сепарации предшествует специальная обработка – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков или флокуллянтов для более эффективного отделения биомассы и стабилизации продукта. Существует несколько способов сепарации. Флотация (буквально – плавание на поверхности воды) – разделение мелких частиц и выделение капель дисперсной фазы из эмульсий. Основана она на различной смачиваемости частиц (капель) жидкостью (преимущественно водой) и на их избирательное прилипании к поверхности раздела, как правило, жидкость – газ (очень редко: твердые частицы – жидкость). Основные виды флотации – пенная, масляная и пленочная. Наибольшее распространение в биотехнологии получила пенная флотация, которая заключается в следующем: культуральную жидкость с биомассой микроорганизмов непрерывно вспенивают воздухом, подаваемым снизу вверх под давлением. Клетки и их агломераты «прилипают» к пузырькам тонкодиспергированного воздуха и всплывают вместе с ними, собираясь в специальном отстойнике. Этот метод идеален для сахаромицет (хлебопекарные дрожжи), которые Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 280 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность. Использование метода флотирования обеспечивает надежность непрерывного выделения дрожжей из культуральной жидкости, сокращает число сепараторов и, соответственно, эксплутационные расходы. Фильтрация. В этом методе используется принцип задержки биомассы на пористой фильтрующей перегородке. В настоящее время используются разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом эффективность фильтрации практически не снижается, так как по мере прохождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипания частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре скорость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывного действия, рассчитанных на длительное действие, предусматривают системы автоматического удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Такой способ удаления биомассы характерен для барабанного вакуум-фильтра. Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или многократного периодического использования. Среди них выделяют мембранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень разбавленных растворов. Однако проблемой использования таких фильтров является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, так как они быстро разрушаются. Одним из путей преодоления этих проблем является покрытие мембран гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по производству мембранных фильтров и существуют огромное количество фирм, которые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии. Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды, зависят от природы продуцента. Например, дрожжи рода Candida, служащие источником кормового белка, плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме (от выделения его из культуральной жидкости отказались в принципе): содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Физическое осаждение. При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осажда Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 281 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта ется добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно. Центрифугирование. Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Центрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем вышеперечисленные методы сепарации. Поэтому оно оправдывает себя, если, во-первых, суспензия фильтруется медленно, вовторых, необходимо максимально освободить культуральную жидкость от частиц, в-третьих, необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический режим. Центрифугирование и фильтрация могут проходить одновременно, этот процесс реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспективны для осаждения – центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждается на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки. Если продукт содержится в культуральной жидкости, то эта жидкость далее подвергается переработке. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод. Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор. 6.1.3. Методы разрушения клеток Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления). Физические способы разрушения клеток более экономичные, чем химические и химико-ферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта. Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтерауксусной кислоты или других детергентов, Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 282 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта клетки дрожжей – зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномицетов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом. За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок. Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Однако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта. 6.1.4. Отделение и очистка продукта Выделение целевого продукта из культуральной жидкость или из гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции. Осаждение может быть физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ). Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50 %-й этанол осаждает 80 % протеазы и 3-5 % амилазы, 70 %-й спирт осаждает 98 % амилазы. Высаливание – механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия. Экстракция – процесс избирательного извлечения одного или нескольких растворимых компонентов из твердых тел и растворов с помощью жидкого растворителя – экстрагента. Различают твердо-жидкостную и жидко-жидкостную типы экстракции. При твердо-жидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидко-жидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Жидко-жидкостную экстракцию органическими растворителями часто применяют для извлечения из культуральной среды антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В12 экстрагируют фенолом, высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие фосфолипиды как фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин извлекаются хлороформом. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 283 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной экстракции свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, нагреванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости, понижением давления в аппарате для экстракции. Экстракция хлороформом используется при выделении из бактериальной биомассы полигидроксиалканоатов (ПГА). Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. Сырую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хлороформа и оставляют на 15–20 ч в ёмкости при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а остаток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления полноты экстракции. Второй подход, используемый в лабораторных условиях: предварительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата «Сокслет» и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов. В колбу заливается экстрагент, обычно органический растворитель. При нагревании колбы растворитель испаряется, его пары поднимаются вверх, конденсируются на холодильнике, и растворитель попадает в патрон с пробой. После заполнения патрона до определенного объема растворитель с экстрагируемым веществом сливается в колбу, и процесс многократно повторяется. Во многих случаях процесс нагревания может быть губительным для целевого продукта. Для предотвращения этого используется криоэкстракция, которая осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находящимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Для экстракции неполярных соединений используют жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном нагревании до 0 °С растворитель улетучивается, и остается продукт в чистом виде. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: катионит – карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); анионит – диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму. 6.1.5. Методы тонкой очистки и разделения препаратов Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами. Наибольшее распространение получила хроматография. Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos – цвет, краска и -графия) – физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. По технике выполнения хрома Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 284 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта тографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных колонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумажной – на специальной бумаге. Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью до 5–7 %. В зависимости от природы подвижной фазы (ПФ), тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения. Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промышленностью, размером 5х15 или 20х20 см. На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3–5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой. Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестицидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН. При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно около 10 см) и высушивают. Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 285 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ-свете (например, пестициды). Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей). Величина Rf рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению Rf = а/б, (6.1) где а – расстояние от стартовой линии до центра пятна; б – расстояние, пройденное за это же время растворителем. При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «свидетелю». Стандартное вещество (свидетель), наличие которого предполагают в анализируемой смеси, наносят на линию стандарта рядом с исследуемой пробой. Таким образом, стандартное вещество хроматографируется в тех же условиях. После хроматографирования и детекции пятен сравнивают величины Rf определяемого вещества и «свидетеля». Количественное определение в ТХС может быть проведено непосредственно на пластинке или после удаления веществ с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества. Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 286 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Рис. 6.1. ТСХ липидов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252 (слева) и изолята Botryococcus озера Шира (справа). Система растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1 по объему). С – стандарт, 0 – начало роста, I – 6 суток, II – 13 суток, III – 24 сутки, IV – 38 сутки. 1 – полярные липиды, 2 – диациглицерины, 3 – стерины, 4 – свободные жирные кислоты, 6 – триацилглицерины, 7 – МЭЖК в стандарте, 8 – эфиры стеринов, 9 – углеводороды, X и Х1 – неидентифицированные фракции [3, 22] В качестве иллюстрации метода приведена тонкослойная хроматограмма липидов углеводородсинтезирующих штаммов Botryococcus braunii Kutz, иллюстрирующая изменения состава липидов в процессе роста водоросли и изолята озера Шира (рис. 6.1). Хроматография на бумаге. По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную, осадочную и другие виды бумажной хроматографии (БХ). В распределительной жидкость-жидкостной хроматографии бумага, приготовленная из специальных сортов хлопка, выполняет роль носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто выступает вода, адсорбированная парами бумаги. В таком случае гидрофильная бумага используется для нормально-фазовой хроматографии. Растворителями – подвижной фазой (ПФ) - являются спирты (метанол, этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны (ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилацетат), пиридин, хлороформ. Чаще используются смеси растворителей. Для разделения некоторых органических веществ используют метод обращенных фаз. В этом методе для придания бумаге гидрофобного характера ее импрегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, силиконом и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворителей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спиртами. Обращенно-фазовая бумажная хроматография используется, например, для разделения и идентификации полиненасыщенных жирных кислот при Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 287 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта изучении состава липидов, выделенных из животных и растительных тканей. Бумагу пропитывают 5 %-м раствором силикона, в качестве ПФ используют 85 %-й раствор уксусной кислоты. Разделение веществ в распределительной БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов при многократном повторении актов экстракции и сорбции. Скорость перемещения компонентов зависит от их коэффициентов распределения (как и в методе экстракции). По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нисходящую и радиальную (круговую) хроматографию. Если элюент движется по бумаге вверх, метод называют восходящей бумажной хроматографией; при его движении сверху вниз – нисходящей бумажной хроматографией. Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом радиальной бумажной хроматографии, в котором используется бумажный круг с фитилем, опущенным в элюент. Иногда при сложном составе пробы не удается разделить ее компоненты с помощью одного растворителя. Тогда применяют двумерную хроматографию. В угол квадратного листа хроматографической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в одном элюенте, затем, повернув хроматограмму на 90 град, – в другом. Первый элюент производит предварительное разделение компонентов пробы, второй – окончательное. Для проведения хроматографии на бумаге используют стеклянные герметизированные камеры. Внутри камеры в верхней (нисходящий вариант) или нижней ее части (восходящий вариант) помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Радиальную хроматографию можно осуществить в чашке Петри. Детекцию зон, идентификацию и количественное определение в БХ проводят так же, как и в методе тонкослойной хроматографии. Методом распределительной жидкостной бумажной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, пептидов, пестицидов, фенолов, красителей, синтетических поверхностно-активных веществ. Колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые, можно делить продукты согласно их заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография). Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография (ИХ) является разновидностью жидкостной хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной хроматографии. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 288 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта В основе ионообменной хроматографии лежит процесс обмена между ионами анализируемого раствора (ПФ) и подвижными ионами того же знака ионообменника (НФ) (рис. 6.2). Разделяемая смесь Смесь с вычетом адсорбированных ионов а б Рис. 6.2. Катионообменная хроматография (схематизировано: изображено поверхностное электростатическое взаимодействие с частицами): а, б – две стадии процесса В качестве ионообменников или ионитов обычно используют синтетические полимерные вещества, называемые ионообменными смолами. Они состоят из матрицы и активных групп, содержащих подвижные ионы. В зависимости от знака обмениваемых ионов различают катиониты и аниониты. Катиониты содержат кислотные группы различной силы, такие как сульфогруппы, карбоксильные, оксифенильные. Аниониты имеют в своем составе основные группы, например алифатические или ароматические аминогруппы различной степени замещенности (вплоть до четвертичных). Иониты могут находиться в Н-форме и ОН-форме, а также в солевой форме. В Н-форме катиониты и ОН-форме аниониты содержат способные к обмену ионы водорода и гидроксила соответственно, в солевых формах ионы водорода заменены катионами металла, анионы гидроксила – анионами кислот. В зависимости от силы кислотных и основных групп в ионитах различают сильнокислотные (R-SO3Н) и слабокислотные (R-СООН) катиониты; сильноосновные (R-N(СН3)3ОН) и слабоосновные (R-NН3ОН). Сильнокислотные и сильноосновные иониты способны к ионному обмену в широком диапазоне рН. Процесс ионного обмена протекает стехиометрично. Например: R-SO3H + Na+ = R-SO3Na + H+ R(NН3)3ОН + Сl- = R(NН3)3Сl + ОН- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 289 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Это ионообменное равновесие характеризуется константой ионного обмена: K + + = H Na [H + ][RSO3 Na] [OH − ][R(NH3 )3Cl] ; K . = H + Na + [Na + ][RSO3H] [Cl− ][R(NH3 )3OH] (6.2) На основании констант ионного обмена построены ряды сродства ионов к данному иониту, позволяющие предвидеть возможности ионообменных разделений. В зависимости от сродства к фиксированным ионам неподвижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической колонки с различными скоростями; чем выше сродство, тем больше объем удерживания компонента. При разделении органических кислот и оснований важную роль играет степень их диссоциации. Для двух веществ, имеющих разные константы обмена, рассчитывают фактор разделения или коэффициент распределения, который характеризует селективность ионита: fа/ b= KA/KB, (6.3) где fa/b – фактор разделения; KA, KB – константы ионного обмена веществ А и В. Чем больше фактор разделения, тем сильнее ионит удерживает вещество А. Например, константы ионного обмена солей железа (III) и кобальта (II) на сильнокислотном катионите марки КУ-2 составляют 3726 и 286 соответственно, тогда fFe3/Co2+ = 13. Таким образом, можно сделать вывод о том, что катионит КУ-2 более селективен к ионам железа (III). Важной количественной характеристикой ионитов является их обменная емкость. Полная обменная емкость определяется количеством эквивалентов ионов, обмениваемых одним граммом сухого ионита. Чем больше обменная емкость, тем большую пробу можно ввести в колонку с ионитом. При подготовке ионитов к работе их переводят в соответствующую форму. Так, для перевода катионита в Н-форму через колонку с набухшим ионитом пропускают раствор сильной кислоты, избыток которой отмывают водой. Затем медленно пропускают раствор смеси ионов. Каждый катион задерживается на ионите согласно своей сорбируемости. Далее пропускают подходящий элюент. Например, катионы щелочных металлов легко элюируются 0,1 М HCl. При этом ионы водорода обмениваются на сорбированные катионы, которые вместе с раствором выходят из колонки в соответствии с константами ионного обмена. На выходе из колонки фракции собирают в отдельные сосуды и определяют содержание любым подходящим методом. Иониты применяются для деионизации (обессоливания) воды, очистки сахарных сиропов от минеральных солей; в препаративной химии – для концентрирования растворов; для определения ионов железа (III), меди и свинца в вине; кальция и магния в молоке; различных металлов в биологических жидкостях. Кроме того, ионный обмен используют для перевода ионов в форму, удобную для количественного определения. Ионообменную хроматографию применяют для разделения фенолов, карбоновых кислот, аминокислот, аминосахаров, пуриновых, пиримидиновых и других оснований. Часто Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 290 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта иониты используют для предварительного разделения сложных смесей на менее сложные. На ионном обмене основано получение ионнитного молока для детского питания. Ионный обмен используют для очистки натуральных соков от ионов тяжелых металлов. Ионообменные смолы применяют для получения ионообменных мембран. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков или других соединений по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми (рис. 6.3). В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Таким образом, при помощи гель-фильтрации можно разделить смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы. Гельпроникающая хроматография на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых витаминов перед их определением методом ВЖХ. Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело–антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата. а б Рис. 6.3. Хроматография на основе «молекулярных сит» (компоненты, размеры которых соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на колонке): а, б – две стадии процесса Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 291 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта а б Рис. 6.4. Аффинная хроматография (в виде частиц различной формы изображены молекулы с различными химическими структурами, из которых только одна вступает в специфическое взаимодействие с частицами геля. Показано, что в выемки на частицах геля входят лишь молекулы комплементарной формы): а, б – две стадии процесса Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, экстракта клеток – в одну стадию, в то время как более традиционные методы осаждения и ионообменной хроматографии требуют многоэтапной очистки, сопряженной с большими затратами труда и времени. Определенные неудобства вызывает относительная дороговизна материалов для аффинной хроматографии, в частности, веществ, используемых в качестве лигандов. Проблемой является также быстрый выход колонки из строя при пропускании через нее смесей, компоненты которых забивают промежутки между гелевыми частицами. Поэтому в производственных условиях колонки используются в периодическом, а не в непрерывном режиме. После пропускания через колонку порции культуральной жидкости, из которой выделяют продукт, частицы геля подвергают очистке. Методы очистки основаны: а) на использовании гелевых частиц, превышающих по плотности конгломераты веществ, закупоривающих колонку (различие в плотности позволяет очистить гель путем его избирательного осаждения или проточной промывки, уносящей только загрязняющие частицы); б) на придании частицам геля магнитных свойств, что позволяет провести их очистку в градиентном магнитном поле; в) на упаковке частиц геля в виде ленты, покрытой тонкоячеистой оболочкой (лента вращается и проходит попеременно через жидкость с неочищенным продуктом и через буферный раствор, в который переходят загрязняющие примеси). Масштабирование процесса аффинной хроматографии ограничивается разрушением структуры геля и уносом его частиц током жидкости. Это в частности обусловлено тем, что в широких колонках для крупномасштабной очистки продуктов стенки колонки уже не служат опорой для частиц геля, увлекаемых жидкостью. Увеличение высоты колонки приводит к пропорцио Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 292 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта нальному возрастанию сил, разрушающих нижние слои геля. Помимо этого, для повышения эффективности и степени разделения близких по свойствам соединений целесообразно применять мелкие частицы геля (менее 1 мкм в поперечнике), но именно такие частицы легче всего увлекаются током жидкости. В последние годы изыскивают средства укрепления гелей для крупномасштабной аффинной хроматографии. Частицы агарозы – наиболее перспективного материала для гелей – предполагают укреплять путем сшивок. Наряду с аффинной хроматографией, называемой также аффинной адсорбцией в геле, для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов предполагают применять аффинную преципитацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. Аффинное разделение основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера. Один из полимеров, например полиэтиленгликоль, несет специфические лиганды. Другой полимер, например высокомолекулярный декстран, обладает сродством к остальным, примесным компонентам. Так, содержащиеся в разделяемой смеси белки, нуклеиновые кислоты, фрагменты клеточных структур предпочитают более полярный декстран, тогда как целевой продукт, скажем, фермент, накапливается «в сетях» полиэтиленгликоля, несущего молекулы лиганда (субстрата, кофактора, ингибитора). Аффинное разделение – наиболее высокоэффективный из аффинных методов очистки Гидрофобная хроматография. В ходе создания носителей для аффинной хроматографии были проведены контрольные опыты, в которых изучалось поведение матриц, содержащих удлиняющие мостики, но без лиганда. Оказалось, что в некоторых случаях ферменты прочно связывались с гексаметиленовыми мостиками. Этот факт послужил основой для развития методов гидрофобной хроматографии, основанных на связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхности белковой глобулы. Гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышением концентрации соли. Максимальное усиление вызывают соли, проявляющие наибольшую активность при высаливании, такие как сульфат аммония. Это объясняется тем, что в основе обоих процессов лежат одинаковые механизмы. При высаливании основной причиной агрегации является усиление гидрофобных взаимодействий между белками. Следовательно, при высоких концентрациях соли большинство белков будут адсорбироваться на гидрофобных группах, связанных с матрицей. Элюцию проводят понижающимся градиентом концентрации соли. Белки, которые прочно адсорбируются, обычно удаляют с колонки, добавляя в элюирующий раствор этиленгликоль. Наряду с хроматографией перспективными для биотехнологии методами разделения веществ служат электрофорез и его модификации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 293 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х гг. был разработан модифицированный метод электрофореза – электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент – додецилсульфат натрия или ДСН (SDS). Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Например, белки идентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 294 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта Рис. 6.5. Мини-камеры для горизонтального и вертикального электрофореза Mini-PROTEAN® Tetra System и камера Protean: резервуар для буфера, держатель кассет гелей с системой охлаждения и кассеты гелей со стеклами, закрепленный на заливочном приспособлении (фирма Bio-Rаd) Аппаратура для гель-электрофореза может различаться конструктивно при неизменности принципов разделения. Существует огромное количество фирм, поставляющих оборудование для электрофореза. Наиболее известна фирма Bio-Rаd, небольшая часть продукции которой представлена на рис. 6.5. Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1 000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты. При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент – меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента – мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит. Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой – значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гельэлектрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 295 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении, перпендикулярном тому, что был на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН, и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецилсульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко. Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора. При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить. Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S. Скорость вращения до 80 000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500 000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количество входящих в их состав субъединиц. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 296 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для определения количественных и качественных характеристик целевых продуктов биотехнологии Приоритет открытия хроматографии принадлежит российскому ученому Михаилу Семеновичу Цвету. 21 марта 1903 г. М.И. Цвет прочитал свой знаменательный доклад «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу» (Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т. 14. С. 1–20). Эксперименты в области адсорбции, приведшие в итоге к открытию хроматографии, ученый начал двумя годами раньше – в возрасте 28 лет. Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г. в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г. «Хромофиллы в растительном и животном мире». Однако вплоть до 40-х гг. хроматография не получила должного развития. Лишь в 1941 г. А. Мартин и Р. Синг открыли метод распределительной хроматографии и показали его широкие возможности для исследования белков и углеводов. А в 50-е гг. А. Мартин и американский учёный А. Джеймс разработали метод газожидкостной хроматографии. По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия оказались столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами – Ломоносова, Менделеева, Бутлерова и Семенова, – в числе ста выдающихся химиков прошлого. В настоящее время хроматография представляет собой: – самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц; – уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей; – самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения; – препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде; – мощную отрасль научного приборостроения. Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены бо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 297 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии лее 1 000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2 000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе «Геном человека». Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анализа атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого одной живой клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контроле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов производства. В биотехнологии хроматография является основным процессом выделения вирусов гриппа, энцефалита, бешенства и ящура, очистки вакцин, промышленного производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллеренов, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмид, ДНК, антибиотиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ. 6.2.1. Основные виды хроматографии В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды хроматографии: – адсорбционную; – распределительную; – ионообменную; – эксклюзионную (молекулярно-ситовую); – осадочную. Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью). Распределительная хроматография – на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что при распределительном механизме разделения на перемещение зон компонентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие анализируемых компонентов с твёрдым сорбентом). Ионообменная хроматография – на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси. Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография – на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 298 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гельпроникающую (ГПХ), в которой элюент – неводный растворитель, и гельфильтрацию, где элюент – вода. Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе. В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают газовую и жидкостную хроматографию. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая хроматография бывает газо-адсорбционной (неподвижная фаза – твёрдый адсорбент) и газожидкостной (неподвижная фаза – жидкость), а жидкостная хроматография – жидкостно-адсорбционной (или твёрдо-жидкостной) и жидкостно-жидкостной. Последняя, как и газожидкостная, является распределительной хроматографией. К твёрдо-жидкостной хроматографии относятся тонкослойная и бумажная. 6.2.2. Основные закономерности хроматографического разделения в колонке Параметры удерживания. Время удерживания и удерживаемый объем. Разделение в хроматографии основано на различной сорбируемости анализируемых соединений при движении их по слою сорбента в колонке. Если соединение не сорбируется, то оно не удерживается сорбентом в колонке, и будет выходить из колонки со скоростью потока элюента. Если же вещества сорбируются, то они удержатся в колонке, это будет определяться их сорбционной способностью: чем сильнее сорбция соединения, тем дольше оно будет удерживаться в колонке. Параметры удерживания, по существу, характеризуют сорбционную способность анализируемых соединений. Различие в сорбируемости в конечном итоге определяется различием межмолекулярных взаимодействий вещество – сорбент. Время от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума пика называется временем удерживания tR (рис. 6.6). Оно складывается из двух составляющих: времени нахождения молекул соединения в элюенте (tм) и времени нахождения молекул соединения в сорбируемом состоянии (tR ): tR = tм + tR . (6.4) Рис. 6.6. Параметры удерживания Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 299 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Для газовой и жидкостной хроматографий время нахождения молекул исследуемого соединения в элюенте зависит от доли пустот в колонке. В разных набивных колонках плотность набивки может изменяться, будет также изменяться и величина tм, поэтому для характеристики истинной удерживающей способности необходимо определять величину t'R – так называемое приведенное время удерживания: tR = tм − tR . (6.5) Величину tм определяют по времени выхода несорбируемого соединения (иногда называемого мертвым временем). Приведенное время удерживания зависит от скорости элюента: чем больше скорость элюента, тем меньше время удерживания, поэтому на практике удобнее использовать удерживаемый объем VR – произведение времени удерживания на объемную скорость элюента Fr: VR = tR · Fr. (6.6) Удерживаемый объем – это объем элюента, который необходимо пропустить через хроматографическую колонку, чтобы элюировать данное анализируемое соединение. Приведенный удерживаемый объем (V'R) соответственно равен: V'R = (tR – tм) Fr = tRFr – tмFr = VR – Vd, (6.7) где Vd – объем пустот в колонке (мертвый объем). Объемную скорость элюента чаще всего измеряют на выходе из колонки. Из-за сжимаемости элюента при повышении давления объемная скорость неодинакова по длине колонки. В начале колонки она меньше, чем на выходе, поэтому для определения средней скорости в колонке вводится специальная поправка j, учитывающая перепад давления: j = 3/ 2 ( p1/p0 ) 2 − 1 , ( p1/p0 )3 − 1 (6.8) где p1 – входное давление; p0 – давление на выходе колонки. Приведенный удерживаемый объем с поправкой на среднее давление называется чистым удерживаемым объемом: VN = V R · j. (6.9) Чистый удерживаемый объем можно считать физико-химической константой, так как он не зависит от скорости элюента при постоянной температуре и доли пустот в колонке. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 300 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Чистый удерживаемый объем зависит от количества сорбента в колонке, поэтому для точных физико-химических измерений используют понятие удельного удерживаемого объема (VTg). Величина VTg – это чистый удерживаемый объем, отнесенный к массе сорбента g в колонке или к площади поверхности адсорбента SК при усредненном давлении в хроматографической колонке и температуре T колонки: VTg = V'R j/g; VTg = V'R j/ SК. (6.10) Относительные параметры удерживания. Все рассматриваемые выше параметры удерживания зависят от случайных небольших колебаний параметров опыта, в частности расхода элюента и температуры термостата колонки. Для исключения этих влияний используют относительные параметры удерживания. При расчете относительного параметра удерживания (времени или объема) берут отношение чистого объема удерживания исследуемого вещества к чистому объему удерживания стандартного соединения: Vотн = VNB / VNC ; tотн = t'R / t'RC. (6.11) В газовой хроматографии в качестве стандартных соединений используют н-алканы, с параметрами удерживания, близкими к параметрам удерживания исследуемого вещества. В этом случае при случайных колебаниях расхода или температуры абсолютные параметры удерживания будут изменяться, а их отношения – практически нет. В качестве относительного параметра широко используют индекс Ковача: I = 100 [(lg t K /t n)/(lg t n+1/t n)] + 100n, (6.12) где tn, tn+1 – приведенные времена удерживания н-алканов, с числом атомов углерода в молекуле n и n + 1; t n – приведенное время удерживания исследуемого соединения. Индекс Ковача – безразмерная величина и может быть подсчитана с большой точностью, например в капиллярных колонках – до сотых долей процента. Индексы Ковача в первую очередь применяют для идентификации неизвестных веществ (проведение качественного анализа). Изменения индексов Ковача для соединений, отличающихся природой функциональной группы, используют для оценки межмолекулярных взаимодействий. Индексами удерживания определенного набора стандартных веществ характеризуют полярность неподвижных жидких фаз и адсорбентов. Параметры хроматографического пика. Выходной сигнал анализируемого соединения имеет форму треугольника или пика, обычно это участок нулевой линии, на котором возникает сигнал при выходе анализируемого соединения из хроматографической колонки. Нулевая или базовая линия соответствует участку нулевой концентрации анализируемого соединения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 301 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Запись пика исследуемого соединения вместе с участками нулевой линии до и после пика называется хроматограммой. Высота пика – это расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора. Ширина пика у основания – отрезок основания пика, отсекаемый двумя касательными, проведенными в точках перегибов восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика. Ширина пика на полувысоте – отсекаемый пиком отрезок линии, проведенной параллельно основанию пика на середине его высоты. Площадь пика – это площадь части хроматограммы, заключенной между пиком и его основанием. Важным параметром пика является коэффициент асимметрии, который применяется для сравнения различных твердых носителей, адсорбентов и всей системы хроматографа в целом. В идеальных условиях пик по форме близок к кривой Гаусса, т.е. симметричен. На практике пики по разным причинам в основном несимметричны. Асимметрия пиков ухудшает разделение и затрудняет количественную обработку. Асимметричные пики появляются при разделении на неоднородных сорбентах, когда концентрации анализируемых соединений соответствуют нелинейным участкам изотермы сорбции. Кроме того, это может быть вызвано в некоторых случаях кинетикой сорбции (замедленный процесс десорбции), наличием непродуваемых полостей. Асимметрию пиков оценивают относительно полуширин пиков на половине высоты (рис. 6.7) отношением отрезка БВ к АБ либо на 1/10 высоты пика от основания отношением отрезков ДЕ к ГД. Точнее пользоваться отношением площадей половин пика – отношением заштрихованной части пика к незаштрихованной части (рис. 6.7). Рис. 6.7. Оценка асимметричности пиков Асимметрия пиков может быть вызвана размыванием полос в колонке. Обычно выделяют три вида размывания полос: – размывание, связанное с различной скоростью движения по слою сорбента зон с разной концентрацией (зависит от формы изотермы сорбции); – диффузионные размывания (молекулярная диффузия, вихревая диффузия, динамическое размывание, стеночный эффект); – кинетическое размывание, связанное со скоростью внешнего и внутреннего массообмена. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 302 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Первый вид размывания наблюдается в том случае, когда концентрация вещества соответствует нелинейному участку изотермы сорбции. На рис. 6.8 показано размывание полос для различных типов изотерм. В случае нелинейности изотермы сорбции линейная скорость перемещения зоны вещества по слою сорбента Uс = U/a/c, (6.13) где U – линейная скорость элюента. При линейной изотерме сорбции (изотерма Генри) отношение а/с постоянно во всем диапазоне концентраций, поэтому искажение формы зон не происходит, следовательно, зарегистрированный пик будет симметричным. В случае нелинейной изотермы сорбции отношение а к с изменяется с концентрацией. Для выпуклой изотермы (изотермы Лэнгмюра) с повышением концентрации величина а/с уменьшается, а скорость продвижения участков зон с большими концентрациями возрастает. В случае вогнутой изотермы (рис. 6.8, в), наоборот, скорость продвижения участков зон с меньшими концентрациями будет больше. Это единственный вид размывания, который можно полностью исключить. Для этого нужно выбрать адсорбент с однородной поверхностью с линейной изотермой для анализируемых концентраций. а б в Рис. 6.8. Размывание полос для различных типов изотерм: а – линейная изотерма; б – изотерма Лэнгмюра (выпуклая изотерма); в – вогнутая изотерма Молекулярная диффузия. В хроматографических колонках это размывание рассматривают вдоль колонки, размывание в других направлениях ограничено стенками колонки, поэтому в этом случае часто используют термин «продольная диффузия». Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 303 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Вихревая диффузия имеет место только в набивных колонках и определяется неоднородностью набивки, разным сопротивлением потоку в разных частях сечения колонки. Общий поток элюента при попадании в колонку распадается на отдельные микропотоки между зернами. Если сопротивление по сечению неоднородно, то там, где сопротивление меньше, микропоток будет продвигаться быстрее; наоборот, там, где сопротивление больше, микропоток будет двигаться медленнее. Это приведет к дополнительному размыванию. Чтобы уменьшить вклад вихревой диффузии, нужно уменьшать размер зерен, использовать более узкий фракционный состав зерен, исключать пыль и заполнять колонку с максимальной плотностью. Динамическое размывание наблюдается в пустых незаполненных (т.е. капиллярных) колонках, оно связано с профилем скоростей по сечению в пустых трубках. В центре скорость потока больше, чем у стенок, в результате происходит искажение формы полосы и имеет место дополнительное размывание. Стеночный эффект. Плотность набивки на единицу объема около стенок всегда меньше, а доля пустот больше, чем в центре колонки, особенно при использовании зерен крупного размера. Это приводит к тому, что скорость элюента около стенок больше, чем в центре колонки. В результате возникает дополнительное размывание, так называемый стеночный эффект. Стеночный эффект может вносить большой вклад, когда диаметр колонок значительно больше высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ), т.е. в препаративной хроматографии. В аналитических колонках небольшого диаметра (внутренний диаметр 2–4 мм) размывание за счет стеночного эффекта мало и им пренебрегают. Кинетическое размывание. Задержка массообмена с поверхностью адсорбента вследствие медленности процессов адсорбции и десорбции также приводит к размыванию полосы. Задержка при адсорбции приводит к продвижению компонента вперед, т.е. к размыванию переднего фронта полос, а задержка при десорбции приводит к размыванию заднего фронта. В том случае, когда скорости адсорбции и десорбции неодинаковы, такое размывание может быть несимметричным. Все перечисленные причины искажения хроматографических пиков можно описать математическими зависимостями, а их суммарное действие выразить уравнением Ван-Деемтера: H = A + B/U + cU, (6.14) где каждое из трех слагаемых по порядку соответствует ранее описанным факторам: А – степень неоднородности структуры упакованного в колонку сорбента; В – коэффициент, учитывающий вклад диффузии данного сорбата в подвижной и неподвижной фазах; с – константа, определяющая массообмен сорбата между сорбентом и элюентом; U – линейная скорость потока элюента. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 304 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Рис. 6.9. График зависимости H от U (уравнение Ван-Деемтера) На графике зависимости Н (высота эквивалентной теоретической тарелки) от U (рис. 6.9) можно в общем виде оценить величины А, В и с. Обращает на себя внимание несимметричность ветвей кривой, следовательно, превышение оптимальной скорости потока ведет к меньшей потере эффективности, чем работа колонки со скоростью потока ниже оптимальной. Размывание приводит к уширению пика, что отражается на эффективности, которая выражается числом теоретических тарелок N и вычисляется по формуле N = 5,54(ti/Δtx)2 , (6.15) где ti – время удерживания данного компонента; Δtx – время выхода пика от половины его высоты на подъеме, до половины высоты на спаде. Отношение длины колонки к ее эффективности называется высотой эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) – Н. Обе эти величины имеют конкретный смысл: для N – число актов сорбции-десорбции, произошедших с веществом при его движении по колонке; для Н – высота слоя сорбента в колонке, на котором происходит единичный акт сорбции-десорбции. Следовательно, эффективность прямо пропорциональна длине колонки. 6.2.3. Газовая хроматография Как уже отмечалось выше, газовая хроматография (ГХ), вид хроматографии, в которой подвижной фазой служит газ (пар). Разделение компонентов в ГХ основано на различии скоростей движения и размывания концентрационных зон исследуемых веществ, движущихся в потоке газовой фазы относительно слоя неподвижной фазы, причем эти вещества распределены между обеими фазами. Газ-носитель (воздух, Не, N2, Аr, СО2 и др.) должен обычно иметь небольшую вязкость и обеспечивать высокую чувствительность детектирования. Далее приводятся основные характеристики ГХ. Основные уравнения, используемые в газовой хроматографии, приведены ниже. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 305 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Коэффициент распределения – отношение концентраций исследуемого соединения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях: K = Cн /Cп. (6.16) Фазовое отношение – это отношение объемов подвижной и неподвижной фаз в колонке: β = Vп /Vн. (6.17) Фактор удерживания (фактор емкости) – это отношение приведенных времен удерживания к мертвому времени: k = t R / tм. (6.18) Фактор разделения – величина, характеризующая селективность разделительной системы, равная отношению факторов удерживания или приведенных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме: α2/1 = K2/K1 = t 2 / t 1. (6.19) Эффективность колонки – характеристика степени размывания полос в колонке, определяется числом теоретических тарелок N или H, N = 5,545 (tR /W0,5)2, (6.20) где W0,5 – ширина пика на половине высоты; H = L / N, (6.21) где L – длина колонки; N – безразмерная величина; Н имеет размерность длины, обычно мм. Разрешение Rs – это отношение расстояния между максимумами исследуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и тех же единицах измерения: Rs = 2 (tR2 – tR1) / (Wb1 + Wb2). (6.22) Связь степени разрешения с фактором разделения α, фактором удерживания k и эффективностью N отражена в соотношении Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 306 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Rs = ¼ ((α − 1)/α)(k/(k + 1)) √N . (6.23) Число тарелок, необходимое для полного разделения при Rs = 1: N = 1/16 (α/ (α − 1))2 ((k + 1)/k)2, (6.24) при k > 10 это уравнение можно упростить: N = 16 (α/ (α−1))2. (6.25) Влияние экспериментальных параметров на хроматографическое разделение (на величины α, R и N). Влияние природы сорбента. Природа сорбента играет решающую роль в разделении компонентов. Разделение происходит за счет различий межмолекулярных взаимодействий разделяемых молекул с сорбентом. Селективность разделения определяется природой сорбента. В большинстве случаев селективность разделения (величинаα) уменьшается с повышением темп ературы. Длина колонки. Степень разделения пропорциональна квадратному корню от длины колонки, эффективность прямо пропорциональна длине колонки. Сечение колонки. С уменьшением сечения колонки (диаметра) возрастает эффективность и степень разрешения колонки. Размер зерен сорбента. Размывание хроматографических полос, эффективность в значительной степени зависят от размера зерен сорбента. Вихревая диффузия и внешний массообмен сильно зависят от диаметра зерен сорбента. Толщина жидкой пленки на носителе. С увеличением толщины пленки жидкой фазы (в случае газожидкостной хроматографии) увеличиваются времена удерживания, затрудняется внутренний массообмен и уменьшается эффективность: VR = Vd + KVж, (6.26) где Vd − мертвый объем; K − коэффициент распределения; Vж − объем жидкой фазы. Природа газа-носителя. В газовой хроматографии при небольших давлениях инертные газы-носители практически не адсорбируются, особенно в газожидкостной хроматографии. Поэтому природа газа-носителя практически не влияет на селективность разделения, за исключением некоторых случаев в газоадсорбционной хроматографии при разделении газов на активных тонкопористых адсорбентах. Природа газа-носителя влияет на эффективность колонок особенно при высоких скоростях. Сопротивление колонки, перепад давления в ней определяется вязкостью газа-носителя. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 307 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Давление газа-носителя. В большинстве случаев на входе в колонку используют избыточное давление в пределах от 0,1 до 2 атм (в очень редких случаях выше). Изменение давления в этих пределах практически не влияет ни на селективность, ни на эффективность разделения. В ряде работ применялись пониженные давления на выходе из колонки, т.е. вакуумная хроматография для разделения малолетучих высококипящих соединений. Описаны варианты газовой хроматографии при повышенных давлениях. При повышении давления возрастает сорбция газа-носителя и уменьшается сорбция разделяемых соединений, особенно если в качестве подвижной фазы используются пары жидкостей, в частности воды. Парофазная хроматография расширяет аналитические возможности газовой хроматографии. Размер пробы. Размер введенной пробы анализируемой смеси должен быть таким, чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы больше максимально допустимой изменяются времена удерживания. Особенно важно не перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность сильно падает с перегрузкой. Способ дозирования. Пробу можно ввести быстро, в виде узкой полосы или медленно, в виде разбавленной полосы. Первый способ введения− «м етод поршня» − идеальный, второй − «способ экспоненциального разбавл ения» может приводить к дополнительному размыванию полосы. Способ дозирования в реальных случаях занимает промежуточное состояние между этими крайними случаями. В общем случае ширина дозируемой пробы должна быть значительно меньше ширины полосы вещества, получаемого на выходе из колонки. Чувствительность, линейность, инерционность и стабильность детектора. Назначение детектора − регистрация выходных кривых в виде сигналов (пиков) достаточной амплитуды, необходимых для количественных измерений. Для точных количественных измерений необходимо: – чтобы детектор не искажал истинную форму полосы, образующейся на слое сорбента, другими словами, детектор должен быть малоинерционен, постоянная времени – небольшой; – показания детектора были пропорциональны концентрации или количеству дозируемых веществ, т.е. детектор должен обладать достаточно широкой областью линейности; – запись сигнала была устойчивой, не должно быть флуктуации нулевой линии или же монотонного смещения нулевой линии в течение длительного времени (дрейфа нулевой линии). Аппаратура для газовой хроматографии Функциональная схема газового хроматографа. В аналитических хроматографах используют проявительный вариант хроматографии, в этом случае газ-носитель непрерывно продувается через хроматографическую колонку. Расход газа-носителя создается за счет перепада давления на входе и выходе колонки. Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоединяют к источнику со сжатым газом (баллонная или лабораторная линия со Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 308 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии сжатым газом). Через колонку поток газа-носителя должен проходить с постоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газаносителя и измеритель расхода газа. Если газ-носитель загрязнен нежелательными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр. Таким образом, на входе в колонку подключается ряд устройств, часто объединяемых в один блок (блок подготовки газа), назначение которого − установка, стабилизация, измерение и очистка потока газа-носителя. В современных хроматографах используются БПГ с электронным заданием и управлением расходов газов. Перед входом в колонку устанавливается устройство для ввода анализируемой пробы в колонку − дозатор -испаритель. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем через самозатекающее термостойкое резиновое уплотнение в дозаторе, газовые пробы вводят дозирующим шестиходовым краном. Анализируемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком газа-носителя (если анализируемая проба− жидкость, то она предварительно переходит в дозаторе-испарителе в парообразное состояние) и направляется в хроматографическую колонку. За счет различной сорбируемости компоненты смеси будут с разной скоростью продвигаться по колонке. Вещества, которые сорбируются слабо, будут продвигаться по колонке с большей скоростью и выходить первыми. Сильносорбируемые вещества будут продвигаться по колонке медленнее. Если выбран достаточно селективный сорбент и подобраны оптимальные условия, то на выходе колонки компоненты смеси будут полностью разделены. Детектор регистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются (усилитель) и регистрируются на шкале вторичного самопишущего прибора или дисплея ПЭВМ в виде выходных кривых (или пиков). Для обеспечения стабильного режима работы детектора используется блок питания детектора. Сорбируемость веществ зависит от температуры. Для исключения влияния колебания температуры на результаты разделения, колонку помещают в специальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и поддерживается терморегулятором. В случае необходимости температура колонки в процессе разделения может изменяться по определенной программе с помощью блока программирования температуры. Высота или площадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного интегратора или ПЭВМ. Значения площадей пиков могут быть отпечатаны на бумажном носителе. Таким образом, перед хроматографическим анализом необходимо провести следующие операции на приборе: – открыть вентиль баллона со сжатым газом и установить по манометру или специальному измерителю определенный расход газа-носителя; – включить питание детектора; – установить необходимую температуру в термостате колонок; Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 309 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии – включить самопишущий прибор, интегратор или ПЭВМ, после выхода прибора на устойчивый режим микрошприцем отобрать и ввести в дозатор-испаритель анализируемую пробу. Все дальнейшие операции проходят без участия оператора: компоненты пробы разделяются на колонке, регистрируются в детекторе, записываются на диаграммной ленте вторичного прибора, интегратор или ПЭВМ определяет площадь пика, а в случае применения ПЭВМ с принтером можно сразу получить полный протокол− хроматограмму с рас печатанной рядом таблицей концентраций разделенных компонентов. Детекторы для газовой хроматографии. Всего для газовой хроматографии предложено более 60 типов детектирующих систем. По общепринятой классификации детекторы подразделяются на дифференциальные и интегральные по форме зарегистрированного сигнала. Дифференциальные детекторы измеряют мгновенное различие в концентрации вещества в потоке газаносителя. Хроматограмма, зарегистрированная таким детектором, представляет собой ряд пиков, площадь которых пропорциональна количеству разделенных соединений. Интегральные детекторы измеряют суммарные количества соединений, выходящих из колонки. Хроматограмма в этом случае ступенчатая, высота ступеней пропорциональна количеству соответствующих соединений. В зависимости от однократной или многократной регистрации молекул анализируемых соединений, выделяют концентрационные и потоковые детекторы. В концентрационных детекторах сигнал пропорционален концентрации соединения в подвижной фазе (элюенте). Здесь имеет место многократная регистрация молекул анализируемых соединений. В потоковых (или массовых) детекторах сигнал пропорционален количеству пробы компонента, достигаемому ячейки детектора в единицу времени. В этом случае происходит только однократная регистрация. По селективности детекторы классифицируются на универсальные, селективные и специфические. В универсальных детекторах регистрируются все компоненты смеси, выходящие из колонки, за исключением подвижной фазы. Селективные детекторы регистрируют определенные группы соединений на выходе из колонки. Специфические детекторы регистрируют только один компонент или ограниченное число компонентов с подобными химическими характеристиками. Основные технические характеристики детекторов: – чувствительность или предел детектирования; – линейность (динамический диапазон); – инерционность (постоянная времени, быстродействие); – стабильность (уровень шума и дрейфа); – величина эффективного объема чувствительной ячейки. Чувствительность концентрационных детекторов Ак определяется следующим выражением: Aк= Sп V Fr / qF, Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие (6.27) 310 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии где Sп − площадь пика, см2; V − шкала самописца, мВ·cм–1; Fr − скорость газаносителя, мл·с–1; q − масса соединения, мг; F − скорость движения ленты самописца, см·с–1. Размерность чувствительности в этом случае – мВ·мг·мл –1. Чувствительность потоковых детекторов (мВ·мг·с-1) Aк = Sп V / Fq. (6.28) В последние годы чаще всего определяют предел детектирования. Для оценки минимально обнаруживаемой концентрации необходимо, кроме чувствительности, знать уровень флуктуаций (шума) нулевой линии. Минимальным сигналом, поддающимся измерению, обычно принято считать сигнал, высота которого в несколько раз (2–5) превышает уровень шумов d: сmin = 2δ / Aк. (6.29) Величина сmin – предел детектирования – определяет предельные возможности прибора. Под линейностью детекторов понимают диапазон концентраций, в пределах которых наблюдается линейность зависимости сигнал – концентрация. Для определения величины линейности строят соответствующий график. Обычно диапазон линейности расположен от предела детектирования до концентраций, в которых уже наблюдается отклонение от линейности на 5–10 %. Под инерционностью (быстродействием, постоянной времени) подразумевается скорость реагирования детектора на быстрое изменение концентрации на выходе из колонки. Детектор должен иметь такое быстродействие, чтобы при регистрации не искажать формы полосы соединения, выходящего из колонки. В современных, особенно ионизационных детекторах постоянная времени – менее 0,1–0,01 с. В некоторых катарометрах, чаще всего устаревших конструкций, постоянная времени может составлять около 1 с и даже выше. Быстродействие сильно зависит от величины эффективного объема ячейки. Уровень шума нулевого сигнала детектора определяется кратковременными флуктуациями. Дрейф – это монотонное смещение нулевой линии. Величину смещения оценивают в течение 1 часа. Обычно требования к этим показателям таковы: шум 0,5 % рабочей шкалы и дрейф не более 3 % в час. Механизм работы детекторов Пламенно ионизационный детектор (ПИД) основан на ионизации органических соединений в пламени водорода. Точный механизм ионизации не выяснен. С использованием масс-спектрометрометрии проведено исследование и обнаружено, что механизм ионообразования связан с термодеструкцией и последующей хемоионизацией. В ПИД одним из электродов служит горелка, второй электрод − коллектор − располагается над горелкой. Малые то- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 311 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии ки (1·10–9–10–12 А) усиливаются, так как шумы самого детектора малы. Из-за высокой чувствительности, большого диапазона линейности ПИД стал наиболее распространенным детектором. Детектор по теплопроводности (ДТП) − катарометр. Чувствительными элементами в ДТП являются нагретые нити (филаменты) из ряда металлов (платина, вольфрам, сплав вольфрам–рений и др.), помещенные в специальные камеры, продуваемые газом-носителем. Филаменты включены в плечи моста Уинстона. Через сравнительную камеру проходит поток чистого газаносителя, через рабочую камеру − газ-носитель с примесями разделяемых соединений. Сопротивление нитей зависит от температуры. При изменении состава газа в рабочей камере теплопроводность его изменяется, изменяется теплопередача от нити к стенкам камеры, температура нити и, следовательно, сопротивление нити по сравнению с сопротивлением нити в сравнительной камере. Происходит разбаланс моста, возникает сигнал на нулевой линии. Электронно-захватный детектор (ЭЗД) предназначен для анализа веществ, обладающих электронным сродством, в частности галогенноорганических соединений. Полезный сигнал детектора − это уменьшение н ачального тока, однозначно связанного с количеством анализируемого соединения. В ионизационной камере ЭЗД помещается радиоактивный источник (например, 63Ni). Под воздействием радиации молекулы газа-носителя (азот, аргон, гелий) ионизируются с высвобождением электрона. В камере между электродами приложено напряжение, фоновый ток создается в основном электронами, так как их подвижность на три порядка выше, чем подвижность ионов. Кроме того, большая часть ионов рекомбинирует, не доходя до электродов. При попадании в ячейку детектора соединений, обладающих сродством по отношению к электрону, происходит захват ими свободных электронов, что приводит к снижению начального фонового тока. ЭЗД обладает высокой ионизационной эффективностью. В газе-носителе недопустимо присутствие кислорода, влаги и других соединений, снижающих количество электронов или их подвижность. Предел детектирования ЭЗД на два-три порядка ниже ПИД, он сильно зависит от числа и положения атомов галогенов в молекулах. Термоионный детектор (ТИД) селективен к N- и P-содержащим соединениям за счет введения в пламя водорода паров солей щелочных металлов (К, Na, Rb и Cs). Скорость введения паров щелочных металлов должна быть стабилизирована. ТИД чувствителен к стабильности поддержания скорости водорода, воздуха и газа-носителя. Селективность ТИД к N- и P-органическим соединениям по сравнению с ПИД − порядка 102–103. Пламенно-фотометрический детектор (ПФД) селективен к S- и P-содержащим соединениям, при сжигании которых в пламени, обогащенном водородом, по сравнению с ПИДом, излучаемый свет от этих элементов на- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 312 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии правляется в фотоумножитель через специальные фильтры (394 нм для S и 526 нм для Р). В фотоионизационном детекторе (ФИД) ионизация анализируемых соединений происходит за счет УФ-излучения в специальной камере с двумя электродами. При фотоионизации молекулы анализируемых соединений диссоциируются на ион и электрон. Образуемые ионы собираются электродами. Ионизируются только те соединения, потенциал которых ниже энергии фотонов. В зависимости от лампы, энергия фотонов может быть 9,5; 10,2 и 11,7 эВ. ФИД, как и ПИД, обладает высокой чувствительностью ко всем органическим соединениям. К ароматическим соединениям ФИД имеет в 10–50 раз большую чувствительность, чем ПИД. В отличие от ПИД, ФИД может регистрировать H2S, PH3, NH3, AsH3. Масс-спектрометрический детектор (МСД). В последние годы достигнут прогресс в создании небольших настольных МСД для газовых хроматографов. В настоящее время этот высокочувствительный детектор− самый совершенный прибор для идентификации неизвестных веществ. Колонки для газовых хроматографов подразделяются на насадочные (НК): препаративные, аналитические, микронасадочные и капиллярные (КК). В насадочных, микронасадочных колонках сорбент находится внутри трубки и имеет форму цилиндра. Набивка должна быть плотной и однородной, без пустот. Чем плотнее и однороднее набивка, тем меньше размывание полос и больше эффективность колонки. В КК слой сорбентов наносится на внутреннюю поверхность капилляра в виде слоя жидкой неподвижной фазы или в виде слоя адсорбента. Технология капиллярных колонок и хроматографического оборудования в целом находится в постоянном развитии. Разработка программного обеспечения и совершенствование хроматографического оборудования существенно расширили область применения газовой хроматографии в науке и промышленности. Имеющаяся в Сибирском Федеральном университете аналитическая приборная база позволяет решать ряд биотехнологических задач. Например, поиск углеводородсинтезирующих штаммов среди одноклеточных водорослей показал принципиальное отличие состава углеводородов природного штамма Botryococcus, выделенного из озера Шира, и музейного Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252, полученный из коллекции культур одноклеточных водорослей Института физиологии растений РАН (IPPAS). На рис. 6.10 представлена хроматограмма углеводородов музейного штамма, выделенных из биомассы водорослей и гидрированных для идентификации наличия ненасыщенных связей. Углеводороды, синтезируемые природным Botryococcus, принципиально отличаются от музейного штамма и представлены диенами и триенами с числом атомов углерода от 23 до 29 . Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 313 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии а б Рис. 6.10. Ионная хроматограмма углеводородов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252: а – исходный образец; б – после гидрирования [3, 22] Не менее интересным для биотехнологии представляют ацетиленовые кислоты, характеризующиеся противовоспалительным эффектом. Источником таких кислот может быть водный мох Fontinalis antipyretica, обильно покрывающий дно реки Енисей. Типичная хроматограмма жирных кислот, содержание которых в биомассе может достигать 15–20 % , представлена на рис. 6.11. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 314 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Рис. 6.11. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Fontinalis antipyretica. Первая цифра – число атомов углерода в цепи жирных кислот, вторая – число насыщенных связей, третья – положение первой двойной связи с метильного конца. А1 – 6a, 9, 12–18:3; А2 – 6a, 9, 12, 15–18:4; А5 – 8a, 11, 14–20:3; А7 – 8а, 11, 14, 17–20:4 [12] Рис. 6.12. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Ralstonia еutrophа В5786 до и после гидрирования. Первая цифра – число атомов углерода в цепи жирных кислот, вторая – число насыщенных связей, третья – положение первой двойной связи с метильного конца [11] Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 315 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Как видно, доля ацетиленовых кислот в спектре жирных кислот состав ляет более 40 %. Рис. 6.13. Ионные хроматограммы полигидроксиалканоатов, синтезируемые Ralstonia eutrophа; С4 – β-гидроксибутирата; С5 – β-гидроксивалерата; С6 – β-гидроксигексаноата [4, 5] Бактерии Ralstonia eutrophа относятся к наиболее перспективным продуцентам биотехнологичекого продукта− полигидроксиалканоатов (ПГА). Они синтезирует с высокими выходами полимеры (до 80–90 %) различной химической структуры на различных субстратах. Технология выделения полимеров предусматривает использование растворителей, которые хорошо экстрагируют из клеток и липидные компоненты, поэтому основными загрязнениями промышленных образцов ПГА могут быть соединения липидной природы. Для того чтобы прогнозировать источник примесей в полимере, был изучен состава жирных кислот в биомассе водородных бактерий с помощью хромато-масс-спектрометрии. Кроме того, для идентификации жирных кислот были использованы методы химической модификации жирных кислот – гидрирование и сравнение хроматограмм до и после гидрирования метиловых эфиров жирных кислот. Результаты проведенных исследований показаны на рис. 6.12. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 316 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Метод газовой хроматографии используется и для качественного и количественного анализа полимера. Количественный анализ полимера проводится с внутренним стандартом, в качестве которого используется бензойная кислота. Качественный анализ позволяет выявить мономерный состав полигидроксиалканоатов. На рис. 6.13 представлена серия хроматограмм полимеров с разным соотношением мономеров – β-гидроксибутирата, β-гидроксивалерата и β-гидроксигексаноата. 6.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ – это жидкостная колоночная хроматография, механизмы сорбции в которой могут использоваться самые различные. По существу, ВЭЖХ − это современная форма реализации классической жидкостной колоночной хроматографии. Ниже перечислены некоторые наиболее существенные качественные характеристики ВЭЖК: – высокая скорость процесса, позволившая сократить продолжительность разделения от нескольких часов и суток до минут; – минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции; – высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достигла нового уровня воспроизводимости и точности. Интенсивные исследования последних десятилетий, громадный объем накопленных экспериментальных данных позволяют сегодня уже говорить о классификации вариантов в рамках метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Конечно, при этом остается в силе классификация по механизму сорбции, приведенная выше. Распространена классификация, основанная на сравнительной полярности подвижной и неподвижной фаз. При этом различают нормально- и обращенно-фазовую хроматографию. Нормально-фазовая хроматография (НФХ) − такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и есть основания считать, что основной фактор, определяющий удерживание, − это взаимодействие сорбатов непосредственно с поверхностью либо объемом сорбента. Обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) − такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента; при этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фазы, сорбированные на поверхности. Ионообменная хроматография − вариант, при котором сорбция осуществляется путем обмена сорбированных ионов подвижной фазы на ионы хроматографируемых веществ; полностью аналогично можно определить лигандообменную хроматографию. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 317 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Хроматография на динамически модифицированных сорбентах − вариант ВЭЖХ, при котором сорбат не взаимодействует непосредственно с поверхностью сорбента, а вступает в ассоциацию с молекулами приповерхностных слоев элюента. Ион-парная хроматография − такой вариант обращенно-фазовой хроматографии ионизированных соединений, при котором в подвижную фазу добавляется гидрофобный противоион, качественно изменяющий сорбционные характеристики системы. Эксклюзионная хроматография − способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров. Для ВЭЖК очень важной характеристикой является величина сорбентов, обычно 3–5 мкм, сейчас до 1,8 мкм. Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы. Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени. Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок, можно управлять степенью разделения анализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки. Сорбенты. Становление ВЭЖХ в значительной мере связано с созданием новых поколений сорбентов с хорошими кинетическими свойствами и разнообразными термодинамическими свойствами. Основной материал для сорбентов в ВЭЖХ− силикагель. Он механически прочен, обладает знач ительной пористостью, что дает большую обменную емкость при небольших размерах колонки. Наиболее ходовой размер частиц 5–10 мкм. Чем ближе к шарообразной форма частиц, тем меньше сопротивление потоку, выше эффективность, особенно, если отсеяна очень узкая фракция (например, 7 + 1 мкм). Удельная поверхность силикагеля 10–600 м2/г. Силикагель может быть модифицирован различными химическими группами, привитыми к поверхности (С-18, CN, NH2, SO3H), что позволяет использовать сорбенты на его основе для разделения самых различных классов соединений. Основной недостаток силикагеля − малая химическая стойкость при рН < 2 и рН > 9 (кремнезем растворяется в щелочах и кислотах). Поэтому в настоящее время идет интенсивный поиск сорбентов на базе полимеров, стойких при рН от 1 до 14, например, на основе полиметилметакрилата, полистирола и т.д. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 318 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Сорбенты для ионообменной хроматографии. В силу особенностей разделения (в кислой или щелочной среде) основной материал сорбентов − полистирол с дивинилбензолом различной степени сшивки с привитыми к их поверхности группами SO3 -H+ (сильнокислые катионообменники) или -СОО-Na+ (слабокислые катионообменники), -Н2N+(CH3)3Cl- (сильноосновные анионообменники) или -N+HR2Cl- (слабоосновные анионообменники). Сорбенты для гель-проникающей хроматографии. Основной тип − стирол-ДВБ. Используются также макропористые стекла, метилметакрилат, силикагель. Для ионо-эксклюзионной хроматографии используются те же сорбенты. Насосы. Для обеспечения расхода подвижной фазы (ПФ) через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления. К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ЖХ относятся: диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульсаций подачи растворителя. По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления. По принципу действия насосы делятся на шприцевые и на плунжерные возвратно поступательные. Шприцевые насосы. Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы. Недостатки насоса: а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя; б) приостановка разделения во время заполнения насоса; в) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью). Плунжерные возвратно-поступательные насосы. Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300–500 атм, расход 0,01–10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи – 0,5 %. Основной недостаток− растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давления и потока. Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического. Способы борьбы с пульсациями: с использованием сдвоенных насосов или двухплунжерного насоса Баглая, применением демпфирующих устройств и электронных устройств. Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3,13; 5,0; 7,0 мм), его амплитудой (12–18 мм) и частотой (что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора). Дозаторы. Назначение дозатора заключается в переносе пробы, находящейся при атмосферном давлении, на вход колонки, находящейся при давлении вплоть до нескольких атмосфер. Важно, чтобы в дозаторе отсутствовали непромываемые подвижной фазой «мертвые» объемы и размывание пробы в ходе дозирования. На первых порах дозаторы в ЖХ были аналогичны Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 319 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии газовым с проколом мембраны. Однако более 50–100 атм мембраны не держат, химическая стойкость их недостаточна, их кусочки загрязняют фильтры колонок и капилляры. В жидкой фазе гораздо меньше скорости диффузии, чем в газовой. Поэтому можно дозировать с остановкой потока − проба не успевает размыться в дозаторе. На время ввода в дозатор пробы специальный кран перекрывает поток растворителя. Давление на входе в колонку быстро снижается, через несколько секунд пробу можно вводить в камеру дозатора обычным микрошприцем. Далее дозатор запирается, включается поток растворителя, идет разделение. Давление, которое держит этот кран, до 500–800 атм. Но при остановке потока нарушается равновесие в колонке, что может приводить к появлению «вакантных» дополнительных пиков. Наибольшее распространение получили петлевые дозаторы. При заполнении дозатора под высоким давлением оказываются входы 1,2 и канал между ними. Входы 3–6, каналы между ними и дозирующая петля оказываются под атмосферным давлением, что позволяет заполнить петлю с помощью шприца или насоса. При повороте дозатора поток подвижной фазы вытесняет пробу в колонку. Для снижения погрешности петля промывается 5–10-кратным объемом пробы. Если пробы мало, то ее можно ввести в петлю микрошприцем. Объем петли обычно 5–50 мкл. Колонки. Успех ВЭЖХ обусловлен не только созданием сорбентов, но и колонок, учитывающих особенности процесса разделения в ЖХ. Наиболее важны 2 момента: 1) создание максимально однородного слоя сорбента в цилиндрической трубке; 2) сведение к минимуму мертвых объемов в колонке и соединительных трубках. Аналитическая колонка представляет собой трубку из нержавеющей стали, титана или стекла, заполненную сорбентом и закрытую с обеих сторон фильтрами для предотвращения высыпания сорбента. Фильтры имеют диаметр пор 2–5 мкм, что не создает сопротивления потоку. Для получения высокой эффективности колонок необходимо соблюдение некоторых условий: 1. Внутренняя поверхность колонки должна быть зеркально гладкой; 2. Сорбент должен иметь однородную фракцию (5 + 1 мкм); 3. Переход от большого диаметра колонки к малому диаметру штуцера должен быть плавный, т.е. нужна конусная выточка в корпусе штуцера. 4. Стенка колонки должна быть достаточно прочной, чтобы выдержать давление 300–500 атм. 5. Между торцом колонки и фильтром не должно быть мертвого объема (воздушного зазора), что очень трудно обеспечить в соединениях типа «свагелок». Учитывая уникальные свойства сорбентов, сложную конструкцию колонок, тщательность набивки колонок и их тестирование, стоимость колонок составляет 1 000–1 500 дол. США (отечественные колонки 1 млн руб.). Поэтому крайне желательно беречь колонки, предохранять от загрязнений с помощью предколонок, заполненных тем же сорбентом, но длиной 30–70 мм. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 320 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Чтобы колонка не «садилась», необходимо производить набивку колонки при давлении в 3–4 раза выше ее рабочего давления (т.е. 300–400 кгс/см2). Для хорошей колонки N = 30 000–100 000 т.т./м. Детекторы. Детектор является преобразователем концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал. В современном жидкостном хроматографе для детектирования компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений (табл. 6.1). Из существующих 50 физикохимических методов детектирования в настоящее время активно используется 5–6. Таблица 6.1 Основные типы детекторов, используемые в ВЭЖК Детекторы Измеряемые свойства подвижной фазы 1. Фильтровой фотометрический 2. Спектрофотометрический 3. Рефрактометрический 4. Флуорометрический 5. Амперометрический Кондуктометрический Оптическая плотность на определенной длине волны, пропускаемой фильтром Оптическая плотность на выбранной длине волны монохроматора Разность показателей преломления растворителя и раствора с пробой Интенсивность излучения молекул пробы в элюенте Ток окисления и восстановления электрохимически активных веществ Электропроводность пробы в элюенте Ориентировочная чувст- Селеквительность, тивность мг 10-10 Высокая 10-9 Высокая 10-6 Низкая 10-11 10-9–10 -11 10-6 Очень высокая Очень высокая Низкая Наибольшей сложностью при конструировании хроматографических детекторов было сочетание малых объемов ячеек (0,1–10 мкл, менее 10 % от объема неудерживаемого пика) с высокой чувствительностью (ввиду малого объема и низкой концентрации пробы). Иллюстрацией достигнутых успехов является то, что чувствительность фотоколориметров и спектрофотометров составляет 10–2 ед. оптической плотности, в то время как чувствительность фотометрических детекторов – 10–5 ед. оптической плотности, т.е. в 1 000 раз выше. Чувствительность − это важнейшая характеристика детектора. Лучше всего оценивать этот параметр по физической величине. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического де Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 321 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии тектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического − в единицах показателя преломления, вольт-амперометрического − в амперах, кондуктометрического − в сименсах. Для химика, очевидно, интереснее определять чувствительность в минимальном количестве определяемого вещества. Чувствительность детектора может быть примерно одинаковой ко всем компонентам пробы (рефрактометр и кондуктометр), а может быть совершенно разной даже для близких соединений. В первом случае говорят о неселективном детектировании. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее и пробе и растворителю (показатель преломления, электропроводность), их разность. Во втором случае − селективное детектирование. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее только молекулам пробы, например, способность флуоресцировать или поглощать свет. Селективное детектирование, с одной стороны, позволяет повысить чувствительность определения или исключить те вещества, которые определять не нужно (предельные углеводороды при определении ароматики), с другой стороны, допускает возможность не обнаружить нужных нам компонентов (тех же предельных углеводородов в нефти). Поэтому при исследовании общего состава объекта лучше использовать неселективный детектор типа рефрактометра, а при определении концентрации отдельных компонентов в сложной смеси – селективные детекторы. Подвижные фазы (ПФ). Элюирующая сила и эффективность Подвижная фаза в ЖХ выполняет двоякую функцию: с одной стороны, она обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке. Для этого химические свойства подвижной фазы не играют существенной роли, более важны их физические свойства: вязкость, летучесть. С другой стороны, подвижная фаза в ЖХ играет активную химическую, по существу, роль. Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Поэтому вторая и более важная функция подвижной фазы сводится к регулированию констант равновесия, к регулированию удерживания. Возможности регулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно велики. Нередко заменой одного растворителя на другой, можно изменить коэффициент емкости К' в 1 000–10 000 раз, однако для практической хроматографии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин значение К' − примерно 1–20. Слишком малые значения К' непригодны, т.к. в этой области резко возрастает вероятность взаимного перекрытия пиков. Наоборот, если К' слишком велико, для разделения требуется слишком много времени, к тому же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компоненты смеси. Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран по физическим и химическим свойствам ее компонентов. Основными характеристиками подвижных фаз являются их элюирующая сила и селективность. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 322 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии Один из элюентов способен смыть с колонки лишь слабосвязанные сорбаты, другие же вызывают десорбцию почти любых молекул. Молекулы подвижной фазы могут взаимодействовать с молекулами разделяемых веществ. При этом образуются ассоциаты, которые взаимодействуют с неподвижной фазой, сила этого взаимодействия отличается от силы взаимодействия молекул пробы. В результате сорбция может стать более или менее прочной. С другой стороны, молекулы подвижной фазы могут конкурировать на поверхности сорбента с молекулами разделяемых соединений, вытесняя последние с активных центров и способствуя смещению равновесия в сторону десорбции. Для характеристики влияния подвижной фазы на удерживание используют понятие элюирующей силы. Элюирующая сила подвижной фазы − это ее свойство вступать в такие межмолекулярные взаимодействия с компонентами системы, которые способствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемещению хроматографических зон. Один подходящий растворитель подобрать трудно. Зато смесь растворителей очень увеличивает гибкость ВЭЖХ. Принцип составления таких смесей прост. Необходимо взять два индивидуальных растворителя, один из которых имеет заведомо недостаточную элюирующую силу (А1, А2), другой− заведомо избыточную (В1). Из этих двух растворителей можно приготовить множество различных подвижных фаз. Часть из них будет обязательно обладать подходящей элюирующей силой (А2, В1). Сила растворителя является экспериментально определяемым интегральным параметром. Когда мы говорили, что растворитель имеет подходящую силу, под этим имеется ввиду, что на данном сорбенте данный сорбат будет иметь приемлемое значение К'. В то же время ясно, что для разделения уже двух соединений подойдет не любая из подвижных фаз, имеющих необходимую силу. Вещества могут иметь хорошее удерживание, но часть пиков перекрывается. В таких случаях мы говорим, что селективность системы недостаточна. Селективность определяется селективностью подвижной фазы, что связано со специфическими взаимодействиями с сорбатами. Селективность, как и элюирующая сила бинарной подвижной фазы, определяется в первую очередь природой более сильного ее компонента. В составе почти любой ПФ можно найти компонент сорбционно менее активный, выполняющий преимущественно транспортную функцию (растворитель А), и сорбционно активный, который служит для регулирования равновесия (растворитель В). Роль одного и того же компонента в различных подвижных фазах и в зависимости от характера НФ, может быть различной. Например, в ПФ гексан-хлороформ последнее соединение выступает в качестве растворителя В (активного), а в системе хлороформ − мет анол оно же играет роль растворителя А (транспортного). С целью повышения селективности часто используют подвижные фазы более сложного состава, чем бинарные. Во многих случаях это приводит к улучшению разделения. Растворители. Растворители должны быть очищены от механических примесей. Примеси вызывают плохую работу клапанов, способствуют износу плунжеров и уплотнений, забивают входные фильтры колонок. Поэтому рас Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 323 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии творители нужно фильтровать через материал с порами 0,5 мкм, при отборе растворителя из резервуара тоже нужен фильтр. Если температура кипения растворителя низкая (ниже 60 °С) − ацетон, мети ленхлорид, пентан, эфир и т.д., то при всасывании могут образоваться паровые пузыри, препятствующие работе клапанов. У менее летучих растворителей больше вязкость, что ведет к увеличению сопротивления колонки и к повышению давления на входе при сохранении расхода. Вязкость более 1,5 сП не желательна. В зависимости от метода детектирования, к растворителям предъявляются определенные требования (табл. 6.2). При УФ, работающем при 190–220 нм, применимы вода, ацетонитрил, метанол, этанол, гексан, гептан, циклогексан и т.д. Поглощают обычно примеси, поэтому надо использовать не ХЧ, а «для ЖХ» или «для спектроскопии». Таблица 6.2 Элюотропный ряд − перечень растворителей в порядке возрастания элюирующей способности Растворитель Гексан Бензол Бутилхлорид Хлороформ Метиленхлорид ИП эфир Этилацетат Тетрагидрофура Ацетонитрил Метанол Элюирующая сила на силикагеле 0,01 0,10 0,20 0,26 0,32 0,34 0,38 0,44 0,50 0,70 Перечень наиболее часто используемых растворителей: – Вода (лучше бидистиллят, еще лучше деионизованная и очищенная от органики). – Спирты (метанол, этанол, изопропанол) − годятся и ХЧ. Для обращено-фазовой хроматографии лучше использовать метанол – у него меньше всего вязкость (0,54 сп), для НФ− изопропанол, неограниченно смешива ющийся с углеводородами. – Ацетонитрил − удобен для ОФХ (низкая вязкость 0,34 сп) и хорошая растворимость. – Ароматика − поглощает в УФ и токсична. – Алканы − гексан в НФ (недостаточно растворяет). Специфические модификаторы ПФ вводятся для изменения свойств сорбента в лучшую сторону, улучшения разделения. Уксусная кислота 0,5–2,0 % − используется для аммоний -ацетатных буферных растворов, поглощает ниже 230 нм. Фосфорная кислота − в ОФХ д ля буферных растворов или для создания кислой среды. Аммиак− буферы в ОФХ и ИОХ. Алки лсульфаты натрия (от С2 до С12)− добавки для перевода в ион -парный ре Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 324 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии жим, рН 2–5. Величина удерживания оснований растет. Тетра и триалкиламмоний − ион -парный вариант определения кислот (с ростом концентрации ТБА растет удерживание анионов). Аммиак − буферы в ОФХ и ИОХ. Алкилсульфаты натрия (от С2 до С12) − добавки для перевода в ион -парный режим, рН 2–5. Выбор условий разделения. Распределение молекул сорбатов между неподвижной и подвижной фазами определяется, в первую очередь, сравнительным сродством этих молекул к полярным или неполярным растворителям (или поверхностям). Это сродство является главным фактором, влияющим на величины удерживания, выбор неподвижной и подвижной фаз. Так, при использовании неполярных НФ (обращенно-фазная хроматография) удерживание ряда сорбатов уменьшается с увеличением их полярности, а удерживание данного сорбата на данной НФ уменьшается с уменьшением полярности ПФ, т.е. при добавлении органических растворителей. В противоположность этому, при хроматографии на полярных сорбентах (нормально-фазная хроматография) удерживание растет с ростом полярности сорбатов и уменьшением полярности ПФ. То есть «подобное притягивается подобным». Ряд правил, которые надо помнить при выборе условий разделения: 1. Адсорбционная хроматографическая система обладает удерживающей способностью только в тех случаях, когда условная полярность ПФ и НФ различается в достаточной степени. Величины удерживания тем больше, чем больше разница в полярности, химической природе фаз. 2. Приемлемые величины удерживания достигаемы только в таких случаях, когда полярность сорбата является промежуточной по сравнению с полярностью ПФ и НФ. Поэтому основной способ влияния на удерживание на данном сорбенте − изменение полярности подвижной фазы. 3. При хроматографии на силикагеле удваивание концентрации полярного компонента в ПФ ведет к уменьшению удерживания в 2,0–2,5 раза. При хроматографии на алкилсиликагелях (С2, С8, С18) уменьшение концентрации растворителя в 1, 2 раза приводит к 2,0–2,5 кратному уменьшению удерживания сильно сорбирующихся веществ (К' > 10) и 1,2–1,5 кратному уменьшению для слабо сорбирующихся (К' < 2). 4. При хроматографии ионогенных соединений, если рН среды такое, что допускается одновременное существование сорбата в нейтральной и ионизированных формах, степень ионизации в сорбированном и десорбированном состоянии различна. Следствие− снижение эффективности разделения, нарушение формы пика. Поэтому надо использовать ПФ на основе буферных растворов. Без этого трудно добиваться воспроизводимости и качественного разделения. В общем с понижением рН TR оснований падет, а кислот растет. Выбор хроматографической системы. Под термином «тип хроматографической системы» понимают сочетание: сорбента того или иного химического класса, подвижной фазы на основании водных или органических растворителей, характеризующейся интервалом рН, наличием специфических добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т.д. Вы Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 325 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.2. Газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография для опр-я кол-ых и кач-х характ-к целевых прод-в биотехнологии бор типа системы основывается в первую очередь по оценке полярности и кислотно-основных свойств компонентов изучаемой системы. Условная оценка полярности анализируемых веществ, понимаемой в данном случае как относительное количество полярных и неполярных структурных фрагментов, представленных в их молекулах, может быть основана на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н. Этот критерий рассчитывается по формуле Н = nH −4 n f , (6.30) где nH − суммарное число атомов углерода и галогенов; nf − число функциональных групп в молекуле сорбата. Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоотталкивание). При хроматографии неполярных сорбатов средней полярности очень часто оказываются пригодными как нормально-, так и обращеннофазные системы. Для сорбатов с низкой (ароматика) или высокой (органические кислоты, спирты) полярностью пригодны ОФХ. Силикагель (НФХ) селективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различающихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При разделении гомологов (пентан− декан), спиртов , кислот лучше применять алкилсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токсины, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФХ. Выбор элюирующей силы и селективности подвижной фазы При работе в ОФХ выбор элюирующей силы сводится к выбору концентрации органического компонента подвижной фазы. В первичном случае может быть использован подход на зависимости удерживания от Н. Если известны принадлежность сорбата к определенному классу веществ и модель удерживания этого класса в ОФХ, то задача упрощается. Для такого расчета концентрации элюента есть уравнение: lg C x = 1,4 − (1,4 − lg C )(lg K x′ + 0,7) , lg K x′ + 0,7 (6.31) где K′ − коэффициент емкости при концентрации растворителя С, Сх − концентрация растворителя, необходимая для получения желаемого K′х. В НФХ для наименее полярных фаз (15 > H > 10) используют гексан:ИПС (95:5) или гексан:хлороформ (1:1). Для среднеполярных (10 > H > 5) – гексанИПС (80:20) или хлороформ:метанол (95:5). Для полярных (5 > H > 0) – хлороформ:метанол (80:20). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 326 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Масс-спектрометрия − это физико-химический метод измерения отношения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом методе, называются масс-спектрометрами или масс-спектрометрическими детекторами, они имеют дело с материальным веществом, состоящим, как известно, из мельчайших частиц − молекул и атомов. Масс-спектрометры устанавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав, а также пространственную структуру расположения атомов. Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для установления ее механизмов. Значительное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов заключается в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами (например, такие методы, как ИК-, УФ-, КР- и ЯМР), а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества, и в отличие от вышеуказанных методов, является деструктивным методом анализа, т.е. из образующихся при разрушении молекулы ионов исходная молекула регенерироваться не может. Метод массспектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации разделенных ионов. Для представления масс-спектральных данных часто пользуются графиками, называемыми масс-спектрами. Масс-спектр − это распределение заряженных частиц по их интенсивностям в соответствии с отношениями их масс к зарядам. Следовательно, первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, перевести нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы − ионы. Этот процесс называется ионизацией и осуществляется различными способами. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 327 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Рис. 6.14. Масс-спектр диметисульфоксидного производного пальмитолеиновой кислоты из Ralstonia eutropha. Молекулярная масса компонента составляет 362, а идентифицирующими ионами положения двойной связи в молекуле являются 145 и 217 m/z [11] Следовательно масс-спектрометрия (масс-спектральный анализ) – метод анализа вещества путем определения массы (чаще отношения массы к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества. В качестве иллюстрации приведен масс-спектр дисульфидного производного метилового эфира пальмитолеиновой кислоты, выделенной из бактерий Ralstonia eutropha (рис. 6.14). Начало развитию масс-спектрометрии положено опытами Дж. Томсона (1910), исследовавшего пучки заряженных частиц, разделение которых по массам производилось с помощью электрического и магнитных полей, а спектр регистрировался на фотопластинки. Первый масс-спектрометр построен А. Демпстером в 1918 г., а первый масс-спектрограф создал Ф. Астон в 1919 г.; он же исследовал изотопный состав большого числа элементов. Первый серийный масс-спектрометр создан А. Ниром в 1940 г.; его работы положили начало изотопной масс-спектрометрии. Прямое соединение массспектрометра с газо-жидкостным хроматографом (1959) дало возможность анализировать сложные смеси летучих соединений, а соединение с жидкостным хроматографом с помощью термораспылительного устройства (1983)− смеси труднолетучих соединений. Любой масс-спектрометр сочетает комплекс процессов, протекающих в нем. Так, сначала происходит ионизация молекул с образованием газообраз- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 328 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии ных ионов, затем идет разделение ионов, регистрация их масс и относительных количеств. Каждый ион, который может быть положительным или отрицательным, характеризуется отношением его массы к заряду (m/z). В соответствии с этим отношением происходит разделение различных ионов. В масс-спектрометре исследуемое вещество переводится в газообразное состояние до или в процессе ионизации. Macс-спектральные приборы. Для разделения ионов исследуемого вещества по величинам m/z, измерения этих величин и токов разделенных ионов используют масс-спектральные приборы. Рис. 6.15. Принципиальная схема масс-спектрометра Масс-спектральные приборы состоят из системы ввода пробы (система напуска), ионного источника, разделительного устройства (масс-анализатора), детектора (приемника ионов), вакуумных насосов, обеспечивающих достаточно глубокий вакуум во всей вакуумной системе прибора, и системы управления и обработки данных (рис. 6.15). В современных приборах обработка данных и контроль задаваемых параметров производятся компьютером. Превращения нейтрального атома или молекулы в заряженную частицу путем удаления из них или присоединения к ним одного или нескольких электронов называется ионизацией. Ионный источник предназначен для образования газообразных ионов исследуемого вещества и формирования ионного пучка, который направляется далее в масс-анализатор. Наиболее универсальный метод ионизации вещества − электронный удар. Впервые этот метод осуществлен П. Ленардом (1902). Современные источники такого типа построены по принципу источника А. Нира. Для ионизации молекул обычно используют электроны с энергиями 70–100 эВ, которые движутся со скоростью 108 см/с и проходят путь, равный диаметру молекулы органического соединения за 10-16с. Этого времени достаточно для удаления электрона из молекулы вещества и образования молекулярного иона − положительно заряженного ион -радикала М+, имеющего энергию 2–8 эВ. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 329 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Молекулярные ионы в зависимости от избытка внутренней энергии находятся в различных возбужденных состояниях, что обуславливает различное время их фрагментации или диссоциации. Обычно такой процесс протекает за время 10-13с. При этом молекулярные ионы превращаются в осколочные (фрагментные) ионы с более низкой электронной энергией. Фрагментные ионы, которые обладают еще достаточным избытком колебательной энергии, претерпевают дальнейший распад. Этот процесс продолжается до тех пора, пока не будет израсходован весь избыток внутренней энергии, присущий родоначальному молекулярному иону. Образование фрагментных ионов характеризуется энергией (потенциалом) появления, т.е. минимальной энергией электронов, при которой начинает детектироваться соответствующий ион. Нетрудно представить, что энергия появления молекулярного иона есть не что иное, как энергия ионизации молекулы. При распаде молекулярного иона, который является нечетноэлектронной частицей, образуются фрагментный ион и нейтральная частица, которая может быть как четно-электронной, так и нечетно-электронной, т.е. радикалом типа H•, •CH3 и т.д. При отщеплении нейтральной частицы возникает новый нечетно-электронный ион-радикал: М+• → [Ф1]+• + N, а при выбросе радикала − четно-электронный ион: М+• → [Ф2]+ + N•. Дальнейшие направления распада этих ионов различны. Нечетноэлектронный ион [Ф1]+• способен далее подобно М+• элиминировать либо нейтральную четно-электронную молекулу, либо радикал, в то время как катион [Ф2]+ в подавляющем большинстве случаев может терять лишь четноэлектронную молекулу (четно-электронное правило). Таким образом, процессы фрагментации молекулярных ионов характеризуются значительным числом последовательных и конкурирующих направлений распада, вероятность которых определяется природой молекулы и элементов, ее составляющих, энергией разрывающихся связей, внутренней энергией образующихся ионов, стабильностью ионов и элиминирующихся нейтральных частиц, а также временным интервалом между образованием иона и его детектированием. Ионы с минимальным запасом энергии достаточно устойчивы и достигают приемника. Ионы с большим запасом внутренней энергии распадаются на пути движения на ионы с меньшей молекулярной массой (осколочные ионы), характерные для вещества определенного строения. Для ионизации молекул энергия электронного пучка должна превышать некоторую критическую для вещества величину, называемую потенциалом ионизации. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 330 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Потенциалы ионизации лежат в пределах 3,98 эВ (Fr)− 24,58 эВ (Не), для большинства органических соединений – 7–11 эВ. Используя моноэнергетические пучки электронов и снижая их энергию до пороговых значений, можно определять потенциалы ионизации вещества и потенциалы появления ионов − критическую энергию электронов, при которой в спектре появляются линии соответствующих осколочных ионов. При ионизации электронным ударом происходит перераспределение энергии возбуждения по колебательным степеням свободы иона, прежде чем этот ион распадается. Предположение о квазиравновесном распределении энергии возбуждения позволяет полуэмпирическим путем рассчитать масс-спектры некоторых веществ, согласующиеся с экспериментальными данными. Однако во многих случаях, особенно для длинных молекул, эта теория не подтверждается. Для двухатомных молекул изменения колебательного состояний объясняют, исходя из принципа Франка − Кондона. При взаимодействии низкоэнергетических электронов (менее 10 эВ) с веществом могут осуществляться процессы резонансного захвата электронов молекулами с образованием отрицательно заряженных ионов. Масс-спектр электронного удара − высок очувствительный метод анализа, он позволяет анализировать пикомольные количества вещества, его предпочитают использовать для исследования структуры соединений. Существуют «библиотеки» масс-спектров, содержащие спектры более 350 000 органических соединений, по которым можно проводить их идентификацию с применением ЭВМ. Недостатки метода: молекулярные ионы образуются лишь у 20 % органических соединений; метод применим только для определения легколетучих термически стабильных соединений; в значениях полного ионного тока на ионы с большими значениями m/z, дающими информацию о молекулярной массе и наличии функциональных групп, приходится меньшая часть; отрицательно заряженные ионы, имеющие большое значение в структурном анализе, образуются в очень небольшом количестве и в ограниченном числе органических соединений. Для решения части проблем применяют метод химической ионизации, которая осуществляется при столкновении молекул исследуемого вещества с ионами реагентного газа, в качестве которого используются индивидуальные вещества или их смеси. Реагентный газ находится в источнике под давлением 65–130 Па, парциальное давление исследуемого вещества – 0,1–0,01 Па. При бомбардировке такой смеси электронами с энергией 70–500 эВ преимущественно ионизируются молекулы реагентного газа. Образовавшиеся положительно заряженные ионы в результате ионно-молекулярных столкновений с неионизированными молекулами реагентного газа преобразуются в реактантные ионы, которые, в свою очередь, взаимодействуют с молекулами исследуемого вещества и ионизируют их, образуя ионы МН+. Наиболее используемые реагентные газы и их характеристики приведены в табл. 6.3. Химическая ионизация с образованием положительно заряженных ионов может осуществляться также в результате переноса заряда с реактантных ионов, например, Не+' , Ar+' , N2+', СО+', NO+' на молекулы исследуемого вещества; при этом образуется молекулярный ион М+. Масс-спектры химической иониза Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 331 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии ции с реагентными газами Ar и N2 напоминают спектры электронного удара. Метод химической ионизации позволяет оценивать кислотно-основные свойства органических соединений в газовой фазе. Химическая ионизация с образованием отрицательно заряженных ионов осуществляется в результате взаимодействия исследуемых молекул с ионами NH2-, OH-, CH3O-(сродство к протону, соответственно, 1682, 816 и 778 кДж/моль). Таблица 6.3 Реагентные газы и их характеристики Газ-реагент СН4 Н2О (СН3)3СН NH3 Сродство к протону, кДж/моль 536 724 828 858 Реактивный ион CH5+ H3O+ (СН3)3С+ NH4+ Ион исследуемого вещества MH+ + MH , MH3O+ MH+ + MH , MNH4+ Последние образуются при захвате молекулами NH3, H2O и СН3ОН электронов с пониженной энергией (около 6 эВ) с последующим распадом образовавшихся молекулярных ионов М- (диссоциативный захват). Ионы OH-, CH3O- образуются в значительном количестве при электронной бомбардировке смесей N2O с СН4 или (СН3)3СН, Н2О и N2O с СН3ОН. Часто метод химической ионизации более чувствительный, чем метод ионизации электронным ударом, т. к. практически все имеющиеся в ионизационной камере электроны используются для ионизации. Метод позволяет анализировать пространственные и оптические изомеры. Его важное достоинство – большой выход протонированных молекулярных ионов МН+ при малом выходе осколочных ионов. Другим методом мягкой ионизации является полевая десорбция. Полевая десорбция – это образование ионов в сильном электростатическом поле (108 В/см) за счет квантово-механического туннельного эффекта. Полевая десорбция может происходить при низких температурах эмиттера и не сопровождаться диссоциацией. В результате образуются в основном молекулярные и квазимолекулярные ионы. Так, например, в масс-спектре электронного удара ацетилсалициловой кислоты преобладают продукты диссоциативной ионизации с m/z, равным 140 и 120, а в масс-спектре полевой десорбции есть только два пика: молекулярный с М = 180 и квазимолекулярный с М = 181, образованный путем присоединения протона к молекуле ацетилсалициловой кислоты. Однако несмотря на определенные успехи, этот метод не получил достаточно широкого применения в связи с его избирательностью. Далеко не все молекулы отдают поверхности электрон при низких температурах. Для ионизации труднолетучих соединений в масс-спектрометрии применяются искровая и лазерная ионизация вещества. Ионизации подверга Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 332 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии ется твердое вещество. В искровом источнике испарение и ионизация исследуемого вещества происходят за счет искрового разряда, зажигающегося между электродами при разности потенциалов между ними от 3 до 5 кВ. На одном из электродов находится сам образец. Лазерная ионизация производится путем импульсного лазерного нагрева твердого вещества, и образующийся плазменный пучок направляется в масс-анализатор. В этих условиях происходит полное разрушение химических соединений, и в масс-спектре фиксируются лишь атомные ионы и определяется элементный состав образца. Похожие результаты можно получить, производя испарение и ионизацию твердого вещества ионами или нейтральными атомами с энергией в несколько киловольт. Эти методы широко применяются для элементного анализа. Масс-анализаторы – устройства для пространственного или временного разделения ионов с различными значениями m/z в магнитном или электрических полях или их комбинациях. Различают статические и динамические анализаторы. В статических ионы разделяются в постоянных или практически не изменяющихся за время их движения через анализатор магнитных полях. Ионы с различным значениями m/z движутся в таком анализаторе по разным траекториям и фокусируются последовательно на щель детектора в результате плавного изменения напряженности электрического и магнитного полей анализатора. В динамических анализаторах разделение ионов происходит под воздействием импульсных или радиочастотных электрических полей с периодом изменения, меньшим или равным времени пролета ионов через масс-анализатор. Ионы с различным значениями m/z, как правило, разделяются по времени пролета определенного расстояния. Давление в анализаторах должно быть достаточно низким (~10-5Па), чтобы избежать рассеяния ионов на молекулах остаточных газов. Основные характеристика масс-анализатора – его разрешающая способность, или разрешающая сила R. Она характеризует способность анализатора разделять ионы с незначительно отличающимися друг от друга массами и определяется отношением значения массы иона М к ширине его пика ∆М (выраженной в атомных единицах массы) на определенном уровне высоты пика (обычно 50 или 10 %): R = М/∆М. Например, R = 10 000 означает, что масс-анализатор может разделять ионы с массами 100,00 и 100,01. Наиболее часто применяют статистические масс-анализаторы с однородным магнитным полем (одинарная фокусировка) или комбинацией электрических и магнитных полей (двойная фокусировка). В масс-анализаторах с одинарной фокусировкой ионный луч, сформированный в источнике ионов, выходит из щели шириной S1 в виде расходящегося ионного пучка и в магнитном поле разделяется на пучки ионов с различным значениями m/z. Под действием поля, силовые линии которых направлены перпендикулярно направлению движения ионного пучка, ионы двигаются по круговой траектории с радиусом r = (2Vmn/zH2)1/2, Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 333 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии где V – напряжение, ускоряющее ионы; mn – масса иона; z – заряд иона; H – напряженность магнитного поля. Ионы с одинаковой кинетической энергией, но с разными массами или зарядами проходят через анализатор по различным траекториям. Обычно развертка масс-спектра (регистрация ионов с определенными значениями m/z) осуществляется изменением Н при постоянном V. Разброс ионов, вылетающих из ионного источника, по кинетическим энергиям, а также несовершенство фокусировки по направлениям приводят к уширению ионного пучка, что сказывается на разрешающей способности. Для статического массанализатора R = r/(S1 + S2+ δ), где S1 и S2 – соответственно, ширина входной и выходной щелей; δ – уширение пучка в плоскости выходной щели. Уменьшение размера щелей для увеличения разрешающей способности прибора трудно осуществимо технически и, кроме того, приводит к очень малым ионным токам, поэтому обычно конструируют приборы с большим радиусом траектории ионов (r = 200–300 мм). Разрешающая способность может быть повышена также при использовании масс-анализаторов с двойной фокусировкой. В таких приборах ионный пучок пропускают сначала через отклоняющее электрическое поле специальной формы, в котором осуществляется фокусирование пучка по энергиям, а затем через магнитное поле, в котором ионы фокусируются по направлениям. Существует более 10 типов динамических масс-анализаторов: квадрупольный, время-пролетный, циклотронно-резонансный, магнитно-резонансный, радиочастотный, фарвитрон, омегатрон и др. Наиболее широко применяемый масс-анализатор – квадрупольный. Этот масс-анализатор представляет собой квадрупольный конденсатор (рис. 6.16), к парам параллельных стержней которого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное V0cos ωt (ω– частота; t – время); их суммы для каждой пары равны по величине и противоположны по знаку. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 334 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Рис. 6.16. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 – высокочастотный генератор; 2 – генератор постоянного напряжения; 3 – генератор развертки; 4 и 5 – источник и детектор ионов Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся в камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным объемным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и у. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через квадрупольный конденсатор, у ионов с другими значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжения или частоты. Для современных квадрупольных масс-спектрометров R = 8000. Первый квадрупольный прибор построен В. Паули и X. Штайнведелем (ФРГ, 1953). Время-пролетный масс-анализатор представляет собой эквипотенциальное пространство, в котором дрейфуют ионы, разделяясь по скоростям движения. Ионы, образующиеся в ионном источнике, очень коротким электрическим импульсом «впрыскиваются» в виде «ионного пакета» через сетку в анализатор. В процессе движения исходный ионный пакет расслаивается на пакеты, состоящие из ионов с одинаковыми значениями m/z. Скорость дрейфа отслоившихся ионных пакетов и, следовательно, время их пролета через анализатор длиной L вычисляется по формуле t=L , (6.32) где V – напряжение. Совокупность таких пакетов, поступающих в детектор, образует массспектр. Для современных приборов R = 5 000–10 000. Первый прибор создан А. Камероном и Д. Эгтерсом (США, 1948), а в СССР – Н.И. Ионовым (1956). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 335 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Детекторы (приемники) ионов помещают на выходе прибора. Для детектирования используют электрометрические усилители, позволяющие измерять ионные токи до 10-14А, электронные умножители и сцинтилляционные детекторы с фотоумножителем, которые обеспечивают счет отдельных ионов (ток 10-19А) и имеют малую постоянную времени. Обработка данных на современных приборах идет на компьютере. Применение масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия широко применяют в различных областях науки и техники. Большие успехи достигнуты при анализе биологически важных продуктов биотехнологии; показана возможность структурного анализа полисахаридов с молекулярной массой до 15000, белков – до 45 000 и т.д. Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появляются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше информации об объекте исследования. Созданы тандемные масс-спектрометры, позволяющие двукратное, трехкратное, четырехкратное и т.д. разделение по массам. Хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому массспектрометры в хромато-масс-спектрометрах большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями. Весьма плодотворным, но далеко не в полной мере реализованным, оказалось совместное применение лазеров и масс-спектрометрии, которое может идти по двум – трем направлениям: применение лазеров в массспектрометрии, применение масс-спектрометрии для диагностики и изучения работы лазеров, масс-спектрометрический контроль работы установок по лазерному разделению изотопов. Более распространенным и относительно простым является применение масс-спектрометрии в аналитических целях. Условия ионизации в этих случаях, как правило, либо остаются неизменными, либо контролируемым образом переключаются между несколькими значениями. Масс-спектрометрия как область аналитических измерений требует довольно сложных приборов, основательного методического и метрологического обеспечения. Она объединяет и согласует длинную цепочку объектов, методов и процессов: объект исследования; подготовку эталонов, поверочных смесей или образцов сравнения; метод отбора и подготовки проб; ионизацию вводимого вещества; разделение ионов по массам; их детектирование; обработку и представление полученной информации; её анализ и последующие выводы. Работы по осуществлению этой цепочки требуют использования разнообразных систем и узлов масс-спектрометров. Эти методы обладают хорошей наглядностью, большой универсальностью и информативностью, позволяют достигать высокой чувствительности, разрешающей способности и точности, что спо Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 336 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии собствует их широкому распространению в различных отраслях науки и технологии. Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией активно используется в СФУ для решения ряда биотехнологических задач. а б Рис. 6.17. Масс-спектры основных диеновых углеводородов изолята Botryococcus озера Шира: а – 29:2; б – 29:3 [3, 22] Так, например, с помощью масс-спектрометрии были идентифицированы углеводороды двух представителей Botryococcus – музейного штамма и изолята озера Шира. На рис. 6.17 представлены масс-спектры основных углеводородов, выделенных из природного штамма Botryococcus braunii. На данных спектрах четко видны основные молекулярные ионы, характерные для доминирующих диенового и триеного углеводородов С29:2 и С29:3, а фрагментация молекул соответствует углеводородным цепям с двумя и тремя ненасыщенными связями. Идентификацию ацетиленовых кислот, синтезируемых водным мхом, проводили также по масс-спектрам. Но положение двойных и тройных связей в ненасыщенных кислотах определяли после получения диметилоксазолиновых производных фракции жирных кислот (ДМОК) и последующего хроматографирования их в тех же условиях, что и метиловые эфиры жирных кислот. На рис. 6.18 приведены масс-спектры метиловых эфиров двух ацетиленовых кислот и их ДМОК. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 337 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии а б в г Рис. 6.18. Масс-спектры метиловых эфиров основных ацетиленовых кислот липидов Fontinalis antipyretica: а – 6a, 9, 12–18:3 (А1); б – 8a, 11, 14–20:3 (А5) и их диметилоксазолиновых производных: в – 6a, 9, 12–18:3 (А1); г – 8a, 11, 14–20:3 (А5). Точками отмечены диагностические фрагменты, молекулярный вес которых отличается на 10 или 12 ам [12] Совершенная масс-спектрометрическая техника позволяет изучать полимерные молекулы, синтезируемые бактериями – полигидроксиалканоаты. На рис. 6.19 приведены две ионные хроматограммы 4- и 5-компонентных полимеров и масс-спектры соответствующих мономеров, из которых состоят полимеры. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 338 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Рис. 6.19. Ионные хроматограммы полимеров, выделенных из биомассы Ralstonia eutrophа В5786 с добавкой гептаноата (верх) и добавкой октаноата (зеркально внизу) и масс-спектры соответствующих мономеров – ГБ – βгидроксибутират с временем удерживания 7,37; ГВ – β-гидроксивалерат – 8,42; ГГ – β-гидроксигексаноат – 9,48; ГГеп – β-гидроксигептаноат – 10,75; ГО – β-гидроксиоктаноат – 11,95 [5] Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 339 ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ 6.3. Масс-спектрометрия в биотехнологии Масс-спектры β -гидрокси-кислот характеризуются наличием базового иона 103 m/z . Следовательно, все отмеченные на хроматограмме пики относятся к β -гидроксикислотам, а их длина определена по их временам удерживания. Фундаментальные физические законы, передовые научные и инженерные разработки, высокотехнологичные вакуумные системы, самые лучшие материалы, высочайшее качество их обработки, современнейшая быстродействующая цифровая и аналоговая электроника и компьютерная техника, а также программное обеспечение – основы современных массспектрометров. Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ. С ее помощью стала возможным разработка новых лекарственных средств, контроль их производства. Она дала существенное продвижение в области генной инженерии, биохимии и протеомике. Целый ряд техногенных (т.е. не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известный диоксин. Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С ее помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота. Конечно, и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека Helicobacter pylori и является самым надежным из всех методов диагностики. Таким образом, масс-спектрометрия в настоящее время является одним из наиболее информативных, чувствительных и надежных аналитических методов. Любая крупная физическая, химическая или биологическая лаборатория имеет в своем распоряжении масс-спектрометр, ориентированный на те или иные специфические исследования. Совершенствование техники позволило создать приборы, способные исследовать молекулы с огромными массами порядка 100 000 а.е.м. и выше, что, несомненно, открывает просторы для изучения таких сложных биологических молекул, как белки и нуклеиновые кислоты. Масс-спектрометрия способна обнаруживать примеси на уровне 0,0001 % и ниже, что актуально при контроле синтеза высокочистых веществ, например в микроэлектронике и медицинской биотехнологии. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 340 Г ЛА В А 7 ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов Биотехнические системы представляют собой совокупность биологических и технических элементов, связанных между собой в едином контуре управления. В результате интеграции биологии и технических наук конструирование оборудования для реализации биотехнологических процесссов стало специализированной областью биотехнологии, называемой биоинженерия. Аппаратурное оформление технологических процессов производства продуктов биотехнологии и прежде всего микробиологического синтеза весьма разнообразно и во многом специфично. Специфические требования к оборудованию биотехнологической промышленности связаны с санитарногигиеническими вопросами и предотвращением контаминации, что имеет решающее значение при проектировании. В этой связи одним из основных требований к оборудованию микробиологического производства является его герметичность. Применение герметичных аппаратов, особенно для стадии культивирования биологических объектов, является важным условием качественного проведения процесса и получения стандартного продукта с высоким выходом. Большое значение имеет правильный выбор материала, из которого изготовлено оборудование, поскольку компоненты материала могут оказывать как активирующее, так и ингибирующее действие на биосинтез биологически активных веществ. Еще одним важным требованием к оборудованию для биотехнологии является необходимость обеспечения высокой производительности. Чем больше производительность аппарата, тем меньше требуется сложных автоматических приборов контроля и регулирования параметров процесса, запорной аппаратуры, трубопроводов и др. Оборудование должно быть рассчитано на проведение непрерывных процессов, поскольку это создает возможность интенсифицировать и автоматизировать биотехнологические процессы. Важной особенностью биотехнологии является проведение основной технологической стадии (стадии ферментации) в водной среде, при постоянном перемешивании и вибрации, а также меняющихся параметрах (рН, температуры, ионной силы среды и др.). Эти обстоятельства предопределяют схожесть процессов приготовления питательных сред для микроорганизмов, проведения биосинтеза и выделения целевых продуктов и обуславливают создание универсальных установок, позволяющих осуществлять без серьез Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 341 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов ной переналадки большое количество процессов, производящих ценные продукты. Биотехнологическая установка (ферментер, биореактор) состоит из стандартных модулей, реализующих типовые операции. Их конкурентоспособность по сравнению с установками, проектируемыми конкретно для заданного технологического процесса, определяется тем, что в них заранее заложена возможность быстрой замены технологий в широком диапазоне, в зависимости от меняющихся потребностей рынка. Это сокращает вынужденный простой установки и связанные с ним нерациональные накладные расходы. Использование модульного принципа в биоинженерии позволяет добиться высокой степени заводской готовности оборудования и снижает затраты на его изготовление и монтаж. Модульный принцип также предусматривает разработку и использование типовых алгоритмов и программ оптимального управления оборудованием, модулей с использованием микропроцессоров, а также пакета программ оптимального для управления выбранными технологическими процессами. Использование возобновляемого сырья с одновременным производством ценных, например кормовых препаратов, существенно снижает себестоимость получаемого продукта, что также повышает конкурентоспособность модульных линий, а их малая мощность облегчает обеспечение ее экологической безопасности. Кроме того, предлагаемое сырье и процесс его подготовки предусматривают полную утилизацию твердых отходов, концентрирование и использование стоков, и возврат конденсата от их упаривания в технологический процесс. Модульные линии имеют определенные перспективы для выхода на международный рынок, поскольку есть достаточное количество средних и малых стран, испытывающих потребность в препаратах, но не имеющих достаточных средств для создания крупных предприятий. Однотипность модулей позволяет объединять их в сети, в которых отдельные функции линии могут быть сосредоточены в специализированных подразделениях. Важнейшей задачей биотехнологического производства является получение максимального выхода целевого продукта. Для достижения этой цели процесс ферментации должен проходить в оптимальных условиях, которые создаются с помощью ферментационного оборудования и той инфраструктуры, которая обеспечивает его функционирование. В этой связи на первый план выдвигаются задачи, связанные с устранением заражения культуры посторонней микрофлорой и обеспечения качественного управления процессом культивирования. Заражение культуры микроорганизмов или клеток посторонней микрофлорой приводит к прямым экономическим потерям, причем в ряде случаев очень значительным. Поэтому при выборе ферментационного оборудования в первую очередь обращают внимание на надежность обеспечения асептики процесса культивирования. Другое важное требование относится к процессу стерилизации питательной среды. Питательная среда не должна быть «перегрета» при тепловой стерилизации, что приводит к деструкции таких ее ком Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 342 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов понентов, как витамины и аминокислоты, а результатом этого становится замедление роста культуры и падение продуктивности. Стерилизация питательной среды должна проводиться в автоматическом режиме. Практика показывает, что ошибки оператора являются главной причиной отсутствия стерильности питательной среды. Процессы, протекающие при ферментации, требуют непрерывного управления. Всевозрастающая потребность отраслей народного хозяйства в продуктах микробиологического синтеза обусловливает разработку новых принципов подхода и к проектированию технологических линий микробиологических производств. Особенностями такого подхода являются выяснение на этапе проектирования большого числа альтернативных вариантов технологических схем, возможных типов оборудования и формирование наиболее оптимальных из числа рассматриваемых схем. Очевидно, что разработка технологических линий в первую очередь должна осуществляться с учетом функционально-целевого назначения системы, особенностей продукта производства и совокупности ограничений, налагаемых спецификой объекта на структуру и функции системы. Создание новой технологии начинают с выбора аналитических методик. Затем полученные сведения суммируются в лабораторной методике получения продукта. Далее с использованием лабораторного оборудования изучается динамика процессов, определяется критерий оптимальности, подбираются оптимальные параметры всех технологических операций и даются рекомендации по использованию промышленного технологического оборудования, оцениваются объёмы отходов, стоков и выбросов, определяются их параметры, даются рекомендации по их использованию. На основе результатов этих исследований готовится нормативная документация на производство, патентуется способ производства. Итогом работы является лабораторный технологический регламент, который может использоваться для подготовки исходных данных на проектирование либо опытно-промышленной установки, либо опытного производства. Если полученные в лаборатории данные не позволяют с достаточной степенью уверенности осуществить расчетным путем масштабирование для серийного производства, проводятся опытно-промышленные работы, для чего создается опытно-промышленная установка. На ней производится отработка технологического процесса с использованием образцов промышленного оборудования уменьшенных размеров, которые, однако, должны обеспечить сохранение достигнутых показателей при промышленном производстве. При этом нарабатываются опытные партии продукции и проводятся их промышленные испытания, организуется анализ рынка, определяются техникоэкономические показатели. По результатам работы составляется опытно-промышленный регламент, который кладется в основу исходных данных на проектирование промышленного предприятия. Начиная с этого момента, можно говорить о наличии новой технологии. Обычно разработчики технологии не являются инвесторами. Передача технологии от разработчика к инвестору происходит на Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 343 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов коммерческой основе путем заключения лицензионного договора. Предварительно маркетинговая служба инвестора, изучая рынок и информацию о новых технологиях, готовит предложения о направлениях инвестиций, на основании которых инвестор принимает решение о строительстве нового предприятия. Рис. 7.1. Система биотехнологического производства (схема Н.А. Войнова) Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение в России (фармацевтические продукты, ферменты и ферментные препараты, живые культуры микроорганизмов, дрожжи, препараты добывающих отраслей промышленности, сельского хозяйства и защиты окружающей среды), приводит к необходимости рассматривать общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании конкретного биотехнологического производства. В общем виде система производства продуктов биологического синтеза представлена на рис. 7.1. Каждое конкретное микробиологическое производство имеет свои отличительные особенности практически на каждой стадии технологического процесса. Однако эти особенности не меняют общую технологическую схему микробиологического производства. При осуществлении микробиологического синтеза можно выделить пять стадий производства. Это, прежде всего, стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которые могли бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма продуцента – главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший неже- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 344 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.1. Специфика реализации биотехнологических процессов лательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами. Третья стадия – стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. Реализуется микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции. Заключительная стадия производства – приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Управление современными процессами культивирования микроорганизмов основывается на значительном объеме информации о технологических процессах и требует выполнения большого числа воздействий для ведения процесса в соответствии с производственными требованиями. Локальные системы управления, комплектуемые с отдельным оборудованием, не полностью решают задачи автоматизированного управления процессами. Они, как правило, не реализуют логико-программное управление потоками. В этой связи созданы автоматизированные системы, которые комплексно управляют процессами. В этих системах совмещены информационные функции по контролю технологических параметров процессов и отображению состояния оборудования с управляющими функциями по автоматическому регулированию параметров, логико-программному управлению потоками и отдельными режимами процесса. Автоматизированные системы управления обеспечивают первичную обработку поступающей с объекта информации, централизованный контроль параметров процесса, обнаружение и сигнализацию технологических и аварийных отклонений параметров, регистрацию важнейших параметров, автоматическое регулирование заданных параметров, логико-программное управление процессом в автоматическом или операторном режимах работы. При автоматизации процессов культивирования микроорганизмов используют приборы контроля и средства управления как общепромышленного, так и Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 345 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии отраслевого назначения. При этом к дозирующим устройствам, датчикам контроля, запорной и регулирующей арматуре предъявляют специальные требования. Они должны легко разбираться для ручной чистки и мойки и обеспечивать возможность их промывки моющими растворами циркуляционным способом, в них должны отсутствовать застойные и недоступные зоны. Детали, контактирующие с питательной и культуральной средами, изготавливаются из специальных материалов. Дозирующие устройства, датчики и арматура должны выдерживать тепловую обработку горячей водой при 95 оС, а в некоторых случаях – стерилизацию острым паром. Поверхности, контактирующие с культуральной средой, должны быть гладкими, без трещин, выбоин, в которых может развиваться нежелательная микрофлора. При монтаже датчиков на технологических объектах применяют асептические соединения, прокладки и сальники. Для контроля параметров процесса используют специальные датчики (сенсоры), которые должны быть стерильными, если они помещаются в стерильные области. Измеряются следующие параметры: физические (температура, давление, потребляемая мощность, вязкость и поверхностное натяжение среды, скорости потоков, мутность, вес ферментера); химические (pH среды, концентрация растворенных газов, редокс-потенциал, концентрация субстратов, концентрация продуктов); биологические (RNA, DNA, NADH2, ATP, белок). Биологические параметры измеряют в отобранных пробах вне ферментера, за исключением NADH2, который можно измерять на биотехнологической линии флюрометрическим методом. Контроль течения процесса осуществляют с помощью компьютера, использование которого особенно важно для ферментаций, в которых субстрат и сырье составляют главную стоимость. Другая необходимость применения компьютерного контроля заключается в возможности оптимизации процесса, которая позволяет получить максимальные продуктивность, выход продукта и увеличить степень конверсии субстрата в продукт. Преимущество компьютерного контроля состоит также в быстром и эффективном управлении параметрами процесса, хранении и воспроизведении нужных данных, большей гибкости работы производства в соответствии со спросом на продукцию, наиболее надежный контроль загрязненности и безопасности на предприятии. Первичная информация, полученная от системы различных датчиков, с помощью компьютеров превращается в любую удобную стандартную систему единиц. Определяя весь необходимый набор параметров, характеризующих данный процесс, можно с помощью ЭВМ находить оптимальные их соотношения. Для получения четкой модели, описывающей динамику процесса, важно также знать процессы, происходящие внутри клеток. Компьютерный контроль делят на два типа: прямой цифровой контроль и аппаратурный. В первом случае компьютер получает данные с сенсоров и использует эту информацию для образования сигнала, который посылается обратно в систему управления для эффективного регулирования параметров процесса. В случае аппаратурного контроля компьютер только устанавливает показания существующих аналоговых датчиков. ЭВМ определяет скорость Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 346 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии образования CO2, потребление газового субстрата, коэффициент дыхания, удельную скорость потребления субстратов, экономические коэффициенты, технологические балансы, потребление энергии на единицу объема жидкости и другие параметры. В частности, если количество биомассы непосредственно не определяется, то ее можно рассчитать из модели. Использование математической модели позволяет лучше понимать ферментационный процесс, рассчитать влияние отклонений от стандартных параметров, на результаты ферментации и оптимизировать процесс быстрее и с меньшими затратами, чем с помощью традиционных приемов. Схема измерения параметров в ферментере при непрерывном процессе биосинтеза клеточной массы представлен на рис. 7.2. В комплекте ЭВМ – ферментер основными элементами являются: ферментер с набором датчиков, измерительных и исполнительных устройств; ЭВМ со своими периферийными устройствами; устройства связи с объектом, осуществляющие сопряжение ЭВМ и ферментера; математическое обеспечение, включающее операционные системы и программы пользователя. Цели, преследуемые вводом ЭВМ в контур управления, можно сформулировать следующим образом: сделать производство более экономичным за счет оптимизации технологии; увеличить надежность функционирования производства; создать производство мобильным; иметь оперативный доступ к информации о ходе процесса; уменьшить объем трудоемких операций. На рис. 7.3 представлена структурная схема для реализации программы анализа информации датчиков, работающая как подпрограмма математического обеспечения. Эта подпрограмма позволяет пользователю контролировать работу ферментера, так как она представляет ему следующие данные: характеристики массообмена, величину скорости роста микроорганизмов, массу клеток, количество получаемого продукта, расход энергии, общую эффективность процесса ферментации. Все эти показатели вычисляются по данным, полученным от датчиков, и представляются в численном и графическом виде на дисплее. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 347 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Рис. 7.2. Схема измерений основных параметров в ферментере (схема Н.А. Войнова) Рис. 7.3. Структурная схема реализации программы (схема Н.А. Войнова) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 348 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Управление процессом является частью программы обработки информации, в которой формируется рабочая стратегия по ведению процесса. Можно выделить три основных типа управления процессом: регулирование, программное управление и оптимизация. Для измерения рН используют систему со стеклянным измерительным электродом и электродом сравнения. ЭДС системы зависит от величины рН контролируемой среды. Под величиной рН понимают меру активности ионов водорода в растворе: рН = −lg Ан, где Ан – активность ионов водорода, г-ион/л. В последние годы по результатам исследования свойств стекла разработаны электроды, с помощью которых можно измерять не только рН, но и концентрацию (активность) ионов натрия, калия, аммония и др. Созданы также электроды с чувствительным элементом из ионообменных смол для измерения концентрации ионов кальция, магния и других ионов, содержащихся в питательных и культуральных средах, при микробиологических исследованиях. Электродные системы для контроля концентрации ионов состоят из измерительного ионоселективного электрода и вспомогательного электрода сравнения. ЭДС электродной системы зависит от концентрации соответствующего иона в контролируемой среде. По аналогии с рН вводятся величины pNa, рК, рСа и др. В общем виде, обозначив ион символом X, имеем pX = – lg Аx. На рис. 7.4, а приведена конструкция датчика, используемого для измерения рН в процессах культивирования микроорганизмов. В датчике применен комбинированный электрод 3, выдерживающий стерилизацию паром до 130 °С. Диапазон измерения электродом рН от 2 до 12. Рабочая длина электрода в зависимости от модификации колеблется в пределах от 120 до 550 мм. Комбинированный электрод – это система, в которой измерительный стеклянный электрод и вспомогательный электрод сравнения помещены в одном корпусе. Электрод устанавливается в корпусе 2 на фторопластовой втулке 13. Металлический и стеклянный цилиндры 5 и 12, втулка 7, гайка 6 создают герметизированную полость. В нее через узел 8 с манометром подается сжатый воздух, создающий в электроде сравнения избыточное давление. Коаксиальный кабель электрода герметизируется сальниковым уплотнением в виде прокладки 11, втулки 10 и гайки 9. С помощью накидной гайки 1 датчик крепится к установке. Внутренняя часть электрода залита 1 н. раствором НCl с добавлением глицерина и засыпана кристаллами AgCl. Содержание растворенного кислорода в культуральной жидкости в большей степени измеряют полярографическими анализаторами с твердыми электродами, в которых установлены селективно действующие по отношению к кислороду полимерные мембраны. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 349 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Если в измеряемом растворе есть кислород, он диффундирует через разделительную полимерную мембрану к измерительному электроду (катоду), где восстанавливается до гидроксила (в щелочном растворе) или воды (в кислом растворе). На вспомогательном электроде ячейки происходит электрохимическое окисление металла с отдачей электронов во внешнюю цепь. В результате ток, возникающий в цепи электродов электрохимической ячейки, будет пропорционален количеству кислорода, диффундирующего к измерительному электроду в единицу времени. 8 9 10 7 6 5 4 3 2 1 11 5 6 7 8 9 12 13 Т 10 11 14 а Т 12 13 4 3 2 1 б Рис. 7.4. Конструкции датчиков для измерения pH со стерелизуемым электродом (а) и электрохимической ячейки с внешним источником (б) (рис. Н.А. Войнова) Применяемые электрохимические ячейки могут быть с внутренним источником поляризационного напряжения (гальванические) и с внешним. В электрохимических ячейках в качестве измерительного электрода (катода) используют золотой, платиновый или палладиевый. Вспомогательный электрод в ячейках гальванического типа может быть из цинка, кадмия или свинца, а в ячейках с внешним источником напряжения – из серебра. Разделительными полимерными мембранами в ячейках служат мембраны из фторопласта – 4, полиэтилена толщиной от 10 до 100 мкм. Концентрацию растворенного кислорода О2 выражают в г/л или через парциальное давление рО2 над раствором. На рис. 7.4, б приведена конструкция электрохимической ячейки с внешним источником напряжения анализатора «Оксиметр». Ячейка состоит из корпуса 10 и герметично закрепленного в нем блока электродов 9. По Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 350 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии следний состоит из катода 1 и анода 4. Катод выполнен из платиновой проволоки диаметром 1 мм, впаянной в стеклянный капилляр; анод представляет собой трубку из серебра с полированной наружной поверхностью. На корпус надета полимерная мембрана 2 толщиной от 10 до 30 мкм, которая крепится резиновым кольцом 3 и защищается втулкой 11. Между корпусом и блоком электродов заливается раствор электролита 13. Корпус ячейки соединен гайкой 7 через прокладку 6 с втулкой 5. На корпусе крепится кольцо, которое обеспечивает возможность герметичной установки датчика в сосуде со стандартным шлифом 8. Защита ячейки при транспортировке осуществляется с помощью патрона 12. В преобразователе имеется стабилизированный источник постоянного тока, от которого на ячейку накладывается напряжение для осуществления полярографического способа измерения. Для каждой восстановленной на катоде молекулы имеет место соответствующая окислительная реакция на аноде, которая является причиной деградации анода и расхода электролита. Оба этих процесса неизбежно приводят к дрейфу показаний и занижению результатов. В связи с этим представляют интерес датчики, основанные на люминесцентном излучении вещества люминофора, что сводит измерение концентрации кислорода к чисто физическому фиксированию интервала времени. Данное явление определяется как способность определенных материалов (люминофоров) испускать излучение не в результате нагрева, а в результате возбуждения иного рода. Поскольку процесс измерения времени в принципе не подвержен дрейфу, датчик не требует регулярной калибровки и обслуживания. Концентрация CO2 и других отходящих газов также определятся по температуропроводности газов в специальных газовых анализаторах. Принцип движения газа в анализаторе представлен на рис. 7.5. Входящий воздух при помощи насоса отправляется в холодильник, который обеспечивает освобождение воздуха от содержащейся в нем влаги. Конденсат выводится из прибора. Попадание влаги на детекторы может привести к поломке прибора. Использование дополнительного насоса позволяет также поддерживать постоянную скорость протока воздуха, что необходимо для обеспечения воспроизводимости получаемых результатов. После подготовки воздух направляется в измеряющие ячейки. Так как зачастую необходимо получать данные не с одного, а с нескольких аппаратов, предусмотрено использование для этих целей «распределитель» каналов. Автоматический химический анализатор BioProfile 400 анализирует в реальном времени основные питательные компоненты и метаболиты. Этот многоканальный анализатор позволяет измерять десять параметров, включая глюкозу, лактат, глютамин, глютамат, аммоний, рН, РО2, РСО2, натрий, калий. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 351 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Рис. 7.5. Схема движения газа в анализаторе Результаты анализов сообщаются менее чем через 3 мин. Прибор может использоваться вместе с дополнительным компонентом On-Line Autosampler для автоматического одновременного анализа параметров с четырёх биореакторов. Результаты измерений представляются на дисплее и распечатываются на встроенном принтере. Прибор включает потенциометрические электроды (в измерениях pH, PCO2, NH4+, Na+, K+), биосенсоры для глюкозы, лактата, глютамина и глютамата – это амперометрические электроды, в мембране которых содержатся иммобилизованные ферменты. Измерение концентрации микроорганизмов в культуре. В технической микробиологии концентрацию микроорганизмов выражают как плотность микробной популяции, т.е. концентрацию жизнеспособных клеток в единице объема культуральной жидкости. Одним из методов определения плотности популяции микроорганизмов является подсчет количества колоний при высеве на плотные питательные среды. Для автоматического подсчета колоний бактерий на чашках Петри создан прибор «Биоматик» фирмы Фосс-Электрик, который состоит из измерительного устройства с телекамерой, монитора с телевизионным экраном и блока счета и регистрации результатов. Чашки Петри без крышек размещают под объективом прибора. Изображение анализируемой поверхности развертывается электронным пучком. Каждый раз, когда электронный пучок пересекает частицу, изменяется сила тока, что фиксируется блоком счета и регистрации результатов. Максимальный диаметр подсчитываемых колоний до 0,15 мм. Относительная погрешность счета до ±5 %. Прибор позволяет подсчитывать колонии бактерий до 180 чашек Петри в течение часа. Проведенные исследования показали, что оптически прозрачные среды позволяют использовать метод контроля, основанный на деформации световой энергии в клеточной суспензии. Он заключается в измерении интенсивности светового потока, прошедшего через слой жидкости. Оптическая плотность контролируется фотоэлектрическим прибором общепромышленного назначения. Измерения проводят при определенной длине светового потока. Перспективными инструментальными методами контроля концентрации микроорганизмов в жидкости являются методы дисперсионного анализа клеток (кондуктометрический и оптический). Указанные методы позволяют контролировать не только общее количество клеток, но и их распределение по размерам, что по существу является обобщенным морфолого-физиологическим портретом популяции. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 352 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии Биологические датчики представляют собой сочетание разнообразных биологических материалов, способных различать молекулы биологических тел (к числу таких материалов можно отнести ферменты, микроорганизмы, антигены и антитела, лигандовые рецепторы, пробы RNA и DNA и т.д.) с физико-химическими устройствами. В настоящее время существует несколько типов биосенсоров, отличающихся прежде всего принципами детекции хода ферментативной реакции. Это ферментные электроды, ферментные микрокалориметрические датчики и биодатчики на основе хеми- и биолюминесценции. Ферментные электроды используют электрохимический способ определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Они представляют собой электроды с нанесенным поверхностным слоем (какимлибо природным полимером), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворимом состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). Ферментные микрокалориметрические датчики используют тепловой эффект ферментативной реакции, состоят они из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисторами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью. Хеми- и биолюминесцентные датчики регистрируют световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции, находящимися в возбужденном состоянии. Конструкционно они включают колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Заложенный в систему этого типа датчиков аналитический метод характеризуется прежде всего крайне высокой чувствительностью. Большие перспективы для аналитических и диагностических целей имеют биологические микрочипы – миниатюрные устройства для проведения различных биохимических анализов. Это микропластинки с нанесенными на них с большой частотой включений реакционноспособных агентов, способных взаимодействовать с теми или иными веществами в составе анализируемых образцов. Для измерения технологических параметров процессов ферментации в производственных установках, как правило, используют термопары и термометры сопротивления: платиновые (ТСП) и медные (ТСМ). Чувствительные элементы (из платиновой или медной проволоки) заключены в защитный патрон из нержавеющей стали. Давление и разряжение измеряют датчиками с чувствительным элементом из одновитковой или многовитковой трубчатой пружины, а также сильфонными с чувствительным элементом из тонкостенных гофрированных сильфонов. Чувствительные элементы датчиков имеют застойные зоны, которые не промываются, поэтому их используют в комплекте со специальны Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 353 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.2. Элементы контроля и управления в биотехнологии ми разделительными устройствами типа РМ, предохраняющими чувствительные элементы от попадания измеряемой среды. Упругим элементом разделительного устройства типа РМ служит мембрана, прогибающаяся пропорционально измеряемому давлению и передающая через разделительную среду чувствительному элементу – датчику давления. В условиях асептических производств лучшими дозирующими насосами являются перистальтические и мембранные. Принцип действия индукционного расходомера основан на измерении ЭДС, индуктируемой в электропроводной жидкости. Величина ЭДС пропорциональна скорости потока жидкости. Наличие пены, интенсивное перемешивание не позволяют применять обычные методы измерения уровня. В этой связи целесообразно применять весовой тип уровнемера, в котором датчики, фиксирующие массу аппарата, передают свой сигнал на прибор, отградуированный в единицах уровня. Для сигнализации предельного уровня в резервуарах применяют кондуктометрические приборы. 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста Первые работы по составлению материального баланса роста популяций клеток основаны на применении закона сохранения вещества по каждому химическому элементу к метаболизму. Получаемые уравнения аналогичны уравнениям элементного баланса химических реакций. Например, уравнение для алкогольной ферментации глюкозы записывалось в виде С6Н12О6 → 2СН3СН2ОН + 2СО2 (7.1) Последующее развитие этого подхода привело к выводу ряда уравнений для ассимиляции субстрата клетками, где внутриклеточный продукт первичной ассимиляции в большинстве случаев считался углеводами и обозначался как СН2О, например: (Ацетат) 2СН2СООН + 3О2 → (СН2О) + 3СО2 + 3Н2О (7.2) (Сукцинат) С4H6O4 + 2,5O2 → (CH2O) + 3CO2 + H2O Ощутимый шаг в развитии теории материального баланса сделал Тамия в 1932 г. Он использовал вместо СН2О точный элементный состав клеток (C86H160O45N7) – другие элементы отбрасывались ввиду их малого содержания в биомассе. Состав биомассы и субстрата был выражен им в общем виде (7.3). Он сформулировал уравнения материального баланса для образования биомассы клеток из вещества субстрата в процессе клеточного дыхания. Эти Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 354 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста уравнения написаны по отдельности для случаев, когда субстрат имеет более высокую или меньшую восстановленность, чем биомасса, а также для случаев, когда источником азота служит аммиак или нитрат. Вместо восстановленности использован параметр, названный коэффициентом сгорания. Например, для субстратов, имеющих меньшую чем биомасса восстановленность, образование биомассы и окисление субстрата в процессе дыхания записаны в виде S·СnCSHnHS OnOS + N·NH3 = СnСВ НnHB ОnOB NnNB + С СО2; + WН2O, (7.3) s·CnCSHnHSOnОS + о·О2 = с·СО2 + w H2О Здесь n – числа атомов элементов, помеченные индексами соответствующих элементов, а также буквами S или В для субстрата и биомассы; CQ = с/о – коэффициент сгорания, который был получен из (7.3) и представлен в виде CQ = nc / (4nc + nH − 2n0). (7.4) Или для азотсодержащих субстратов состава CnCSHnHSOnOSNnNS, где продуктом биологического окисления является аммиак, из (7.4) получено выражение в виде CQ = nc / (4nc + nH − 2n0 − 3nN). (7.5) В ранних работах отсутствовал анализ роста как единого процесса, где совмещены дыхание и образование биомассы. Дальнейшие исследования в этой области привели к уравнениям элементного баланса роста микробных культур как единого процесса, включающего и образование биомассы и генерацию энергии для этого. Состав биомассы и стехиометрические коэффициенты стали определять экспериментально. Например, для роста на этаноле получено уравнение СН3СН2ОН + 1,82О2 + 0,15NH3 = = 1,03CH1,72 O0,44 N0,15 + 0,97CО2 + 2,31H2О (7.6) Вышеописанные работы по элементному балансу микробного роста показали, что законы сохранения вещества определяют связи между потреблением веществ в метаболизме и продуктами роста. Однако в них не была раскрыта связь между элементным составом и биологически доступной энергией веществ – участников процесса роста. Эта связь вытекает из самого определения величины выхода как отношения удельной скорости роста к удельной скорости потребления субстрата. Другой важный аспект такой зависимости, отражающей глубокие физиологические и биоэнергетические свойства метаболизма клеток, заключается в распределении потребленного субстрата на две части (используемые на рост их биомассы и поддержания существующей биомассы). Общая масса по Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 355 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста требленного субстрата как источника энергии для роста разделяется на два слагаемых: ∆S = ∆Sg + ∆Sm, где индексы g и m означают, соответственно, рост и поддержание. Деление обеих частей на прирост биомассы ∆Х с учетом ∆Х = µX∆t позволило получить 1/YX/S = 1/YGX/S + mS/µ, (7.7) где YGX/S = ∆X/∆Sg – выход роста биомассы из субстрата; mS = ∆Sm/∆t – удельная скорость затрат субстрата на поддержание клеток, г субстрата на г существующей биомассы в час, т.е. ч-1. Умножение (7.7) на удельную скорость роста µ дает: qS = µ/ YGX/S + mS. (7.8) Аналогично, для кислорода как субстрата: qS = µ/ YGX/0 + m0 , 1/YX/0 = 1/YGX/0 + m0/µ. (7.9) и выхода биомассы из образованной ATP: 1/YX/ATP = 1/YGX/ATP + mATP/µ. (7.10) Величина mATP более близка к клеточной биоэнергетике, чем mS и mO, поскольку характеризует скорость затрат переносчика энергии (ATP) на поддержание клеток. Существующие затраты на поддержание клеток пропорциональны удельной скорости роста: mS = mS0 + mS1 µ. (7.11) Это говорит о природе и о регуляции процессов круговорота вещества в живой клетке. Подстановка (7.11) в (7.7) и (7.8) дает следующий вид этих соотношений: 1/YX/S = 1/YmX/S + mS0/µ, qS = = µ/ YmX/S + mS0, 1/YmX/S = 1/YGX/S + mS1, (7.12) где YmX/S – «максимальный» выход биомассы, достигаемый при удельной скорости роста много большей, чем mSO. Параметры YmX/S и mSO определяются по результатам экспериментов. Проводят серию стационарных режимов непрерывного роста культуры при разных значениях µ. Получаемая линейная зависимость 1/YX/S(1/µ) или qS(µ) обрабатывается с использованием (7.12), что позволяет найти YmX/S и mSO. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 356 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста Выделение затрат того или иного субстрата на поддержание клеток, расчет µ – зависимой компоненты этих затрат и разработка вышеприведенных выражений, описывающих влияние скорости роста на выход биомассы и скорость потребления этого же субстрата, явились важным продвижением в области баланса и кинетики роста клеточных популяций. Однако представленные выражения не описывают полный материальный баланс роста популяции. Связь величин mS и mO с энергией количественно не подтверждена (затраты энергии субстрата на поддержание клеток), но не выражена явно. Такую связь отражает величина mATP. Но ни одна из величин YmX/S, YGX/S, YGX/ATP не выражена через энергосодержание субстрата. Рост популяций микроорганизмов имеет два количественных аспекта, тесно связанных между собой – стехиометрический и кинетический. Кинетика есть совокупность закономерностей, определяющих зависимость скоростей метаболических процессов от свойств самого объекта и факторов внешней среды, влияющих на него. Стехиометрические закономерности определяют соотношение между этими скоростями. Входящие в метаболизм клеток потоки перераспределяются, вещество органического субстрата попадает не только в биомассу, но и в продукты метаболизма, энергия субстрата не только включается в биомассу, но и рассеивается в виде тепла. В случае двух химических реакций, использующих один и тот же субстрат, отношение расходящихся потоков не представляет интереса, так как легко находится, если известны зависимости обеих скоростей от условий среды. В метаболизме имеет место иная картина. Чисто линейные участки в нем практически не встречаются, он представляет собой большую сеть из переплетающихся реакций, связанных стехиометрическими и регуляторными кинетическими связями. Эксперименты по культивированию микроорганизмов указывают на то, что какой-то из больших метаболических потоков, например от органического субстрата в биомассу, может быть ведущим, а остальные привязаны к нему и через него зависят от внешней среды. Важным фактором, определяющим соотношение скоростей входящих и выходящих потоков, являются связи и ограничения, определяемые законом сохранения вещества и законами термодинамики. Они образуют жесткие физико-химические рамки, внутри которых действует кинетика и которые в значительной степени ответственны за определенность свойств биологического объекта. Задача заключается в выявлении физико-химических основ стехиометрии роста микробных популяций и максимальном использовании этих закономерностей в исследованиях эффективности и скорости роста микроорганизмов на различных источниках вещества и энергии в различных условиях. Исследование баланса вещества и энергии при росте популяций микроорганизмов включает в себя следующие аспекты: количественные соотношения между различными стехиометрическими коэффициентами, описывающими распределение потоков вещества в метаболизме; взаимосвязь балансов вещества и энергии при росте микробных популяций; механизмы влияния среды и характеристик клеточного метаболизма на эффективность и скорость Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 357 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.3. Основы материально-энергетического баланса микробного роста роста; максимальная достижимая эффективность роста популяций на различных субстратах; использование найденных закономерностей в исследовательской и технологической практике. 7.4. Элементный баланс роста микробных культур Распространенная форма записи стехиометрии химической реакции и их множества такова, что субстраты (расходуемые вещества) стоят в левой части уравнения, а продукты (образуемые вещества) в правой [3]. Например, реакция превращения 3-фосфоглицеринового альдегида в пировиноградную кислоту, состоящая из ряда стадий, имеет вид Н2РО3–ОСН2– СНОН– СНО + NAD+ + 2ADP) + Рi = = СН3–СО–СООН + 2АТР + Н2О + NADH + Н+ (7.13) В общем виде стехиометрическое уравнение можно записать как I J ∑ νisSi = ∑ ν PJ PJ . (7.14) =i 1 = J 1 Здесь 1 < i < I и 1 <j <J – отдельная нумерация для субстратов Si и продуктов Рj, а соответствующие стехиометрические коэффициенты νis (для субстратов) и νJp (для продуктов) все положительны. Такая форма записи обладает громоздкостью, которая видна при исследовании множеств химических реакций. Одно и то же вещество может тогда быть субстратом в части реакций и продуктом в других. Чтобы избежать излишней сложности, все участники реакции переносятся в левую часть уравнения, нумеруются одной общей нумерацией, а коэффициенты считаются отрицательными для субстратов (это символизирует их убыль) и положительными для продуктов. Тогда обобщенное стехиометрическое уравнение химической реакции имеет вид v1S1 + v2S2 + … + vKSK = 0 (7.15) или, в более компактной форме: K 0, ∑ ν k Sk = (7.16) k =1 где k – номер реагента (субстрата или продукта); Sk – символическое обозначение k-го реагента; vk – стехиометрические коэффициенты; К – общее число реагентов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 358 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур Стехиометрические коэффициенты любой реакции связаны между собой законом сохранения вещества, который соблюдается для каждого химического элемента, входящего в состав реагентов. Еще одну связь добавляет закон сохранения электрического заряда, если в реакции участвуют ионы. Стехиометрические уравнения могут относиться и к совокупности реакций. Превращение глюкозы в фруктозо-1,6-дифосфат происходит без изменения числа атомов углерода в молекуле. Затем происходит расщепление на два трехуглеродных фрагмента, и поэтому число молекул, превращающихся из 3-фосфоглицеральдегида в пируват, а затем в этанол, вдвое больше, чем число прореагировавших молекул глюкозы. Учитывая последнее обстоятельство, сложение стехиометрических уравнений всех реакций дает итоговое уравнение так называемой брутто-реакции: С6Н12О6 (глюкоза) + 2АДР = 2С2H6O(этанол) + 2СО2 + 2АТР (7.17) При этом предполагается, что движение вещества по всему пути происходит жестко – сколько молекул, например, фруктозо-1,6-дифосфата образовалось, столько же и употребилось в следующей реакции, и не происходит ни накопления, ни истощения пула каждого интермедиата (промежуточного метаболита). В действительности же в любом метаболическом пути все пулы «дышат», концентрации интермедиатов испытывают колебания, либо периодические, либо случайные, либо то и другое одновременно. Поэтому стехиометрия, описываемая брутто-уравнением типа (7.17), справедлива, если рассматриваются количества вещества, прошедшие по данному пути за достаточно большое время, например, значительно превышающее период колебаний интермедиатов. Тогда, поскольку концентрации интермедиатов ограничены, количество вещества, прошедшее через весь метаболический путь, значительно превышает количество вещества, остающееся в промежуточных соединениях. Вышесказанное позволяет рассматривать рост биомассы и образование продуктов метаболизма как большую брутто-реакцию. Ее балансирование по химическим элементам и, если нужно, по электрическому заряду, дает возможность найти связи между различными стехиометрическими коэффициентами при росте клеточных популяций. Этот подход явился стартовой позицией [2] для разработки новых принципов и расчетных методов материальноэнергетического баланса роста клеточных популяций. Задача баланса сводилась к следующему. Имеется несколько величин, характеризующих эффективность роста микроорганизмов. В простейшем случае аэробного роста, когда образование органических продуктов незначительно или вообще отсутствует, это два коэффициента – YX/S – выход биомассы из органического субстрата, водорода и т.д. и YХ/O – выход биомассы из потребленного кислорода. Субстрат является источником вещества и энергии для роста, а кислород связан с процессом извлечения клетками энергии из субстрата для использования в метаболизме при преобразовании субстрата в биомассу. Поэтому каждый из двух выходов представляет интерес. Возникает вопрос о взаимосвязи Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 359 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур этих величин. При наличии такой связи можно ограничиться изучением одной из них, а именно, той, которую легче измерять, а другую при необходимости вычислять из первой. В связи с этим интересен элементный баланс для весьма распространенного в природе и биотехнологии процесса – гетеротрофного аэробного роста микроорганизмов, когда в качестве источника азота используется аммиак. Этот случай интересен также потому, что азот в NН3 находится в том же электронном состоянии, в котором находится почти весь азот биомассы. Элементный состав сухого вещества биомассы, состав органического субстрата и возможного органического продукта в общем виде записывается следующим образом: СНmO1 (субстрат), СНрОnNq (биомасса), СНrОsN1 (продукт). Углерод органического субстрата расходится в трех направлениях – в биомассу, в органический продукт (если он образуется) и в СО2. Выходы (по углероду) биомассы и продукта – ух/s и ур/s. Каждая из этих величин есть доля углерода субстрата, включенная в вещество биомассы и продукта. Тогда процесс преобразования вещества субстратов при росте культуры с позиции перераспределения атомов химических элементов записывается в следующем виде: СНmO1 + аNН3 + bO2 = = YХ/S СНРОNNq + YP/S СНГ OS NT + (1 – уx/s – yp/s)СО2 + сН2О. (7.18) Значения ух/s и уp/s не фиксированы. В зависимости от микроорганизма и условий культивирования они могут меняться в пределах от нуля до некоторого максимума. В уравнении (7.18) присутствуют пять коэффициентов: а, b, с, ух/s, yp/s. Имеются четыре условия сохранения числа атомов химических элементов С, Н, О, N, из которых условие для углерода уже учтено. Остальные условия дают выражение а, b, с через С и yp/s: a = YP/S q + YP/S t; b = ¼ (γS − YP/S γB − YP/S γP); с = m/2 + γX/S (3q − p)/2 + γP/S(3t − r)/2; γs = 4 + m – 21; γB = 4 + p –2n – 3q ; γp = 4 + r – 2s – 3t. (7.19) (7.20) (7.21) (7.22) (7.23) (7.24) Величины γs, γВ, γр играют важную роль в материально-энергетическом балансе микроорганизмов и живой материи. Они являются мерой восстановленности углерода, соответственно, органического субстрата, биомассы и органического продукта. Это можно видеть из правых частей уравнений (7.22)–(7.24), учитывают число атомов С, Н, О, N в составе каждого вещества: 4 – число электронов внешней оболочки атома углерода, каждый атом во- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 360 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур дорода добавляет по одному электрону, а кислород и азот (выступающий как окислитель в NНз) отнимают от этих электронов, соответственно, по 2 и 3. Эти величины послужили отправным пунктом дальнейшего развития исследований, приведших к разработке метода материально-энергетического баланса. Величины а, b и с описывают расход аммиака и кислорода и образование метаболической воды при росте культуры. Чтобы найти их численные значения, необходимо задать выходы биомассы и продукта по углероду уx/s и уp/s, а также γs, γВ, γр. Значения ух/s и ур/s зависят от вида клеток и от условий культивирования. Для часто встречающегося случая, когда образование органических продуктов отсутствует или незначительно, уp/s = 0. Поскольку молекулярная масса кислорода равна 32, а сухая масса клеток в правой части (7.18) равна 12ух/s/σв (σв – доля углерода в сухом веществе клеток), то расход кислорода на единицу образованной биомассы равен: 1/ YX/O = 2σB/3 ((γs / ух/s ) − γВ). (7.25) Согласно анализу (7.25) для каждого значения γs имеется ух/s такое, при котором расход кислорода становится равным нулю, а при более высоких ух/s делается отрицательным. Однако это означало бы, что при каких-то режимах гетеротрофного роста кислород мог бы выделяться, как при фотосинтезе. Поскольку такие процессы неизвестны, это предположение выглядит неправдоподобным. Очевидно, что строгое решение вопроса о максимально допустимом значении выхода по углероду требует совместного рассмотрения баланса вещества и баланса энергии. В связи с этим степень восстановленности является величиной, которая несет в себе связь балансов вещества и энергии. Чтобы понять ее смысл, рассматривается уравнение окисления органического вещества кислородом: СНuОvNw + O2 → СО2 + Н2O + NН3. Здесь СНuОvNw может быть индивидуальным органическим соединением либо их смесью, в том числе биомассой клеток. После сбалансирования это уравнение имеет вид CHuOvNw + γ¼O2 = CO2 + ½(u – 3w)H2O + wNH3, γ = 4 + u − 2ν − 3w, (7.26) где γ – выражение, идентичное γs, γВ, γр. Если окисление происходит чисто химическим путем, то весь запас энергии органического вещества превращается в тепло. При биохимическом окислении с участием электронтранспортных путей часть энергии сохраняется в промежуточных носителях, а затем используется клеткой. Таким образом, процесс (7.26) является способом оценки общего количества биологически доступной энергии, заключенной в органических веществах. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 361 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур Поскольку, согласно (7.26), количество потребленного кислорода пропорционально γ, а выделившаяcя энергия пропорциональна кислороду (с приблизительно постоянным коэффициентом), то γ оценивает запас энергии вещества СНuОvNw в расчете на один грамм-атом его углерода. Наиболее полное использование энергии субстрата имеет место при участии электронтранспортной цепи с кислородом как терминальным акцептором. Каждая молекула О2 имеет 4 вакантных места для присоединения электронов других атомов и образования СО2 и H2О. Тогда 1/4О2 есть количество cвободного кислорода, пересчитанное на одно такое вакантное место, т.е. на один электрон, присоединяемый свободным кислородом. Схема (7.26) не рассматривает детали процесса преобразования энергии в электронтранспортных цепях, она предназначена лишь для оценки энергетического запаса субстрата окисления и отражает формальный подход. В связи с этим введена [2] система отсчета термодинамических потенциалов. Нулевые значения энтальпии и свободной энергии образования прописаны в ней следующим базисным веществам: Н+, НСO-3, Н2O, NH+4, Н2РО4-, Н2S, Fe3+ и другие ионы металлов и галогенов. Все эти вещества взяты в водном стандартном состоянии. Таким образом, вышеназванные вещества являются естественным энергетическим нулем клеточного метаболизма, который достигается при биологическом окислении органических веществ. Для того, чтобы физиологический базис был полным, в него введен свободный кислород. Тогда реакция образования любого соединения выглядит как сложение вышеупомянутых базисных веществ со стехиометрическими коэффициентами, а затем вычитание из полученного результата соответствующего количества О2. Например, глюкоза: С6Н12О6 = 6НСО3– + 6H+ – 6О2. С позиции векторного формализма знак «–» перед членом линейной комбинации означает присутствие отрицательного слагаемого. С физико-химической точки зрения вычитание кислорода означает восстановление базисных веществ, т.е. придание нового свойства. Поэтому для придания этому подходу логической завершенности заменено [2] вычитание кислорода вложением специфического базисного вещества – 1/4О2, названного «редоксон». Указанный коэффициент служит для пересчета количества кислорода на один электрон, акцептируемый О2 в процессе, обратном реакции образования химического соединения в физиологическом базисе (при окислении его свободным кислородом до веществ физиологического базиса – НСO–3, Н2O, NH+4, Н2РО4– и т.д.). Тогда реакция образования, например, глюкозы в физиологическом базисе имеет вид: С6Н12О6 = 6НСО3– + 6H+ – 24RO, где понятие физиологический базис – это альтернативная система отсчета для элементного состава химических соединений. Задание числа редоксонов определяет с абсолютной точностью количество вещества в виде M = Mmol NRO/αRO; (7.27) RO M = (12/σγ) N , (7.28) RO где М – масса данного количества вещества; N – число редоксонов; αRO и γ – восстановленность вещества (число RО на молекулу и на один атом угле Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 362 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур рода соответственно); Mmol – молекулярная масса; σ – доля углерода в массе вещества. Расчет величин αRO и RО и их значения представлены в работе [2]. Зависимость (7.27) применима к любым индивидуальным соединениям, в том числе и не содержащим углерод. Формула (7.28) применима исключительно к углеродсодержащим веществам, однако не только к индивидуальным соединениям, но и к любым их смесям, в том числе к биомассе клеток. Если ввести средний уровень энергии в виде НRO, то количество энергии, прошедшее с потоком вещества через данную реакцию, определяется равенством: H ≈ NRO HRO . В связи с этим рассмотрение потоков вещества и энергии может быть сделано совместно, если измерять количество вещества в числах RО. Таким образом, баланс редоксонов является материально-энергетическим балансом клеточного метаболизма: ∆NS + ∆NО2 = ∆NB + ∆NP. Из закона сохранения – количество редоксонов, входящих в метаболизм, равно числу RО, выходящих из него, вытекает: ∆NS = ∆NB + ∆NP + ∆NRES, (7.29) где индексы S, О2, В и Р относятся, соответственно, к органическому субстрату, кислороду, биомассе и продукту метаболизма. Под продуктами метаболизма подразумеваются вещества, образуемые клетками и обладающие восстановленностью в физиологическом базисе. Это в большинстве случаев органические вещества, но это может быть также и водород. Уравнение (7.29) является универсальным для всех микроорганизмов, использующих химические соединения в качестве субстрата – источника восстановленности для роста. Оно описывает не только аэробный метаболизм при росте на органическом субстрате. В случае анаэробного брожения ∆NRES = 0. В случае анаэробного дыхания ∆NRES есть число электронов, которые акцептируются веществом, иным, чем кислород (например, нитрат). В случае хемолитотрофного метаболизма ∆NS есть число редоксонов неорганического субстрата. Уравнение (7.29) описывает перераспределение вещества и энергии в процессе метаболизма. Оно рассматривает метаболизм с точки зрения его входов и выходов. Соотношение между членами правой части (7.29) зависит от особенностей метаболизма, которые определяются видом организма, видом субстрата и совокупностью условий роста. Учет этих факторов позволил Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 363 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.4. Элементный баланс роста микробных культур получить [2] дополнительные связи между большими метаболическими потоками, идущими в биомассу, на кислород и в восстановленные продукты. 7.5. Ферментационное оборудование Для расчета параметров ферментационного оборудования необходимо знание ряда показателей, включая растворимость и степень восстановленности субстрата, теплопродукцию при его окислении, потребность культуры в кислороде и многое другое. 7.5.1. Экспериментальные данные тепломассообмена при культивировании микроорганизмов Одним из значимых параметров процесса ферментации является тепловыделение, которое образуется в результате биологического окисления субстрата (термогенеза) и функционирования перемешивающих устройств биореактора. Согласно [2], тепловыделение в расчете на один RO потребленного кислорода составляет 103,7 кДж/экв. RO. Удельное количество теплоты, выделяющееся при жизнедеятельности микроорганизмов изменяется от 1,1 до 8,3 кВт/м3 при культивировании продуцентов ферментов, а при культивировании продуцентов антибиотиков достигает 15 кВт/м3. Тепловой эффект при выращивании кормовых дрожжей составляет (10–13)·103 кДж/кг. При периодическом культивировании в ходе стадийного развития культуры наблюдается существенное изменение величины тепловыделения микроорганизмами. Так, при концентрации бактерий Ralstonia eutropha количество выделяемого тепла составило 2 000–24 000 кДж/(кг⋅ч) [4]. Потребление микробной культуры газового субстрата. Потребности культуры микроорганизмов в кислороде при росте на углеродосодержащем субстрате представляют в виде эмпирической зависимости GО2 = А/Y – B, где GО2 – количество потребляемого кислорода, кг O2/кг АСД; А – количество кислорода, необходимое на окисление 1 кг субстрата до CO2 и H2O (и NH3, если в субстрате содержится азот); B – количество кислорода, идущее на окисление 1 кг сухой биомассы до СО2, H2O и NH3; Y – экономический коэффициент. При использовании в качестве субстрата глюкозы (A = 1,067 кг O2/кг глюкозы, B = 1,334 кг O2/кг АСД, Y = 0,5). Максимальное значение экономического коэффициента для дрожжей по кислороду, когда в качестве источника углерода используется глюкоза, составляет 3,39 г сухой биомассы на 1 г кислорода, т.е. минимальная вели Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 364 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование чина GО2 = 0,3 кгO2/кг биомассы. В промышленной практике выращивания дрожжей рода Candida на гидролизатах древесины потребность в кислороде лежит в пределах от 0,6 до 0,8 кг О2/кг АСД при значениях экономического коэффициента 0,45–0,55. Расходный коэффициент по кислороду зависит, как указывалось выше, от ряда других факторов, в том числе от физиологической активности популяции микроорганизмов. Например, экономический коэффициент культуры у бактерий Ralstonia eutropha, растущих на водороде в качестве энергетического субстрата и на полной питательной среде, составляет: по Н2 – 1,5 кг АСБ/кг; O2 – 0,34; CO2 – 0,48. При лимитировании роста бактерий каким-либо элементом субстрата этот показатель существенно снижается, соответственно, до 0,9; 0,2; 0,4. Удельная скорость дыхания дрожжевых организмов при их выращивании на растительных гидролизатах составляет q = 0,11–0,33 кг О2/(кг⋅ч), а удельная скорость потребления компонентов газовой смеси, лимитированной, например по азоту, культуры Ralstonia eutropha составляет на начальных этапах развития для водорода 0,036–0,04 кг/(кг·ч), кислорода – 0,17–0,18, диоксида углерода – 0,11–0,14; по мере старения культуры и перехода в стационарную фазу роста скорость потребления компонентов газа газового субстрата существенно снижается. Скорость потребления газового субстрата культурой может быть постоянна только в условиях непрерывного выращивания, когда процесс является установившимся, и микроорганизмы находятся в определенной фазе роста. Зависимости потребления кислорода от экономического коэффициента и скорости дыхания дрожжей от концентрации О2 представлены на рис. 7.6. При низких концентрациях кислорода в среде и его недостатке для культуры нарушаются энергетические процессы в клетке, происходит переключение путей обмена веществ, и это явление сопровождается увеличением количества кислорода, необходимого для построения единицы биомассы. Последнее происходит в том случае, если концентрация кислорода оказывается ниже определенного порогового значения. Критическая концентрация растворенного кислорода при росте дрожжей находится в диапазоне (2–4)·10-4 кг/м3. При окислении глюкозы дрожжами Candida troрicalis и Candida liрolytica при аэрации среды атмосферным воздухом заметное уменьшение интенсивности дыхания клеток начинается при снижении концентрации растворенного кислорода до 4–6 % от концентрации насыщения. Граница физиологического действия парциального давления кислорода для бактериальной культуры Ralstonia eutropha также лежит в узком диапазоне 2–5 мг/л. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 365 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование GO2 q 1,5 1,0 0,5 0 0,3 0,4 0,5 0,6 Y cкр c а б Рис. 7.6. Потребность в кислороде от экономического коэффициента при выращивании дрожжей на глюкозе (а) и влияние концентрации растворенного кислорода на скорость дыхания микроорганизмов (б) (материал Н.А. Войнова) Растворимость газов. Влияние компонентов питательной среды на растворимость газов различно. При концентрации сахара в растворе 2,5 % растворимость кислорода понижается на 5 %. В сложной питательной среде добавление небольшого количества подсолнечного масла, используемого в качестве пеногасителя, приводит к значительному увеличению растворимости кислорода, что обуславливается возникновением зон повышенной концентрации кислорода вокруг частиц масла. Внесение в водную среду спиртов, кетонов, эфира может существенно повышать скорость растворения кислорода. Кроме того, растворимость газа уменьшается с увеличением вязкости среды. Основными факторами, влияющими на растворимость газа, являются его парциальное давление в газовой фазе и температура в соответствии с законом Генри: xм= P/E, где xм – мольная доля газового компонента в жидкости; P – парциальное давление, мм рт. ст.; E – константа Генри, мм рт. ст. Транспорт кислорода к поверхности клетки разделяют на несколько стадий: массопередача из газовой фазы в жидкую, перемещение растворенного кислорода в жидкой фазе (конвективная и молекулярная диффузия), массопередача кислорода из жидкой фазы к поверхности клетки. Каждая стадия характеризуется сопротивлением массопередаче. В процессе выращивания, когда клеточные агломераты не образуются, микроорганизмы, как правило, находятся в жидкости в виде отдельных взвешенных особей. В этом случае ввиду низкой растворимости кислорода в жидкости наибольшее практическое значение имеет межфазный переход «газ – жидкость». При этом общий коэффициент массопередачи обычно определяется массоотдачей газа в жидкой фазе. Изменение концентрации растворенного газа в среде определяется уравнением баланса скоростей потребления газа клетками и поступления его из газовой фазы: Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 366 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование dc/dτ = βa(c* – c) – qx, где a – удельная межфазная поверхность, м2/м3; q – удельная скорость потребления газа биомассой, кг О2/(кг⋅ч); x – концентрация биомассы, кг/м3; β – коэффициент массоотдачи, м/ч. В стационарном состоянии dc/dτ = 0, и тогда βa(c*– c) = qx. При равенстве количества газа, поступающего из газовой фазы в жидкость и потребляемого микроорганизмами, c = c*– qx/(βa), что позволяет оценить изменение концентрации растворенного кислорода по численности популяции при постоянных условиях аэрации. Потребление газового компонента клетками увеличивает движущую силу процесса (c*– c), а следовательно, и скорость переноса кислорода в жидкость. Способы определения коэффициента массоотдачи. Используют четыре наиболее приемлемых метода определения скорости поглощения газового субстрата (например, кислорода): динамический; сульфитный; прямое измерение и теоретический расчет, учитывающий рост биомассы. Динамический метод осуществляется в периодической ферментации путем измерения скорости снижения концентрации газа в жидкости после прекращения аэрации и построения линейной зависимости величины концентрации от времени. Угол наклона построенной зависимости и определяет обратную величину объемного коэффициента массоотдачи – 1/βV. Сульфитный метод заключается в том, что в присутствии 10-3 молей Со2+ или Сu2+ сульфит натрия окисляет растворенный кислород. Сульфит определяется путем добавки раствора йода. Однако метод не дает представления о динамике обеспечения жидкости кислородом, а характеризует только условия аэрации. Прямое определение скорости переноса газа дает наиболее точные результаты, но требует точных аналитических приборов. Расчет объемных значений коэффициента массоотдачи при физической абсорбции обычно определяется по опытным данным, полученным при насыщении дистиллированной воды кислородом из воздуха по уравнению βV = ln [(1 – c/c*)/A]/τ, (7.30) где с – концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3; с* – равновесная концентрация кислорода в жидкости, кг/м3; А – коэффициент, опреде- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 367 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование ляемый из начальных условий; τ – время насыщения, с; βV – объемный коэффициент массоотдачи, с-1. Величина коэффициента A определяется согласно (7.30) из начальных условий (с = сн). A = 1 − cн/c*/(e-βτ), где сн – начальная концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3. При приготовлении рабочей смеси жидкость обескислороживается путем пропускания через нее азота либо за счет создания в аппарате вакуума с последующей дегазацией. 7.5.2. Характеристика газожидкостных биореакторов Несмотря на многообразие конструкций биореакторов, все они должны удовлетворять основным требованиям для поддержания эффективного процесса культивирования клеток, обеспечивая: подвод к каждой клетке в достаточном количестве всех питательных веществ; отвод от каждой клетки продуктов метаболизма; термостатирование микробной суспензии в каждой точке; поддержание оптимальных рабочих параметров; требуемый уровень аэрирования, перемешивания; высокий уровень автоматизации процесса культивирования, техники безопасности и условий труда операторов. Для выполнения этих требований каждый ферментер должен быть снабжен следующими системами: подачи жидкостных (или сыпучих) потоков в аппарат; ввода и вывода газовых потоков; аэрирования ферментационной среды; перемешивания ферментационной среды; пеногашения; термостатирования; стерилизации ферментера и ферментационной среды; вывода потоков из аппарата; контроля и регулирования заданных параметров процесса. Барботажные биореакторы. Наибольшее использование в предшествующие годы получили барботажные биореакторы с принудительным диспергированием газа (рис. 7.7). Они представляют собой вертикальную емкость, в основном цилиндрической формы, снабженную теплообменником, барботером и технологическими штуцерами. Характерным признаком работы барботажного реактора является неорганизованная и слабая циркуляция жидкости. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 368 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование 1 1 7 1 1 2 9 2 2 8 7 5 10 2 4 4 8 6 7 3 а 3 б 3 в г Рис. 7.7. Барботажные биореакторы [5]: 1 – корпус; 2 – рубашка; 3 – барботер; 4 – теплообменник; 5 – механическое перемешивающее устройство; 6 – ребра; 7 – решетка; 8 – подвижная насадка (гранулы); 9 – сепаратор; 10 – циркуляционный контур (рис. Н.А. Войнова [5]) Пропускная способность аппарата по газу лимитируется его приведенной скоростью, которая обычно не превышает 0,1 м/с. При более высоких скоростях значительно возрастает газосодержание, что приводит к неоправданному увеличению общего объема реактора. Возникают пульсации давления и вибрации аппарата. Газосодержание барботажного слоя изменяется как по высоте, так и по сечению аппарата. При наличии в жидкости поверхностно – активных веществ над барботажным слоем независимо от режима движения образуется слой стабильной пены, который оказывает отрицательное воздействие на процесс ферментации. В аппаратах рассматриваемого типа количество кислорода, доставляемого в жидкую фазу, определяется величиной межфазной поверхности, развиваемой в результате массового прохождения пузырьков газа сквозь слой жидкости. Однако скорость переноса кислорода в жидкой фазе так же, как и скорость отвода продуктов метаболизма, оказывается весьма низкой и не превышает 0,7 кг О2 /(м3⋅ч), а расход воздуха в связи с этим достигает 50 м3/(м3⋅ч). Применение реакторов с принудительным диспергированием газа большой высоты (10−25) м для увеличения степени насыщения культуральной жидкости газом (рис. 7.7, в), а также аппаратов с подвижной насадкой (рис. 7.7, б) требует больших энергозатрат на компремирование газа. Увеличить скорость переноса газового субстрата в аппаратах барботажного типа можно путем применения перемешивающих устройств (рис. 7.7, г). Для этой цели используются различные типы мешалок, что не только увеличивает межфазную поверхность, но и обеспечивает дополнительную турбулизацию жидкой фазы. Эксплуатация аппаратов барботажного типа с мешалками показывает, что увеличение энергетических затрат не сопровождается адек Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 369 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование ватным повышением эффективности процесса. Лишь при подводимой удельной мощности, не превышающей 2–11 кВт/м3, рост эффективности массопереноса в жидкой фазе имеет приблизительно линейный характер. Дальнейшее увеличение мощности не приводит к уменьшению диаметра пузырьков газа и росту межфазной поверхности. Одним из важнейших требований, предъявляемых к условиям проведения ферментации, является поддержание температуры в реакционной зоне на оптимальном уровне. Однако непрерывный отвод тепла из зоны реакции аппаратов барботажного типа с мешалками затруднен. Это обуславливает необходимость оснащения реакторов этого типа выносными теплообменниками, что приводит к еще большему увеличению энергозатрат. Газлифтные биореакторы. Некоторое повышение тепло- и массообменных характеристик, по сравнению с барботажными аппаратами, достигается использованием газлифтных биореакторов (рис. 7.8), которые нашли наибольшее распространение в промышленной практике. Отличительной особенностью газлифтных аппаратов является наличие в аппарате циркуляционного контура в виде одного (рис. 7.8, а) или нескольких стаканов (рис. 7.8, б) или газлифтных труб (рис. 7.8, в, г), в полости которых поддерживается повышенное газосодержание (0,5 – 0,6), что позволяет обеспечить циркуляцию газожидкостной смеси со скоростью 0,1–0,6 м/с. Для таких аппаратов характерны интенсивное пенообразование и высокий удельный расход воздуха. В газлифтных биореакторах объемный коэффициент массоотдачи составляет 200–400 ч-1, коэффициент теплоотдачи дрожжевой суспензии – (2–3)·103 Вт/(м2⋅К). В промышленной практике выращивания кормовых дрожжей объем применяемых газлифтных аппаратов составляет 320–1 300 м3, при диаметре 5,7–11,0 м и высоте 13,4–14,5 м. Во время работы воздух проходит в аппарат по центральной трубе в кювету, где из подаваемого сусла и жидкости, содержащейся в нижней части аппарата, образуется газожидкостная смесь, которая движется по внутреннему циркуляционному контуру. Часть воздуха отделяется от пены и выходит из аппарата через отверстие в крышке, а другая часть вместе с пеной опускается по кольцевому зазору между диффузором и стенкой. Основной причиной низкой эффективности аппаратов системы Лефрансуа – Марийе (рис. 7.8, а), является слабое диспергирование воздуха в жидкость. При достижении расхода воздуха 45–50 м3/(м2⋅ч) перерабатывается питательная среда с редуцирующими веществами менее 1,5 %, при объеме аппарата 600 м3 производительность, не превышает 6–7 т сухих дрожжей в сутки, скорость переноса составляет 1,1–1,2 кг О2/(м3⋅ч). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 370 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование 3 4 1 1 1 4 1 4 4 2 2 2 3 3 2 3 а б в г Рис. 7.8. Газлифтные биореакторы системы Лефрансуа – Марийе [5]: 1 – корпус; 2 – циркуляционный стакан с рубашкой; 3 – система воздухораспределения; 4 – патрубок для подачи ферментативной среды (рис. Н.А. Войнова [5]) Несколько выше показатели газлифтных ферментаторов с многозонной системой воздухораспределения (рис. 7.8, в, г) в которых рабочий объем аппарата условно разделен на 4–8 зон, в каждой из которой находится циркуляционный контур. Однако и в этих аппаратах, вследствие низких коэффициентов массоотдачи и неравномерного распределения воздуха скорость переноса кислорода в жидкость не превышает 1,3 кг О2/(м3⋅ч), что не позволяет получить высокую производительность, снизить затраты на очистку воздуха и отработанной жидкости. Применение системы воздухораспределения (рис. 7.8, г) приводит к увеличению производительности на 15–20 % при удельном расходе воздуха 45–60 м3/(м2⋅ч). Увеличение поверхности контакта фаз за счет уменьшения диаметра газовых пузырей и увеличения степени перемешивания предполагается получать в аппаратах с газлифтными трубами (рис. 7.9, а). Установка в объеме аппарата труб диаметром до 0,1 м и высотой 6 м обеспечивает дробление газовых пузырей и приводит к увеличению скорости переноса кислорода в культуральную жидкость до 4,0–4,5 кг О2 /(м3⋅ч) и объемный коэффициент массопереноса до 0,15 с-1, что позволяет при больших расходах воздуха перерабатывать ферментативные среды с редуцирующими веществами до 3 %. К достоинствам такого биореактора следует отнести развитую поверхность теплообмена и большую межфазную поверхность. Коэффициент массопереноса вещества из газа в жидкость сохраняет максимальное значение при увеличении диаметра барботажной трубы. Попытка увеличения скорости транспорта кислорода за счет установки перемешивающего устройства в циркуляционном контуре приводит к резкому увеличению энергетических затрат (рис. 7.9, б). Устойчивая работа мешалки определяется газосодержанием системы, предельная величина которого составляет ϕ = 0,4. Поэтому биореакторы с мешалкой в циркуляционном контуре применяются только для ферментативных сред, не образующих устойчивой пены с высоким газосодержанием. Расход энергии на единицу полученной биомассы в Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 371 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование биореакторах с механическим перемешиванием составляет 2–3 кВт⋅ч/кг АСД, что значительно больше, чем в аппаратах других типов. Увеличение энергозатрат объясняется тем, что хотя интенсивное перемешивание жидкости мешалками и способствует некоторому увеличению межфазной поверхности за счет дробления газовых пузырьков, течение жидкости между пузырьками газа остается преимущественно ламинарным и затраченная энергия не ведет к соответствующему повышению скорости транспорта кислорода в жидкой фазе. 1 6 1 1 1 2 2 2 2 4 4 3 4 4 7 5 5 5 3 3 3 а б в г Рис. 7.9. Газлифтные биореакторы с пневматическим и механическим перемешиванием [5]: 1 – корпус; 2 – циркуляционный стакан; 3 – барботер; 4 – рубашка; 5 – механическое перемешивающее устройство; 6 – механический пеногаситель; 7 – ребро (рис. Н.А. Войнова [5]) Струйные биореакторы. В струйных биореакторах используется эффект инжекции воздуха струей культуральной жидкости, вытекающей из насадки (сопла) со скоростью 6–8 м/с (рис. 7.10). Проникая вместе со струей жидкости на глубину до одного метра, газ дробится на мелкие пузыри, образуя газожидкостную систему с развитой межфазной поверхностью. Разработано около десятка конструкций струйных биореакторов со сплошной или кольцевой струей жидкости (сплошная струя образуется при истечении жидкости из цилиндрического патрубка, кольцевая – из кольцевого зазора, образованного патрубком и цилиндрической вставкой). При внедрении струи в жидкость происходит захват газа ее поверхностью и образование аэрируемой (барботажной) зоны. Поверхностный коэффициент массоотдачи в струйных насадках составляет (0,5–0,7)·10-4 м/с, высота зоны аэрации 0,2–0,4 м, диаметр газовых пузырьков в жидкости 1,8–5,0 мм. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 372 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование 6 1 5 2 1 1 2 2 4 4 4 4 6 5 6 2 6 3 1 3 3 а б в г Рис. 7.10. Струйные биореакторы [5]: 1 – корпус; 2 – струйная насадка (эжектор); 3 – насос; 4 – циркуляционный стакан (труба); 5 – теплообменник; 6 – воздуховод (рис. Н.А. Войнова [5]) Величина объемного коэффициента массоотдачи в биореакторе со струйной насадкой не превышает 210 ч-1. Эксплуатация струйных биореакторов требует меньших (по сравнению с барботажными) удельных энергозатрат, однако небольшая скорость переноса кислорода в жидкой фазе не позволяет перерабатывать в них концентрированные среды (допустимая концентрация редуцирующих веществ в субстрате, как правило, не превышает 8 кг/м3), что приводит к увеличению габаритов и повышению эксплуатационных расходов. В струйных аппаратах, как и в аппаратах барботажного типа, ярко выражен эффект флотации биомассы, значительно снижающий интенсивность микробиологического синтеза. Конструктивные особенности струйных биореакторов не дают возможности отводить тепло непосредственно из зоны реакции, что обуславливает необходимость использования выносного теплообменника для обеспечения оптимального температурного режима процесса. Одним из наиболее существенных недостатков струйных аппаратов является неравномерное распределение газа в объеме жидкости. Кроме того, для обеспечения оптимальной скорости течения струи необходима высота слоя жидкости, равная трем и более метров, что не позволяет обеспечить требуемое газосодержание. Задача поддержания газосодержания по всему объему культуральной жидкости решена в струйном биореакторе с шахтным аэратором фирмы «Фогельбуш» (рис. 7.10, б). Равномерное распределение газо-жидкостной смеси достигается специальным насосом большой производительности, перекачивающим жидкость с высокой кратностью циркуляции (60–90 ч-1) из емкости для культивирования в насадки, где осуществляется насыщение культуральной жидкости кислородом, путем вовлечения воздуха струей жидкости, перетекающей через верхний торец шахтного устройства. Большая высота устройства обеспечивает высокую скорость жидкости, что дополнительно интенсифицирует процесс. Попытка интенсифицировать процесс массообмена путем использования эжекторов (рис. 7.10, в) приводит к резкому увеличе Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 373 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование нию энергозатрат из-за поддержания высокого давления в линии подачи жидкости. К общим недостаткам струйных биореакторов относят также плохой отвод тепла, флотирование биомассы, невозможность масштабирования, наличие большого количества насадок в аппарате. Низкая концентрация микроорганизмов в объеме аппарата обуславливает большие расходы свежей воды и отработанной жидкости, очистка которой сводит на нет экономию энергии, полученную за счет энергии струй. Биореакторы с самовсасывающими мешалками. Подвод и циркуляция газа осуществляется механическими перемешивающими устройствами, что позволяет многократно использовать газовый субстрат в замкнутом контуре аппарата и интенсифицирует процесс абсорбции труднорастворимых газовых субстратов. Такие аппараты перспективны для проведения процессов ферментации, абсорбции, окисления, при культивировании микроорганизмов на взрывоопасной газовой смеси, а также в случаях, когда в жидкости, через которую барботируют газ, присутствуют мелкие твердые частицы во взвешенном состоянии, которые могут перекрыть входные отверстия барботеров. Одним из вариантов самовсасывающих устройств является мешалка с полым валом и трубчатыми лопастями. Она проста в изготовлении, не требует больших энергозатрат и может найти применение в случаях, когда количество газа, которое она засасывает, достаточно для проведения процесса. В промышленном биореакторе объемом 800 м3, разделенном на 12 секций (рис. 7.11, в), ферментационная среда последовательно проходит все секции и из последней выходит культуральная жидкость с минимальным содержанием редуцирующих веществ и максимальной концентрацией биомассы. В каждой секции установлено перемешивающее и аэрирующее устройство – щелевая мешалка, состоящая из двух частей: узла для перемешивания жидкой фазы лопастями и интенсивного прохождения циркулирующей жидкости и узла для подвода газовой фазы. При вращении щелевой мешалки жидкость на выходе, обладая большой энергией, создает разряжение. В разряженную зону подсасывается воздух по трубопроводу, соединенному с полой частью этого узла. В зоне разряжения происходит интенсивное смешивание воздуха с жидкостью и ее насыщение кислородом. Удельная мощность такого аппарата составляет 14,2 кВт/м3, приведенные энергозатраты на единицу абсолютно сухой биомассы – 4,0 кВт⋅ч/кг, расход воздуха на единицу рабочего объема – 113 м3/(м3⋅ч). Вследствие создания вакуума ограничивается глубина погружения щелевой турбины в жидкость. Малая величина вакуума не позволяет устанавливать на линии подсоса воздуха фильтрующие элементы, что может отражаться на стерильности процесса ферментации. Самовсасывающие мешалки как устройства для ввода газа в жидкость имеют невысокий энергетический коэффициент полезного действия. Однако хорошее дробление газа, обеспечивающее большую площадь поверхности контакта фаз, ставит эти мешалки по удельным Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 374 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование знергозатратам на один уровень с высокоэффективными диспергирующими устройствами. 4 2 8 10 7 3 2 1 6 5 5 1 2 5 3 а б 3 1 4 9 в Рис. 7.11. Биореакторы с самовсасывающей мешалкой [5]: (а) и (б): 1 – корпус; 2 – рубашка (теплообменник); 3 – полый вал с самовсасывающими мешалками; 4 – механический пеногаситель; 5 – циркуляционный стакан; (в): 1 – корпус; 2 – теплообменник; 3 – мешалка; 4 – опора; 5, 6 – штуцера; 7 – люк-лаз; 8, 9, 10 – коллекторы (рис. Н.А. Войнова) Эффективность всасывающих устройств существенно зависит от глубины их размещения. Поскольку эта глубина обычно невелика, для обеспечения равномерного перемешивания в аппаратах с высоким уровнем жидкости, а иногда и большим объемом, на том же валу устанавливают дополнительную мешалку, т.е. наблюдается тенденция к созданию двух- и трехъярусных аэрирующих устройств (рис. 7.11, а), позволяющих более эффективно использовать газовую фазу. Пленочные биореакторы. Большие перспективы имеют аппараты со стекающей турбулентной пленкой жидкости по внутренней поверхности трубы с винтовой шероховатостью (рис. 7.12). Скорость переноса кислорода в пленочных биореакторах достигает 10 кг/(м3⋅ч) и более, поверхностный коэффициент массоотдачи – (2–5)·10-2 м/с, что на порядок выше, чем в других биореакторах [5]. Коэффициент теплоотдачи в турбулентной пленке, при высоких нагрузках по жидкости, в 2–3 раза превышает значения, полученные в барботажных и газлифтных аппаратах. В пленочных аппаратах достигается равномерное распределение температуры в объеме культуральной жидкости по причине пропускания всей ее массы через теплопередающую поверхность, что исключает образование застойных зон. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 375 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование 4 1 4 4 1 3 1 3 2 2 2 5 3 5 5 7 6 6 6 а б в Рис. 7.12. Схемы пленочных трубчатых биореакторов [5]: 1 – корпус; 2 – контактная труба; 3 – газовый патрубок; 4 – камера для ввода газа; 5 – теплообменная секция; 6 – камера для культивирования; 7 – насос (материал и рисунки Н.А. Войнова [5]) При этом отвод тепла организуется непосредственно в зоне биохимической реакции, что не требует дополнительных конструктивных решений и не влияет на процесс интенсификации тепло- и массообмена. В пленочном биореакторе исключается накапливание продуктов метаболизма, в частности CO2, в культуральной жидкости благодаря их интенсивному отводу из пленки и отсутствию циркулирующих пузырьков углекислого газа в объеме культуральной жидкости. Проведение процесса ферментации в пленочных биореакторах возможно при низких расходах воздуха или чистого газа (О2, Н2), так как в этих аппаратах газ не участвует в создании поверхности контакта фаз и турбулизации жидкости. При этом снижаются потери газа в окружающую среду, вследствие его размещения в зоне контакта с пленкой. Из-за высокой скорости подвода кислорода, отвода тепла и продуктов метаболизма пленочные биореакторы способны перерабатывать концентрированные питательные среды (при концентрации редуцирующих веществ 10 % и более) и получать высокую производительность (x = 50–100 кг/м3). Это позволяет в несколько раз уменьшить габариты биореактора, снизить расход воды и газа, обеспечить их качественную очистку. Небольшие габариты пленочного биореактора при высокой его производительности обеспечивают процесс ферментации при избыточном давлении, что увеличивает степень насыщения жидкости кислородом и позволяет легко изменять концентрацию газа в культуральной жидкости в процессе ферментации. В пленочном биореакторе исключается эффект флотации биомассы и пенообразования, что позволяет увеличить рабочий объем биореактора и обеспечить равномерное распределение микроорганизмов и питательной среды в аппарате. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 376 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование Пленочные биореакторы по конструктивному оформлению можно разделить на одноступенчатые (рис. 7.12, а, в) и многоступенчатые (рис. 7.12, б). В многоступенчатом биореакторе на каждой ступени осуществляется насыщение жидкости газом и его исчерпывание микроорганизмами. Это позволяет уменьшить расход перекачиваемой жидкости через аппарат, разместить большее количество культуральной жидкости в рабочей зоне биореактора. Рис. 7.13. Фотография и схема газовихревого биореактора: 1 – корпус; 2 – полый вал; 3 – турбинка; 4 – циркуляционная перегородка; 5, 6 – вывод и ввод газового субстрата; 7, 8 – штуцера (рис. Н.А. Войнова) Газовихревые биореакторы. В биореакторе «Биок» (рис. 7.13) перемешивание суспензии бактериальных клеток осуществляется путем создания в рабочем объеме вращательного движения, генерируемого аэрирующим газовым субстратом, который подается в емкость над поверхностью суспензии клеток с одновременным его закручиванием в поток турбинкой. При этом перепад давления в потоке аэрирующего газа между периферией и центром вихря поддерживается в пределах 10–2 000 Па. Благодаря такому закручиванию аэрирующего газа, за счет трения на границе раздела фаз и разницы давления между периферией и центром газового вихря, обеспечивается движение суспензии клеток в виде вихревого кольца, вращающегося относительно оси емкости с одновременным нисходящим движением жидкости на периферии емкости и восходящим в приосевой зоне. Аэрирующий газ взаимодействует с суспензией клеток только через свободную поверхность последней, не смешиваясь с ней. Энергия, необходимая для перемешивания суспензии клеток, подводится по всей поверхности жидкости, что позволяет реализовать режимы суспензионного культивирования культур, наиболее чувствительных к механическому воздействию. Газовихревой биореактор осуществляет мягкое перемешивание без образования пены, кавитации, высоко турбулентных и застойных зон. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 377 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование Мембранные ферментеры. Эти реакторы перспективны с позиции расширения возможностей исследования и управления процессом ферментации, в котором развитие популяции происходит в постоянно обновляемой среде. а б в Рис. 7.14. Схемы мембранных биореакторов: 1, 2 – корпус; 3 мембрана; 4 – мешалка (насос); 5, 6, 7 – штуцера; 8, 9 – штуцера для газового субстрата; 10 – рубашка (рис. Н.А. Войнова) Это достигается за счет использования полупроницаемой мембраны. В зависимости от типа мембраны различают три режима работы мембранных реакторов: режим диализа, режим ультрафильтрации и режим микрофильтрации. Две основные схемы организации работы мембранных реакторов (встроенной и вынесенной мембраной) приведены на рис. 7.14, а, б. Реактор со встроенной мембраной (рис. 7.14, а) выполняется обычно трубчатым, в нем поддерживается режим идеального вытеснения. Аппарат на рис. 7.14, б содержит вынесенный мембранный контур, а в установке поддерживается режим идеального смешения. Субстрат с постоянным расходом, пропорциональным выходу продукта, подают в систему. Фермент, фактически иммобилизованный в контуре, задерживается мембраной, которая свободно пропускает продукты реакции. В случае снижения активности катализатора в систему добавляют его новую порцию для поддержания скорости реакции на необходимом уровне. Степень задержания мембраной фермента должна быть максимально высокой. Схема мембранного реактора для культивирования микроорганизмов «Елен-5» представлена на рис. 7.14, в. Преимущества мембранных реакторов состоит в достижении высокой концентрации клеток, в использовании как растворимых, так и не растворимых субстратов. Поток продуктов, выходящих из аппарата, свободен от клеток и других специфических материалов, что снижает стоимость их очистки. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 378 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование 7.5.3 Приемы и способы стерилизации в биотехнологии Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) – полное освобождение различных веществ, предметов от живых микроорганизмов. Среди физических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. Простейшим способом стерилизации является обжигание металлических и стеклянных предметов в пламени горелки. Стерилизация сухим жаром производится в сушильных шкафах при 160–165 °С в течение двух часов. Таким методом стерилизуют лабораторную посуду, металлические предметы, некоторые порошкообразные, не портящиеся при нагревании вещества. Стерилизация водяным паром под давлением производят в автоклавах. Насыщенный пар под давлением убивает микроорганизмы и споры быстрее, чем перегретый пар. Сухой воздух (жар) убивает микроорганизмы при более высокой температуре, чем водяной пар. Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов. Основным недостатком термической стерилизации, несмотря на ее широкое практическое использование, следует считать неизбежные потери питательных свойств среды, поскольку при температурах, необходимых для стерилизации (120–150 °С), большинство субстратов, особенно углеводы, оказываются термически нестабильными. Осмотическое давление отрицательно влияет на биохимическую активность микроорганизмов. Повышение концентрации солей задерживает развитие многих бактерий, однако есть виды, способные развиваться в присутствии концентрированных растворов солей, такие бактерии называют осмофильными (галофильными). Осмотическое давление в клетке регулирует цитоплазматическая мембрана. При высоком осмотическом давлении окружающей среды происходит плазмолиз. Плазмолиз явление обратимое, и если понизить осмотическое давление окружающего микроорганизмы раствора, вода поступает внутрь клетки и возникает явление, противоположное плазмолизу. Ультрафиолетовая компонента солнечного света является главной причиной гибели микробов в наружном воздухе. Смертность микроорганизмов на открытом воздухе достигает 90–99 %, но зависит от вида микроорганизма и может варьировать от нескольких секунд до пары минут. Споры и некоторые виды бактерий окружающей среды имеют стойкость к воздействию солнечного света и могут переносить длительное облучение светом без особого вреда своему организму. Энергия ультрафиолетовой компоненты солнечного света вызывает повреждения микроорганизмов на клеточном и генетическом уровнях, тот же самый ущерб наносится людям, но он ограничен кожей и глазами. Искусственные источники ультрафиолетового излучения (УФИ) используют гораздо более сконцентрированные уровни излучения, нежели те, что представлены в обычном солнечном свете. Ультрафиоле Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 379 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование товые лучи распространяются по прямой и действуют преимущественно на нуклеиновые кислоты, оказывая на микроорганизмы как летальное, так и мутагенное воздействие. Бактерицидными свойствами обладают только те лучи, которые адсорбируются протоплазмой микроклетки. Биофизическое действие УФИ на генетический или функциональный аппарат бактерий выглядит следующим образом: излучение вызывает деструктивно-модифицирующее повреждение ДНК, нарушает клеточное дыхание и синтез ДНК, что приводит к прекращению размножения и лизису микробных клеток. В нарушении синтеза ДНК основным является окисление сульфгидрильных групп, что вызывает инактивацию нуклеотидазы и гибель микробной клетки в первом или последующих поколениях. Сила проникновения ультрафиолетовых лучей невелика. Тонкий слой стекла достаточен для того, чтобы не пропустить их. Действие лучей ограничивается поверхностью облучаемого предмета, его чистота имеет большое значение. УФИ высокоактивно, если микроорганизмы и частицы пыли расположены в один слой, при многослойном расположении верхние защищают нижележащие. Защитная оболочка вокруг бактериальной клетки препятствует достижению антимикробного действия. В любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру поврежденной молекулы ДНК. Благодаря радиационному мутагенезу, уцелевшие микроорганизмы способны образовывать новые колонии с меньшей восприимчивостью к облучению. Вероятностный характер стерилизации УФИ изучен в достаточной степени, существуют различные уравнения, характеризующие процесс отмирания бактерий. Эффективность биоцидного действия УФИ зависит от длины волны, интенсивности облучения, времени воздействия, видовой принадлежности обрабатываемых микроорганизмов, расстояния от источника, а также от состояния воздушной среды помещения: температуры; влажности; уровня запыленности; скорости потоков воздуха. Метод заслуженно считается эффективным для обеззараживания поверхностей, при этом доказаны микробиологическое и экономическое преимущество УФИ или его эквивалентная эффективность химическим методам. При использовании ультрафиолетовых облучателей лимитирующим фактором является предельно допустимая доза облучения людей, а не доза, требуемая для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещения. Влияние ультразвуковых волн. Ультразвуком (УЗ) называются механические колебания с частотой, превышающей 18 кГц (18 000 колебаний в секунду). УЗ получают с помощью высокочастотного генератора, который превращает частоту электросети в электрический ток высокой частоты. Колебания электрического тока высокой частоты посредством пьезоэлектрического преобразователя превращаются в механические колебания, которые передаются в резервуар с жидкостью. При частоте колебания 1,0–1,3 мГц в течение 10 мин оказывает бактерицидный эффект на клетки микроорганизмов. Ультразвук способствует разрыву клеточных стенок и мембран, повреждению флагеллина у подвижных форм микроорганизмов. Влияние ультра Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 380 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование звука основано на механическом разрушении микроорганизмов в результате возникновения высокого давления внутри клетки. Это позволяет использовать его в качестве стерилизующего агента, а также применять для инактивации и дезинтеграции вирусов с целью получения антигенов и вирусных вакцин. Стерилизация инфракрасными лучами. Инфракрасные, или тепловые, лучи составляют часть спектра световой радиации, простирающуюся от красного конца видимого спектра в область длинных волн. Источником инфракрасных лучей являются любые нагретые тела. Практически для этой цели могут быть использованы специальные зеркальные тепловые лампы накаливания, выпускаемые отечественной промышленностью. Особенность передачи лучистой энергии заключается в том, что промежуточный слой воздуха между термоизлучателем и облучаемым материалом не нагревается и потери тепла в окружающую среду невелики. Различные типы бактерий в разной степени стойки к ультрафиолетовым излучениям. Так, особостойкими являются споры, многие из которых не теряют своих вегетативных свойств. Высокая влажность воздуха повышает сопротивляемость бактерий, а в тонком слое воды на стерилизацию требуется примерно в десять раз больше энергии по сравнению с той, которая нужна для гибели тех же микроорганизмов в воздухе. С увеличением толщины слоя воды бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей приближаются к нулю. Стерилизация озоном. Механизм инактивации воздушной микрофлоры озоном очень похож на действие озона в воде. Сначала озон воздействует на оболочку микроорганизмов путем реакции с двойными связями липоидов. Затем, благодаря способности разрушать дегидрогеназы клетки, озон воздействует на ее дыхание. В результате нарушения проницаемости оболочки и изменения растворимости белков клетка лизируется. Обнаружено проникновение озона внутрь микробной клетки, вступление его в реакцию с веществами цитоплазмы и превращение замкнутого плазмида ДНК в открытую ДНК, что снижает пролиферацию бактерий. Противовирусное действие озона связывается с разрушением вирусных частиц, инактивацией обратной транскриптазы и влиянием на способность вируса связываться с клеточными рецепторами. Капсулированные вирусы более чувствительны к действию озона. Это объясняется тем, что капсула содержит много липидов, которые легко взаимодействуют с озоном. Наблюдается известное различие между разными видами микроорганизмов по их сопротивляемости действию озона. Довольно быстро погибают возбудители ангины, дифтерии, различные плесени. Как правило, наиболее устойчивы микробы, покрытые оболочкой, как например туберкулезная палочка и микробные споры. Эффективность стерилизующего действия озона зависит от его концентрации, экспозиции, температуры, влажности, вида микроорганизма, pH и исходной обсемененности обеззараживаемого воздуха. Озон в низких концентрациях (около 0,2 мг/м3) не очень эффективен для уничтожения бактерий, так как они восстанавливаются спустя некоторое время после обработки. В этих случаях озон оказывает лишь поверхностное Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 381 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование действие (контактируя с внешней оболочкой клетки) и незначительно проникает вглубь. Для полной инактивации микрофлоры помещения необходима высокая концентрация озона и длительное время для контакта с микроорганизмами. Оксиды азота усиливают бактерицидные свойства озона, которые в значительной степени зависят от влажности воздуха. При относительной влажности воздуха ниже 45 % озон почти не оказывает бактерицидного действия, а оптимум его активности лежит между 60–80 % влажности. В профессиональных целях для стерилизации воздуха помещения в присутствии людей генератор озона служить не может, поскольку концентрация озона в несколько раз превышает ПДК для человека. Высокая концентрация выделяющегося озона приводит к деструкции. Таким образом, озонирование высокоэффективно для стерилизации поверхностей и воздушной среды помещения. Невозможность использования метода в присутствии людей и необходимость проводить обеззараживание в герметичном помещении серьезно ограничивает сферу его профессионального применения. Воздействие химического агента. По химическому составу противомикробные антисептические вещества можно разделить на несколько групп. Например, галогены – препараты йода и хлора, они нарушают ферментативные структуры бактериальной клетки, угнетают гидролитическую и дегидрогеназную активность бактерий, инактивируют такие ферменты, как амилазы и протеазы. Перекись водорода, перманганат калия, как и галогены, обладают окислительным действием. Кислоты и их соли, щелочи, спирты и альдегиды повреждают поверхностные структуры бактериальной клетки, клеточную стенку и мембраны, нарушая их избирательную проницаемость и другие функции. Соединения тяжелых металлов обладают антиферментным механизмом действия на бактериальную клетку, при этом изменяется структура дыхательных ферментов, и разобщаются процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях. Красители обладают денатурирующим эффектом. К антисептическим химическим веществам относятся группы производных 8-оксихинолина и нитрофурана, которые также нарушают биосинтетические и ферментативные процессы в бактериальной клетке. К наиболее распространенным дезинфицирующим средствам относятся хлорсодержащие, фенольные, перекисные и аммониевые соединения. Стерилизация твёрдых предметов, портящихся при нагревании (некоторые пластмассы, электронная аппаратура и др.), может быть осуществлена обработкой газами (например, окисью этилена в смеси с СО2 или бромистым метилом), спиртом, растворами сулемы. Стерилизация растворов проводится также путем их пропускания через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Широкое применение нашли мембранные фильтры их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Бактерии задерживаются пористыми перегородками не потому, что диаметр капиллярных ходов фильтра меньше, чем поперечник бактерий, а вследствие молекулярного притяжения и прилипания взвешенных тел к внутренним стенкам пор. В принципе метод стерилизующей фильтрации является иде Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 382 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование альным средством стерилизации лабильных, в том числе термически неустойчивых жидких и газовых сред, поскольку он может быть проведен при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Промышленная очистка и стерилизация воздуха. Как известно [6], в воздухе содержится взвешенных частиц до 109, в том числе микроорганизмов 0,8·103–104 на 1 м3. Среди микроорганизмов обнаружены бактерии и их споры, актиномицеты и аспоргенные дрожжи, вирусы и др. Наименьшие размеры, за исключением вирусов, имеют бактерии, диаметр которых 0,5–2,1 мкм и длина до 26 мкм. Это требует при подготовке воздуха его стерилизации. Отечественный и зарубежный опыт показывает, что технологически и экономически оправданным является многоступенчатый способ продувания воздуха через волокнистые, зернистые или пористые материалы. Для больших расходов воздуха широко распространена технологическая схема, представленная на рис. 7.15. Воздух на аэрацию в посевные и производственные ферментеры подается с помощью комрессора. Перед сжатием воздух проходит через масляный или сухой фильтры, где осуществляется его очистка от механических примесей. Нагретый в процессе компреммирования сжатый давлением 0,3 МПа воздух охлаждается в теплообменнике. После ресивера воздух охлаждается в теплообменнике для конденсации влаги. Выходящий из ресивера воздух нагревается в кожухотрубном аппарате. Далее воздух проходит частичную очистку от микроорганизмов в фильтре грубой бактериальной очистки и полностью очищается от микроорганизмов в фильтре тонкой бактериальной очистки. Воздух, выходящий из ферментатора и инокулятора высушивается от влаги на фильтре, достигая расчетной допустимой концентрации микроорганизмов. Воздух Рис. 7.15. Промышленная схема очистки воздуха: 1 – фильтр; 2 – компрессор; 3 – теплообменник; 4 – влагоотделитель; 5 – ресивер; 6 – теплообменник; 7 – головной фильтр (схема Н.А. Войнова) Некоторые конструкции фильтров для биологической очистки воздуха представлены на рис. 7.16. Глубинный фильтр (рис. 7.16, а) представляет собой емкость, снабженную рубашкой с перфорированными решетками внут Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 383 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.5. Ферментационное оборудование ри. Между решетками укладывается волокнистый фильтрующий материал. В зависимости от напора сжатого воздуха плотность укладки стекловолокнистого фильтрующего материала составляет 100–500 кг/м3. Фильтр с тканью Петрянова (рис. 7.16, б) представляет собой стальной цилиндр с разъемной крышкой и коническим днищем. Внутри фильтра в трубной решетке на резьбе закреплены перфорированные цилиндры, обтянутые слоями ткани через которые проходит воздух и очищается. Фильтр стерилизуется паром с примесью формалина. Необходимая степень биологической очистки воздуха достигается при использовании в качестве фильтрующего материала пористых фильтрующих материалов. Фильтр такой конструкции представлен на рис. 7.16, в. Известны эффективные металлокерамические фильтрующие элементы для очистки микробных частиц диаметром 0,3 мкм. Особенностью фильтрования с помощью этих элементов является тесная взаимосвязь между формой каналов фильтра с периодически изменяющимся диаметром сечения и скоростью движения воздушного потока в этих каналах. При движении воздуха через материал фильтра в нем возникают ультразвуковые колебания, приводящие к осаждению микроорганизмов на стенки фильтра. На основе фильтрующих металлокерамических элементов разработаны парные автоматические фильтрующие комплексы для грубой и тонкой биологической очистки воздуха. а б в Рис. 7.16. Схемы фильтров – а: 1 – корпус; 2 – крышка; 3 – решетки со слоем фильтрующего материала; 4 – днище; 5 – вход воздуха; 6 – выход воздуха; 7 – вход острого пара; 8, 9 – выход; б: 1 – корпус; 2 – фланец; 3 – фильтрующий фторопластовый элемент; 4 – прокладка; 5, 6 – вход и выход воздуха; в: 1 – корпус: 2 – крышка; 3 – фильтр; 4, 5 – выход и вход воздуха (схемы Н.А. Войнова) Отличительной особенностью таких комплексов является гарантированная микробиологическая надежность очистки и полная автоматизация их работы. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 384 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Характерной особенностью биотехнологических сред является сравнительно низкое содержание целевых продуктов в них. Например, концентрация биомассы при производстве дрожжей составляет 5–10 %, а при производстве бактериальных препаратов не превышает 1–2 %, что требует различного оборудования для концентрирования. Концентрирование биомассы является процессом обезвоживания – удаления воды, содержащей в веществе в свободном несвязанном состоянии. В зависимости от степени влажности, плотности вещества, размера твердых частиц, требований технологического характера в микробиологической промышленности применяют различные методы обезвоживания. По энергетическому признаку выделяют два основных принципа обезвоживания: удаление из материала влаги без изменения агрегатного состояния в виде жидкости; удаление влаги с изменением агрегатного состояния, т.е. при фазовом превращении жидкости в пар. Первый принцип положен в основу механических способов обезвоживания (центрифугирование, сепарирование, и т.п.). Второй принцип обезвоживания (тепловая сушка) связан с затратами теплоты на фазовое превращение влаги. Выбор методов предварительного обезвоживания биомассы основан на комплексном анализе технологических свойств объекта. Так, для концентрирования суспензии микроорганизмов применяют сепарацию или осаждение; для отделения мицелия предпочтительно использовать коагуляцию с последующей фильтрацией жидкости; концентрирование растворов антибиотиков и аминокислот производят путем выпаривания с многократным использованием теплоты в многокорпусных выпарных установках. 7.6.1. Выпарные пленочные аппараты В микробиологической промышленности выпаривание применяют для концентрирования растворов, антибиотиков, ферментов, витаминов и т.п. Процесс выпаривания проводят под разряжением, при повышенном и атмосферном давлении. Выбор давления связан со свойствами выпариваемого раствора и возможностью использования тепла вторичного пара. Основное преимущество выпаривания под вакуумом заключается в том, что процесс можно проводить при более низких температурах по сравнению с другими вариантами. Это особенно важно при концентрировании термолабильных материалов микробиологической природы, склонных к термической инактивации. Выпаривание нельзя рассматривать как чисто физический процесс, так как оно сопровождается нежелательными химическими превращениями вещества. Чем ниже температура нагрева и короче время нагрева, тем меньше происходит нежелательных побочных явлений. Первое условие обычно Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 385 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы достигается применением вакуума и быстрым охлаждением при конденсации, второе значительно труднее, так как требует выпарных аппаратов, обеспечивающих быстрое испарение влаги из концентрируемого продукта. Этому требованию наиболее соответствует пленочные выпарные аппараты. Аппараты, в которых испарение растворителя происходит из тонкой пленки жидкости, движущейся под действием центробежной силы по быстро вращающейся поверхности теплообмена, получили название центробежных испарителей. Из всех известных пленочных выпарных аппаратов центробежные испарители являются наиболее скоростными. Так, например, время контакта раствора с поверхностью теплообмена, необходимое для уменьшения его первоначального объема в пять раз, у испарителей с падающей пленкой составляет 300–600 с, роторных пленочных аппаратов – 20–30 с, центробежных испарителей – 1–3 с. Испарители с вращающейся поверхностью теплообмена применяются в основном для концентрирования термолабильных и пенящихся растворов. В микробиологической промышленности они используются при упаривании ферментных растворов, чрезвычайно чувствительных к температурным воздействиям. Gн 3 3 W W Gк 1 2 Gн Gп 4 4 2 1 5 6 Gп G Gк он Gк Gк он а б Рис. 7.17. Центробежный испаритель с вращающейся поверхностью теплообмена: 1 – неподвижный кожух; 2 – ротор; 3 – патрубок подачи раствора; 4 – вращающаяся пластина (конус); 5 – отводная трубка. Здесь и далее Gн, Gк – начальный и конечный расход суспензии; Gп, W – первичный и вторичный расход пара (рис. Н.А. Войнова) Поверхность теплообмена таких аппаратов выполнена из тонкостенных элементов, к одной стороне которых подведен теплоноситель, а к другой – испаряемая жидкость. В промышленности чаще других используются центробежные испарители с поверхностью теплообмена, выполненной из усеченных тонкостенных конусов. Такой аппарат имеет (рис. 7.17) неподвиж Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 386 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы ный кожух 1 с крышкой, внутри которого размещен ротор 2. В корпусе ротора установлен пакет усеченных конусов или пластин 4, образующих камеры для упаренного раствора и для греющего пара. Греющий пар вводится в ротор 2 и обогревает наружную вращающую стенку, а конденсат отводится из ротора с помощью отводной трубки 5. Подача раствора в аппарат осуществляется через патрубок 3. С ростом угловой скорости ротора происходит интенсификация процесса испарения пленки жидкости. Это достигается в роторно-пленочных аппаратах, которые практически незаменимы при переработке вязких, термолабильных, кристаллизующихся сред. Конструкции роторно-пленочных испарителей представлены на рис. 7.18. Исходный раствор подается на внутреннюю поверхность корпуса аппарата и при помощи лопастей вращающегося ротора транспортируется в виде пленки по нагреваемой поверхности. При этом происходит его кипение и испарение влаги. 3 3 А- А Тип LN 2 W w Gн Gп Gн Gн Gп А- А Тип LK 2 Gкон l v А 4 А 1 1 А- А Тип LB 4 Gкон 4 Gк Gк Рис. 7.18. Вертикальные роторно-плёночные испарители: 1 – корпус; 2 – вращающийся ротор; 3 – привод; 4 – лопасти (рис. Н.А. Войнова) Несмотря на сложность конструкции и относительно небольшую площадь поверхности теплообмена роторные пленочные аппараты по сравнению с испарителями других типов имеют ряд преимуществ. К ним относятся малое время пребывания жидкости в аппарате; пониженное пенообразование при выпаривании сильно пенящихся веществ; большое отношение начального расхода раствора к выходу конечного продукта; возможность упаривания вязких жидкостей и получения готового продукта в виде сухого порошка. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 387 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Основное преимущество роторно-пленочных испарителей заключается в возможности достижения более высоких значений степени выпаривания, которая представляет собой отношение массы испарившегося растворителя к исходной массе упариваемого раствора. Известны пленочные трубчатые испарители работающие при сравнительно низкой полезной разности температуры (3–6) °С по сравнению с традиционными аппаратами циркуляционного типа (10–2) °С. Они обеспечивают высокие коэффициенты теплоотдачи до 20 000 Вт/(м2⋅К), большую производительность по вторичному пару 200 кг/(ч⋅м2) и более, низкую температурную депрессию 1 °С, малое время обработки продукта (3–10 с). Пленочные аппараты наиболее перспективны при работе под вакуумом, так как их низкое гидравлическое сопротивление позволяет обеспечить высокую величину вакуума по высоте аппарата. А отсутствие гидростатического напора позволяет вести процесс кипения при постоянной низкой температуре. Наибольшее распространение в промышленности получили установки с восходящей пленкой (рис. 7.19), в которых раствор транспортируется потоком вторичного пара в виде пленки по внутренней поверхности контактных труб. Они используются при выпаривании маловязких растворов, в том числе пенящихся и не чувствительных к высоким температурам. W W 2 2 1 3 GН GКОН 2 1 GК GП W 3 GК GП Gп 1 3 GКОН GКОН GН 4 GН Gн GК а б в Рис. 7.19. Схемы пленочных испарителей с восходящей пленкой [5]: 1 – греющая камера; 2 – сепаратор; 3, 4 – контактные трубы (рис. Н.А. Войнова) Достоинством аппаратов с поднимающейся пленкой является сравнительно небольшое время пребывания раствора в зоне высокой температуры. Основным их недостатком является наличие большой полезной разности температур (11–17) °С, чувствительность к изменению режима работы, зарастание верхней части труб накипью и отложениями, сравнительно невысокая зона кипения, которая различна в каждой трубе и зависит от местной скоро- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 388 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы сти нагревания. Для устранения накипи на поверхности труб предложена конструкция (рис. 7.19, б), в которой предусмотрены устройства для ввода дополнительного раствора во внутрь труб греющей камеры, где он распределяется потоком вторичного пара на поверхности, препятствуя тем самым оголению. Известны выпарные аппараты комбинированного типа (рис. 7.19, в), где реализуется восходящее и нисходящее пленочное течение раствора, что позволяет получить в одном аппарате более концентрированный раствор. Однако при этом усложняется конструкция аппарата и увеличиваются его габариты. Использование выпарных аппаратов с восходящей пленкой для условий работы под вакуумом затруднено из-за их высокого гидравлического сопротивления. В связи с этим наиболее предпочтительны выпарные аппараты со стекающей пленкой, которые можно разделить на прямоточные и противоточные. Gн W Gн 1 Gп Gп Gп 3 Gк он 1 Gн W Gк он Gк он 1 Gп 3 2 Gк он W 3 2 Gк Gк а б 2 Gк в Рис. 7.20. Пленочные испарители с нисходящей пленкой [5]: 1 – греющая камера; 2 – сепаратор; 3 – контактные трубы (рис. Н.А. Войнова) Наименьшим гидравлическим сопротивлением и наибольшей производительностью обладают аппараты с нисходящей пленкой и прямоточным движением пара, схемы конструкций, которых представлены на рис. 7.20. Работа испарителей со стекающей пленкой не зависит от местных скоростей кипения, и расходы в каждой трубке практически одинаковы, вне зависимости от скорости кипения. Указанные испарители могут работать в широком диапазоне производительности при малой разности температур. Это идентично во многих отношениях работе испарителя с принудительной циркуляцией. Именно эта характеристика позволяет проектировать испарительные системы с большим числом ступеней, в каждой из которых используются ма Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 389 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы лая разность температур между паром и раствором, что позволяет получить более высокую экономию энергии и увеличивать концентрацию раствора с дополнительной экономией вследствие большей рекуперации тепла в процессе кипения концентрированного раствора на поверхности нагрева. Высокая рециркуляция жидкости, а также хорошее ее распределение по периметру труб препятствует образованию сухих участков вследствие пересыхания при кипении, тем самым уменьшается возможность образования осадка на пленкообразующей поверхности. Низкое термическое сопротивление стекающей пленки и высокая ее турбулентность позволяет снизить поверхность теплообмена по сравнению с восходящей пленкой. Общие эксплуатационные расходы, включающие пар, электроэнергию, охлаждающую воду и вторичный пар, у испарителей с нисходящей пленкой значительно ниже, по сравнению с испарителями с восходящей пленкой. Увеличение потребления электроэнергии вследствие рециркуляции раствора через трубы компенсируется более низким потреблением пара и расширенными рабочими циклами. Действительные эксплуатационные расходы на единицу массы воды, выпаренной из раствора, примерно на 20 % ниже, чем у эквивалентного испарителя с поднимающей пленкой. С целью повышения производительности за счет увеличения длины цилиндрических труб греющей камеры разработаны испарители с выносным сепаратором (рис. 7.20, б). С целью снижения скорости пара в трубах разработан аппарат (рис. 7.20, в) с запасным отводом вторичного пара. Это позволяет частично снизить гидравлическое сопротивление аппарата, уменьшить температурную депрессию, увеличит производительность. Gв Gв Gв Gв 1 1 3 Gн Gн 3 6 Gк он Gк W 2 5 GВ Gк он 4 Gк 6 4 3 Gп 2 Gк он Gк W Gн 1 2 Gп Gп 5 6 4 5 GВ W а б в Рис. 7.21. Пленочные испарители со стекающей пленкой при конденсации вторичного пара на поверхности центральных труб [5]: 1 – корпус; 2 – контактные трубы; 3 – центральные трубы; 4 – патрубки для отвода конденсата вторичного пара; 5 – отвод хладагента; 6 – камера для вывода раствора (рис. Н.А. Войнова) Для достижения высокой производительности, особенно при работе под вакуумом, наиболее перспективны [5] пленочные трубчатые аппараты с Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 390 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы нисходящим прямотоком и конденсацией вторичного пара на поверхности центральных труб (рис. 7.21). В рассматриваемых аппаратах вследствие конденсации вторичного пара на поверхности центральных труб или змеевиков увеличивается движущая сила процесса, снижается скорость вторичного пара по длине трубы. Это позволяет увеличить удельную тепловую нагрузку и расход рабочей жидкости, снизить гидравлическое сопротивление и тем самым обеспечить глубокий вакуум, высокую производительность по испаряемой влаге и низкую температурную депрессию. 7.6.2. Флотаторы в микробиологической промышленности Для концентрирования культуральной жидкости перед стадией выпаривания или сепарации используется флотация, которая существенно снижает затраты на производство продукта. Флотацией называют процесс всплывания в жидкой среде частиц дисперсной фазы с прилипшими к ним пузырьками газа. Различают пенную, пленочную, масляную и другие виды флотации. Наибольшее распространение в микробиологической промышленности получила пенная и электрофлотация. Необходимыми условиями флотации являются способность частицы прилипать к пузырьку газа в воде и способность суспензии образовывать устойчивую пену. Стабильность и продолжительность существования пены снижается с увеличением размера пузырьков и с ростом температуры жидкости. В свою очередь, размеры пузырьков зависят от поверхностного натяжения жидкости на границе с газообразной фазой. Процесс флотации осуществляется в специальных аппаратах – флотаторах. Флотационные аппараты, применяемые в микробиологической промышленности, выполняются в нескольких вариантах: горизонтальные, конические, вертикальные, цилиндрические, одноступенчатые с внутренним стаканом, двухступенчатые. На рис. 7.22, б представлен общий вид наиболее простого одноступенчатого флотатора. Флотатор состоит из цилиндрического корпуса с плоским днищем и внутреннего стакана, являющегося пеносборником. Кольцевое пространство между корпусом и сборником разделено вертикальными перегородками на секции. Перегородки не доходят до дна, кроме перегородки между первой и последней секциями. В секциях установлены аэраторы. Суспензия из ферментера поступает в первую, самую большую по длине секцию флотатора, где осуществляется флотирование основной массы дрожжей за счет содержащего в суспензии газа. Образующая пена стекает через верхний борт внутреннего стакана и попадает в сборник. В остальных секциях флотирование оставшихся в культуральной жидкости дрожжей осуществляется за счет воздуха, подаваемого через аэраторы. Образовавшаяся пена также поступает в сборник. Пена гасится в сборнике пеногасителем. Концентрат Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 391 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы дрожжей из сборника подается на первую ступень сепарации. Отработанная жидкость выводится из последней секции через карман, служащий гидрозатвором. Производительность флотатора по исходной дрожжевой суспензии составляет 40–70 м3/ч, концентрация 40–50 кг/м3. а б Рис. 7.22. Схемы пенных (пневматических) флотаторов: 1 – корпус; 2, 5 – аэраторы; 3 – штуцер для отвода отработанной жидкости; 4 – штуцер для отвода концентрата (рис. Н.А. Войнова) Рис. 7.23. Схемы электрофлотаторов: 1– камера; 2, 3 – электроды; 4 – ввод культуральной жидкости; 5 – вывод отработанной жидкости; 6 – отвод концентрата; 7 – пеносъемник (рис. Н.А. Войнова) Конструкции электрофлотаторов, которые являются в настоящее время наиболее перспективными для концентрирования микроорганизмов, показаны на рис. 7.23. Перспективность электрофлотаторов связана с образованием при электролизе воды высокодисперсных пузырьков газа, что позволяет извлекать гидрофильные частицы без применения реагентов-собирателей, при этом величина пузырьков составляет 0,015–0,2 мм. Существенными преимуществами этого способа флотации являются также возможность неограниченного насыщения суспензии пузырьками и простота осуществления про- Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 392 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы цесса газонасыщения. Наиболее экономичными аппаратами (с позиции снижения энергозатрат) являются струйные флотаторы (рис. 7.24). а б в Рис. 7.24. Схемы струйных флотаторов [5]: 1– корпус; 2 – трубы; 3 – газовый патрубок; 4 – штуцер входа газа; 5 – штуцер вывода отработанной жидкости; 6 – штуцер вывода концентрата; 7 – штуцер ввода суспензии; 8,1 0 – аэраторы (рис. Н.А. Войнова) Из струйных флотаторов наиболее эффективным является пленочный флотатор с винтовой шероховатостью, установленной на внутренней поверхности труб. Вследствие, образования в суспензии, стекающей по винтовой шероховатости, высокого газосодержания и развитой межфазной поверхности, пленочный флотатор обеспечивает сгущение дрожжей до концентрации 350–500 кг/м3 прессованной биомассы [5]. 7.6.3. Центрифуги и сепараторы В микробиологической промышленности используют различные типы рассматриваемых машин с целью отделения балластных частиц из растворов биологически активных веществ, биомассы от культуральной жидкости, выделения биологически активного комплекса при его выделении из растворов, а также для разделения смесей жидкости или суспензий. В промышленных установках центробежное разделение применяют для отделения частиц размером от 25 мм до 0,5 мкм. При разделении биологических жидкостей к центрифугам и сепараторам предъявляются особые требования по разделяющей способности и обеспечению стерильности процесса для предотвращения попадания аэрозолей в окружающую среду. Под центрифугированием понимают процесс разделения неоднородных систем, суспензий и эмульсий, в поле центробежных сил с использованием сплошных или проницаемых для жидкости перегородок. В аппаратах со сплошными стенками производят разделение суспензий и эмульсий по принципу отстаивания, причем действие силы тяжести заменяется действием цен Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 393 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы тробежной силы. В аппаратах с проницаемыми стенками осуществляется процесс разделения суспензий по принципу фильтрования, причем вместо разности давлений используется действие центробежной силы. Разделение неоднородных систем центрифугированием, с физической точки зрения, можно рассматривать как процесс свободного или стесненного осаждения взвешенных частиц в жидкости под действием центробежного силового поля. Центробежная сила возникает при вращении центрифуги и находящейся в ней суспензии. Она возникает, как сила инерции при вращательном движении тел и направлена всегда по радиусу от оси вращения к периферии. В практике центрифугирования, как уже было сказано выше, используются два основных способа разделения суспензий: центробежное фильтрование и центробежное осаждение. Соответственно, по физической сущности реализуемого процесса центрифуги подразделяют на фильтрующие и осадительные (отстойные). Рабочим органом центрифуги является ротор (барабан), закрепленный на вращающемся валу, во внутреннюю полость которого подается суспензия. Ротор состоит из кольцевой крышки, цилиндрической или конической обечайки, плоского или выпуклого днища. По расположению его вала центрифуги делятся на вертикальные и горизонтальные. Обечайки роторов осадительных центрифуг сплошные, а фильтрующих – перфорированные (рис. 7.25, а и рис. 7.26, а). Под действием центробежных сил частицы твердой фазы скапливаются у стенки обечайки ротора, а жидкость либо располагается ближе к его оси, либо продавливается через слой осадка, фильтрующую перегородку и отверстия в обечайке. Рабочий цикл фильтрующих центрифуг включает операции загрузки суспензии, фильтрования, промывки, осушки и выгрузки осадка. В осадительных центрифугах фильтрование заменяется осаждением, промывка осадка отсутствует, но появляется операция удаления жидкости, собравшейся над осадком. Центрифуги предназначены для разделения эмульсий и плохо фильтрующихся суспензий, а также разделения суспензий по крупности частиц твердой фазы. По режиму работы выделяют центрифуги периодического и непрерывного действия. Для первых характерно последовательное осуществление операций рабочего цикла во всем объеме ротора, для вторых – одновременное выполнение операций на разных участках ротора при перемещении осадка вдоль его образующей. Центрифуги классифицируют также по способу выгрузки осадка. Для машин периодического действия характерны выгрузка вручную, гравитационная, с помощью ножа; для центрифуг непрерывного действия – пульсирующая, шнековая, вибрационная. Расчет производительности центрифуг в доступном виде представлен в работе [7]. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 394 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы а б в Рис. 7.25. Схема фильтрующей маятниковой центрифуги (а, б) и ее сборочный чертеж (в): 1, 2 – станина; 3 – подвеска; 4 – кожух; 5 – крышка; 6 – ротор; 7– подшипниковый узел; 8 – электродвигатель; 9, 10, 11 – клиноременная передача; 12 – основание; 13 – сетка; 14 – фильтрующая ткань; 15 – осадок; 16 – суспензия (рис. Н.А. Войнова) а б в Рис. 7.26. Схема осадительной центрифуги (а, б) и фотография ротора (в): 1 – кожух; 2 – ротор (барабан); 3 – привод; 4 – стенка ротора; 5 – слой осадка (рис. Н.А. Войнова) Наиболее используемые типы центрифуг периодического действия – маятниковые и горизонтальные с ножевой выгрузкой осадка. Маятниковые центрифуги (рис. 7.25, в) получили название из-за колебательного движения корпуса во время работы. Конструктивная особенность этих машин – вертикальное расположение вала ротора и наличие трех колонок, в которых размещены тяги упругой подвески с шаровыми шарнирами и пружинами. Такая подвеска позволяет уменьшить динамическую нагрузку на подшипники. В горизонтальных центрифугах с ножевой выгрузкой осадка (рис. 7.27) все операции рабочего цикла выполняются при одинаковой частоте вращения ротора, как правило, в автоматическом режиме. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 395 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Рис. 7.27. Схема горизонтальной центрифуги с ножевой выгрузкой осадка: 1, 2 – выход и вход продуктов; 3 – пневмоцилиндр; 4 – кожух; 5 – ротор; 6, 7, 8 – подшипниковый узел: 9 – электродвигатель; 10 – нож для съема осадка (рис. Н.А. Войнова) Фильтрующие центрифуги применяют для обработки волокнистых материалов и суспензий, содержащих более 10 % мелкозернистой, преимущественно растворимой твердой фазы, когда допускается дробление частиц осадка. Осадительные центрифуги используют для разделения мало концентрированных суспензий с нерастворимой твердой фазой (размер частиц 5–40 мкм). Наиболее восстребованными машинами непрерывного действия являются: с пульсирующей и вибрационной выгрузкой осадка, шнековые. Горизонтальные центрифуги с пульсирующей выгрузкой осадка (рис. 7.28) применяют для разделения суспензий, содержащих более 25 % кристаллической твердой фазы с размером частиц более 100 мкм, когда необходима качественная промывка осадка. Вал ротора этой центрифуги полый, внутри него расположен шток толкателя, который получает возвратно-поступательное движение от поршня гидроцилиндра (до ста двойных ходов в минуту амплитудой 0,1 длины ротора). Суспензия подается на освобождающийся участок сита ротора через приемный конус, соединенный с толкателем. Осадок постепенно смещается к открытому концу ротора, по пути промывается и отжимается. Экспериментально установлена толщина слоя осадка, обеспечивающая его перемещение по поверхности ротора без вспучивания. Толщина осадка регулируется сменным кольцом, закрепляемым на приемном конусе. В случаях, когда необходима тщательная промывка и осушка осадка, применяют двух-, четырех- и шестикаскадные центрифуги, где внутренние сита ротора, вращаясь, совершают возвратно-поступательное движение, проталкивая слой осадка своими бортами по внешним ситам. При этом операции фильтрования, промывки и осушки осадка осуществляются на разных ситах. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 396 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Рис. 7.28. Схема центрифуги с пульсирующей выгрузкой осадка: 1 – кожух; 2 – ротор; 3 – шток; 4 – подшипниковые узлы; 5 – толкатель; 6 – поршень; 7 – выгрузка осадка; 8 – приемный конус; 9 – ввод суспензии (рис. Н.А. Войнова) Рис. 7.29. Схемы шнековых центрифуг: 1 – ротор; 2 – кожух; 3 – вход суспензии; 4 – вывод осветленной жидкости; 5 – вывод осадка; 6 – шнек; 7, 8 – подшипниковые узлы; 9 – планетарный редуктор (рис. Н.А. Войнова) Центрифуги со шнековой выгрузкой осадка (рис. 7.29) выпускаются в модификациях, как фильтрующая, так и осадительная. Для выгрузки осадка в них используются расположенные соосно внутри ротора четырех-, шести- и восьмизаходные шнеки, вращающиеся с иной, чем у ротора, скоростью, что позволяет регулировать время обработки материала. Фильтрующие центрифуги применяют для обработки суспензий, содержащих более 20 % кристаллических твердых частиц размером более 100 мкм. Ротор фильтрующей центрифуги представляет собой усеченный конус, внешняя поверхность которого имеет щелевидные отверстия для прохода фугата, а внутренняя покрыта металлическими листами с круглыми отверстиями диаметром 0,3–0,5 мм. Уменьшение скорости вращения шнека, по сравнению с ротором, на 0,65–2,0 % обеспечивает планетарный редуктор. Центрифуги с вибрирующей выгрузкой осадка (рис. 7.30) применяют для обработки суспензий при размере частиц до 10 мм, главным образом для Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 397 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы обезвоживания шлама и осушки гранул полимера. Их ротор имеют форму усеченного конуса, обечайка которого собирается из проволочных сит с размером щелей 0,2–0,3 мм. Рис. 7.30. Схема центрифуги с вибрирующей выгрузкой осадка: 1, 2 – кожухи; 3 – загрузочное устройство; 4, 5, 6 – узлы опоры; 7 – вал; 8 – штуцер вывода; 9 – шкив; 10 – кривошипный вал; 11 – шатун; 12 – ремень; 13 – ротор (рис. Н.А. Войнова) Осадок движется от узкого края ротора к широкому под действием составляющей центробежной силы и силы инерции, создаваемой колебаниями ротора в направлении его оси. Частота вибраций 23–37 Гц, амплитуда 3–8 мм. Время пребывания осадка в роторе регулируется путем изменения амплитуды и частоты вибраций. Трубчатые центрифуги. Основным элементом трубчатой центрифуги является полый цилиндр (ротор), вращающийся с частотой 13 000–15 000 об/мин. В настоящее время в производстве белковых препаратов применяются трубчатые сверхцентрифуги, у которых фактор разделения превышает 100 000 (рис. 7.31). С помощью полой цапфы трубчатый ротор опирается на нижнюю упругую опору. Шпиндель ротора в верхней части соединен с приводом. Головка ротора расположена в приемнике, служащем для улавливания фугата. Трубчатая сверхцентрифуга может быть осветляющей или разделяющей. В первом случае в верхней узкой части ротора имеются отверстия для выпуска осветленной жидкости. Во втором – верхняя часть ротора имеет более сложное устройство, помимо отверстий в верхней части барабана еще имеются для отвода тяжелого компонента. Суспензия, введенная в центре нижней части ротора, вовлекается во вращение и одновременно течет вдоль его стенок в осевом направлении. Микроорганизмы осаждаются на стенке ротора, образуя осадок, а фугат выбрасывается через выпускные отверстия. Осадок удаляется вручную после остановки центрифуги. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 398 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Рис. 7.31. Трубчатая сверхцентрифуга РТР: 1 – шкив веретена центрифуги; 2 – веретено; 3 – приемник легкой фазы; 4 – приемник тяжелой фазы; 5 – ротор; 6 – тормоз; 7 – ввод эмульсии; 8 – станина; 9 – электродвигатель; 10 – шкив электродвигателя (рис. Н.А. Войнова) Сепараторы. Сепарирование нашло широкое применение при концентрировании кормовых и хлебопекарных дрожжей, при разделении эмульсий и осветлении растворов биологически активных веществ перед концентрированием в выпарных аппаратах и ультрафильтрационных установках. Использование сепараторов позволяет обрабатывать большие объемы трудно фильтрующих суспензий, интенсифицировать выделение и концентрирование микроорганизмов размером более 0,5 мкм. По конструкции сепараторы разделяют на тарельчатые (рис. 7.32) и камерные (рис. 7.33). Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 399 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы а б Рис. 7.32. Тарельчатый сепаратор – а: 7 – вал; 10 – барабан; 16 – сопла: 18 – тарелкодержатель; б: 1, 6 – пробки; 2 – станина; 3 – указатель уровня масла; 4 – вал горизонтальный; 5 – тахометр; 7 – гидроузел; 8 – чаша; 9 – приемник; 10 – клапаны; 11 – корпус барабана; 12 – основание барабана; 13– поршень; 14 – тарелкодержатель; 15 – тарелки; 16 – крышка барабана; 17– напорный диск; 18 – выводное устройство; 19 – труба центральная; 20, 21 – кольца затяжные; 22 – приемник шлама; 23 – шламовое пространство; 43 – подшипник верхней опоры; 25 – пружина верхней опоры; 26 – вал вертикальный; 27 – опоры (рис. Н.А. Войнова) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 400 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы а б в Рис. 7.33. Схемы сепараторов: камерный (а–б) и бесприводной основе (в): (а) и (б): 1 – корпус; 2 – червячная пара; 3 – тахометр; 4 – бобышка; 5 – вал; 6, 7, 8 – ротор в сборе; 9 – напорный диск; 10 – крышка; 11 – гайка; 12 – уплотнение; 13 – штуцер; 14 – кран; 15 – манометр; 16 – шток; 17 – подача суспензии; 18 – сгон; 19 – корпус барабана; 20 – барабан; 21 – опора; 22 – нижняя опора; 23 – приемник осадка; (в): 1 – статор; 20 – барабан (рис. Н.А. Войнова) По технологическому назначению сепараторы делятся на три основных класса: сепараторы-разделители для разделения смеси жидкостей, не растворимых одна в другой, и для концентрирования суспензий и эмульсий; сепараторы-осветлители для выделения твердых частиц из жидкости; комбинированные сепараторы для выполнения двух или более операций переработки жидких смесей. Комбинированные сепараторы называют универсальными. К ним относятся сепараторы, в которых процесс разделения совмещается с каким-либо другим процессом (сепараторы-экстракторы, сепараторы-реакторы). Ротор тарельчатых сепараторов укомплектован пакетом конических тарелок, которые делят поток суспензии на параллельные ламинарные слои. Ротор камерных сепараторов имеет цилиндрические вставки. В сепараторе Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 401 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы разделителе исходная смесь по центральной трубке поступает в тарелку держатель, откуда по каналам, образованным отверстиями в тарелках, поднимается вверх через тарелки и растекается в зазорах, образованных между ними. Под действием центробежной силы легкая фракция оседает на верхнюю поверхность нижележащей тарелки. По этой поверхности легкая фракция движется к центру барабана, далее по зазору между кромкой тарелки и тарелкодержателем поднимается вверх барабана и отводится по коммуникациям. Суспензия в сепараторе-осветлителе по центральной трубке поступает в тарелкодержатель, из которого направляется в шламовое пространство между кромками пакета тарелок и крышкой. Затем жидкость поступает в межтарельчатое пространство, по зазору между тарелкодержателем и верхними кромками тарелок поднимается вверх и через прорезь выходит из барабана. Процесс очистки начинается в шламовом пространстве и завершается в межтарельчатом. Процесс разделения гетерогенных систем осуществляется главным образом в межтарельчатом пространстве. При этом траектории частиц дисперсной фазы состоят из двух стадий. Легкая фракция дисперсной фазы движется к оси вращения, а тяжелая – к периферии. На процесс разделения оказывают влияние частота вращения барабана, размеры тарелок и расстояние между ними, величина отверстий для вывода фракций. Разработан сепаратор (рис. 7.34, в) с двойным вращением ротора, что позволяет не только осуществлять гидродинамическую выгрузку осадка, но и интенсифицировать процесс центрифугирования. При работе такого сепаратора разделяются взвеси, частицы направляются в грязевое пространство ротора, образуя слой осадка. Перед выгрузкой осадка прекращается подача жидкости в ротор и осуществляется торможение выгружающего устройства, т.е. n1 > n2, где n1 – частота вращения ротора; n2 – частота вращения выгружающего устройства. Происходит нагнетание осадка в каналы выгружающего устройства к отверстию. По окончании выгрузки осадка выгружающее устройство снова начинает вращаться с частотой вращения ротора, и цикл работы сепаратора повторяется. Конструкция сепаратора позволяет интенсифицировать процесс центрифугирования за счет увеличения частоты вращения пакета тарелок. Одним из путей снижения уноса частиц дисперсной фазы из шламового пространства сепаратора-разделителя является уменьшение производительности сепаратора либо путем установки фильтрующей перегородки на разделительной тарелке сепаратора-разделителя (рис. 7.34, а, б). Процесс разделения в роторе сепаратора-разделителя с фильтрующей перегородкой складывается из двух стадий: тонкослойного сепарирования и фильтрования тяжелой жидкой фазы без образования осадка на поверхности фильтрующей перегородки. Жидкая фаза, проходя через фильтрующую перегородку, дополнительно осветляется, а у ее поверхности образуется зона коагуляции частиц дисперсной фазы, которые не могут пройти через поры перегородки. Фильтрующая перегородка является «барьером» для частиц, которые не осаждаются в рассматриваемом центробежном поле. При сепарировании высокодисперсных сис Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 402 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы тем в роторе с фильтрующей перегородкой на разделительной тарелке улучшаются условия сепарирования, значительно снижается унос дисперсной фазы, устраняется неравномерность загрузки пакета тарелок. а б в Рис. 7.34. Схемы сепараторов: а и б – с фильтрующей перегородкой; в – двойного вращения с гидродинамической выгрузкой осадка: 1 – корпус; 2 – тарелки; 3 – вал вертикальный; 4 – фильтрующая перегородка; 5 – выгружающее устройство (рис. Н.А. Войнова) Для повышения эффективности работы и увеличения числа оборотов барабана разработаны сепараторы на бесприводной основе. Схемы конструкций сепаратора на бесприводной основе представлены на рис. 7.33, в, в них установленный на двух опорном валу ротор размещен внутри статора электродвигателя. Статор сепаратора выполнен по типу асинхронного электродвигателя. Ротор сепаратора изготовлен из высоколегированной нержавеющей стали, на внешней поверхности его напрессовывается цилиндрическое роторное кольцо из ферромагнитного материала, выполняющее роль короткозамкнутого ротора электродвигателя. 7.6.4. Сушилки в биотехнологической промышленности Удаление влаги из полупродуктов микробного синтеза является одной из конечных операций в производстве. Сушка представляет собой весьма энергоемкий, сложный, взаимообусловленный комплекс химических, тепловых и диффузионных процессов. В промышленной микробиологии имеют дело с живыми микроорганизмами, а в ряде случаев для товарного продукта требуется сохранение не только качества, но и жизнеспособности препара Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 403 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы тов. Главным при этом является форма связи влаги с материалом, которая для продуктов микробиологического синтеза мало исследована. Продукты микробиологического синтеза применительно к процессу сушки могут быть классифицированы на два больших класса: продукты, которые при обезвоживании требуют сохранения жизнедеятельности микроорганизмов или высокой активности препаратов (антибиотики, средства защиты растений, ферменты); продукты, которые после высушивания требуют сохранения высокой питательной ценности (кормовые дрожжи, пищевой белок и др.). Cогласно [8, 9], продукты микробиологического синтеза (с позиции реализации процесса сушки) разделены на две категории: вегетативные бактериальные культуры (бактерии, дрожжи, грибы, вирусы и т.п.); спорообразующие микроорганизмы (споры бактерий, белки, ферменты, аминокислоты, антибиотики и т.п.). Для первой категории характерна высокая скорость гибели микроорганизмов в результате тепловой инактивации в сравнительно узком температурном диапазоне (40–60) °С независимо от вида культуры. Материалы, отнесенные ко второй категории, обладают значительно более высокой термоустойчивостью и меньшей скоростью инактивации. Как установлено, для вегетативных бактериальных клеток, ферментов, вирусов и т.п. основным лимитирующим механизмом термоинактивации является термоденатурация клеточного белка, во втором случае можно предположить нарушение целостности структуры споры или макромолекулы вещества. Аналогично влиянию температуры проявляется и воздействие остаточного влагосодержания на жизнеспособность (сохранность) качественных показателей объектов сушки различной природы. Для материалов первой категории критическое влагосодержание составляет 50–70 %, причем большей устойчивостью обладают дрожжевые культуры и культуры бактерий, выращенные на твердых субстратах. Высокая жизнеспособность спор Вас. thuringiensis сохраняется при влагосодержании препарата, равном примерно 11 %. Высокой устойчивостью отличаются антибиотики и аминокислоты. Материалы, отнесенные ко второй категории, при низком остаточном влагосодержании сохраняют технологические показатели длительное время, тогда как вегетативные бактериальные формы склонны к снижению жизнеспособности во времени в зависимости от влагосодержания. Ко второй категории можно отнести также белковые и ферментные препараты, обладающие наряду с высокой термочувствительностью достаточной устойчивостью – конечная влажность порядка 5–6 % практически не снижает их ферментативной активности. Строгое обоснование выбора метода и режима сушки с учетом получения желаемого качества конечного продукта может быть произведено лишь при тщательном анализе таких теплотехнических параметров процесса сушки, как длительность и скорость нагрева и охлаждения, скорость удаления влаги, реологические и гигроскопические свойства материала. При рекомендации любого метода сушки необходимо задать температурный режим процесса. С позиций интенсификации тепломассопереноса, естественно, следует ориентироваться на максимальный тепловой потенциал, определяемый, в свою очередь, предельно допустимой для термоустойчиво Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 404 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы сти материала температурой греющей среды. Производительность сушилки по высушенному материалу и количество влаги, удаляемое при сушке определяют из уравнений материального баланса. Четкой характеристики для классификации сушильных установок продуктов микробиологической промышленности не существует. Сушилки, применяемые в микробиологической промышленности, можно характеризовать по способу подачи продукта и теплоносителя в сушильные камеры, а также по гидродинамическим условиям их работы. Наибольшее применение при обезвоживании продуктов биосинтеза нашли конвективные сушилки (вальцовые, ленточные, барабанные, распылительные, в кипящем слое и т.п.), реже используются контактивные сушилки. Вальцовые сушилки (рис. 7.35) наиболее часто используются для сушки кормовых дрожжей с содержанием сухих веществ до 20–25 %. Процесс сушки проводится при строгом контроле температурного режима во избежание денатурации белков. На вальцовых сушилках предел температуры теплоносителя составляет 70–80 °С. В барабан, который закрыт с торцов крышками, подается пар. У торцов барабанов сверху устанавливаются клинья, образующие между барабанами ванну, в которую непрерывно поступает концентрат биомассы. При вращении барабана клеточная биомасса смачивает их поверхность тонким слоем, который высушивается до влажности 8–10 %. Сухая биомасса снимается с поверхности барабана ножами и осыпается в продольные шнеки, откуда подается на фасовку. Сушку кормовых концентратов, содержащих аминокислоты, такие, как лизин, гистидин, аргинин, триптофан, до влажности 8–10 % осуществляют на ленточных, распылительных и в кипящем слое сушилках. Схема ленточной сушилки представлена на рис. 7.35, б. Пастообразная биомасса предварительно смешивается с наполнителем, а затем формуется в виде брикетов, которые подаются на транспортер ленточной сушилки. После сушки материал размалывается на молотковой дробилке. Применение ленточных сушилок целесообразно и том случае, когда влажный материал заранее отформован и сушка в таком виде является единственно приемлемой. а б Рис. 7.35. Схемы сушилок: вальцовая (а) и ленточная (б); а: 1– кожух; 2 – барабан; 3 – штуцер подачи пара; 4 – штуцер вывода конденсата; 5 – шнек; б: 1 – конденсационный горшок; 2 – скребок для очистки ленты; 3 – щит; 4 – шибер для разравнивания продукта; 5 – термопара; 6 – психрометр; 7 – лента; 8 – калорифер (рис. Н.А. Войнова) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 405 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Распылительные сушилки. Способ сушки распылением обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами сушки. Процесс сушки протекает чрезвычайно быстро (15–30 с), частицы в зоне повышенной температуры имеют насыщенную поверхность, температура которой близка к температуре адиабатного испарения чистой жидкости. Благодаря мгновенной сушке и невысокой температуре распыленных частиц материала высушенный продукт получается хорошего качества. Например, не происходит денатурации белков, окисления, потерь витаминов и т.д. Этот метод часто применяется для сушки пищевых продуктов, органических солей и красителей, биологических и фармацевтических препаратов и других термочувствительных материалов. По качественным свойствам продукт, высушенный в распылительных сушилках в нагретом воздухе или инертном газе (азот, углекислый газ), можно сравнить только с продуктом, высушенным при глубоком вакууме. При сушке распылением легко регулировать и изменять в нужном направлении качественные показатели готового продукта в зависимости от условий сушки. Например, можно регулировать и изменять в определенных границах объемный вес сухого порошка, величину частиц, конечную влажность и температуру. В результате сушки получается готовый продукт, который не требует обычно дальнейшего измельчения и обладает повышенной растворимостью. При применении сушки распылением часто может быть значительно сокращен и полностью механизирован технологический цикл получения сухого продукта. В этом случае могут быть исключены такие процессы, как фильтрация, центрифугирование, размол. В распылительных сушилках можно достигнуть высокой производительности по высушиваемому материалу, при этом не требуется большого количества обслуживающего персонала. Высушиваемый материал в процессе сушки не соприкасается с поверхностями сушилки до тех пор, пока он не высохнет. Это упрощает разрешение проблемы коррозии и выбора материала для сушильной камеры. При других способах сушки влажный продукт соприкасается с металлическими поверхностями. В распылительных сушилках можно осуществить сушку в широких температурных пределах (60–1 200) °С. При сушке распылением легко осуществить получение высушенного продукта, состоящего из различных сухих компонентов в определенных соотношениях, например при добавлении необходимого количества других материалов до сушки в основной материал. Метод сушки распылением имеет и недостатки: большие удельные габариты сушильной установки при сушке с начальной температурой воздуха (100–150) °С; сравнительно дорогое и сложное оборудование для распыления и выделения высушенного продукта из отработанных газов. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 406 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Рис. 7.36. Схема распылительной сушилки с центробежным распылением суспензии: 1 – корпус; 2 – распылительное устройство; 3 – ввод теплоносителя; 4 – вывод теплоносителя; 5 – отвод готового продукта (рис. Н.А. Войнова) Наиболее производительными являются распылительные сушилки, применяемые для сушки кормовых дрожжей. На рис. 7.36 представлена схема распылительной сушилки с центробежным распылением. Дрожжевая суспензия непрерывно подается под небольшим давлением в распылительный механизм к вращающимся дискам. За счет центробежной силы, возникающей при вращении диска, раствор в виде пленки перемещается с непрерывно возрастающей скоростью к периферии диска и сбрасывается в виде струек, распадающихся на мельчайшие капли размером (6–70) мкм. Сушильный агент (нагретый воздух или дымовые газы, разбавленные воздухом) подается в сушильную камеру по газопроводу. При помощи направляющего аппарата создается большая скорость движения теплоносителя на входе в сушильную камеру и одновременно сообщается спиралеобразное направление. Начальная температура сушильного агента при сушке кормовых дрожжей достигает (300–350) °С. Распыленная дрожжевая суспензия, вступая в контакт с теплоносителем, высушивается. Испарение воды из дрожжевой суспензии при высокой степени распыления протекает практически мгновенно, благодаря чему сушильный агент быстро охлаждается, и температура его на выходе из сушилки не превышает 90 °С. Высушенные дрожжи также не прогреваются выше этой температуры. Сухие кормовые дрожжи в виде порошка поступают в нижнюю конусную часть сушилки, откуда непрерывно удаляются. Отработанный теплоноситель отводится из сушильной камеры через газоотвод. Часть дрожжей (15–20 %) уносится вместе с теплоносителем, и для их улавливания устанавливаются циклоны. Сухие дрожжи из-под конуса сушилки и из циклонов подаются пневмотранспортом на фасовку и упаковку. Сушилки типа СРФ оснащены пневматическими или механическими форсунками. Применение той или другой конструкции форсунки зависит от свойств исходного продукта, условий сушки и требований к готовому продукту. Сушилки с механическими форсунками рекомендуются для распыления и сушки тонких эмульсий, истинных и коллоидных растворов, тонкодисперсных суспензий. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 407 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Барабанные сушилки (рис. 7.37), работающие при атмосферном давлении применяют для сушки ферментных препаратов, органических кислот и других продуктов микробиологического синтеза. По сравнению с сушильными установками других типов, в сушилках барабанного типа потери ферментативной активности не превышают (10–5 %). Рис. 7.37. Схема и фотография барабанной сушилки: 1 – барабан; 2 – бункер; 3 – разгрузочное устройство; 4 – вентилятор; 5 – циклон (рис. Н.А. Войнова) Чаще всего сушка ведется подогретым воздухом при прямоточном или противоточном движении теплоносителя и продукта. Воздух, подаваемый в барабан, для сушки тщательно очищается. Обычно для этого применяют двухступенчатую фильтрацию, используются фильтры грубой и бактериальной очистки. Сушилка состоит из полого вращающегося цилиндрического корпуса 1, установленного на роликовых опорах 6 с углом наклона (0,5–0,6)о в сторону выгрузки продукта. Высушиваемый материал подается в бункер 2 и при помощи винтовой вставки поступает в полость корпуса, где проходит через ряд насадок, интенсивно перемешивается и контактирует с теплоносителем, что и обеспечивает процесс сушки. Сушка в псевдоожиженном слое широко используется при обработке ксеролабильных материалов, так как легко обеспечивается регулирование конечной влажности материала. Основными преимуществами указанной сушки являются: высокая интенсивность процессов переноса; предотвращение локального перегрева частиц; сравнительно простое конструктивное выполнение (рис. 7.38, а), возможность гранулирования материала (антибиотики, аминокислоты) непосредственно в процессе сушки. Наиболее существенным противопоказанием применения метода псевдоожиженного слоя является механическое нарушение целостности частиц (истирание, слипание). В трубчатых сушилках (рис. 7.38, б) используется принцип пневмотранспорта твердых частиц (гранул) в трубе 3, при этом осуществляется удаление внешней влаги с поверхности высушиваемого продукта. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 408 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы а б Рис. 7.38. Схемы сушилок: с псевдоожиженном слоем (а, б); пневмотранспортная трубчатая сушилка (в): 1 – питатель; 2 – бункер; 3 – корпус; 4 – циклон; 5 – фильтр; 7 – штуцер выхода продукта; 8 – вход теплоносителя (рис. Н.А. Войнова) Сублимационные сушилки. Сублимация (лиофилизация) – это переход твердого вещества при нагревании в газообразное состояние, минуя стадию жидкости. На выходе из сушилки отработанный теплоноситель поступает в циклон 5, а сухой продукт стекает в разгрузочное устройство 3. При диаметре корпуса сушилки 1,2 м и его длине 4,2 м производительность сушилки по культуре гриба достигает 1,5 т/сут. Сублимационная сушка продуктов микробиологического синтеза представляет собой частный случай вакуумной дистилляции льда методом испарения из замороженного продукта. Проведение сублимационной сушки под вакуумом дает возможность значительно снизить температуру процесса и тем самым сохранить клеточные структуры в жизнеспособном состоянии. Сублимационная сушка наиболее пригодна для живых микроорганизмов, некоторых видов ферментов и других термолабильных продуктов. В этом случае меньше всего инактивируются ферменты, хорошо сохраняется жизнеспособность клеток. Преимущества рассматриваемой сушки: влага удаляется при низких температурах, что практически исключает термоинактивацию продукта; сохраняется стабильная структура материала (не происходит разрушения или конгломерации частиц); практически исключается удаление летучих компонентов высушиваемого материала, нарушение его химического состава; облегчается возможность получения сухого продукта в фасованном и стерильном виде. Сублимационная сушка биологических продуктов состоит из стадий замораживания, сублимации, десорбции (досушивания). От скорости замораживания и конечной температуры продукта зависит процесс сублимации. Сублима Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 409 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы ционной сушке подвергают концентрат суспензии микроорганизмов, полученный из культуральной жидкости одним из механических способов обезвоживания (фильтрованием, центрифугированием). В концентрированную суспензию микроорганизмов добавляют в определенном количестве так называемую защитную среду, которая предохраняет клетки от гибели при замораживании и последующем высушивании. В качестве защитных сред используют коллоидные и гидрофильные вещества (белки, аминокислоты, углеводы и др.), которые замедляют внутриклеточное образование льда, уменьшают концентрирование электролитов и защищают клетки от глубокого необратимого обезвоживания. Замораживание биомассы приводит к физическим, биофизическим и биохимическим изменениям в клетке. В результате кристаллообразования при замораживании происходит повреждение и разрушение клеточных мембран и других структур клетки. Эти повреждения могут быть вызваны тремя основными причинами: механическим воздействием на клетки кристаллов льда; повышением концентрации электролитов, что вызывает денатурацию мембран; снижением разности концентраций веществ внутри и снаружи клетки. Чтобы избежать денатурации белка в процессе замораживания подбирают оптимальные условия кристаллизации воды. Большое значение имеет скорость замораживания. При медленном замораживании образуются крупные кристаллы льда, имеющие меньшую поверхность испарения, чем мелкие кристаллы, образующиеся при быстром замораживании. Существует несколько способов замораживания биомассы: контактное замораживание на охлаждаемых полках; конвективное замораживание охлажденным газом; комбинированное замораживание. Сублимационная сушильная установка (рис. 7.39) состоит из сушильной камеры, конденсатора-десублиматора и вакуум-насосной системы. Рис. 7.39. Схема установки периодического действия: 1, 7 – холодильные установки; 2 – холодильник; 3 – полки; 4 – сублиматор; 5 – конденсатор; 6 – вакуум-насос; 8 – насос; 9 – емкость для нагрева теплоносителя (рис. Н.А. Войнова) Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 410 ГЛАВА 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ 7.6. Оборудование для концентрирования биомассы Конструктивное оформление отдельных элементов схемы обусловлено спецификой сублимируемого материала и стремлением организовать непрерывный и высокоинтенсивный процесс сушки. В промышленных сублимационных установках подвод энергии осуществляется в основном за счет теплопроводности, инфокрасного излучения, токами высокой частоты. Применение сублимационной сушки с использованием комбинированного энергоподвода (ИК – излучения, энергии ультразвука и принудительного потока газа) позволяет снизить удельный расход энергии и увеличить способность к восстановлению бактерий из сухого концентрата. Наиболее эффективна сублимационная сушка в поле ультразвука и атмосфере инертного газа. К тому же значительно сокращается удельный расход энергии по испаряемой влаге по сравнению с контактной сублимационной сушкой. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 411 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение теоретического материала пособия, разработанного для курса «Современные проблемы и методы биотехнологии» в сочетании с приобретением экспериментальных навыков в рамках лабораторного практикума имеет целью дать знания студентам о новейших достижениях, направлениях исследования и практической реализации биотехнологической науки XXI в. и обеспечить формирование представлений о революционных изменениях комплекса наук биологического направления в области генетической инженерии, в геномике и протеомике, о новейших достижениях молекулярной биотехнологии. В результате освоения курса студенты получат представление о научных основах молекулярной биотехнологии, направлениях получения и использования генетически модифицированных организмов различного уровня организации; основах новейших направлений и технологии получения целевых генно-инженерных продуктов для различных областей применения; основ генной диагностики и генной терапии; о необходимости соблюдения этических норм и стратегии риска при развитии биотехнологических технологий; направлениях исследований и стратегии применения новых безопасных материалов, получаемых биотехнологическими способами; о современных методах аналитики важнейших клеточных макромолекул и целевых продуктов биотехнологии; методологии биоинженерии. Помимо теоретических знаний студенты, приобретут умение ориентироваться в современных направлениях и новейших методах биотехнологии (геномике, протеомике, генетической инженерии, биоматериаловедении и современной аналитике); смогут использовать знания по новейшим направления современной биотехнологии при изучении специальных дисциплин, применять их для повышения качества жизни людей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 412 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ К главе 1 1. Данные Ernst & Young LLP, Americas Biotechnology Report: Resurgence, 2004 2. BioWоrld [Электронный ресурс]. – Режим доступа : http://www.cbio.ru/. 3. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. Новосибирск : Изд-во СО РАН, 1999. – 252 с. 4. Квеситадзе, Г. И. Введение в биотехнологию / Г. И. Квеситадзе, А. М. Безбородов. – М. : Наука, 2002. – 283 с. 5. Егорова, Т. А . Основы биотехнологии / Т. А. Егоровой, С. М. Клуновой, Е. А. Живухиной. – М. : Академия, 2003. – 208 с. 6. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Д. Пастернак. – М. : Мир, 2002. 7. Безбородов, А. М. Ферментационные процессы в биотехнологии / А. М. Безбородов, Н. А. Загустина, В. О. Попов. – М. : Наука, 2008. – 335 с. К главе 2 1. Boehm, R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of plants and plant cells as production platforms // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2007. – V. 1102. – Р. 121–134. 2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Д. Пастернак. – М. : Мир, 2002. 3. Трансгенные растения для фармакологии / Е. Б. Рукавцова, Я. И. Бурьянов, Н. Я. Шульга, В. А. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2006. – № 2. – С. 3–12. 4. Эрнст, Л. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных сельскохозяйственных животных / Л. Эрнст, Н. Зиновьева // Вестник РФФИ. – 2002. – № 3. 5. Niemann, H. Transgenic farm animals: an update / H. Niemann, W. Kues // Reproduction, fertility and development. – 2007. – V. 19. – P. 762–770. Дополнительная литература: 6. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И. Ф. Жимулев // Новосибирск : Наука, 2003. 7. Патрушев, Л. И. Искусственные генетические системы / Л. И. Патрушев. – М. : Наука, 2005. – Т. 1. 8. Щелкунов, С. Н. Генетическая инженерия / С. Н. Щелкунов ; Новосиб. гос. ун-т. – Новосибирск, 2004. – 496 с. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 413 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ К главе 2 9. Никитин, В. А. Методы введения веществ и органелл в клетку в технологиях клеточной инженерии / В. А. Никитин // Цитология. – 2007. – Т. 49. – № 8. – С. 631–641. 10. Кочетов, А. В. Генная инженерия растения / А. В. Кочетов // Природа. – 2007. – № 6. 11. Кузьмина, Н. А. Основы биотехнологии [Электронный ресурс] / Н. А. Кузьмина. – Режим доступа : www.biotechnolog.ru. 12. Лебедев, В. Миф о трансгенной угрозе / В. Лебедев // Наука и жизнь, 2003. – № 11, 12. 13. Семенова, М. Л. Зачем нужны трансгенные животные / М. Л. Семенова // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. – № 4. – С. 13–20. 14. Kind, A. Animal pharming, two decades on / A. Kind, A. Schnieke // Transgenic research. – 2008. – V. 17(6). – P. 1025–1033. 15. Protocols and applications guide. Chapter 12: Transfection [Электронный ресурс], 2007. – Режим доступа : www.promega.com. К главе 3 1. Fleischmann, R. D. Alland, D. Eisen, J. A. Carpenter, L. White, O. Peterson, J. DeBoy, R. Dodson, R. Gwinn, M. Haft, D. Hickey, E. Kolonay, J. F. Nelson, W. C. Umayam, L. A. Ermolaeva, M. Salzberg, S. L. Delcher, A. Utterback, T. Weidman, J. Khouri, H. Gill, J. Mikula, A. Bishai, W. Jacobs, W. R. Venter, J. C., and Fraser C. M. // Journal of Bacteriology. – 2002. – V. 184. – №. 19. – P. 5479–5490. 2. Киселев, Л. Л. // Вестник Российской академии наук. – 2000. – Т. 70. – № 5. – 412–424. 3. Высоцкий, Е. С. Маркова, С. В. Франк, Л. А. // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40. – 410–417. 4. Кнорре, Д. Г. Биологическая химия / Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. – М. : Высш. шк., 2003. – 295–297. 5. Борисова, В. В. Пышная, И. А. Пышный, Д. В. Франк, Л. А. // Биоорганическая химия. – 2008. – Т. 34. – С. 1–7. 6. Mothershed, E. A. Whitney, A. M. // Clinica Chimica Acta. – 2006. – V. 363. – Р. 206–220. 7. Глик. Б. Молекулярная биотехнология/ Б. Глик, Д. Пастернак. – М. : Мир, 2002. 8. Shubert, S. Kurreck, J. // Curr. Drug Targets. – 2004. – V. 5. – № 8. – Р. 667–681. 9. Воробьева, М. А. Ковалев, Н. А. Зенкова, М. А. Веньяминова, А. Г. Власов В. В. // Вестник ВОГиС. – 2006. – Т. 10. – № 2. – С. 321–330. Дополнительная литература: 10. Кларк, Д. Молекулярная биология: простой и занимательный подход / Д. Кларк, Л. Рассел. – М. : Компания КОНД, 2004. – 472 с Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 414 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ К главе 4 1. Баев, А. А. Биотехнология / А. А. Баев. – М. : Наука, 1984 – 311 с. 2. Бекер, М. Е. Биотехнология / М. Е. Бекер, Г. К. Лиепиньш, Е. П. Райпулис. – М. : Агропромиздат, 1990. – 334 с. 3. Бест, Д. Биотехнология / Д. Бест, Г. Бич. – М. : Агропромиздат. – 1988. – 420 с. 4. Биотехнология растений: культура клеток / под ред. Р. Г. Бутенко. – М. : Агропромиздат, 1989. – 280 с. 5. Биотехнология. Принципы и применение / под ред. И. Хингинса, Д. Беста и Дж. Джонсона. – М. : Мир, 1998. – 480 с. 6. Бутенко Р. Г. Культура клеток растений и биотехнология / Р. Г. Бутенко. – М. : Наука, 1986. 7. Бутенко Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко. – М. : Агропромиздат, 1975. – 89 с. 8. Елинов Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов. – СПб. : Наука, 1995. – 600 с. 9. Першина, Л. А. Культивирование изолированных клеток и тканей растений : учеб. пособие : в 2 ч. / Л. А. Першина. – Новосибирск : Новосиб. гос. ун-т, 2000. – Ч. 1. – 45 с. 10. Першина, Л. А. Методы культивирования in vitro в биотехнологии растений : учеб. пособие : в 2 ч. / Л. А. Першина. – Новосибирск : Новосиб. гос. ун-т, 2000. – Ч. 2. – 69 с. 11. Першина, Л. А. Основные методы культивирования in vitro в биотехнологии растений : учеб. пособие / Л. А. Першина. – 2-е изд., перераб. и доп. – Новосибирск : Новосиб. гос. ун-т, 2005. – 142 с. 12. Сельскохозяйственная биотехнология : учеб. / под ред. В.С. Шевелухи. – М. : Высш. шк., 2003. – 469 с. 13. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы / под ред. В. С. Шевелухи. – М. : Евразия+, 2000. – 264 с. 14. Сельскохозяйственная биотехнология / В. С. Шевелуха, С. В. Калашникова, Е. З. Кочиева [и др.]. – М. : Высш. шк., 1998. – 416 с. 15. Сергеева, Л. Е. Новая селективная среда с ионами Ва2+ – альтернативная система для отбора солеустойчиывх клеточных линий / Л. Е. Сергеева // Биотехнология. – 2002. – № 2. – С. 47–52. 16. Гладков, Е. А. Отбор солеустойчивых газонных трав с помощью методов биотехнологии / Е. А. Гладков, Ю. Н. Долгих, В. В. Бирюков // Биотехнология. – 2003. – № 5. – С. 11–15. 17. Лукаткин, А. С. Скрининг клеточных культур огурца на повышенную хладоустойчивость / А. С. Лукаткин, А. В. Гераськина // Биотехнология. – 2003. – № 3. – С. 65–73. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 415 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ К главе 5 1. Повестка дня XXI в. [Электронный ресурс]. – Режим доступа : www.un.org/russian/conferen/wssd/agenda21/. 2. Kijchavengkul, T. Perspective Compostability of polymers / T. Kijchavengkul, R. Auras // Polymer International. – 2008 – V. 57. – P. 793–804. 3. Stein, R. S. Polymer recycling: opportunities and limitations / R. S. Stein, // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1992. – V. 89. – P. 835–838. 4. Фомин, В. А. // Биоразлагаемые полимеры, состояние и перспективы использования / В. А. Фомин, В. В. Гузеев // Пластические массы. – 2001. – № 2. – С. 42–46. 5. Gerngross, T. U. and Martin D.P. Enzyme-catalyzed synthesis of poly [(R)-(3-hydroxybutyrate]: formation of macroscopic granules in vitro / T. U. Gerngross // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – V. 92. – P. 6279–6283. 6. Волова, Т. Г. Биосинтез на водороде / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Наука СО, 2004. – 397с. 7. Asrar, J. Biodegradable Polymer (Biopol®) / J. Asrar and K. J. Gruys // In: Series of Biopolymers in 10 vol. (A. Steinbüchel Ed.).Wiley-VCY Verlag GmbH. – 2002. – V. 4. – P. 55–86. 8. Lee S. Y. Bacterial Polyhydroxyalkanoates (Rewiew) / S. Y. Lee // Biotechnol. and Bioengin. – 1996. – V. 49. – P. 1–14. К главе 6 1. Айвазов, Б. В. Основы газовой хроматографии : учеб. пособие для хим. спец. вузов / Б. В. Айвазов. – М. : Высш. шк., 1977. – 183 с. 2. Биотехнология : учеб. пособие для вузов : в 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 1. Проблемы и перспективы / Н. С. Егоров, А. В. Олескин, В. Д. Самуилов. – М. : Высш. шк., 1987. – 159 с. 3. Волова, Т. Г. Специфика состава липидов двух представителей Botryococcus, синтезирующих жидкие углеводороды / Т. Г. Волова, Г. С. Калачева, Н. О. Жила // Физиология растений. – 2003. – Т. 50. – № 5. – С. 1–7. 4. Волова, Т. Г. Синтез сополимеров гидроксибутирата и гидроксивалерата [поли(2ГБ/3ГВ)] бактериями RALSTONIA EUTROPHA / Т. Г. Волова, Г. С. Калачева // Микробиология. – 2005. – Т. 74. – № 1. – С. 1–7. 5. Биосинтез многокомпонентных полигидроксиалканоатов бактериями Wautersia eutropha / Т. Г. Волова, Г. С. Калачева, И. В. Кожевников, А. Штайнбюхель // Микробиология. – 2007. – Т 76. – № 5. – С. 316–319. 6. Вульфсон, Н. С. Масс-спектрометрия органических соединений / Н. С. Вульфсон, В. Г. Заикин, А. И. Микая. – М. : Химия, 1986. – 312 с. 7. Высокоэффективная газовая хроматография / под ред. К. Хайвер. – Дзержинск : ЗАО НТК: Синтеко, 1997. – 134 с. Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие 416 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК, ЭЛЕКТРОННЫЕ И ИНТЕРНЕТ-РЕСУРСЫ К главе 6 8. Гейсс, Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) : в 2 т. : пер. с англ. / под ред. В. Г. Березкина. – М., 1999. – Т. 1. – 405 с. ; Т. 2. – 348 с. 9. Гааль,
