Технологии оцифровки генетической информации В. Зубов Институт теоретической и
advertisement
22.09.2011 Технологии оцифровки генетической информации «Новые поколения методов высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот» В. Зубов Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Пущино Сокращения NGS - Next Generation Sequencing SBS - Sequencing By Synthesis SOLiD - Sequencing By Oligonucleotide Ligation and Detection PGM - Personal Genome Machine NNGS - Next-Next Generation Sequencing Единицы измерения Mb - Megabase (миллион пар оснований) Gb - Gigabase (миллиард п.о.) Tb - Terabase (триллион п.о.) Основные задачи NGS Медицинская генетика Фармакогенетика Этногенетика Эпигенетика Диагностика Трансплантология Криминалистика Биобезопасность Селекционная работа Теория эволюции Происхождение человека Происхождение жизни Основные этапы развития NGS Дореволюционный период • • • • завершение проекта «Геном человека» (3 млрд.$); резолюция Конгресса США о Национальном Дне ДНК (25.04.2003); снижение стоимости секвенирования генома человека до 200 млн.$; исчерпание потенциала Сенгеровской технологии секвенирования. Революция 2005 года – появление NGS I пятилетка (2005…2009 годы) • • • • • 2005 г. - появление первого секвенатора нового поколения; 2006 г. - геном за 20 млн.$ (GS 20, 10…20 млн.п.о. за цикл); 2007 г. - геном за 1 млн.$ (GS FLX, ~ 100 млн.п.о. за цикл); 2008 г. - GA II (Illumina, ~ 3 млрд.п.о.) и SOLiD 2.0 (ABI, ~ 6 млрд.п.о); 2009 г. - цена генома опустилась ниже 100 тыс.$. II пятилетка (2010…2014 годы) 2010 г. - HiSeq 2000 (Illumina, 200 млрд.п.о. за цикл); - геном за 10 тыс.$; - 5500xl (Life Tech., 180 млрд.п.о. за цикл). 2011 г. - геном за 5 тыс.$; - PGM (Ion Torrent, 200 млн. п.о. за цикл). Общие принципы NGS Пробоподготовка основана на получении клонов ДНК Клоны размещаются на стенке проточной ячейки Через ячейку пропускаются растворы реагентов Реагенты участвуют в синтезе ДНК Информация считывается ПЗС- или КМОП-сенсорами Ячейка промывается Основные технологии NGS Фирмы Технология секвенирования Производительность (2011 г.) Продолжительность рабочего цикла Биолюминесцентная ~ 1 Gb ≤ 23 ч Флуоресцентная ДНК-полимеразная 200…500 Gb 5…10 дней Флуоресцентная ДНК-лигазная 200 Gb 5…10 дней Полупроводниковая 200 Mb 2…4 ч Краткая история пиросеквенирования Шведский период • 1985 год – шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали чувствительный люминометрический метод определения пирофосфата; • 1987 год – P. Nyren разработал пирофосфатный метод анализа ДНК-полимеразной активности; • 1988 год – E. Hyman предложил использовать этот метод для секвенирования ДНК; • 1990 год – получен патент на пирофосфатный метод секвенирования ДНК; • 1997 год – создана компания «Pyrosequencing» (до 2008 г. - “Biotage AB”). Американский период • 2000 год – в США учреждена компания «454 Life Sciences»; • 2004 год – «454 Life Sciences» получает от NIH гранты на совершенствование метода геномного секвенирования (2,4 млн.$) и на разработку ультрамикрометода секвенирования геномов (5 млн.$); • • • • • 2005 год – появление коммерчески доступных пиросеквенаторов GS 20; 2007 год – выпуск модели GS FLX; 2009 год – GS FLX Titanium; 2010 год – GS Junior; 2011 год – FLX+. Технология пиросеквенирования Проточные ячейки пиросеквенаторов Пиросеквенаторы FLX и Junior Флуоресцентные технологии (пробоподготовка) http://seq.molbiol.ru/sch_lib_fr.html Получение клонов ДНК SBS / SBL (sequencing by synthesis / sequencing by ligation) N 3 Cy3 Cy3 - XXXX - S ~ P - NNNNN - OH P - NNNNN- P US Pat.№ 7795424 ~ S - XXXX - Cy3 N 3 TCEP tris(2-carboxy-ethyl)phosphine AgNO3 Phosphatase 5’ 3’ 3’ 5’ Форматы проточных ячеек 2х8 2х1 2х4 2х8 Динамика роста производительности флуоресцентных секвенаторов GA IIx SOLiD Jeremy Preston, PhD (Illumina, Marketing Manager, июль 2009 г.) - http://www.solexa.com/seminars/archive/presentations/200907_JPreston.pdf http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm Флуоресцентные секвенаторы HiSeq 1000 HiSeq 2000 5500 5500xl Max-Seq Технология Complete Genomics In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger … Currently, Complete Genomics is operating 24 machines in its Mountain View, Calif., which can each produce one genome per day. … Война клонов Технология Диаметр клонов Количество молекул ДНК 10…30 мкм 1…10 млн. 1…2 мкм 1…2 тыс. 1…2 мкм 2…3 тыс. 2 мкм 2…3 тыс. 0,2…0,3 мкм 200…600 Полупроводниковая технология (“тёмная сторона” секвенирования) Personal Genome Machine (первая встреча) Дина Надыршина и Ирина Гилязова у выставочного стенда компании Ion Torrent (14.06.2010, Швеция, European Human Genetics Conference) Основные этапы технологии An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Принципиальная схема полупроводникового секвенатора An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Сенсорные чипы и проточные ячейки An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Структура pH-сенсорных чипов Ion 314 Ion 318 Ion 316 Ion 320 ? Внешний вид и общее устройство PGM An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing / J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352. Экспансия PGM PGM в Индии PGM в Чили Jonathan M. Rothberg (вождь NGS) http://www.profimedia.si/picture/personalized-medicine-jonathan-m-rothberg/0089893207/ NNGS (наносеквенирование) “НАНО” без “НО” не бывает PacBio RS In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger Pacific Biosciences said today that it has had to cut approximately 130 employees, or 28 percent of its workforce, in response to "uncertainties associated with the economic environment" and a slower-than-projected adoption rate of its PacBio RS. … Основные модели секвенаторов 2005 GS 20 2006 2007 2008 GS FLX GA 1G 2009 2010 Titanium GS Junior GA II……x………e HiSeq 2000 SOLiD 2.0 SOLiD 3 2011 FLX+ HiSeq 1000 SOLiD 4 5500xl 5500 PGM PacBio RS MaxSeq Цены (тыс. $, май 2011 г.) FLX / Junior 500 / 108 + 30 / 16 HiSeq 2000 / 1000 690 / 560 + 55 / 55 5500xl / 5500 595 / 349 + 54 / 54 PGM 49,5 + 18 http://www.molecularecologist.com/next-gen-table-3a/ Скачки с препятствиями $600,000 $500,000 $400,000 $300,000 $200,000 $0 $100,000 PGM 5500 5500xl HiSeq 2000 HiSeq 1000 GA IIx Junior FLX Max-Seq RS MiSeq ? Эволюция технологий NGS 2005 г. – рождение пиросеквенирования 2007…2010 г.г. - развитие флуоресцентных технологий 2011 г. - начало эволюции полупроводниковых технологий 2012 г. - вымирание пиросеквенирования 2013…2014 г.г. - появление секвенаторов эконом-класса Типы секвенаторов Обычный геномный секвенатор Секвенатор эконом-класса Схема полупроводникового секвенатора с замкнутой системой подачи реагентов 2 1 1. Ёмкости с промывочным раствором. 2. Ёмкости с реагентными растворами. 3. Перистальтический насос. 4. Шаговые моторы. 5. Датчики кондуктометра. 6. Многоходовые краны. 7. Проточная ячейка. 8. Сенсорный чип. 9. Контроллер чипа. 10. Контроллер шаговых моторов. 11. Плата кондуктометра. 12. Управляющий компьютер. 1 4 3 5 5 7 4 4 6 6 5 5 8 12 9 10 11 Раздел сфер влияния Флуоресцентное секвенирование Полупроводниковое секвенирование Практика Наука Ре секвенирование геномов Медицинская генетика Фармакогенетика Этногенетика Эпигенетика Диагностика Трансплантология Криминалистика Биобезопасность Селекционная работа Секвенирование геномов de novo Теория эволюции Происхождение человека Происхождение жизни NNGS Экспрессная генодигностика инфекционных болезней (?) Благодарю за внимание
