Краткий курс Next Generation Sequencing (NGS)

Краткий курс
Next Generation Sequencing
(NGS)
В. Зубов
Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН
Пущино
Содержание
Введение
Часть I. Технологии
454-секвенирование
Флуоресцентные
Полупроводниковые
Часть II. Приборы
Roche (GS 20 – FLX – Titanium – FLX+ - Junior)
Illumina (HiSeq 1000 – 2000 – 2500 – MiSeq)
Life Technologies (5500 – xl – W) – Ion Torrent (PGM – Ion Proton)
Конкуренты
Часть III. Наборы
Реагенты
Приготовление библиотек/матриц
Специальные и вспомогательные наборы
Часть IV. Биоинформатика и генетика
Часть V. Альтернативы и перспективы
NNGS
clone Torrent
Заключение
Введение в NGS
Начало постгеномной эры
Завершение проекта «Геном человека»
Национализация Международного Дня ДНК
Инвестиции в инновации
Геномные гонки
Основные участники
Лидеры и аутсайдеры
NNGS
Индивидуальная геномика
День Генома
Рост производительности NGS
Краткая история NGS
Большой приз Геномных гонок – 100 млрд.$
Постгеномная эра
Проект «Геном человека»
1990 – 2003 годы, 3 млрд.$
Национальный День ДНК (США) – с 25 апреля 2003 г.
Revolutionary DNA Sequencing Technologies
Бюджетное фининсирование:
I пятилетка – 100 000$ и 1000$ за геном
2004 г. – 39 млн.$
2005 г. – 31 млн.$
2006 г. – 13 млн.$
2007 г. – 16 млн.$
2008 г. – 20 млн.$
II пятилетка – 1000$ за геном
2009 г. – 19 млн.$
2010 г. – 18 млн.$
2011 г. – 14 млн.$
Внебюджетное финансирование:
> 100 млн.$ -
Краткая история NGS
•
•
•
•
Дореволюционный период
завершение проекта «Геном человека» (3 млрд.$);
резолюция Конгресса США о Национальном Дне ДНК (25.04.2003);
снижение стоимости секвенирования генома человека до 200 млн.$;
исчерпание потенциала Сенгеровской технологии секвенирования.
Революция 2005 года – появление NGS
I пятилетка (2005…2009 годы)
•
•
•
•
•
2005 г. - появление первого секвенатора нового поколения;
2006 г. - геном за 20 млн.$ (GS 20, 10…20 млн.п.о. за цикл);
2007 г. - геном за 1 млн.$ (GS FLX, ~ 100 млн.п.о. за цикл);
2008 г. - GA II (Illumina, ~ 3 млрд.п.о.) и SOLiD 2.0 (ABI, ~ 6 млрд.п.о);
2009 г. - цена генома опустилась ниже 100 тыс.$.
II пятилетка (2010…2014 годы)
2010 г. - HiSeq 2000 (Illumina, 200 млрд.п.о. за цикл);
- геном за 10 тыс.$;
- 5500xl (Life Tech., 180 млрд.п.о. за цикл).
2011 г. - геном за 5 тыс.$ ?;
- PGM (Ion Torrent, 200 млн. п.о. за цикл).
2012 г. - чип Ion 318 к PGM (1 млрд.п.о. за цикл)
- HiSeq 2500; 5500xl W; Ion Proton
2013 г. - геном за 1000$
Успехи и неудачи
+
+/-
-
NNGS
(наносеквенирование)
“НАНО” без “НО” не бывает
День Генома
Dr. James Watson, co-discoverer of the DNA helix
and father of the Human Genome Project, became
the first human to receive the data encompassing
his personal genome sequence at Baylor College of
Medicine in Houston in May
31, 2007.
James Watson (left) receives a digital copy of
his genome sequence from Jonathan Rothberg
in May 2007.
Уотсон в России
(июль 2008 г.)
Динамика роста производительности
флуоресцентных секвенаторов
GA IIx
SOLiD
Jeremy Preston, PhD (Illumina, Marketing Manager, июль 2009 г.) - http://www.solexa.com/seminars/archive/presentations/200907_JPreston.pdf
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/overviewofsolidsystem/index.htm
Стоимость секвенирования генома человека
•
•
•
•
•
•
2007 г. –
2008 г. –
2010 г. –
2011 г. –
2012 г. –
2013 г. –
1 млн.$
100 тыс.$
10 тыс.$
5 тыс.$
9,5 тыс.$
1 тыс.$ ???
Основные задачи NGS
Медицинская генетика
Фармакогенетика
Этногенетика
Эпигенетика
Диагностика
Трансплантология
Криминалистика
Биобезопасность
Селекционная работа
Теория эволюции
Происхождение человека
Происхождение жизни
…
…
Большой приз Геномных гонок
Снижение стоимости секвенирования генома человека
до 1000$ за геном
приведёт к увеличению объёма рынка секвенирования
с 1 до 100 миллиардов долларов
Часть I
Технологии NGS
Общие принципы NGS
Пробоподготовка основана на получении клонов ДНК
Клоны размещаются на стенке проточной ячейки
Через ячейку пропускаются растворы реагентов
Реагенты участвуют в синтезе ДНК
Информация считывается мегапиксельными сенсорами
Ячейка промывается
Основные технологии NGS
Фирмы
Технология
секвенирования
Производительность
(Gb)
Продолжительность
рабочего цикла
(суток)
Биолюминесцентная
1
~ 0,9
Флуоресцентная
ДНК-полимеразная
600
10…14
Флуоресцентная
ДНК-лигазная
200
10…14
1
~ 0,2
(пиросеквенирование)
Полупроводниковая
Пиросеквенирование
Краткая история пиросеквенирования
Шведский период
• 1985 год – шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали чувствительный
люминометрический метод определения пирофосфата;
• 1987 год – P. Nyren разработал пирофосфатный метод анализа ДНК-полимеразной
активности;
• 1988 год – E. Hyman предложил использовать этот метод для секвенирования ДНК;
• 1990 год – получен патент на пирофосфатный метод секвенирования ДНК;
• 1997 год – создана компания «Pyrosequencing» (c 2008 г. - “Biotage AB”).
Американский период
• 2000 год – в США учреждена компания «454 Life Sciences»;
• 2004 год – «454 Life Sciences» получает от NIH гранты на совершенствование
метода геномного секвенирования (2,4 млн.$) и на разработку ультрамикрометода
секвенирования геномов (5 млн.$);
•
•
•
•
•
2005 год – появление коммерчески доступных пиросеквенаторов GS 20;
2007 год – выпуск модели GS FLX;
2009 год – GS FLX Titanium;
2010 год – GS Junior;
2011 год – FLX+.
Основы пиросеквенирования
Технология пиросеквенирования
Реагенты для пиросеквенирования
ДНК-полимераза
Особо чистые дезоксинуклеозидтрифосфаты (T, G и C)
α-тио-дезоксиаденозинтрифосфат (A)
Сульфурилаза + аденозинфосфосульфат
Люцифераза + люциферин
Апираза
Флуоресцентное секвенирование
Пробоподготовка
http://seq.molbiol.ru/sch_lib_fr.html
Получение клонов ДНК
Wildfire technology
Технология Complete Genomics
In Sequense. September 20, 2011. By Monica Heger
… Currently, Complete Genomics is operating 24 machines in its Mountain View, Calif., which
can each produce one genome per day. …
SBS / SBL
(sequencing by synthesis / sequencing by ligation)
Полимеразный синтез ДНК
Лигазный синтез ДНК
N
3
Cy3
Cy3 - XXXX -
S ~ P - NNNNN - OH
P - NNNNN- P
US Pat.№ 7795424
~ S - XXXX -
Cy3
N
3
TCEP
tris(2-carboxy-ethyl)phosphine
AgNO3
Phosphatase
5’
3’
3’
5’
Cluster-SBS Technology
Кластеры ДНК
SOLiD
(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)
2 Base Pair Encoding
Особенности технологий
параллельного секвенирования ДНК
Полупроводниковое секвенирование
Основные этапы технологии
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Реагенты для полупроводникового секвенирования
ДНК-полимераза
Особо чистые дезоксинуклеозидтрифосфаты
Война клонов
Технология
Диаметр
клонов
Количество
молекул ДНК
10…30 мкм
1…10 млн.
1…2 мкм
1…2 тыс.
1…2 мкм
2…3 тыс.
1…3 мкм
2…3 тыс.
0,2…0,3 мкм
200…600
Часть II
Секвенаторы
Пиросеквенаторы FLX и Junior
GS FLX Titanium
(2009 г.)
Количество лунок увеличено до 3,6 млн.
(у GS 20 и FLX - 1,6 млн.)
Количество циклов увеличено в 2 раза
(у GS 20 и FLX – 100 циклов)
Длина чтения - >400 п.о.
(GS 20 - >100 п.о., FLX - >200 п.о.)
Производительность - >0,5 млрд. п.о.
(за 10 часов).
Проточные ячейки пиросеквенаторов
Флуоресцентные секвенаторы
(флуоресцентные микроскопы)
Темнопольный
Эпифлуоресцентный
Форматы проточных ячеек
2х8
2х1 2х4 2х8
Геномные модели
HiSeq 1000
HiSeq 2000
HiSeq 2500
5500
5500xl
5500 W
Клинические модели
MiSeq
Mini-20
Производительность секвенаторов
1 Tbp
100 Gbp
10 Gbp
1 Gbp
Наномонстры
HeliScope™
PacBio RS
Полупроводниковые секвенаторы
PGM
Ion Proton
PGM
Внешний вид и общее устройство PGM
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Принципиальная схема
полупроводникового секвенатора
An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing /
J.M. Rothberg et al. // Nature. – 2011. – Vol.475. – P.348–352.
Экспансия PGM
PGM в Индии
PGM в Чили
Сенсорные чипы и проточные ячейки
Структура pH-сенсорных чипов
Ion 314
Ion 318
Ion 316
Ion Proton I
Контактная площадка PGM
Виды на PGM
Виды на Ion Proton
Чип Ion Proton I
(165 Mp)
Ion Proton Sequencer and Jonathan Rothberg
Jonathan Rothberg – основатель компании
454 Life Sciences
Dr. Rothberg was born in 1963
in New Haven, M.S., M.Phil, and
Ph.D. in biology from Yale University.
Dr. Rothberg is the founder of 454 Life Sciences,
Clarifi Corporation, CuraGen Corporation, The
Rothberg Institute for Childhood Diseases, and the
co-founder and Chairman of RainDance Technologies.
Jonathan M. Rothberg
(вождь NGS)
http://www.profimedia.si/picture/personalized-medicine-jonathan-m-rothberg/0089893207/
Основные модели секвенаторов
2005
GS 20
2006
2007
2008
GS FLX
GA 1G
2009
2010
Titanium
GS Junior
GA II……x………e HiSeq 2000
SOLiD 2.0
SOLiD 3
2011
FLX+
HiSeq 1000
MiSeq
SOLiD 4
5500xl
5500
PGM
PacBio RS
MaxSeq
Смена поколений
Цены
(тыс. $, май 2011 г.)
FLX / Junior
500 / 108
+ 30 / 16
HiSeq 2000 / 1000
690 / 560
+ 55 / 55
5500xl / 5500
595 / 349
+ 54 / 54
PGM
49,5
+ 18
http://www.molecularecologist.com/next-gen-table-3a/
Раздел сфер влияния
Флуоресцентное секвенирование
Полупроводниковое секвенирование
Практика
Наука
Ре секвенирование геномов
Медицинская генетика
Фармакогенетика
Этногенетика
Эпигенетика
Диагностика
Трансплантология
Криминалистика
Биобезопасность
Селекционная работа
Секвенирование геномов de novo
Теория эволюции
Происхождение человека
Происхождение жизни
NNGS
Экспрессная генодигностика инфекционных болезней (?)
Благодарю за внимание