P. obovata - Биокласс Московской гимназии на Юго–Западе №1543

Поиск
диагностических морфологических признаков
и генетических маркеров
у ели европейской (Picea abies)
и ели сибирской (P. obovata)
и определение видовой принадлежности елей
Северной Карелии
Борисова П.
Научныe руководители:
Волкова П.А.
Ильинский В.В.
Введение
P. obovata
Зона
гибридизации
P. abies
P. abies
P. obovata
Зона
гибридизации
ледник
Цель
поиск видоспецифичных
морфологических диагностических
признаков и генетических маркеров у
P. abies и P. obovata и определение
видовой принадлежности елей
Северной Карелии.
Материалы и методы
141 дерево (149 шишек), 10 популяций
Северная
Карелия (4)
Ненецкий АО (1)
Красноярский
край (2)
Германия (3)
Наша работа
P. abies
Морфология
10-16 см
Длина шишек:
P. obovata
4-6 (8) см
коэффициент сужения:
DSL/HS*100
коэффициент вытянутости:
(LS-DS)/HS*100
значение разности коэффициентов
сужения и вытянутости:
P. abies
P. obovata
–5
5
Геометрическая морфометрия –
описание формы без размеров объекта
Классическая морфометрия



Длина шишки, наибольшая
ее ширина и расстояние до
нее от основания шишки;
для чешуи – аналогично
Вторичные показатели:
отношение длины к ширине
и отношение положения
наибольшей ширины к
длине для чешуи и шишки
коэффициенты сужения и
вытянутости и их разность
Геометрическая морфометрия
Распределение исследованных образцов в
пространстве двух первых главных компонент
(классификация по совокупности морфологических
промеров)
ь
Длина шишек для популяций
С. Карелия
P. obovata
P. abies
Отношение длины шишки к ее ширине
С. Карелия
P. obovata
P. abies
Разность коэффициентов
сужения и вытянутости
С. Карелия
P. obovata
P. abies
Распределение исследованных растений в пространстве
двух первых главных компонент для результатов
геометрической морфометрии
Усредненные контуры чешуй
Молекулярно-генетическая часть
P. abies
Постепенный переход
P. obovata
изменение частот аллелей некоторых генов с
запада на восток
Маркеры в
хлоропластной и
митохондриальной ДНК
Разграничивают виды, но важны частоты
маркеров в популяции => нужны
большие выборки
полиморфизм одиночных нуклеотидных замен
(Single nucleotide polymorphism, SNP)
Возможно использовать для различения видов
Материалы и методы
Поиск нужных участков ДНК
Выделение ДНК
(по базе данных)
Подбор праймеров
Получение копий этих
участков (ПЦР)
Электрофорез
определение последовательности
нуклеотидов
Результаты и обсуждение
Выбранные последовательности ДНК
(в скобках – условные названия)
4 участка ДНК –
 два ядерных (220 и 467),
 один митохондриальный (МТ)
 один хлоропластный (TRN)
Подбор параметров ПЦР
58°,
60°,
10 сек
10 сек
62°,10 сек
61°, 10 сек
64°, 5 сек
60°, 5 сек
65°, 5 сек
67°, 5 сек
Полученные последовательности
SNP в 427 позиции для участка для хлоропластного участка.
GB – последовательности GenBank
вид
P. abies
(GB)
P. obovata
(GB)
P. abies
P. obovata Карельские
ели
нуклеотид
С
A
C
A
A
SNP для ядерного участка (220)
GB – последовательности GenBank
Выводы



Найден участок хлоропластной ДНК, который можно
рекомендовать для дальнейшей разработки маркера
для разграничения P. abies и P. obovata. Разработаны
праймеры и подобраны оптимальные параметры ПЦР
для анализа SNP на этом участке.
P. abies, P. obovata различаются длинной шишек и
формой чешуи, описанной как классической, так и
геометрической морфометрией.
Карельские ели, согласно данным геометрической
морфометрии, относятся к P. × fennica, согласно
классической морфометрии – к P. obovata .
Благодарности
Часть материала для настоящей работы
собрана в ходе Беломорской экспедиции Московской
гимназии на Юго-Западе (№1543).
Автор благодарит научных руководителей Волкову
Полину Андреевну и Ильинского Валерия
Владимировича; Л. Абрамову, П. Волкову, П. Петрова,
А. Еськову, Е.Трушину, К. Трушина за помощь в сборе
материала.
Д.В. Ребрикова за ценные указания и помощь в
написании работы, а так же коллектив ЦКП
«Генный полиморфизм» за предоставленную
возможность проведения работы.
Также автор признателен рецензенту Д. Кнорре за
ценные замечания о данной работе и С. М. Глаголеву
за организацию практики.
Спасибо за внимание
Геометрическая морфометрия






Метод тонких пластин
20 равноудаленных точек по всему контуру
Координаты меток – экранный дигитайзера
tpsDig
Координаты эталонной конфигурации,
значения главных, относительных и частных
трансформаций – программа tpsRelw
Усредненные контуры чешуй – программа
tpsSuper
Редактирование и конвертирование файлов
данных – вспомогательная программа tpsUtil
Расположение карельских
популяций
Чупа
биостанция
губа Чупа Кандалакшского залива Белого моря



Анализ главных компонент
Однофакторный дисперсионный анализ
с последущим попарным сравнением
выборок тестом Вилкоксона с поправкой
Бонферрони.
Использовали статистическую среду R
Вид
№
попул
я
ц
и
и
LC
LC/HC
DC/LC
LS/HS
DS/LS
CP
CN
CN – CP
b
62±11
1.92±0.30
0.39±0.10
1.40±0.18
0.69±0.05
43±7
53±11
10±14
c
58±10
1.94±0.25
0.39±0.09
1.31±0.15
0.65±0.06
45±11
56±14
10±17
d
65±12
2.20±0.22
0.39±0.12
1.35±0.13
0.68±0.05
43±9
58±15
15±21
e
57±9
2.01±.28
0.33±0.1
1.36±0.16
0.67±0.05
45±8
59±13
15±15
f
57±9
2.04±0.31
0.34±0.08
1.32±0.19
0.63±0.06
50±13
71±8
21±19
g
61±8
2.17±0.23
0.41±0.0
1.30±0.11
0.71±0.08
37±11
73±8
35±12
h
68±4
1.99±0.48
0.40±0.1
1.42±0.08
0.68±0.08
46±12
62±6
16±14
i
118±13
2.78±0.23
0.40±0.08
1.37±0.13
0.63±0.05
54±20
37±8
-14±13
j
110±18
2.50±0.15
0.40±0.07
1.48±0.13
0.64±0.06
53±10
43±3
-10±11
k
105±10
3.09±0.77
0.34±0.03
1.37±0.13
0.62±0.02
52±3
40±9
-12±6
Карелия
P. obovata
P. abies
значения коэффициента
вытянутости (CP)
коэффициент сужения (CN )
Отношение положения наибольшей ширины
чешуи к ее длине (DC/LC)
Геометрическая морфометрия
Выделение ДНК












ДНК выделяли из высушенной хвои используя метод СТАВ. К 10-20
хвоинкам добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,2 М Tris-HCl pH
8,0, 0,05М EDTA, 2М NaCl, 2% СТАВ), образец вместе с буфером
гомогенизировали в фарфоровой ступке. После проводили очистку
ДНК с помощью стандартной методики фенол-хлороформной
экстракции (Chomczynski, Sacchi, 1987):
Добавляли 400 мкл фенола pH=7,2, хорошо перемешивали.
Добавляли 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1),
хорошо перемешивали.
Центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин (16000 g).
Переносили водную фазу в новую пробирку 1,5мл и добавляли в нее
800 мкл 100% изопропанола, хорошо перемешивали.
Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин.
Полностью удаляли надосадочную жидкость.
Добавляли 400 мкл 70% этанола, хорошо перемешивали.
Центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин
Полностью удаляли надосадочную жидкость и высушивали осадок
при комнатной температуре (не более 10 мин).
Растворяли осадок в 50 мкл TE (Tris EDTA) буфера путем
инкубирования при 65° С с периодическим перемешиванием.
В дальнейшем образцы хранили при температуре – 20° С.
Общий объем смеси для ПЦР на
одну пробирку составлял 25 мкл






17,5 мкл воды
2,5 мкл 10-ти кратного ПЦР-буфера
0,5 мкл раствора dNTP's (25мМ каждого) –
дезоксинуклеотидтрифосфатов
0,15 мкл каждого праймера
1 мкл ДНК
0,5 мкл HS Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген»)
Результаты и обсуждения
Выбранные видоспецефичные
последовательности ДНК
Название
участка
Участок
Номера в GenBank
1 – P. abies
2 – P. obovata
Праймеры/название праймера
467
conserved
ortholog
PgTRX_WS00935.B21_B17
1. EU309976.1
2.EU309990.1
220
conserved ortholog set (COS) PgTRX_20992
1.
EU309947.1
2.EU309961.1
GCTTGCTAAGAGTGGAACCTGTTC
(220-D)
ACGACTTGTTATGCACTGGGCTTG
(220-R)
TRN
isolate ABI2b tRNA-Thr (trnT) gene, partial
sequence; tRNA-Leu (trnL) gene, complete
sequence; and tRNA-Phe (trnF) gene
1.
EU364798.1
2.EF440555.1
TGAATGTAGATTGTAGATTCCTTCAAG
(TRN-D)
GTCCGTAGCGTCTACCGATTTCG
(TRN-R)
MT
NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) gene,
intron 2 and partial cds
1.
EF440449.1
2.
EF440476.1
TCTATAGATAGAGAGATAGTAGCGAG
(MT-D)
CTCAAAGGGCTAGCTAGAAGGTAAG
(MT-R)
set
(COS)
GTCAAGCAGGCCACGTGGGTC (467-D)
AGTTGGAGGACCTAGGGAGGAG (467-R)