НАДЕЖДЫ И ОПАСНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Выполнила: Дзуцева Элина 202 группа

НАДЕЖДЫ И ОПАСНОСТИ
ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
Выполнила: Дзуцева Элина
202 группа
Педиатрический факультет
Генная терапия (ГТ)
– совокупность генно-инженерных
и медицинских методов,
направленных на внесение изменений
в генетический аппарат соматических клеток человека
путем введения в организм
рекомбинантных генетических конструкций
с лечебной целью
Стратегии ГТ
IN VIVO
EX VIVO
Классификация ГТ
По типу векторной системы
I. Вирусная
1. РНК – содержащие вирусы :
• ретровирусы (онкоретровирусы,
лентивирусы и др.)
II. Невирусная
1. Прямая инъекция ДНК в клетку,
ткань, орган
2. Липофекция
3. Электропорация
2. ДНК – содержащие вирусы :
• аденовирусы
• вирус герпеса
• аденоассоциированные вирусы
4. «Генное ружье»
5. Рецептор-опосредованный эндоцитоз
I. Вирусные векторы
Преимущества
+ трансдукция большого
числа клеток
+ тропизм
+ устойчивость к деградации
лизосомами
Недостатки
– иммуногенность (аденовирусы, герпесвирусы)
– потенциальная канцерогенность (ретровирусы)
I. Вирусные векторы
(на примере ретровируса)
• gag кодирует большой белок-предшественник
всех основных структурных белков вирусной сердцевины
• pol кодирует каталитические белки (ревертаза, протеаза, интеграза)
• env кодирует гликопротеины вирусной оболочки
• Ψ
участок, необходимый для упаковки РНК в нуклеокапсид
I. Вирусные векторы
Схема получения рекомбинантной ГТ-конструкции
на основе ретровирусного вектора
в клетке «упаковочной» линии
ψ
•
Транскрипция «терапевтического»
гена в ядре под контролем
промотора в 5’-LTR
и трансляция в цитоплазме белков
Gag, Pol, Env, кодируемых
соответствующими генами вируса
в разных хромосомах
•
Образование вирусного капсида и
упаковка двух цепей РНК и
ревертазы
•
Высвобождение из клетки вирионов
с «терапевтическим» геном
I. Вирусные векторы
1. Векторы на основе ретровирусов
РНК-геном
Преимущества
• не иммуногенны
• постоянная экспрессия трансгенов
(в геноме)
Недостатки
• инфицирование только делящихся клеток
• случайное включение в геном
• потенциальная канцерогенность
• низкий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий
• небольшая клонирующая емкость (до 8 - 10 т.п.н.)
I. Вирусные векторы
2. Векторы на основе аденовирусов
Преимущества
днДНК-геном
• способны инфицировать
неделящиеся клетки
• большая клонирующая емкость
(в настоящее время до 28 т.п.н.)
• высокий титр вирионов,
выделяемых из упаковочных линий
• не встраиваются в геном
Недостатки
• иммуногенность (иммунный ответ развивается через 2-3 инъекции)
• кратковременная экспрессия трансгена (не интегрирован в геном)
I. Вирусные векторы
3. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов
Преимущества
онДНК-геном
• не иммуногенны
• встраиваются в специфический сайт
в хромосоме 19
• не патогенны
• способны инфицировать
неделящиеся клетки
• длительная экспрессия трансгена
Недостатки
• небольшой размер клонируемой ДНК (до 4.5 т.п.н.)
II. Невирусные системы доставки
Прямая инъекция ДНК
Липофекция
Электропорация
«Генное ружье»
Рецептор-опосредованный эндоцитоз
II. Невирусные системы доставки
Преимущества
+ относительная безопасность
+ отсутствие иммунного ответа
+ простота применения
Недостатки
- низкая эффективность трансфекции
- низкий уровень экспрессии трансгена
II. Невирусные системы доставки
• Внутримышечная инъекция ДНК-вакцины
• Подкожное введение «генным ружьем»
Недостаток
• Низкий уровень экспрессии трансгена
II. Невирусные системы доставки
• Липофекция с помощью катионных липосом
Недостаток
• Возможность деградации
в лизосомах
II. Невирусные системы доставки
• Рецептор-опосредованный эндоцитоз
а) ДНК ковалентно связывается с поликатионом (поли-Lлизин)
и лигандом (моносахарид, дисахарид или гликопротеин),
образуя ДНК-комплекс (in vitro)
II. Невирусные системы доставки
• Рецептор-опосредованный эндоцитоз
б) ДНК-комплекс взаимодействует
со специфическим рецептором
на поверхности клетки и путем эндоцитоза
попадает внутрь клетки, а затем в ядро (in
vivo)
Недостаток
• возможность деградации в лизосомах
Частота современного использования
разных типов векторных систем в ГТ
Новейшие подходы в ГТ
РНК-интерференция
(непрямая коррекция генетических нарушений)
Прямая коррекция генетических нарушений
→ гомологическое замещение малым фрагментом (SFHR)
РНК-интерференция
• непрямая коррекция генетических нарушений
Области применения ГТ в настоящее время
Лечение наследственных заболеваний с помощью ГТ
Первое применение ГТ –
лечение тяжелого комбинированного иммунодефицита,
связанного с мутацией гена аденозиндезаминазы (ADA)
(20 сентября 1990 года)
Фазы клинических испытаний генотерапевтических препаратов
Фаза I → оценка токсичности генной конструкции
Фаза II → ограниченные испытания на небольшом контингенте больных
Фаза III → широкомасштабные клинические испытания
Современное состояние протоколов по ГТ
ГТ-протоколы, проходящие II/III фазы клинических испытаний
• Тяжелый комбинированный иммунодефицит (аденозиндезаминаза)
• Семейная гиперхолестеринемия (рецептор липопротеинов низкой
плотности)
• Гемофилия В (фактор IX)
• Болезнь Гоше-сфинголипидоз (глюкоцереброзидаза)
• Муковисцидоз (СF-трасмембранный фактор)
Основной подход
• заместительная терапия
Генотерапия рака
3 основных подхода:
1. Иммунотерапия рака
2. Подавление роста раковых клеток введением генетических
конструкций
3. Вирусный онколизис
Частота использования различных подходов к ГТ рака:
I. Иммунотерапия рака
Использование ГТ- конструкций,
стимулирующих иммунный (в основном клеточный)
противоопухолевый ответ
Для создания рекомбинантных генетических конструкций используют гены:
• Антигенов
• Эпитопов
• Комплекса MHCI; фактора B7
• Цитокинов
• Рецепторов Т-клеток
Стратегии антиопухолевой иммунотерапии
«Генетическая коррекция» иммуногенности клеток опухоли
– ДНК-вакцинация (презентация чужеродного антигена);
– Введение генов комплекса гистосовместимости (MHCI);
– Введение гена костимулирующего фактора T-клеток (B7)
Ex vivo
In vivo
Стратегии антиопухолевой иммунотерапии
• Генетическая модификация клеток иммунной
системы
II. Подавление роста раковых клеток введением в них
генетических конструкций (ДНК и ингибиторные РНК)
(или в нормальные клетки для защиты от противоопухолевой терапии)
Гены-супрессоры опухоли
Суицидные гены
Ингибиторы онкогенов
Факторы антиангиогенеза
Ингибиторы циклинов
Гены, повышающие чувствительность
клеток опухоли к лекарственным соединениям
Гены транспортеров лекарственных соединений
(введение, например, в клетки костного мозга)
Гены-супрессоры опухоли
До 80 % видов онкологических заболеваний
связано с нарушением активности гена р53
Функции гена р53 в клетке
гены-мишени
АПОПТОЗ
p53
АРЕСТ
КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
• bax
• fas
• KILLER/DR5
• NOXA
• p53AIP
• PUMA
• 14-3-3σ
• p21/waf1
циклины
Ингибиторы онкогенов
Мутация в гене Ras может привести
к конститутивной работе
сигнальной системы запуска деления,
а, следовательно,
к стимуляции пролиферации клеток
и ингибированию апоптоза
Основные подходы к блокированию онкогенного
Ras-зависимого сигнального пути:
• ингибирование экспрессии белка Ras с помощью рибозимов,
антисмысловых РНК и ДНК-олигонуклеотидов
• ингибирование экспрессии генов, стоящих ниже в сигнальном пути
• препятствование встраиванию белка Ras в клеточную мембрану
Факторы антиангиогенеза
Ангиогенез – процесс формирования новых кровеносных сосудов;
играет существенную роль в канцерогенезе:
питание раковых клеток и снабжение их кислородом
Клетки опухоли характеризуются
состоянием гипоксии
и повышенной экспрессией
ангиогенных факторов (хемокинов)
ГТ-подходы к антиангиогенезу :
• подавление экспрессии генов,
кодирующих хемокины
• активация естественных
ингибиторов ангиогенеза
• введение мутантного гена рецептора
хемокинов в клетки эндотелия сосудов, окружающих опухоль
Гены транспортеров лекарственных соединений
Одним из подходов в ГТ рака является защита нормальных тканей
от цитотоксического действия лекарственных препаратов,
применяющихся при химиотерапии
Основные способы повышения специфичности
и эффективности ГТ онкологических заболеваний
• Использование специфичных и/или индуцибельных
промоторов для экспрессии терапевтических генов
→ опухолеспецифичные промоторы
→ тканеспецифичные
→ промоторы, индуцируемые радиоактивным облучением
→ промоторы, индуцируемые в условиях гипоксии
• Использование «bystander» эффекта
Проблемы ГТ
• Небезопасность генно-инженерных конструкций
• Невысокая эффективность векторных систем
• Кратковременная экспрессия «терапевтического гена»
• Инактивация ГТ-конструкций защитными системами клетки
Актуальные задачи ГТ
• Разработка индивидуальных алгоритмов ГТ
наследственных и ненаследственных заболеваний
• Повышение эффективности векторных систем, используемых в ГТ
• Регуляция места, уровня и времени экспрессии трансгенов
• Разработка систем переноса ГТ-конструкций в митохондрии
• Повышение эффективности ДНК-вакцин для лечения
инфекционных и онкологических заболеваний
ГТ человека (примененные протоколы) в1989-2008 г.г.
Распространение протоколов клинических испытаний по ГТ (на всех стадиях)
 По континентам
По странам 
ГТ в России
• В России 5-10 лабораторий, где ведутся экспериментальные исследования
• Основные проекты по ГТ в России:
→ ГТ опухолей (противоопухолевые вакцины)
→ ГТ СПИДа (блокирование экспрессии генов ВИЧ)
→ ГТ ишемических болезней сердца (индукция ангиогенеза)
→ ГТ мышечной дистрофии Дюшена (заместительная терапия)
Заключение
ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний
Эффективность ГТ нуждается в повышении
Дальнейшее развитие и широкое использование ГТ неизбежно
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ