Е. В. Саватеева-Попова Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт- Петербург
advertisement
Новая глава в нейробиологии: некодирующие РНК и эпигенетические механизмы формирования памяти Е. В. Саватеева-Попова Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, СанктПетербург Pavlov Institute of Physiology, St. Petersburg Pavlov’s lab in Koltushi and monument to Gregor Mendel Martin Heisenberg Наука должна быть инфекционной Если что-то имеет смысл, то только в свете поведения Недавние открытия в нейробиологии и генетике – не только переворот в традиционных представлениях, но и слияние казалось бы разных наук При попытке понять механизмы синаптической пластичности - long term potentiation (LTP) и long term depression (LTD) лежащих в основе обучения и памяти, нам приходится обращаться к большому спектру чисто генетических проблем: Нейрон-специфичная транскрипция, Эпигенетическое ремоделирование хроматина, транспорт mRNAs из сомы для локальной трансляции в удаленных сайтах аксонов и дендритов Long-term potentiation (LTP) – основополагающая экспериментальная модель формирования разных по продолжительности стадий памяти Выделяют по крайней мере три последовательных, но различных по механизмам фазы, для развития которых используются разные компартменты нервной клетки и разные уровни регуляции генетических процессов Molecular mechanisms that contribute to the regulation of the three sequential stages of (LTP/LTD) I. Early Phase III. Late Phase II. Intermediate Phase ~2 hours ~6 hours molecular mechanisms protein modification (eg. phosphorylation) mRNA editing, stability, translation and splicing cellular requirements translation independend translation dependent/ transcriptoin independend duration ~10 hours+ transcriptional regulation and epigenetic modification transcription dependent Эпигенетические изменения – ацетилирование хроматина и метилирование ДНК - необходимы для регуляции сложных сетей экспрессии генов при формировании и сохранении памяти Специфически генетическая задача изучения организации хроматина и его ремоделирования –привела к постановке нового популярного вопроса “How many remodelers does it take to make a brain?” (Brown et al., 2007) Возникла проблема иерархической организации генетического материала в ядре нервной клетки Как положение гена в динамичной трехуровневой иерархической системе 1. 2. 3. последовательность ДНК – конформация хроматина – пространственная организация ядра – определяют его активность и сказываются на когнитивных способностях животных и человека? Какую роль выполняет актин, если он сопрягает все иерархические уровни организации генома? Chromosome structure RNP assembly Actin Transcription Актин в ядре: Transport Nucleus Cytoplasm Cytosceleton компонент комплексов ремоделирования хроматина выстилает ядерную мембрану, определяя точки прикрепления хромосом и образование ядерных пор входит в состав RNP комплексов взаимодействует со всеми тремя РНК полимеразами эукариот Cascade of actin remodeling AMPAreceptor Glutamate KYNA Feed-back regulation of receptor functioning Rho NMDAreceptor ROCK Rac neureguli n LIMK1 PAK1 Dia Stress Heat Shock PIP F actin agnostic cofilin Ca2+ А А D Т P P profilin nucleators Barbed (+) end Chromatin remodeling (SW12/SNF2) Induction of recombination А Т P А D P А D P G actin Activation of transcription (SRF-factor) А D P А D P Pointed (-) end Remodeling of dendritic spines (synaptic plasticity, learning/memory) Synthesis of neurotrophic factors A Novel Model for an Older Remodeler: The BAF Swap in Neurogenesis 0 Aigner et al., Neuron 55, 2007 Комплекс ремоделирования хроматина BAF, также называемый SWI/SNF, состоит из каталитической субъединицы (Brg/Brm) , дополнительных субъединиц BAF250, BAF170, BAF155, BAF60, BAF57, BAF47и актина Специфичные для нервных клетокпредшественников и стволовых клеток при их пролиферации комплексы npBAF содержат две дополнительные субъединицы, BAF45a и BAF53a (показаны красным) Регуляция нейрогенеза Во время дифференцировки нейронов они заменяются на гомологичные нейронспецифические белки BAF45b/c, и BAF53b (зеленым), формируя постмитотический нейрон-специфичный комплекс nBAF. Combinatorial assembly of neurons: from chromatin to Dendrites de la Torre-Ubieta and Bonni Trends in Cell Biology, 2008,18, 48-51 Нейрональная активность – ток ионов Са через потенциалзависимые каналы или NMDA рецепторы – вызывает ремоделирование хроматина и регулирует морфогенез дендритов BMP gradients steer nerve growth cones by a balancing act of LIM kinase and Slingshot phosphatase on ADF/cofilin Wen et al., The Journal of Cell Biology, Vol. 178, No. 1, July 2, 2007 107–119 Для конуса роста 4–8-часнейронов BMP7 действует как аттрактант, активируя LIMK1-каскад. Для конуса роста 12-час нейронов, BMP7 действует как репеллент, используя Ca2+ зависимый сигнальный путь, инициируемый TRP каналами. Кофилин – общая мишень обоих путей при локальной регуляции актинового цитоскелета What proteins are the interacting partners of LIMK1? BMPR2 YWHAZ CFL1 PXN DSTN LIMK1 PARK2 LATS1 PAK4 LOXL2 BMPR2 Bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) CFL1 Cofilin 1 (non-muscle) DSTN Destrin (actin depolymerizing factor) LATS1 LATS, large tumor suppressor, homolog 1 (Drosophila) LOXL2 Lysyl oxidase-like 2 Drosophila Dmloxl-2) PAK4 P21 protein (Cdc42/Rac)activated kinase 4 PARK2 Parkinson disease (autosomal recessive, juvenile) 2, parkin, Drosophila PXN Paxillin YWHAZ Tyrosine 3monooxygenase/tryptophan 5monooxygenase activation protein, zeta polypeptide Drosophila gene leonardo, affects olfactory learning) LIMK1 isoforms in D.melanоgaster Isoform С Isoform D LIM1, LIM2 и PDZ domains inhibit the LIMK1 activity in vivo (Birkenfeld, Betz, Roth, 2001; Edvards, Gill, 1999) LIM PDZ Required for protein-protein interactions and are often located in the same molecule with PDZ Interaction modules, key players in signal trunsduction, recognize the proteins of the receptor families (NMDA NR2/D, AMPA, GluR2, mGluR5, beta-AR, melatonin) and ion channels (Shaker K+, voltage-gated Na+, N-type Ca2+) A new paradigm for developmental biology Mattick JS Journal of Experimental Biology 210, 1526-1547 (2007) В последние 3 года наблюдается взрыв исследований в направлении, противоречащем устоявшейся молекулярногенетической парадигме: обнаружено, что лишь 1.2% генов эукариот кодируют белки, остальная же часть генома генерирует различные классы некодирующих, нкРНК. Согласно с «Новой Парадигмой» (Mattick, 2007), уже известные классы нкРНК и те, что еще предстоит обнаружить, в норме и патологии обеспечивают регуляцию экспрессии генов, кодирующих белки Взаимодействие двух «миров» – РНК и белков – основа гибкой взаимосвязи генов с окружающей средой, что необходимо для функционирования нервной системы (Mercer et al., 2008) Многие иРНК, в частности, кодирующие субъединицы рецепторов NMDA, GluR локализуются в дендритах, и их зависимая от нкРНК локальная трансляция осуществляется в ответ на нейрональную активность, создавая основу для синаптической пластичности при формировании средне- и долгосрочной памяти. The Genetic Signatures of Noncoding RNAs Mattick JS, PLoS Genet. 2009 5(4) The Eukaryotic Genome as an RNA Machine Amaral et al., SCIENCE VOL 319 28 MARCH 2008 Schematic showing known and putative extracellular signaling pathways mRNA (blue) and ncRNA (red) are (a) transcribed in the donor cell Упаковка РНК в пузырьки и их транспорт (b) для выведения в межклеточное пространство;. (d) Пузырьки сливаются с клеткой-мишенью, высвобождая свое содержимое; (e) РНК может либо транслироваться в клетке-доноре или выполнить регуляторную функцию для (f) эпигенетических модификаций хроматина; I(g)сигналы внеклеточных РНК (siRNAs или miRNAs могут передаваться через плазматическую мембрану посредством специфических рецепторов, таких как Sid-1; (h) в клеткереципиенте это может приводить к ингибированию трансляции или деградации мРНК ncRNA Описание miRNA MicroRNAs (miRNAs) маленькие (21–23 nt) одно-цепочечные РНК, регулирующие экспрессию генов за счет частичной комплементрности пар оснований со специфическими мРНК . Это ингибирует трансляцию и в некоторых случаях приводит к деградации мРНК siRNA Small interfering or silencing RNAs (siRNAs) маленькие двуцепочечные РНК tкоторые посредством РНК-интерференции (RNAi) осуществляют down-регуляцию специфического гена, содержащего комплементарную последовательность. Это приводит к эпигенетическим изменениям экспрессии гена-мишени snoRNA Small nucleolar RNAs (snoRNAs) маленькие (w70–240 nt) РНК управляющие метилированием и псевдоуридилированием рРНК и других РНК. SnoRNAs содержат фнтисенс-последовательность (10– 20), комплементарную последовательности мишени рядом с основанием для модификации long ncRNAs Long ncRNAs длинее, чем 200 nt с малой возможностью кодировать белки или полным ее отсутствием. Регулируют экспрессию генов за счет разных механизмов piRNAs Piwi-interacting RNA (piRNA) маленькие (27–30 nt) РНК, половых клеток дрозофилы и позвоночных . Осуществляют модификацию хроматина и подавление экспрессии транспозонов. RNAi pathways in Drosophila (a) siRNA-путь антивирусной защиты. Dicer-2 разрезает dsRNA до siRNAs, которые включаются в состав Argonaute-содержащего RISC комплекса, направляющего РНК на деградацию RISC - RNA-induced silencing complex Ago - белок Argonaute, каталитическое ядро RISC-комплекса, связывается с короткими РНК и часто проявляюет RNase H-подобную активность RNAi pathways in Drosophila miRNA-путь Первичные miRNAs после транскрипции при действии Drosha и Dicer-1 превращаются в зрелые miRNAs, поступающие в RISCкомплекс. Его связывание с мРНК совместно с другими факторами подавляет трансляцию ферменты Dicer и Drosha– члены семейства RNaseIII,нарезающи[dsRNA на короткие РНК RNAi pathways in Drosophila Пинг-понг модель «молчания» транспозонов (TE) в линии половых клеток. Aubergine и Argonaute-3 (Argonautes семейства Piwi)поочередно расщепляют смысловую и несмысловую нити –транскриптов транспозонов, направляемые действием piRNAs . Предположительно, piRNAs участвуют в сборке гетерохроматина, тем самым обеспечивая «молчание» попадающих в гетерохроматин генов Predicted secondary structure of putative miRNA precursors and organization of miRNA gene clusters Mourelatos Z et al. Genes Dev. 2002;16:720-728 ©2002 by Cold Spring Harbor Laboratory Press miR-134 в регуляции трансляции LIMK1 в зависимости от уровня BDNF При отсутствии BDNF трансляция LIMK1 блокируется miR-134 опосредованно через сайленсинг комплекс (SC), что ведет к уменьшению шипиков дендритов. В присутствии BDNF активируется трансляция LIMK1 и рост шипиков дендритов (Schratt et al., (2006). A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development. Nature, 439, 283–289 ). Нейротрофические факторы, высвобождаемые при синаптической пластичности регулируют локальную трансляцию. Три BDNF-регулируемых мРНК (discs large homologue 2 (DLG2), Neurod2, LIMK1, ключевой фермент ремоделирования актина, содержат консервативную последовательность в 3’UTR частично комплементарную miR134. Локальная трансляция в аксонах, необходимая для направленного path-finding, аналогична LTP и LTD Белки сигнального каскада ремоделирования актина (кофилин) Молекулярные шапероны HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, grp75 и grp78/BiP Белки, участвующие в патогенезе нейродегенеративных заболеваний Почему при синаптической пластичности выгоднее использовать мРНК, а не белки? Поскольку РНК может служить матрицей для теоретически безграничной трансляции, выгоднее сохранять матрицы, нежели неактивные белки Регуляция белков на уровне трансляции мРНК по сравнению с пост-трансляционной модификацией белков является более гибкой, поскольку активность белка регулируется произвольными последовательностями мРНК, а не конститутивными доменами белка Белки не всегда содержат информацию, необходимую для их локализации При локальной трансляции локальный сплайсинг мРНК создает дополнительный уровень регуляции белков Зачем использовать некодирующие РНК? Последовательность нуклеотидов в РНК может определять большую точность и специфичность взаимодействия, нежели достигаемые изменением третичной структуры белков Поэтому нкРНК при функционировании нервной системы являются устройством связи между цифровой информацией нуклеиновых кислот ядра и аналоговой информацией клеточных белков Current Rules In the mammalian brain as elsewhere, miRNAs subserve multiple fundamental biological roles. Many miRNAs are thought to interact with thousands of different targets. Posttranscriptional RNA editing may change mRNA target specifity. Current Rules One gene – different miRNAs One miRNA – different genes current needs of the organism individual experience Present view synaptic plasticity neurotrophic factors (BDNF) environmental requirements local translation in dendrites of “dormanr” mRNAs for LIMK1, NMDAR, GluR intermediate memory remodeling of the spatial structure of the nucleus due to bringing together heterochromatic chromosomal regions transport of “dormant” mRNAs in complex with miRNAs epigenetic chromatin change for long-term memory “genome disorders” deletion/duplication syndromes Для изучения этого нового, мало исследованного феномена регуляции посредством нкРНК требуются и новые модели Такой моделью могут служить спонтанные и мутантные варианты локуса agnostic дрозофилы с разной структурой гена LIMK1 и необычной последовательностью ДНК рядом с 3’UTR гена LIMK1, потенциально способной генерировать новые нкРНК (Медведева и др., 2008) Localization of the agnostic locus within the X-chromosome 11AB in situ hybridisation on polytene chromosomes of P40 (probe P[w+]) Df(1)112: 38.1-41.0 ts-lethality Ca2+/calmodulin-dependent PDE activity ether sensitivity/resistance mitotic index of larval brain cells defective oogenesis Deletion mapping. The length of rectangles [with the exception of microdeficiency Df(1)112, for which the limits of recombinational mapping are presented] indicate the X-chromosome regions spanned by deficiencies uncovering and not uncovering manifestations of mutant phenotypes of the agnostic locus mutations Am J Med Genet 2000 97(2):164-71 Donnai D, Karmiloff-Smith A. Williams syndrome: From genotype through to the cognitive phenotype Williams syndrome arises due to a contiguous gene deletion at 7q11.23. The WBS deletion is flanked by large repeats containing genes and pseudogenes The deletions arise spontaneously by inter- or intrachromosomal crossover events within misaligned duplicated regions Cognitive disabilities - gross deficiencies in visual-spatial processing arise due to LIMK1 hemizygosity Иммунохимический анализ распределения LIMK1 по зонам мозга самок 220 C 290 C CS Df(1)112/CS agnts3 Первичные антитела к LIMK1, разведение 1:500 вторичные конъюгированы с флюоресцеином (FITC), разведение 1:400 (goat LIMK1, donkey-anti-goat IgG-FITC, donkey serum, Santa Cruz) Иммунохимический анализ внутриклеточного распределения LIMK1 и р-кофилина а,б – первичные CS agnts3 CS agnts3 CS,ТШ agnts3 ТШ CS,ТШ agnts3 ТШ антитела к LIMK1, вторичные конъюгированы с FITC в,г – первичные антитела к р-кофилину, вторичные конъюгированы с Rhodamin Вестерн-блот анализ содержания двух изоформ LIMK1 в головах самцов Canton-S и agnts3 измерения интенсивности полос в программе GelAnalyzer (n=3, p≤0,05) Video-registration of Drosophila larval behaviour The monitoring system consists from chambers (B) to place the larvae Chambers are lighted up by luminescent lamp (A) Video camera (C) is installed over the plates, and connected to the computer (D) Video data obtained by camera are analyzed by special software, which determines the larval position and records the tracks of larval movements (E) Statistical analysis of all tracks is performed to reveal distinguishes (F) Tracks before and after heat shock in wild type and agnts3 larvae CS females CS females HS agn females 50 50 45 45 40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 agn females HS 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Conditioned courtship suppression paradigm Stages of courtship in Drosophila melanogaster Learning acquisition and memory retention (conditioned courtship suppression paradigm) Iong-term memory intermediate memory 250 C, adult 250 C, adult HS adult CS CS agnts3 agnts3 HS adult # Learning, 0 hr Test immediately after 5-hrs long massive training in 5-day-old males Memory, 3 hr Test 2 days after massive training in 7-day-old males Test 8 days after massive training in 13-day-old males CS males NERVE CELL BODIES BRAIN STRUCTURE 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 w ithout inclusions inclusions NERVE CELL PROCESSES 1,0 0,8 0,6 0,4 BRAIN CONGO RED POSITIVE INCLUSIONS 0,2 0,0 w ithout inclusions inclusions agnts3 males * * * * * * THUS WITHOUT HS NERVE CELL PROCESSES >> NERVE CELL BODIES >> EYE FACETS AFTER HS EYE FACETS >> NERVE CELL PROCESSES >> NERVE CELL BODIES Частота появления особей с Конго Ред позитивными включениями в линиях CS и agnts3 в норме и при ТШ 100 % личинок с агрегатами 90 80 70 60 * 50 40 30 20 10 0 CS agnts3 , ТШ CS, ТШ agnts3 agnts3, ТШ agnts3 У agnts3 повышенное содержание LIMK1 и рts3 agn , ТШ кофилина приводит к сбоям в динамике актинового цитоскелета и формированию амилоидных агрегатов, в состав которых вероятно входит актин. Cytoskeletal Pathologies of Alzheimer Disease Bamburg and Bloom Cell Motil Cytoskeleton 2009 66(8):635-49 Due to the fact that the giant polytene chromosomes can be found in larval tissues of Drosophila, especially in salivary glands, it was possible to create detailed and highly correlated genetic, cytogenetic and molecular maps, down to the nucleotide level (Kafatos et al, 1991). This was the first step in Drosophila genome Project Источником малых РНК является гетерохроматин – ключевой фактор эпигенетической регуляции генной экспрессии, поведения хромосом, функций нервной системы в норме, патологии и в эволюционных преобразованиях Политенные хромосомы слюнных желез дрозофилы Х-хромосома Район интеркалярного гетерохроматина 11АВ – место локализации гена для LIMK1 Частота эктопических контактов в 2L-плече Alleles of the agnostic locus differently determine: the chromosome architecture in the region of the locus location; chromosome packaging; features of homologous and nonhomologous pairing, implemented in different rates of unequal recombination heterochromatic “gene silencing” Asynapsis Example of asynapsis Differences in frequency of asynapsis in individual chromosomes A/T- богатые районы рядом с геном LIMK1 дрозофилы могут служить для: Генерации неравным кроссинговером делеционных и дупликационных вариантов гена Местом встройки транспозонов (The National Centre for Biotechnology Information, NCBI) Инсерция генетического материала в 3' UTR . гена LIMK1 у agnts3 Положение выбранных праймеров указано относительно последовательностей ДНК, РНК и белка возможные изменения в районе локализации 3'-области гена limk1 гипотетическая шпилечная структура, сайт связывания miR-134 в 3'-UTR Limk1, инсерция и возможное место ее встраивания, а так же предполагаемая мРНК считывающаяся за стоп-кодоном. Новые классы некодирующих РНК Хотя у дрозофилы не обнаружены эндогенные siRNAs, они могут быть производными длинных генов со шпилечной структурой long hairpin RNA genes (hpRNAs) hpRNA путь дрозофилы – это гибрид между каноническими факторами РНК интерференции (Dicer2, Hen1 известный как CG12367 м Argonaute 2) и каноническим miRNA -фактором (Loquacious) для генерации siRNAs. (Okamura et al., (2008). The Drosophila hairpin RNA pathway generates endogenous short interfering RNAs. Nature, 453, 803-6. Identification and target prediction of miRNAs specifically expressed in rat neural tissue You-Jia Hua et al, BMC Genomics 2009, 10:214 Current rules One gene – different miRNAs One miRNA – different genes NAME OF MIRNA MicroInspector: a web tool for detection of miRNA binding sites in an RNA sequence: 13 dme-miRs dme-miR-316 dme-miR-9b dme-miR-210 dme-miR-306star dme-miR-275 dme-miR-184 dme-miR-954 dme-miR-973 dme-miR-990 dme-miR-306star dme-miR-306star dme-miR-1016 dme-miR-190 Insertion might disrupt miR-target The hair-pin itself might generate mi-Rs: TargetscanFly dme-miR-973: 25 conserved targets, with a total of 27 conserved sites and 11 poorly conserved sites Function of target genes: signal transduction; microtubule cytoskeleton organization; actin filament-based process dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a total of 419 conserved sites and 102 poorly conserved sites dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a total of 419 conserved sites and 102 poorly conserved sites Function of target genes: calmodulin binding; GTP binding small GTPase mediated signal transduction Rho protein signal transduction actin cytoskeleton mRNA binding; mRNA 3'-UTR binding RNA polymerase II chromatin architecture Epigenetics axon guidance olfactory behavior Learning/memory dme-miR-1014: 388 conserved targets, with a total of 419 conserved sites and 102 poorly conserved sites Some well known target genes: Cyclic-AMP response element binding protein A Dmel\CrebA Adenylyl cyclase 78C dunce, 3',5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity Camta, Calmodulin-binding transcription activator Pde1c Phosphodiesterase 1c Su(var)3-9 5-HT1B Таким образом: Возможно, что нарушения в 3’UTR у agnts3 сказываются на miRNA –зависимой регуляции гена agnostic за счет дефектности комплементации между мРНК для LIMK1 и miRNA В норме связывние miRNA с 3’UTR мРНК предотвращает терминацию транскрипции, вызывая деградацию транскрипта Этот предполагаемый дефект комплементации у agnts3 может приводить к увеличению числа транскриптов LIMK1, которые, в отличие от дикого типа, более успешно пройдут через аппарат трансляции Ekaterina Nikitina Gennady Zakharov Learning/ memory Computer modeling Dmitry Molotkov Molecular biology Julia Dolgaya Brain histology Alexander Zhuravlev Computer modeling biochemistry Lab of Neurogenetics Alena Kamynskaya Sound production Professor Andrey Popov Tatijana Payalina Larval locomotion Sound production Sechenov Institute of evolutionary physiology and biochemistry Anna Medvedeva Cytogenetics
