Erwinia amylovora

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ
И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ»
(ФГБУ «ВНИИКР»)
УТВЕРЖДАЮ
Директор ФГБУ «Всероссийский
центр карантина растений»
(ФГБУ «ВНИИКР»)
_______________ У.Ш. Магомедов
«___» __________________ 2014 г.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА КЛАССИЧЕСКОЙ ПЦР
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ОЖОГА ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР
Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.
В РАСТИТЕЛЬНОМ ЭКСТРАКТЕ
(В СООТВЕТСТВИИ СО STÖGER ET AL., 2006)
(отчет)
Москва - 2014 г.
Отчет по теме «Валидация метода классической ПЦР для выявления
возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et
al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006)»
подготовлен младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и
молекулярных
методов
бактериологии
и
К.П. Корневым,
А.А. Кузнецовой,
молекулярных
младшим
методов
научным
заведующим
ФГБУ
лабораторией
«ВНИИКР»
сотрудником
к.б.н.
лаборатории
бактериологии и молекулярных методов И.Н. Писаревой, младшим научным
сотрудником
лаборатории
С.И. Приходько,
бактериологии
младшим
научным
и
молекулярных
сотрудником
методов
лаборатории
бактериологии и молекулярных методов И.М. Игнатьевой, младшим
научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов
М.Б. Баландиной.
Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ФГБУ
«ВНИИКР» (протокол № ____ от «______» _________ 2014 г.).
Редактор – Т.В. Артемьева.
2
Оглавление
Введение……………………………………………………………………….. 4
1. Материалы и методы исследований……………………………………
7
1.1. Растительный материал…………………………………………….....
7
1.2. Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia
amylovora и инокуляция растительных экстрактов…..…….……….
7
1.2.1. Получение стандартной базовой суспензии…………………….
7
1.2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности.…..
8
1.2.3. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности для
определения селективности……………..……………………….……. 9
1.3. Изоляты и штаммы бактерий…………..…………………………….
10
1.4. Выделение ДНК из растительных экстрактов…………...………….
11
1.5. Постановка классической ПЦР……………………….....................….. 11
2. Результаты тестирований и обсуждение……………………………..….
2.1.
Определение
стандартной
базовой
суспензии
14
культуры
E. amylovora……………………………………………..…………………..
14
2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности………... 14
2.3. Аналитическая чувствительность…………..……………...…………..
15
2.4. Аналитическая специфичность…………………………...……………
16
2.5. Селективность……………………………………………..…………….
21
2.6. Повторяемость…………………………………...……………………… 23
2.7. Воспроизводимость…………………………………………..…………
24
Выводы………………………………………………………...………………. 26
Заключение………………………………………………………….…………. 27
Список литературы……………………………………………….…………… 28
Приложение 1…………………………………………………..……………... 30
Приложение 2………………………………………………..………………... 44
3
Введение
Разработка систем управления качеством (также называемых системами
управления или системами качества) и аккредитация на соответствие
Стандарту ISO/IEC 17025 стали проблемными вопросами для многих
лабораторий в регионе ЕОКЗР.
Традиционно
аккредитация
лабораторий
основывается
на
фиксированной области аккредитации, что четко и однозначно определяет
серию тестов, которые она охватывает (например, иммунофлуоресцентный
тест на выявление Ralstonia solanacearum в клубнях картофеля). Однако в
современных условиях, когда активно развиваются новые направления в
диагностике, а также могут меняться запросы клиентов к конкретной
лаборатории, фиксированная область аккредитации не позволяет с легкостью
добавлять новые или модифицированные тесты в область деятельности
лаборатории.
Вследствие этого была разработана концепция
гибкой области
аккредитации. Гибкая аккредитация позволяет лаборатории выполнять
определенные тесты и сообщать о результатах как об аккредитованных даже
в том случае, если эти тесты четко не указаны в области деятельности
лаборатории («Требования к гибкой аккредитации» EA-2/15, 2008). Опыт
фитопатологических лабораторий показывает, что при гибкой области
аккредитации лаборатория несет больше ответственности за подтверждение
надежности
и
достоверности
(валидности)
тестов,
их
соответствия
обстоятельствам использования и подтверждение того, что они проводятся
компетентно и единообразно.
Аккредитованная лаборатория должна использовать только те тесты,
которые прошли валидацию (признаны надежными и достоверными).
Возможно
использование
тестов,
валидированных
ранее
другими
лабораториями. В противном случае тесты должны пройти процедуру
валидации в лаборатории, которая намеревается использовать данный тест.
4
Валидация проводится для предоставления объективных данных о том, что
данный тест соответствует условиям использования. В сфере диагностики
вредных организмов растений тест должен быть подходящим для проведения
рутинной диагностики.
Тест считается полностью валидным, когда предоставляются данные о
следующих
рабочих
критериях:
аналитическая
чувствительность,
аналитическая специфичность, воспроизводимость и повторяемость. В
зависимости от области применения также может возникнуть необходимость
в определении его селективности. Тесты, прошедшие валидацию и имеющие
предоставленные рабочие критерии, считаются «стандартными тестами». Не
все тесты, включенные в диагностические протоколы ЕОКЗР, являются
валидированными; опрос, проведенный в 2008 и 2013 годах на предмет их
использования (Petter & Suffert, 2010) показал, что тесты, представленные в
Приложении 2, широко используются. Следовательно, эксперты-участники
группы ЕОКЗР по диагностике считают, что эти тесты показывают
соответствующий
уровень
повторяемости
и
воспроизводимости.
Лаборатории, использующие данные тесты, должны по крайней мере
получить
данные
по
проверке
аналитической
чувствительности
и
аналитической специфичности.
Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя
ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в
растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) была проведена
согласно схеме, описанной в Стандарте ЕОКЗР PM 7/98 (2) (рис. 1).
В данном отчете приводятся результаты исследований по валидации
метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых
культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в
соответствии со Stöger et al., 2006), c использованием различных
коммерческих реагентов и оборудования, имеющихся в лаборатории
бактериологии и молекулярных методов Испытательного экспертного центра
(ИЭЦ) ФГБУ «ВНИИКР».
5
Определите организм
Определите природный субстрат
Определите тест
Определите предполагаемые показатели рабочих характеристик
Смотрите таблицы 4-9 Стандарта ЕОКЗР PM 7/98 (2)
Определите основные ключи для валидации (например используемое оборудование)
Составьте план проведения валидации
Аналитическая специфичность/селективность*
Требуемые
значения
получены
Совершенствование
путем корректировки
теста
Требуемые
значения не
получены
Выберите
новый тест
Тест не может быть признан
валидным
Аналитическая чувствительность*
Совершенствование
путем корректировки
теста
Требуемые
значения
получены
Требуемые
значения не
получены
Выберите
новый тест
Тест не может быть признан
валидным
Повторяемость/воспроизводимость
Совершенствование
путем корректировки
теста
Требуемые
значения
получены
Требуемые
значения не
получены
Выберите
новый тест
Тест не может быть признан
валидным
Отчет о валидации
Заявление о том, что тест успешно охватывает область действия
* В зависимости от предполагаемого
использования
теста
оценка
аналитической
чувствительности
может проводиться до оценки
специфичности и селективности
Рис. 1. Процесс валидации
6
1. Материалы и методы исследований
1.1.Растительный материал
Для
валидации
метода
классической
ПЦР
с
использованием
диагностической системы к возбудителю ожога плодовых культур Erwinia
amylovora (Burrill) Winslow et al. использовали смесь замороженных при 20 °С экстрактов вегетативных частей (ветвей) растений сем. Розовые
(Rosáceae), свободных от возбудителя и искусственно инокулированных
культурой Erwinia amylovora. Растительные экстракты получены согласно
диагностическому протоколу ЕОКЗР PM 7/20 (2) (OEPP/EPPO Bulletin, 2013)
и «Методическим рекомендациям по выявлению и идентификации Erwinia
amylovora (СТО ВНИИКР 4.001-2010).
1.2.
Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia
amylovora и инокуляция растительных экстрактов
1.2.1. Получение стандартной базовой суспензии
Для получения стандартной базовой суспензии с концентрацией 107
колониеобразующих
единиц
(КОЕ)/мл
петлю
культуры
возбудителя
суспензировали в 1000 мкл 0,01 М стерильного фосфатно-солевого буфера1
(PBS) и готовили серию десятикратных разведений, последовательно
перенося 100 мкл предыдущего разведения к 900 мкл PBS последующего.
Далее проводили посев 100 мкл суспензии из каждого разведения в чашки
Петри на питательную среду Levan2 для подсчета числа КОЕ. В результате
получали суспензию с различным содержанием КОЕ патогена.
Состав фосфатно-солевого буфера (PBS): Na2HPO4 х 12Н2О 2,9 г/л, КH2PO4 х
2Н2О 0,2 г/л, NaCl 8,0 г/л, KCl 0,2 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7,2.
1
Состав питательной среды Levan: дрожжевой экстракт 2,0 г/л, пептон
бактериологический 2,0 г/л, сахароза 50 г/л, NaCl 5,0 г/л, агар бактериологический
15,0 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7-7,2.
2
7
1.2.2. Подготовка
экстрактов
с
различным
уровнем
зараженности
В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения
аналитической
чувствительности
используют
3
серии
(повторности)
экстрактов с уровнем зараженности 101-106 клеток целевого организма на
миллилитр.
Образцы с различным уровнем зараженности готовили по следующей
схеме:
1.
Готовили
экстракт
вегетативных
частей
в
количестве,
необходимом для оценки четырех методов выделения ДНК, смешивая
протестированные ранее экстракты, хранившиеся при -20 °С. Экстракты
были приготовлены согласно СТО ВНИИКР 4.001-2010. Для этого
растительный материал встряхивали в 30 мл фосфатного3 буфера в течение
90 минут. Фильтровали через бумажный фильтр и центрифугировали 10 мин
на 8000 об/мин при 5 °С. Удалили супернатант и ресуспендировали осадок
каждого образца в 1 мл фосфатно-солевого буфера.
2.
Приготовили 7 10-кратных разведений базовой суспензии с
концентрацией 106-100 КОЕ/мл, объемом 1000 мкл каждый, в соответствии с
п. 1.2.1.
3.
В новые пробирки переносили 900 мкл растительного экстракта и
добавляли 100 мкл бактериальной суспензии начиная с базовой, с
концентрацией
107
КОЕ/мл
и
далее
последовательно,
заканчивая
концентрацией 100 (табл. 2). Всего было приготовлено 3 серии (повторности)
образцов из каждого из 10-кратных разведений. Далее каждый образец был
разделен на субобразцы, объем которых составил 200 мкл.
4.
В качестве отрицательного контроля использовали чистый
экстракт, свободный от возбудителя ожога плодовых.
Состав фосфатного буфера (PB): Na2HPO4 4,26 г/л, КH2PO4 2,72 г/л,
дистиллированная вода 1 л, рН 7,0.
3
8
5.
Оставшуюся базовую суспензию и 10-кратные разведения
поместили в морозильную камеру при -20 оС для дальнейших испытаний.
1.2.3. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности
для определения селективности
Согласно
Стандарту
ЕОКЗР
РМ
7/98
(2),
для
определения
селективности необходимо оценить влияние природного субстрата, что
применительно к бактериям означает оценку влияния экстрактов различных
растений-хозяев
исследований.
и
различных
Определение
сортов
растений-хозяев
селективности
на
качество
осуществляется
путем
добавления различных концентраций бактериальной культуры в экстракты
вегетативных частей здоровых растений (ветви) различных сортов сем.
Розовые (Rosáceae).
Для определения влияния природного субстрата в лаборатории
бактериологии и молекулярных методов ИЭЦ использовали растительные
экстракты
различных
растений-хозяев
с
пороговыми/пограничными
положительными концентрациями возбудителя, согласно пункту 1.2.2,
определенные в результате изучения аналитической чувствительности
диагностической
системы.
В
опыте
использованы
18
экстрактов
вегетативных частей растений-хозяев, полученных в результате проведения
лабораторной экспертизы: груши (Prunus communis), яблони (Malus
domestica), боярышника (Crataegus sanguinea), кизильника (Cotoneaster
melanocarpa), рябины (Sorbus aucuparia), айвы (Cydonia oblonga), аронии
черноплодной (Aronia melanocarpa), малины (Rubus idaeus), роз (Rosa
rugosa), спиреи (Spirea japonica), черемухи (Padus racemosa), ирги
(Amelanchier ovalis), лапчатки (Pentaphylloides fruticosa), пузыреплодника
(Physocarpus opulifolius), земляники (Fragaria vesca), сливы (Prunus
domestica), вишни (Cerasus vulgaris) и черешни (Cerasus avium). Были
приготовлены 3 серии (повторности) экстрактов вегетативных частей
растений, перечисленных выше, с концентрацией патогена 102, 103 и 104.
9
1.3.Изоляты и штаммы бактерий
Для
изучения
аналитической
чувствительности,
повторяемости,
воспроизводимости и селективности использовали референтный штамм
E. amylovora 0172 (CFBP 1430) из бактериологической коллекции ФГБУ
«ВНИИКР», полученный из Института аграрных исследований (Валенсия,
Испания).
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения аналитической
специфичности испытуемой диагностической тест-системы необходимо
провести
анализ
генетическое
(во-первых)
разнообразие,
штаммов
разное
целевой
бактерии,
географическое
учитывая
происхождение
и
растений-хозяев и (во-вторых) ряда нецелевых бактерий, в частности,
бактерий, которые могут присутствовать в образцах. Рекомендуется
использовать
суспензии
клеток
чистых
культур
в
соотношении,
приблизительно 106 КОЕ/мл.
Также дополнительно результаты теста могут быть подтверждены
компьютерным (in silico) сравнением последовательностей праймеров/зонда
с последовательностями геномных библиотек.
Для определения специфичности были использованы более 120
штаммов вида E. amylovora, выделенных при проведении экспертизы в
лаборатории
бактериологии
и
молекулярных
методов
ИЭЦ
ФГБУ
«ВНИИКР», штаммы видов E. billingae, E. tasmaniensis, E. piriflorinigrans,
присутствие которых возможно в растительных экстрактах. Также для
изучения специфичности была использована ДНК видов Erwinia pyrifoliae и
Erwinia uzenensis, полученная в рамках рабочего блока 2 («оценка рабочих
характеристик теста» Erwinia sp.), проекта Phytfire («Фитосанитарная
диагностика, выявление в полевых условиях и эпидемиология Erwinia
amylovora») Европейской организацией координирования фитосанитарных
исследований EUPHRESCO II (http://www.euphresco.net). Кроме материала,
описанного выше, для определения специфичности использовали более 80
10
штаммов нецелевых видов бактерий из коллекции ФГБУ «ВНИИКР»,
выделенных
из
различных
растительных
образцов
при
проведении
бактериологической экспертизы, штаммы, полученные из лабораторий
Ленинградского и Краснодарского референтных центров Россельхознадзора,
а
также
приобретенные
и
полученные
из
европейских
коллекций
(Приложение 1).
1.4.Выделение ДНК из растительных экстрактов
Выделение ДНК из растительных экстрактов проводили при помощи
коммерческого набора «Проба-ГС» ООО «АгроДиагностика» для выделения
ДНК из растительной ткани в соответствии с инструкций производителя.
Метод основан на использовании для лизиса клеток гуанидин тиоционата
(GuSCN) с последующей сорбцией ДНК на носителе: стеклянные бусы,
диатомовая земля и т.д. После отмывок в пробе остается ДНК,
сорбированная на носителе, с которого она снимается элюирующим
раствором.
Выделение ДНК из чистых культур для определения аналитической
специфичности диагностической системы проводили методом кипячения,
для этого бактериальную культуру суспендировали в 200 мкл фосфатного
буфера, далее микропробирки с образцами инкубировали 10 мин при 98 оС в
твердотельном термостате, охлаждали 5 мин в морозильной камере,
центрифугировали 3 мин при 7000 об/мин, проводили амплификацию.
1.5.Постановка классической ПЦР
Для проведения классической ПЦР были использованы следующие
праймеры, синтезированные в ООО Агентство «Химэксперт», разработанные
на основе участка плазмиды pEA29 (Stöger et al., 2006):
PEANT 1 5’ – TATCCCTAAAAACCTCAGTGC – 3
11
PEANT 2 5’ – GCAACCTTGTGCCCTTTA – 3
Основные исследования проводили в термоциклере VeritiTM (Applied
Biosystems, США). При составлении реакционных смесей использовали
готовые окрашенные 5х ПЦР-МастерМиксы (5x ScreenMix-HS) компании
ЗАО «Евроген», состав смесей и условия проведения ПЦР представлены в
таблице 1. Размер ампликона составляет 391 п.о. Окончательный объем
реакционной смеси составлял 20 мкл.
Таблица 1
Состав реакционных смесей и условия амплификации
для постановки классической ПЦР
Компоненты
Объем (V), мкл
Конечная
концентрация
1x
Включено в Master Mix
Включено в Master Mix
Включено в Master Mix
250 нМ
250 нМ
1x
Включено в 10x ВК ЭФ
Ультрачистая вода
11,0
5х ПЦР-буфер
4,0
MgCl2 (25 mM)
Включено в Master Mix
d-NTP (25 mM)
Включено в Master Mix
Taq-полимераза
Включено в Master Mix
Прямой праймер (10 рM/µl)
0,5
Обратный праймер (10 рM/µl)
0,5
ВК ЭФ (10х)
2,0
праймер Mus 714F (10 pmol/µl) Включено в 10x ВК ЭФ
праймер Mus 714R (10
Включено в 10x ВК ЭФ
Включено в 10x ВК ЭФ
pmol/µl)
плазмида Mus 714_6 (10 нг/µl) Включено в 10x ВК ЭФ
Включено в 10x ВК ЭФ
ДНК образца
2,0
Объем реакции
20,0
Условия амплификации классической ПЦР
Температура, оС
Время
Количество циклов
96
15 мин
1
95
15 с
58
30 с
35
72
45 с
72
5 мин
1
В качестве внутреннего контроля, позволяющего оценить корректность
постановки реакции и отсутствие ингибиторов, использовали систему
внутреннего контроля на основе гена мыши, встроенного в вектор (Мазурин
12
и др., 2012). Внутренний контроль состоял из плазмидного вектора и
праймеров, размер ампликона составляет 714 п.о.:
Mus 714F 5’ – CTTCTGGCGTTTCAGAGACC – 3
Mus 714R 5’ – GGCTCCTCTTGTGCAGATTC – 3
В пробирке одновременно проходят две реакции – амплификация
специфического
фрагмента
генома
патогенного
организма
и
ДНК
внутреннего контроля. Количество матрицы для внутреннего контроля
подобрано так, чтобы не ингибировать амплификацию специфического
фрагмента, поэтому при высокой концентрации специфической матрицы
синтез внутреннего контроля может отсутствовать.
При
испытании
воспроизводимости
амплификация
проводилась
разными специалистами в разные дни, на следующих термоциклерах:
VeritiTM (Applied Biosystems, США), Mastercycler personal (Eppendorf,
Германия), C1000 Touch (BioRad, США). Результаты реакции амплификации
регистрировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном
бромистым этидием в гель-документирующей системе Molecular ImagerGel
Doс XR (BioRad, США). Размер продукта ПЦР измеряли, используя маркеры
молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п.н. и Fast Ruler™ (Fermentas). При
проведении электрофореза использовали камеры производства «Хеликон»
(Россия), источник напряжения Эльф («ДНК-технология») со следующими
параметрами: 115 В, 165 мА, 40 Вт.
13
2. Результаты тестирований и обсуждение
2.1.
Определение
стандартной
базовой
суспензии
культуры
E. amylovora
Результаты постановки метода серийных разведений описанного в
п. 1.2.1, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Получение стандартной базовой суспензии E. amylovora
№ разведения
Колоний на чашке
Петри
КОЕ/мл
КОЕ/мл растительного
экстракта
Концентрация копий
мишени в субобразце
(200 мкл)
Минимальное
количество копий
мишени ДНК (2 мкл)
0
1
2
3
4
5
6
7
газон
газон
газон
газон
602
66
9
-
107
106
105
104
103
102
101
100
-
6,0 х 106
6,0 х 105
6,0 х 104
6,0 х 103
6,6 х 102
9,0 х 101
9,0 х 100
-
1,2*106
1,2*105
1,2*104
1204
132
18
-
-
-
-
-
≈ 24,1
≈ 2,6
≈ 0,4
-
Из таблицы 2 видно, что искомая базовая стандартная концентрация
107 КОЕ/мл была получена в нулевом разведении.
2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности
Результаты подготовки растительных экстрактов с различным уровнем
зараженности представлены в таблице 2. Приведенные данные показывают,
что концентрация патогена в растительных экстрактах составила 9,0*100,
9,0*101, 6,6*102, 6,0*103, 6,0*104, 6,0*105, 6,0*106 КОЕ/мл, соответственно,
дальнейшая концентрация возбудителя в субобразцах (200 мкл) № 1-6
составила: 1,8*101, 1,3*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106. Минимальное
количество копий мишени в 2 мкл ДНК для постановки ПЦР составило ≈
0,4*100, 2,6*101, 24,1*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106.
14
2.3. Аналитическая чувствительность
В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения
аналитической
чувствительности
необходимо
проанализировать
как
минимум 3 серии (повторности) образцов зараженных растительных
экстрактов в соотношении 100-106 клеток целевого организма на миллилитр.
Серии образцов зараженных растительных экстрактов подготовлены в
соответствии
с
п.
1.2.2,
результаты
определения
аналитической
чувствительности представлены таблице 3.
Таблица 3
Результаты определения чувствительности классической ПЦР
для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте
(в соответствии со Stöger et al., 2006)
с использованием коммерческого набора «Проба-ГС»
ООО «АгроДиагностика»
Метод выделения/
Разведение (КОЕ/мл)
106
105
104
103
102
101
100
Квыделения
Кчистая зона
Из
результатов,
Серия
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
Результат ВК
Результат спец
представленных
«Проба-ГС»
1
2
3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
–
в
таблице
3,
видно,
что
чувствительность метода с использованием коммерческого набор «Проба15
ГС» позволила выявить возбудителя ожога плодовых в концентрации 103
КОЕ/мл во всех трех сериях (100%), возбудителя в концентрации 102 КОЕ/мл
в двух сериях из трех (66,66%).
2.4. Аналитическая специфичность
Сведения о специфичности диагностической системы классического
ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(Burrill) в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006)
представлены в таблице 4. Полная информация о штаммах, использованных
для определения аналитической специфичности, а также результаты
классического ПЦР представлены в Приложении 1.
Таблица 4
Результаты определения специфичности метода ПЦР «в реальном
времени» для возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(Burrill) Winslow et al. (в соответствии с Stöger et al., 2006)
Количество
Реакция
исследованных
с системой
штаммов
Erwinia amylovora
Тамбовская область
16
+
Самарская область
12
+
Волгоградская область
8
+
Воронежская область
10
+
Саратовская область
2
+
Липецкая область
14
+
Калининградская область
13
+
Ставропольский край
8
+
Белгородская область
1
+
Пензенская область
9
+
Кабардино-Балкарская Республика
5
+
Карачаево-Черкесская Республика
1
+
Всего
99
Штаммы Erwinia amylovora из зарубежных коллекций
Республика Казахстан
18
+
Республика Молдова
2
+
Французская Республика
1
+
Республика Польша
6
+
Всего
27
Вид бактерии (штаммы/изоляты),
происхождение
16
Erwinia sp.
Erwinia billingiae
Erwinia tasmaniensis
Erwinia piriflorinigrans
Erwinia uzenensis
Erwinia pirifoliae
Всего
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика Египет
Республика Индия
Китайская Народная Республика
Народная Республика Бангладеш
Московская область
Штаммы из зарубежных коллекций
Всего
Иные виды
Ochrobacterium sp.
Rahnella aquatilis
Pseudomonas congelans
Curobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens
Enterobacter amnigenus
Ochrobactrum anthropi
Artrobacter castelli
Acidovorax citrulli
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
Pectobacterium atrosepticum
Pantoea stewartii subsp. stewartii
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Xilophilus ampelinus
Dickeya sp.
Xanthomonas fragaria
Xanthomonas campestris pv. raphani
Xanthomonas arboricola pv. pruni
Всего
1
1
2
1
1
6
-
32
4
4
1
6
4
51
-
1
1
1
1
1
1
1
3
1
2
8
4
1
3
3
1
1
1
35
-
Проведенный эксперимент выявил высокую специфичность системы
Классической ПЦР к Erwinia amylovora. При тестировании штаммов данного
вида специфичная реакция наблюдалась во всех случаях со 126 штаммами
(приложение 1). Высокая специфичность ПЦР системы также была отмечена
как по отношению к нецелевым видам, так и по отношению к другим видам
рода Erwinia, поражающим растения сем. Розовые (Rosáceae) в азиатских
странах (Erwinia pyrifoliae, Kim et al., 2001), Erwinia uzenensis (Matsuura et. al.,
2012) и вызывающим некротизацию цветков в некоторых странах Европы
17
(Erwinia pyriflorinigrans, Lopez et al., 2011), а также видам, не являющимся
фитопатогенами (Erwinia billingiae, Erwinia tasmaniensis).
В эксперименте не было зарегистрировано ни одного случая
ложноположительной либо ложноотрицательной реакции.
Подтверждение специфичности последовательностей праймеров ‘in
silico’ проводили путем сравнения последовательностей с геномными
библиотеками. Сравнительный анализ последовательностей праймеров,
разработанных на основе участка плазмиды pEA29 осуществляли с помощью
базы
данных
Генбанка
–
пакета
NCBI
BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). На рисунках 2 и 3, приведены
результаты сходства последовательностей прямого, обратного праймеров с
полными и частичными геномами организмов, депонированных в данный
ресурс. Во всех приведенных на рисунках результатах 100% покрытия и
идентичности последовательностей праймеров было получено с более чем 30
геномами штаммов вида Erwinia amylovora (включая референтный штамм
CFBP 1430), комплементарность праймеров к участкам генома каких-либо
нецелевых организмов не выявлена.
18
Рис. 2. Результат сравнения прямого праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stöger et al., 2006)
с базой данных ГенБанка (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
Рис. 3. Результат сравнения обратного праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stöger et al., 2006)
с базой данных ГенБанка (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
20
2.5. Селективность
При
изучении
селективности
ДНК
растительных
экстрактов
различных растений-хозяев возбудителя была выделена при помощи
коммерческого набора «Проба-ГС» ООО «АгроДиагностика», метода,
выбранного в результате определения чувствительности диагностической
системы. Полученные результаты изучения селективности диагностической
системы представлены в таблице 5.
Таблица 5
Результаты определения селективности метода классического ПЦР
для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте
(в соответствии со Stöger et al., 2006)
Экстракт
вегетативных
частей
Результатсц
Результатвк
Результат
Результатсц
Результатвк
Результат
Результатсц
Результатвк
Результат
Концентрация возбудителя, КОЕ/мл
103
102
Серия
104
Груши
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
+
+
+
Яблони
Боярышника
Кизильника
Рябины
Айвы
Аронии
черноплодной
Малины
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Роз
Спиреи
Черемухи
Ирги
Лапчатки
Пузыреплодника
Земляники
Сливы
Вишни
Черешни
Квыделения
Ctспец
CtВК
Результат
Кчистая зона
Ctспец
CtВК
Результат
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
–
–
–
+
–
–
+
–
Как видно из проведенных опытов, состав суспензии в некоторых
случаях
влияет
на
прохождение
реакции
амплификации.
Влияние
растительного материала на результаты анализа образцов отмечено при
тестировании
экстрактов
вегетативных
частей
груши,
ирги.
При
концентрации возбудителя 103 КОЕ/мл ложноотрицательные результаты
тестирования данных экстрактов получены в 100% случаев. Полученный
результат, возможно, связан с веществами-ингибиторами, содержащимися в
22
растительном соке. При тестировании остальных образцов при данной
концентрации ни одного ложноотрицательного случая не зарегистрировано.
Слабый, но визуально регистрируемый результат, при концентрации
возбудителя 102 КОЕ/мл, был получен практически во всех случаях, за
исключением
растительных
экстрактов
груши,
черемухи,
ирги,
пузыреплодника. Положительный результат по внутреннему контролю
зарегистрирован во всех без исключения тестовых образцах.
2.6. Повторяемость
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения повторяемости
необходимо проанализировать как минимум 3 серии (повторности) образцов
растительных экстрактов с низким уровнем зараженности, если после трех
серий
не
получены
стабильные
результаты,
следует
подготовить
дополнительные серии и провести их анализ.
В наших исследованиях были специально протестированы 6 серий
образцов
с
концентрацией
возбудителя
102,
103
(низкий
уровень
зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности), а также
использованы
данные,
полученные
при
изучении
чувствительности.
Результаты определения повторяемости представлены в таблице 6.
Таблица 6
Результаты определения повторяемости метода Классической ПЦР
для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте
(в соответствии со Stöger et al., 2006)
Результатсп
Результат
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
К- (выделения ДНК)
Ctспец
Результат
РезультатВК
1
2
3
Результатсп
Результат
Определения
чувствительности
п. 2.3
РезультатВК
Результаты
Результатсп
102
РезультатВК
103
Серия
104
+
+
+
+
+
–
–
+
+
–
23
К- (Чистая зона)
CtВК
Результат
Ctспец
CtВК
Результат
1
2
3
4
5
6
Определения
повторяемости
К- (Чистая зона)
К- (Зона внесения ДНК)
+
–
–
+
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
–
–
+
–
Ctспец
CtВК
Результат
Ctспец
CtВК
Результат
Итого
+
+
+
+
+
+
9 из 9
100%
9 из 9
100%
2 из 9
22,2
Повторяемость метода классического ПЦР для выявления возбудителя
ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в
растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006) со средним и
низким уровнем зараженности (104
и 103) составила 100%, с уровнем
зараженности возбудителем в концентрации 102 КОЕ/мл повторяемость
составила 22,2%.
2.7. Воспроизводимость
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, эксперимент по оценке
воспроизводимости проводится по такой же методике, что и определение
повторяемости, но другими операторами, в другие сроки и по возможности
на другом оборудовании.
В нашем эксперименте были специально протестированы 6 серий
образцов
с
концентрацией
возбудителя
102,
103
(низкий
уровень
зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности). Постановку
классической ПЦР проводили 3 специалиста на оборудовании, указанном в п.
1.5, полученные результаты приведены в таблице 7.
24
Таблица 7
Результаты определения воспроизводимости метода классической
ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia
amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте
(в соответствии со Stöger et al., 2006)
К- (Чистая зона)
К- (Зона внесения ДНК)
12 ноября,
термоциклер Veriti (Applied
Biosystems, США),
специалист
Писарева И.Н.
К- (Чистая зона)
К- (Зона внесения ДНК)
13 ноября,
термоциклер Mastercycler
personal
(Eppendorf, Германия),
специалист
Баландина М.Б.
К- (Чистая зона)
К- (Зона внесения ДНК)
Итого
Результат ВК
Результат СП
Результат
Результат ВК
Результат СП
Результат
1
2
3
4
5
6
Результат ВК
Результат СП
Результат
Результат ВК
Результат СП
Результат
1
2
3
4
5
6
Результат
РезультатВК
РезультатСП
Результат
РезультатВК
РезультатСП
Результат
1
2
3
4
5
6
102
РезультатСП
14 ноября,
термоциклер C1000 Touch
Thermal Cycler (BioRad, США),
специалист
Кузнецова А.А.
103
РезультатВК
Дата проведения,
название прибора
104
Серия
Серия/Разведение
(кое/мл)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Результат ВК
Результат СП
Результат
Результат ВК
Результат СП
Результат
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
+
+
–
–
–
–
–
–
–
–
+
–
–
+
–
–
18 из 18
100%
18 из 18
100%
9 из 18
50%
25
Воспроизводимость результатов теста оказалась абсолютной (100%)
для образцов с зараженностью 103 и 104 КОЕ/мл и низкой (50%) для образцов
с зараженностью 102 КОЕ/мл.
Выводы
1. Аналитическая чувствительность метода классической ПЦР для
выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill)
Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stöger et al., 2006)
составила не менее 102-103 КОЕ/мл.
2. Установлена высокая специфичность метода классической ПЦР к
виду Erwinia amylovora.
3.
Влияние природного субстрата отмечено при тестировании
растительного экстракта груши, ирги. Предел детекции возбудителя в
данных растительных экстрактах составляет 104 КОЕ/мл. При тестировании
остальных растительных экстрактов, с концентрацией возбудителя 103
КОЕ/мл влияние природного субстрата на эффективность выявления не
отмечено.
Слабый,
но
визуально
регистрируемый
результат
при
концентрации возбудителя 102 КОЕ/мл был получен практически во всех
случаях, за исключением растительных экстрактов груши, черемухи, ирги,
пузыреплодника.
4.
Проведенные
испытания
свидетельствуют
о
высокой
повторяемости и воспроизводимости результатов при использовании данного
метода.
26
Заключение
Проведена валидация метода классической ПЦР с диагностической
системой для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia
amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со
Stöger et al., 2006), согласно Стандарту ЕОКЗР PM 7/98 (2) (OEPP/EPPO
Bulletin
44
(2)).
чувствительностью
Метод
и
характеризуется
специфичностью,
высокой
обладает
аналитической
селективностью
по
отношению к растительным экстрактам груши и ирги, обеспечивает высокий
уровень повторяемости и воспроизводимости результатов и может быть
рекомендован для проведения лабораторной экспертизы по выявлению и
идентификации этого карантинного организма.
27
Список литературы
1. Европейская ассоциация по аккредитации/EA (2008) EA-2/15
«Требования для гибкой аккредитации», http://www.eurolab.org/docs/EA/EA2_15.pdf.
2. Мазурин Е.С. Контроль достоверности результатов фитосанитарной
экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики /
Мазурин
Е.С.,
Копина
М.Б.,
Шероколава
Н.А.
//
Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство. – 2012. – №3. – С. 31-38.
3. Стандарт ЕОКЗР PM 7/98 (2) «Специфические требования к
лабораториям, ведущим подготовку к аккредитации деятельности в сфере
диагностики вредных организмов растений». OEPP/EPPO Bulletin. – 2014. –
V 44 (2). – P. 117-147.
4. Стандарт ISO/IEC 17025 «Общие требования к компетенции
исследовательских и калибровочных лабораторий». – 2006.
5. СТО ВНИИКР 4.001-2010 Возбудитель ожога плодовых деревьев
Erwinia
amylovora
(Burrill)
Winslow
et
al.
Методы
выявления
и
идентификации. – 2010.
6. Bereswill S. Sensitive and species-specific detection of Erwinia
amylovora by polymerase chain reaction analysis / Bereswill S., Pahl A.,
Bellemann P., Zeller W. & Geider K. // Applied and Environmental Microbiology.
– 1992. – V. 58. – P. 3522-3526.
7. Gottsberger R.A. Development and evaluation of a real-time PCR assay
targeting chromosomal DNA of Erwinia amylovora / Gottsberger R.A. // Letters in
Applied Microbiology. – 2010. – V. 51. – P. 285-292.
8. Kim W.S. Molecular detection and differentiation of Erwinia pyrifoliae
and host range analysis of the Asian pear pathogen / Kim W.S., Jock S. // The
American Phytopathological Society. – 2001. – P. 1183-1188.
9. Llop P. Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a
single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant
28
material / Llop P., Bonaterra A., Penalver J. & Lopez M.M. // Applied and
Environmental Microbiology. – 2000. – V 66, – P. 2071-2078.
10. Lopez M.M. Erwinia piriflorinigrans sp. nov., a novel pathogen that
causes necrosis of pear blossoms / Lopez M.M., Roselló M., Llop P., Ferrer S.,
Christen R., Gardan L. // International journal syst. Evol. Microbiol. – 2011. – V.
61 (Pt 3). – P. 561-567.
11. Matsuura T. Erwinia uzenensis sp. nov., a novel pathogen that affects
European pear trees (Pyrus communis L.) / Matsuura T., Mizuno A., Tsukamoto
T., Shimizu Y., Saito N., Sato S., Kikuchi S., Uzuki T., Azegami K., Sawada H. //
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2012. – V.
62. – P. 1799-1803.
12. Obradovic D. Detection of Erwinia amylovora by novel chromosomal
polymerase chain reaction primers / Obradovic D., Balaz J. & Kevresan S. //
Mikrobiologiia. – 2007. – V. 76. – P. 844-852.
13. Petter F. Survey on the use of tests mentioned in EPPO Diagnostic
protocols / Petter F. & Suffert M. // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. – 2010. – V.
40. – P. 5-22.
14. Pirc M. Improved fire blight diagnostics using quantitative real-time
PCR detection of Erwinia amylovora chromosomal DNA / Pirc M., Ravnikar M.,
Tomlinson J. & Dreo T. // Plant Pathology. – 2009. – V. 58. – P. 872-881.
15. PM 7/20 (2) Erwinia amylovora. OEPP/EPPO Bulletin. – 2013. – V. 43
(1). – P. 21-45.
16. Stoger A. A rapid and sensitive method for direct detection of Erwinia
amylovora in symptomatic and asymptomatic plant tissues by polymerase chain
reaction / Stoger A., Schaffer J. & Ruppitsch W. // Journal of Phytopathology. –
2006. – V. 154. – P. 469-473.
17. Taylor R.K. Detection of Erwinia amylovora in plant material using
novel polymerase chain reaction (PCR) primers / Taylor R.K., Guilford P., Clark
R.G., Hal C.N. & Forster R.L.S. // New Zealand Journal of Crop and Horticultural
Science. – 2001. – V. 29. – P. 35-43.
29
Приложение 1
Информация о штаммах, использованных
для определения аналитической специфичности
№
п/п
Штамм,
№
Вид бактерии
1
0001
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
2
0002
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
3
0003
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
4
0004
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
5
0005
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
6
0006
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
7
0007
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
8
0008
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
9
0009
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
10
0010
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
11
0011
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
662-и, 5п
–
12
0012
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
649-и
–
13
0013
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет
–
14
0014
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
1418/11-и, Rф661
–
Происхождение
Арабская Республика
Египет,
542/1-и, R489
Арабская Республика
Египет,
542/1-и, R490
Арабская Республика
Египет,
638-и, 1п
Арабская Республика
Египет,
590-и, MR14
Арабская Республика
Египет,
579-и, MR18
Арабская Республика
Египет,
577-и, MR19
Арабская Республика
Египет,
588-и, MR20
Арабская Республика
Египет,
662-и, 3п
Арабская Республика
Египет,
662-и, 4п
Арабская Республика
Египет,
662-и, 5п
Результат
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
30
Арабская Республика
Египет,
940-и, R656
–
15
0015
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
16
0016
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
943-и, R657
–
17
0017
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
938-и, R653
–
18
0018
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
949-и, R663
–
19
0019
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
R652
–
20
0020
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
854-и, R622
–
21
0021
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Республика Индия,
5084
С-Петербургская МВЛ
–
22
0022
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Республика Индия,
5609
С-Петербургская МВЛ
–
23
0023
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Республика Индия,
6986
С-Петербургская МВЛ
–
24
0024
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Республика Индия,
7088
С-Петербургская МВЛ
–
25
0025
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
1045-и, МR622
–
26
0026
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
МR42
–
27
0027
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
1655/11-и, Rф866
–
28
0029
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Арабская Республика
Египет,
11-и, Rф
–
29
0030
Ralstonia solanacearum,
филотип 1
КНР,
57п,
Иркутский филиал
–
31
КНР,
60п,
Иркутский филиал
–
30
0031
Ralstonia solanacearum,
филотип 1
31
0032
Ralstonia solanacearum,
филотип 1
КНР,
61п,
Иркутский филиал
–
32
0033
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
–
33
0034
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
–
34
0035
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
–
35
0036
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
–
36
0037
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
–
37
0038
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
38
0039
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
39
0040
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
40
0041
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
41
0042
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
42
43
0043
Ochrobactrum sp.
0044
Erwinia billingiae
(культура изначально
определена как Erwinia
amylovora)
Московская область,
Озерский р-н, ЗАО
«Озеры»
Нами получен из NCPPB,
FERA (Йорк,
Великобритания). Перу,
1970
Нами получен из NCPPB,
FERA (Йорк,
Великобритания).
Австралия, 1970
Hungary, Domaszek,
isolated
11/1999, Nemeth J.
Hungary, Domaszek,
11/1999, Kovacs N.A.
Самарская обл., Волжский
р-н, трасса Самара –
Волгоград, поворот на
Новокуйбышевск,
заброшенные дачи у
дороги.
МЕ 958-2, 811-о
Воронежская обл.,
г. Воронеж, ЗАО
«Зареченский», кв. 9,
1985, 10 га
–
–
–
–
–
–
–
32
49п (№ 87)
44
0045
45
0046
Curobacterium
flaccumfaciens pv.
flacumfaciens
Pseudomonas congelans
(штамм изначально
определен как
Pseudomonas syringae
pv. syringae)
Тамбовская обл.,
г. Уварово
–
AOBC PPSCD, Печ,
Венгрия, Kovacs N.A.,
Hungary, 1976
–
Калининградская обл., г.
Светлый (территория
теплопункта, рядом с
судоходным каналом)
213-о
Саратовская обл., г.
Хвалынск, КПХ «Садов»,
МЕ 972, 812-о
–
46
0047
Enterbacter amnigenus
47
0048
Ochrobactrum anthropi
48
0049
Clavibacter
michiganensis subsp.
michiganensis
Московская область,
Дмитровский р-н
–
49
0050
Xilophilus ampelinus
Нами получен из LSV
Франция. France 2004
–
50
0051
Erwinia amylovora
51
0052
Erwinia amylovora
52
0053
Erwinia amylovora
53
0054
Erwinia amylovora
54
0055
Erwinia amylovora
55
0056
Erwinia amylovora
Тамбовская обл., г.
Мичуринск, ВНИИС им.
Мичурина, опытный
интенсивный сад, 5,5 га
Тамбовская обл., г.
Мичуринск, ВНИИС им.
Мичурина, опытный
интенсивный сад, 5,5 га
Тамбовская обл., г.
Мичуринск, ВНИИС им.
Мичурина, опытный
интенсивный сад, 5,5 га
Тамбовская обл., г.
Мичуринск, территория
элеватора рядом с
карантинным пунктом
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
коллекционнопроизводственный сад,
13 га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
коллекционнопроизводственный сад, 10
–
+
+
+
+
+
+
33
56
0057
Erwinia amylovora
57
0058
Erwinia amylovora
58
0059
Erwinia amylovora
59
0060
Erwinia amylovora
60
0061
Erwinia amylovora
61
0062
Erwinia amylovora
62
0063
Erwinia amylovora
63
0064
Erwinia amylovora
64
0065
Erwinia amylovora
65
0066
Erwinia amylovora
66
0067
Erwinia amylovora
67
0068
Erwinia amylovora
68
0069
Erwinia amylovora
га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
коллекционнопроизводственный сад, 10
га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИС
им. Мичурина, поросль по
краю бывшего опытного
интенсивного сада
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИС
им. Мичурина, поросль по
краю бывшего опытного
интенсивного сада
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
молодой сад, 7 га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
коллекционный сад, 6 га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск, ВНИИГ и
СПР им. Мичурина,
коллекционный сад, ряд 5,
дерево 12, 6 га
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск
Тамбовская обл.,
г. Мичуринск
Воронежская обл.,
Острогожский р-н,
лесополоса за
территорией ООО
«Острогожсксадопитомник»
Воронежская обл.,
Аннинский р-н, ОАО
«Новонадеждинское»
кв. 1, 1999 г., 4 га
Воронежская обл.,
Новоусманский р-н, ТНВ
«Маликов и К», кв. 79,
1973 г.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
34
69
0070
Erwinia amylovora
Воронежская обл., г.
Воронеж, ул. Шишкова, д.
49
70
0071
Erwinia amylovora
Воронежская обл., г.
Воронеж, ул. Шишкова,
напротив д. 49
+
+
–
71
0072
Erwinia amylovora
Воронежская обл., г.
Воронеж, ул. Шишкова,
напротив д. 28а
72
0073
Artrobacter cаstelli
Штамм изначально
определен как вид Cmm
-
73
0074
Erwinia amylovora
74
0075
Erwinia amylovora
75
0076
Erwinia amylovora
76
0077
Erwinia amylovora
77
0078
Erwinia tasmaniensis
Воронежская обл.,
г. Воронеж,
ул. Шишкова, напротив д.
28
Воронежская обл.,
Семилукский р-н, СНТ
«Росинка», участок №
216, 0,15 га, 1990 год
посадки
Воронежская обл.,
г. Воронеж, ул. Шишкова,
напротив д. 47, 0,5 га
Саратовская обл.,
Хвалынский р-н, г.
Хвалынск, дорога на
Черемшаны, сад яблони
Саратовская обл.,
Хвалынский р-н, г.
Хвалынск, гора Богданиха
Самарская обл.,
Сергиевский р-н
Самарская обл.,
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 7, 2012 г.
+
+
+
+
+
–
78
0079
Erwinia amylovora
79
0080
Erwinia amylovora
80
0081
Erwinia amylovora
81
0082
Erwinia amylovora
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 7, 2012 г.
+
+
+
82
0083
Erwinia amylovora
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 31, 2012 г.
83
0084
Erwinia amylovora
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 13, 2012 г.
+
+
+
35
84
0085
Erwinia amylovora
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 15, 2012 г.
85
0086
Erwinia amylovora
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 15, 2012 г.
Самарская обл.
Приволжский р-н, ООО
«Сад», кв. 15, 2012 г.
Самарская обл.,
Сызранский р-н, ООО
«Садовод», кв. 94, 1982 г.,
10,7 га
Самарская обл.,
Сызранский р-н, ООО
«Садовод», кв. 97, 1987 г,
10,7 га
Самарская обл.,
Сызранский р-н, ООО
«Садовод», кв. 95, 1981 г,
10,7 га
Самарская обл.,
Сызранский р-н
+
+
86
0087
Erwinia amylovora
87
0088
Erwinia amylovora
88
0089
Erwinia amylovora
89
0090
Erwinia amylovora
90
0091
Erwinia amylovora
91
0092
Acidovorax
США
–
92
0093
Acidovorax
США
–
93
0094
Acidovorax
США
–
94
0095
Erwinia amylovora
Липецкая обл., СНТ «Заря
2», массив 1, линия 6
+
95
0096
Erwinia amylovora
96
0097
Erwinia amylovora
97
0098
Erwinia amylovora
98
0099
Erwinia amylovora
99
0100
Erwinia amylovora
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест»
кв. 1, 10,5 га
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 1,
10,5 га
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 1,
10,5 га
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 9,
10,5 га
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 1,
10,5 га
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
36
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 1,
10,5 га
Липецкая обл.,
Тербунский р-н, ООО
«Сельхозинвест» кв. 1,
10,5 га
Воронежская обл.,
Острогожский р-н,
лесополоса за
территорией ООО
«Острогожсксадопитомник»
Арабская Республика
Египет,
R 434/305-и
100
0101
Erwinia amylovora
101
0102
Erwinia amylovora
102
0103
Erwinia amylovora
103
0104
Ralstonia solanacearum,
раса 3, bv. 2
104
0105
Erwinia amilovora
Калининградская обл.
+
105
0106
Erwinia amilovora
Калининградская обл.
+
106
0107
Erwinia amilovora
Калининградская обл.
+
+
–
107
0108
Erwinia amylovora
Калининградская обл.,
Багратионовский р-н,
вдоль ж/д Мамоново –
Польша
108
0109
Erwinia piriflorinigrans
Калининградская обл.,
г. Балтийск, Балтийская
коса
Калининградская обл.,
Нестеровский р-н, пос.
Пригородное, сад возле
мехдвора (зернотока)
+
+
+
–
109
0110
Erwinia amylovora
+
110
0111
Erwinia amylovora
111
0112
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
112
0113
Erwinia piriflorinigrans
-
–
113
0114
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
114
0115
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
115
0116
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
116
0117
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
117
0118
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
+
37
0119
Erwinia amylovora
Калининградская обл.
+
119
0120
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Нами получен из
AOBC PPSCD, Печ,
Венгрия
–
120
0121
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
121
0122
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
122
0123
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
123
0124
Xilophilus ampelinus
Итальянская Республика,
сорт Шардоне
–
124
0125
Xilophilus ampelinus
Итальянская Республика,
сорт Каберне Совиньон
–
125
0126
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
126
0127
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
127
0128
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
128
0129
Erwinia amylovora
Ставропольский край
129
0130
Erwinia amylovora
Ставропольский край
+
130
0131
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика
Египет, R786/13
+
131
0132
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика
Египет, R786/13
–
132
0133
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика
Египет, R786/13
–
133
0134
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика
Египет, R786/13
–
134
0135
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика
Египет, R786/13
–
135
0136
Ralstonia solanacearum
КНР
–
136
0137
Clavibacter
michiganensis subsp.
sepedonicus
Московская область
–
137
0138
Clavibacter
michiganensis subsp.
sepedonicus
Московская область,
R77/80-о
–
138
0139
Clavibacter
michiganensis subsp.
sepedonicus
РФ, Московская обл.,
Раменский р-н, д.
Заворово, R40, Н.В.
–
139
0140
Clavibacter
michiganensis subsp.
sepedonicus
Клубни картофеля
с. Романо
–
118
38
140
0141
Pectobacterium
carotovorum subsp.
carotovorum
Типовой штамм
–
141
0142
Pectobacterium
atrosepticum
Великобритания,
типовой штамм
–
142
0143
Pectobacterium
atrosepticum
-
–
143
0144
Diсkeya sp.
-
–
144
0145
Diсkeya sp.
-
–
145
0146
Diсkeya sp.
-
–
146
0147
Xanthomonas fragariae
NCPPB 1469 FERA (Йорк,
Великобритания)
–
147
0148
Xanthomonas campestris
pv. raphani
NCPPB 1946
FERA (Йорк,
Великобритания)
–
148
0149
Xanthomonas arboricola
pv. pruni
AOBC PPSCD, г. Печ,
Венгрия
–
Белгородская обл.,
Прохоровский р-н,
с. Редьковка
+
149
0150
Erwinia amylovora
150
0151
Erwinia amylovora
151
0152
Erwinia amylovora
152
0153
Erwinia amylovora
153
0154
Erwinia amylovora
154
0155
Erwinia amylovora
155
0156
Erwinia amylovora
156
0157
Erwinia amylovora
157
0158
Erwinia amylovora
Пензенская обл.,
Тамаринский р-н.
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н,
с-з им. Льва Толстого, ул.
Черемушки, д. 16, кв. 1
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н,
с-з им. Льва Толстого, ул.
Черемушки, д. 16, кв. 1
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н,
с-з им. Льва Толстого, ул.
Черемушки, д. 16, кв. 1
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н., с-з им.
Льва Толстого, ул.
Черемушки, д. 16, кв. 1
Кабардино-Балкария,
Баксанский р-н
Кабардино-Балкария, с.
Кенже, ОАО «Кенже»
Кабардино-Балкария,
Чегемский р-н, с-з
Лечинкай, старый сад
груши с посадкой 8 га
+
+
+
+
+
+
+
+
39
158
0159
Erwinia amylovora
Кабардино-Балкария
+
159
0160
Erwinia amylovora
Кабардино-Балкария
+
160
0161
Erwinia amylovora
161
0162
Erwinia amylovora
162
0163
Erwinia amylovora
163
0164
Erwinia amylovora
164
0165
Erwinia amylovora
165
0166
Erwinia amylovora
166
0167
Erwinia amylovora
167
0168
Erwinia amylovora
168
0169
Erwinia amylovora
169
0170
Erwinia amylovora
170
0171
Ralstonia solanacearum
Республика Молдова
Страшенский р-н,
промышленный сад, 105,5
га
Республика Молдова
Страшенский р-н,
промышленный сад, 105,5
га
Карачаево-Черкесская
Республика,
Малокарачаевский р-н, п.
Красный, старый сад
груши конного завода
Волгоградская обл., г.
Краснослободск,
ГНУ ВОС ВНИИР им.
Вавилова, кв. 7, ряд 13
Волгоградская обл., г.
Волгоград, дендрарий
ВНИИАЛМИ
Волгоградская обл., г.
Краснослободск, ГНУ
ВОС ВНИИР им.
Вавилова, кв. 7, ряд 12
Волгоградская обл.,
г. Волгоград, ул.
Чимбарова, 53
Волгоградская обл., г.
Волгоград, дендрарий
ВНИИАЛМИ
Волгоградская обл., г.
Краснослободск, ГНУ
ВОС ВНИИР им.
Вавилова, сад айвы
Волгоградская обл., г.
Краснослободск, ГНУ
ВОС ВНИИР им.
Вавилова, сад айвы
Арабская Республика
Египет, Карельский
филиал
171
0172
Erwinia amylovora
IVIA, Валенсия, Испания,
нами получен из Bielefeld,
France
172
0173
Erwinia amylovora
Республика Польша,
Новый Двор, Опытное
цветоводческое
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
40
предприятие Институт
садоводства и
цветоводства
Арабская Республика
Египет
Республика Польша, г.
Пасечно, питомник
декоративных растений
«Эмиль Хома»
Республика Польша, г.
Пасечно «Кордус»
Республика Польша, г.
Пасечно «Кордус»
Республика Польша, г.
Пасечно «Кордус»
Республика Польша,
Wojewodztwo
Mazowieckie, питомник
«Грабчевски»
Республика Казахстан,
Алматинская обл.,
Енбекшиказахский р-н,
Байтерекский с/о,
крестьянское х-во
«Жарык», промышленный
сад, 15 га
–
173
0174
Ralstonia solanacearum
174
0175
Erwinia amylovora
175
0176
Erwinia amylovora
176
0177
Erwinia amylovora
177
0178
Erwinia amylovora
178
0179
Erwinia amylovora
179
0180
Erwinia amylovora
180
0181
Rahnella sp.
Нидерланды
–
181
0182
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
182
0183
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
183
0184
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
184
0185
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
185
0186
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
186
0187
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
187
0188
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
188
0189
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
189
0190
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
Erwinia amylovora
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с/х им.
Л. Толстого, ул.
Механизаторов, д. 13, кв.
2, Волков А.И.
+
190
0191
+
+
+
+
+
+
41
191
0192
Erwinia amylovora
Республика Киргизия
+
+
192
0193
Erwinia amylovora
Липецкая обл., ЛевТолстовский р-н, с/х им.
Л. Толстого, ул.
Механизаторов, д. 13, кв.
2, Волков А.И.
193
0194
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская область
+
194
0195
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская область
+
195
0196
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская область
+
196
0197
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская обл.
+
197
0198
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская обл.
+
198
0199
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская обл.
+
199
0200
Erwinia amylovora
Республика Казахстан,
Алма-Атинская обл.
+
200
0201
Краснодарский край
–
201
0202
Краснодарский край
–
202
0203
Краснодарский край
–
203
0204
204
0205
205
0206
206
0207
207
0208
Erwinia amylovora
208
0209
Ralstonia solanacearum
209
0210
Erwinia amylovora
210
0211
Ralstonia solanacearum
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Pantoea stewartii subsp.
stewartii
Нами получен из
Германии
Нами получен из
Германии
ЮАР, ФГБУ
«Краснодарская МВЛ»
ЮАР, ФГБУ
«Краснодарская МВЛ»
г. Пенза, ул. Кирова, 25Д,
территория Троицкого
женского монастыря
Народная Республика
Бангладеш, ФГБУ
«Ленинградская МВЛ»
г. Пенза, ул. Кирова, 25Д,
территория Троицкого
женского монастыря
Арабская Республика
Египет, ФГБУ
«Ленинградская МВЛ»
–
–
_
_
+
_
+
_
42
211
0212
Erwinia amylovora
г. Пенза, ул. Кирова, 25Д,
территория Троицкого
женского монастыря
212
0213
Erwinia amylovora
Пензенская обл., р.п.
Тамала, ул. Пацаева, д. 23
+
213
0214
Erwinia amylovora
Пензенская обл., р.п.
Тамала, ул. 60 лет
Октября
+
214
0215
Erwinia amylovora
215
0216
Erwinia amylovora
216
0217
ДНК Erwinia pyrifoliae
217
0218
ДНК Erwinia uzenensis
Пензенская обл., р.п.
Тамала, пер. Березовый, д.
2
г. Пенза, ул. Кирова, 25Д,
территория Троицкого
женского монастыря
Проект Phytfire
(EUPHRESCO II)
Проект Phytfire
(EUPHRESCO II)
+
+
+
_
_
43
Приложение 2
Тесты, не требующие дополнительной оценки повторяемости
и воспроизводимости, касающиеся возбудителя бактериального
ожога плодовых культур Erwinia amylovora
(выдержка из Стандарта ЕОКЗР PM 7/20 (2))
Бессимптомные образцы
Прямое выделение возбудителя
(на среды CCT, King's B и Levan)
Обогащение DASI ИФА
Обогащение с последующей классической
ПЦР
Обогащение с последующей классической
ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992
Обогащение с последующим ПЦР-РВ в
соответствии с Gottsberger, 2010
Обогащение с последующим ПЦР-РВ в
соответствии с Pirc et al., 2009
Обогащение с последующим выделение
возбудителя (на среды King's и CCT)
Выделение возбудителя с последующей
проверкой реакции агглютинации
Выделение возбудителя с последующим
секвенированием ДНК
Выделение возбудителя с последующей
постановкой реакцией
сверхчувствительности
Выделение возбудителя с последующей
постановкой реакцией
иммунофлуоресценции
Выделение возбудителя с последующей
постановкой теста на патогенность
Образцы с симптомами
Реакция агглютинации
Биохимические тесты
Прямое выделение возбудителя (на среды
CCT, King's B и Levan)
Методы секвенирования ДНК
Обогащение DASI ИФА
Обогащение с последующим выделение
возбудителя (на среды King's и CCT)
Профили жирных кислот
Сверхчувствительная реакция
Реакция иммунофлуоресценции
Иммунохромотографический анализ
Nested-ПЦР в соответствии с Llop et al.,
2000
Тест на патогенность
ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992
ПЦР в соответствии с оптимизированным
протоколом Obradovic et al., 2007
ПЦР в соответствии с Stoger et al., 2006
ПЦР в соответствии с Taylor et al., 2001
ПЦР-РВ в соответствии с Gottsberger, 2010
ПЦР-РВ в соответствии с Pirc et al., 2009
44