Р.У. БЕЙСЕМБАЕВА, А.Т. МУРЗАГАЛИЕВА, Т.А. ЗАЦЕРКОВНАЯ, Г.К. ДЖАНАБЕКОВА ИММОБИЛИЗАЦИЯ МИКРОСОМАЛЬНОЙ PGH-СИНТАЗЫ

Р.У. БЕЙСЕМБАЕВА, А.Т. МУРЗАГАЛИЕВА, Т.А. ЗАЦЕРКОВНАЯ,
Г.К. ДЖАНАБЕКОВА
ИММОБИЛИЗАЦИЯ МИКРОСОМАЛЬНОЙ PGH-СИНТАЗЫ
(ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО "БИОГЕН",
бывший институт экспериментальной биологии)
Определены оптимальные концентрации микросомальной PGH-синтазы (по белку) в среде при
иммобилизации. Получены ферментные препараты с 93-97% исходной активностью
микросомальной PGH-синтазы
Введение. Важную функциональную роль во многих физиологических системах организма
млекопитающих играет простагландин-Н-синтаза (PGH-синтаза) - первый фермент биферментного
комплекса, ответственного за синтез биологически активных соединений простагландинов (PG).
Продукт простагландинсинтазной реакции PGH2 служит предшественником всех синтезируемых in
vivo соединений простагландинового типа. PGH-синтаза лимитирует весь процесс биосинтеза
простагландинов, поэтому активность и концентрация данного фермента являются ключевыми для
контроля уровня простагландинов в клетках /1-3/.
В настоящее время ведутся поиски факторов, активирующих и стабилизирующих in vitro PGHсинтазу /4,5/. Это направление исследований является закономерным и необходимым для
понимания всех аспектов регуляции процесса биосинтеза простагландинов в клетке. Кроме того,
наиболее эффективный биотехнологический метод получения простагландинов требует
стабильного в процессе реакции биокатализатора, для получения которого прежде всего нужно
найти пути стабилизации PGH-синтазы. Ранее нами было установлено, что иммобилизация
снижает скорость инактивации PGH-синтазы в процессе реакции и при хранении /6,7/.
В данной работе исследована зависимость активности иммобилизованной PGH-синтазы от
концентрации микросомального белка в среде при иммобилизации.
Материалы и методы
Объектом исследования служила микросомальная PGH-синтаза, выделенная из везикулярных
желез барана и матки овцы по методу Van der Ouderaa F.J. /8/.
Активность микросомальной и иммобилизованной PGH-синтазы определяли биосинтетическим
методом /9/.
Биосинтез простагландина Е2 из арахидоновой кислоты проводили в 0,1 М трис-HCl буфер при рН
7,8-8,5, 45 минут при 37ОС. За единицу активности микросомальной PGH-синтазы принимали
количество простагландина В2 (мкМ на 1 мг белка), который образуется в результате щелочной
изомеризации PGE2. Количество простагландина B2 находили по поглощению раствора при длине
волны, равной 278 нм (e=23000 мг-1см-1).
Количество микросомальной PGH-синтазы, связанной с силикагелем, определяли двумя
методами: 1) щелочным гидролизом, предложенным Chosh, et al. /10/; 2) по разнице количества
белка в растворе до и после иммобилизации
Для иммобилизации микросомальной PGH-синтазы применяли уравновешенный 0,1 М трис-HCl
буфером с рН 7,9-8,4 коммерческий препарат силикагеля, содержащий 13% CaSO4.
Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере фирмы IBM PC
286 с использованием пакета программ "Statgraph".
Результаты и их обсуждение
Ранее нами было установлено, что наиболее активные препараты иммобилизованной PGHсинтазы получаются при иммобилизации в 0,1 М трис-HCl буфере, в области рН 7,9-9,1, 4оС, 30
минут в присутствии адреналина и ионов кальция /6/. Активность иммобилизованных ферментных
препаратов составляла 83-84% от активности исходной микросомальной PGH-синтазы.
Одним из факторов, определяющим активность иммобилизованной PGH-синтазы, может быть
исходная концентрация микросомального белка. Известно /11/, что активность иммобилизованных
ферментов снижается при увеличении степени заполнения поверхности адсорбента белком,
например, в случае гексокиназы. Мы установили /7/, что активность иммобилизованной PGHсинтазы на силикагель зависит от скорости ее сорбции, которая определяется концентрацией
микросомального белка в среде при иммобилизации.
На первом этапе работы была определена оптимальная концентрация (по белку) микросомальной
PGH-синтазы в среде при иммобилизации. Суспензии микросом с исходной концентрацией 0,02 0,55 мг/мл (по белку) инкубировали с 0,5г силикагеля 25 минут при 4оС, в 0,1 М трис-HCl буфера,
рН 8,5. Затем сорбент отделяли от супернатанта, определяли активность каждого препарата и
количество связанного с носителем белка. Все препараты иммобилизованной PGH-синтазы
содержали по 0,56 мг белка на 0,5 г силикагеля. Из данных таблицы 1 видно, что каталитическая
активность иммобилизованной PGH-синтазы обратно пропорциональна концентрации
микросомального белка в среде при иммобилизации и максимальна при 0,02 мг/мл. Снижение
концентрации микросомального фермента до 0,01 мг/мл к увеличению активности фермента не
приводило.
Таблица 1.
Зависимость удельной активности иммобилизованной PGH-синтазы от концентрации
микросомального белка в растворе при иммобилизации
Концентрация микросомального
белка при иммобилизации (по
белку мг/мл)
Активность иммобилизованной
PGH-синтазы (мкмоль/мг белка)
0,02
0,05
0,08
0,11
0,28
0,55
125,0
±1,9
109,5 100,4 85,90 43,70 21,00
±1,6 ±1,8 ±1,7 ±1,5 ±1,9
На следующем этапе работы исследовали зависимость активности иммобилизованной PGHсинтазы от количества иммобилизованного фермента (по белку). Микросомальную PGH-синтазу
(0,02 мг/мл по белку) иммобилизовали на 0,5 г силикагеля. Количество микросомального белка в
среде изменяли за счет увеличения общего объема иммобилизационной смеси. Ферментные
препараты анализировали на количество иммобилизованного белка, на общую и удельную
активности. По результатам опытов строили изотерму сорбции. Из рисунка 1 видно, что изотерма
сорбции представляет собой две пересекающиеся прямые.
Точка пересечения этих прямых соответствует количеству микросомальной PGH-синтазы (по
белку), выше которого начинается образование полислоев.
Результаты анализа активностей ферментных препаратов показали (рис. 2), что общая активность
PGH-синтазы возрастает до тех пор, пока количество иммобилизованного белка не будет равно
0,57 мг, а удельная активность практически не меняется. Дальнейшее увеличение количества
сорбированного белка сопровождается снижением удельной активности при постоянном значении
общей активности.
Аналогичные исследования были проведены и для других концентраций микросомальной PGHсинтазы (0,04 мг/мл и 0,08 мг/мл по белку) при иммобилизации. Найдено, что для всех
исследуемых концентраций изотермы сорбции, а также зависимости общей и удельной активности
PGH-синтазы от количества иммобилизованного белка подобны. Отмечено лишь различие в
количестве иммобилизованного микросомального белка, выше которого удельная активность
начинает снижаться, для концентрации 0,04 мг/мл - 0,48 мг, для 0,08 мг/мл - 0,34мг.
Рисунок 1.
Изотермы сорбции микросомальной PGH-синтазы
Ось абсцисс - количество микросом в растворе до иммобилизации (мг по белку). Ось ординат количество микросом, связанное с сорбентом (мг по белку).
Рисунок 2.
Зависимость активности иммобилизованной
PGH-синтазы от количества сорбированного белка
Ось абсцисс - количество микросом, связанное с сорбентом (мг по белку). Ось ординат: 1 - общая
активность PGH-синтазы (мкмоль); 2 - удельная активность (мкмоль/мг белка).
Наиболее высокую активность проявляет ферментный препарат, полученный иммобилизацией
микросомальной PGH-синтазы при концентрации свободных микросом - 0,02 мг/мл. Она
составляла 93% исходной активности фермента, тогда как для двух других исследованных
концентраций - 85%, 79% соответственно.
Условия иммобилизации, разработанные для микросомальной PGH-синтазы везикулярных желез
барана, были применены для микросомального фермента, выделенного из матки овцы. При
сравнительном исследовании свойств препаратов иммобилизованной PGH-синтазы везикулярных
желез барана и матки овцы было установлено, что в обоих случаях получены ферментные
препараты с сохранением 93-97% исходной активности. Следовательно, разработанные нами
условия сорбции могут быть использованы для иммобилизации микросомальной PGH-синтазы,
выделенной из разных органов овец.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гончар М.В., Сергеева М.Г., Мевх А.Т. Варфоломеев С.Д. Регуляция арахидоновой кислотой
синтеза простагландинов в макрофагах // Биохимия.- 1999. Т.64, №2.С.239-246.
2. Абрамченко В.В., Новиков Е.И. Использование простагландинов в акушерстве // Акушерство и
гинекология. 1982. № 9. С 16-18.
3. Горомыхина Н.Ю., Козлова В.А. Простагландины как фактор регуляции гуморального иммунного
ответа // Иммунология. 1982. № 5. С.11-15.
4. Tam S.S.C., Lee D.S., Wang E.Y., Munroe D.G., Lau C.Y. Tepoxalin, a Novel Dual Inhibitor of the
Prostaglandin-H Synthase Cyclooxygenase and Peroxidase Activities // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270.
P.13948-13955.
5. So O.-Y., Scarafia L.E.,. Mak A.Y, Callan O.H., Swinney D.C. The Dynamics of Prostaglandin H
Synthases. Studies with Prostaglandin H synthase 2 Y355F unmask Mechanisms of time-dependent
inhibition and allosteric Activation // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 5801-5807
6. Beisembaeva R.U., Zatserkovnaya T.A., Kuznetsova Yu.A., Mevkh A.T. Prostaglandin H Synthase
Immobilized on Silica Gel: Stability and Activity // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 1999. V. 25,
№ 3, P.156-160.
7. Зацерковная Т.А., Бейсембаева Р.У. Иммобилизация микросом из везикулярных желез барана
на силикагеле // Известия АН НАН РК сер. биол. 1996. №2, С.42-44.
8. Van der Ouderaa F.J., Buytenhek M., Nugetered D.H., Van Dorp D.A. Purification and characterisation
of prostaglandin endoperoxide synthetase from sheep vesicular glands. // Biophys.Acta. 1977. Vol.487.
P.315-331.
9. Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины - молекулярные биорегуляторы. М.: МГУ, 1985. 307 с.
10. Chosh D., Mukerjee E., Dutta J. Stabilisation of prostaglandin synthetas by immobilisation of goat
seminal microsomes on silicagel G // Indian J. of Biochem and Biophys. 1990. Vol.27, № 2. P. 76-80.
11. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты. M: МГУ, 1976. Т1. С.296.
SUMMARY
Optimal terms of PGH-synthase immobilization were defined as a result of special researches. The
obtained enzyme preparation showed 93-95 per cent of the initiale activity.