Методические рекомендации по выявлению возбудителя
advertisement
Государственный комитет Российской Федерации по рыболовству Национальный центр качества и безопасности рыбной продукции (Нацрыбкачество) Мухина Л. Б., Дмитриева Е. Ю., Борисовская Э. Н. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по выявлению возбудителя листериоза LISTERIA MONOCYTOGENES в рыбе и рыбной продукции Санкт-Петербург «Моринтех» 2003 УДК 637.56:576.8 ББК 36.1 +36.94 Рекомендовано к публикации решением Научно-технического совета «Нацрыбкачество» от 21 октября 2002 г. Мухина Л. Б., Дмитриева Е. Ю., Борисовская Э. Н. Методические рекомендации по выявлению возбудителя листериоза Listeria monocytogenes в рыбе и рыбной продукции. СПб.: Моринтех, 2003. -28с. Методические рекомендации разработаны сотрудниками Национального центра качества и безопасности рыбной продукции (Санкт-Петербург) на основе многолетнего опыта исследовательской работы по оценке эффективности различных методов выявления патогенных листерий в рыбной продукции. В основу Методических рекомендаций положены ГОСТ 51921-2002, МУК 4.2.1122-02 и международный стандарт ISO 11290-1. В Методических рекомендациях освещены биологические особенности листерий, существенные для их выявления и идентификации в неклинических образцах, а также специфические проблемы, возникающие при анализах рыбных продуктов. Методические рекомендации предназначены для использования в качестве отраслевого документа микробиологами испытательных центров в рутинных и арбитражных микробиологических анализах, а также предприятиями, организациями, учреждениями, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой рыбной продукции. The manual is developed by specialists of the National Center of quality and safety of fishery products (St.-Petersburg) on the basis of long-term experience in research of efficiency evaluation of various methods of pathogenic listeria revealing in fishery products. The Manual is based on the standards of the Russian Federation ГОСТ 51921 -2002, МУК 4.2.1122-02 and the international standard ISO 11290-1. The biological properties of listeria, essential for their revealing and identification in samples that are not clinical, as well as specific problems arising at the analyses of fishery products are covered in the Manual. The manual is intended to be used by microbiologists of test centers and offish industry during the routine and arbitration microbiological analyses, and also by enterprises, organizations, establishments, carrying out their activities is in the field of food fishery products handling. ISBN 5-93887-017-8 © Мухина Л. Б., 2003 © Дмитриева Е. Ю., 2003 © Борисовская Э. Н., 2003 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ 1.1. Целью настоящих Методических рекомендаций является повышение эффективности и сокращение продолжительности процедуры выявления возбудителя листериоза — Listeria monocytogenes в свежей, охлажденной, мороженой рыбе и продукции, изготавливаемой из нее. 1.2. Методические рекомендации предназначены для использования в рутинных и арбитражных микробиологических анализах микробиологическими лабораториями рыбной отрасли, предприятиями, организациями, учреждениями, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой рыбной продукции, организациями Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющими государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством пищевой рыбной продукции. 1.3. Настоящие Методические рекомендации разработаны в соответствии с ГОСТ 51921 2002, МУК 4.2.1122-02 и международным стандартом ISO 11290-1. 2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 2.1. Listeria monocytogenes — бактериальный патоген III группы опасности. 2.2. L. monocytogenes способна сохранять жизнеспособность и размножаться вне организма хозяина. L. monocytogenes встречается в загрязненной стоками озерной, речной воде, в прибрежной зоне заливов. L.monocytogenes может поселяться на поверхности тела рыб, используя в качестве источника питания эскулин рыбьей слизи. 2.3. Присутствие L.monocytogenes в рыбе и рыбной продукции характеризуется низкой численностью и неравномерным распределением. 2.4. Обнаружение L. monocytogenes в рыбе и рыбной продукции усложняется следующими обстоятельствами: пониженной жизнеспособностью клеток L.monocytogenes, низкой скоростью их размножения, присутствием посторонней микрофлоры, превышающей численность листерий на несколько порядков. 2.5. В этих условиях выявление листерий достигается проведением стадии накопления в богатой питательной среде в два этапа. На первом этапе накопления концентрацию антибиотиков снижают в два раза. В результате этого поврежденные клетки листерий восстанавливают жизнеспособность и размножаются до уровня, достаточного для их обнаружения. Накопительную культуру высевают на твердую диагностическую среду. Типичные колонии листерий отсевают и идентифицируют до вида по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам. Чувствительность метода — 1—2 жизнеспособные клетки листерий и более в 25 г продукта. 2.6. Для повышения надежности и ускорения видовой идентификации листерий рекомендуется использовать наборы для видовой идентификации листерий типа API-тест или автоматический твердофазный иммуноферментный анализатор VIDAS фирмы Biomerieux, Франция. Отобранные клоны, подозрительные на L.monocytogenes, в обязательном порядке следует подтверждать по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам по ГОСТ 51921-2002 и МУК 4.2. И22. 2.7. Персонал отраслевых микробиологических лабораторий перед началом работы по выявлению листерий должен пройти предварительное обучение методам выделения и идентификации патогенных листерий в «Национальном центре безопасности и качества рыбной продукции» («Нацрыбкачество») или уполномоченных им лабораториях и получить аттестационное удостоверение. 3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ 3.1.Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii и Listeria seeligeri — контрольные штаммы для проверки правильности проведения тестов, Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi — для САМР-теста — получают через «Нацрыбкачество». 4. СРЕДЫ И РЕАГЕНТЫ 4.1. Среды для поддержания изолятов, выращивания посевного материала, проверки подвижности. 4.1.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1% глюкозы, полужидкий питательный агар с 1% глюкозы и 0,8% агар-агара или их западные аналоги. 4.2. Среды накопления. 4.2.1. Питательный бульон для выделения листерий — ПБЛ (ГНЦ «Прикладная микробиология», Оболенск). Состав среды (г/л): гидролизат казеина ферментативный 10,0; пептон ферментативный мясной— 15,0; гидролизат автолизованных дрожжей — 2,0; хлорид натрия — 3,5; хлорид лития — 3,0; рН 7,0±0,2. Перед употреблением к 1 л основы среды добавляли 4,44 мл раствора антибиотиков (в 10 мл физиологического раствора растворить 10 мг налидиксовой кислоты, 5 мг акриф-лавина, 5 мг полимиксина В сульфата). 4.2.2. Бульон Фразера (Fraser broth) — прототип среды ПБЛ. Состав среды (г/л): гидролизат казеина ферментативный — 5,0; мясной пептон — 5,0; дрожжевой экстракт — 5,0; хлорид натрия— 20,0; дигидрофосфат калия— 1,35; гидрофосфат натрия — 12,0; эскулин — 1,0; хлорид лития — 3,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; рН 7,2. На 1-й стадии накопления на 1 л среды добавляют селективные компоненты: налидиксовой кислоты — 10 мг, акрифлавина — 12,5 мг; на 2-й стадии — эти же добавки вносят в 0,5 л среды. 4.2.3. L-PALCAM-бульон (L-PALCAM-Listeria Selective Enrichment Broth) — отечественный аналог отсутствует. Данная среда используется в одну стадию накопления, рекомендуется для обнаружения листерий в образцах с высокой численностью посторонней микрофлоры. Состав среды (г/л): пептон — 23,0; крахмал — 1,0; натрий хлористый — 5,0; маннит — 10,0; железо аммоний цитрат — 0,5; эскулин — 0,8; глюкоза— 0,5; литий хлористый — 15,0; феноловый красный — 0,08. Селективные агенты: налидиксовой кислоты — 20 мг, 0,01 полимиксина В сульфата— 10 мг, акрифлавина— 10 мг растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, вносили 4,44 мл в 1 л среды, рН 7,2. 4.3. Диагностические среды. 4.3.1. Питательный агар для выделения листерий — ПАЛ (ГНЦ «Прикладная микробиология», Оболенск). Состав среды (г/л): гидролизат казеина панкреатический — 10,0; гидролизат автолизованных дрожжей — 2,0; хлорид натрия — 3,5; хлорид лития— 15,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; эскулин — 0,8; агар-агар — 13,0; рН 7,2±0,2. Селективные агенты: налидиксовой кислоты — 20 мг, полимиксина В сульфата —10 мг, акрифлавина — 10 мг растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, вносили 4,44 мл в 1 л среды. 4.3.2. L-PALCAM-агар (L-PALCAM-Listeria Selective Agar) — отечественный аналог отсутствует. Состав среды (г/л): пептон — 23,0; крахмал — 1,0; хлорид натрия — 5,0; эскулин — 0,8; хлорид лития — 15,0; цитрат аммонийного железа — 0,5; глюкоза — 0,5; маннит— 10,0; феноловый красный — 0,08; агар-агар— 13,0. рН 7,0±0,2. На 1л среды добавляли: акриф-лавина — 5 мг, полимиксина В — 10 мг, цефтацидина — 20 мг в 10 мл стерильной дистиллированной воды. 4.4. Питательные среды готовят согласно инструкциям фирм-изготовителей накануне или непосредственно перед использованием. Готовые среды защищают от яркого света, так как акрифлавин, входящий в их состав, может окисляться на свету с образованием продуктов, подавляющих рост листерий. 4.5. Среды Гисса, содержащие рамнозу и ксилозу, для определения сбраживающей активности изолятов листерий, их импортные аналоги, или диски с соответствующими источниками углерода. Допускается использовать среды Гисса с агар-агаром. 4.6. Кровяной агар для определения бета-гемолитической активности, готовят добавлением к питательному агару, или импортной основе кровяного агара 5% по объему дефибринированной крови или суспензии эритроцитов барана. 4.7. Поливалентная листериозная сыворотка для реакции агглютинации на стекле из набора сывороток для типизации листерий (например, Ставропольской биофабрики), поставляется в рабочем разведении. 4.8. Питательные среды и диагностикумы для быстрой видовой идентификации листерий. 4.8.1. «API-Listeria» — стриповый диагностикум фирмы Biomerieux (Франция) для идентификации видов листерий по биохимическим признакам и способности листерий к гемолизу, используется по инструкции фирмы-изготовителя. 4.8.2. «VIDAS LMO/miniVIDAS LMO» — набор фирмы BioMerieux (Франция) для автоматического анализатора VIDAS/miniVIDAS для обнаружения L.monocytogenes на стадии диагностики методом твердофазной ферментзависимой иммунофлюоресценции используется по инструкции фирмы-изготовителя. 4.9. Физиологический раствор (0,85%-ный водный раствор хлорида натрия) — для реакции агглютинации и приготовления разведений накопительных культур. 5. МЕТОДЫ ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ К АНАЛИЗУ 5.1. При анализе продукции, поставляемой на внутренний рынок, содержание L.monocytogenes оценивают количественно методом наиболее вероятных чисел, выявляя патоген в 3 повторностях по 10 г, 1г и 0,1г. При анализе экспортной рыбной продукции содержание L.monocytogenes оценивают альтернативным методом (есть/нет) в 5 точечных пробах по 25 г. 5.2. Подготовка проб к анализу. 5.2.1. При анализе продукции, поставляемой на внутренний рынок, отбирают 2 точечные пробы по 25 г. При наличии кожи в исследуемом продукте ее обязательно вводят в состав отбираемой пробы в максимальном количестве, но не более половины массы пробы. Пробы измельчают до кусочков размером 1 см3, хорошо перемешивают и отвешивают 3 раза по 11,1 г в три стерильных пакета гомогенизатора Стомакер или последовательно в стакан Блендера. К каждой навеске добавляют по 100 мл среды накопления и гомогенизируют образец в течение 1-1,5 мин. Гомогенаты выливают в 3 стерильные колбы. Из каждой колбы переносят в три пустые пробирки по 10 мл гомогената и в три пробирки — по 1,0 мл гомогената. В пробирки с 1,0 мл гомогената дополнительно вносят по 2 мл среды накопления. 5.2.2. В случае анализа экспортной продукции каждую точечную пробу по 25 г помещают в пакет Стомакера или стакан Блендера, приливают 225 мл среды накопления и проводят гомогенизацию в течение 1-1,5 мин. Гомогенаты переносят в 5 стерильных колб для культивирования. 5.2.3. При анализе свежей и охлажденной рыбы, в которой ожидается большое содержание посторонних микроорганизмов, рекомендуется использовать PALCAM-бульон. При анализе образцов, где вероятно присутствие поврежденных клеток листерий (соленая, копченая, сушеная рыба), следует использовать более мягкую среду накопления: ПБЛ или бульон Фразера. 6. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ 6.1. Стадия накопления. 6.1.1. Накопление листерий проводят в две стадии. На первой стадии пробы инкубируют при 30°С 24 часа в среде ПБЛ или бульоне Фразера (1/2 концентрации антибиотиков). На второй стадии 0,1 мл культуры переносят в 10 мл среды ПБЛ или бульона Фразера с полной концентрацией антибиотиков. Посевы инкубируют еще 24-48 ч при 30°С. 6.1.2. Накопление листерий в PALCAM-бульоне (п. 5.2.2) проводят в одну стадию, посевы инкубируют при 30°С 48 ч. 6.1.3. Регистрация результатов. 6.1.3.1. В бульоне Фразера (но не в среде ПБЛ) рост листерий сопровождается почернением среды в результате расщепления бактериями эскулина до эскулетина и глюкозы и взаимодействия эскулетина с ионами Fе+3. Отсутствие почернения бульона Фразера не является основанием для прекращения анализа с отрицательным ответом. 6.1.3.2. Размножение бактерий, расщепляющих эскулин в PALCAM-бульоне, также сопровождается изменением цвета среды с красной на черную или оливково-коричневую. Слабый рост, нетипичное изменение цвета среды или отсутствие изменения цвета не являются основанием для прекращения анализа с отрицательным ответом. 6.2. Диагностический высев. 6.2.1. Из накопительных культур готовят с помощью физиологического раствора серийные десятикратные разведения и проводят поверхностный высев по 0,1 мл на PALCAM-агар. 6.2.2. Посевы инкубируют 48 ч при 30°С. 6.2.3. Регистрация результатов, выбор клонов для идентификации. 6.2.3.1. Колонии всех видов листерий на PALCAM-агаре имеют одинаковый внешний вид: на 2-е сутки они маленькие, диаметром 1,0-2,0 мм зеленовато-серые, полупрозрачные с черным ореолом. На 3^-е сутки у колоний листерий темнеет и углубляется центр, что позволяет безошибочно их отличить от колоний посторонних микроорганизмов. 6.2.3.2. Колонии L.grayi на PALCAM-агаре имеют желтый оттенок, среда вокруг колоний окрашивается в желтый цвет, что указывает на потребление маннита и крахмала (маннит- и крахмал-положительные колонии). 6.2.3.3. Для идентификации отсевают не менее 10 типичных листериозных колоний, исключая маннит- и крахмал-положительные колонии L.grayi. Потребность в анализе большого числа клонов листерий объясняется присутствием в образце разных видов листерий, а также высокой гетерогенностью популяций L.monocytogenes по идентификационным признакам. 6.3. Стадия подтверждения. 6.3.1. Для идентификации отсеянных клонов листерий, предположительно L.monocytogenes, L.innocua, L.seeligeri, L.ivanovii и L.welshimeri, согласно ГОСТ 51921-2002 и МУК 4.2.1122, следует установить родовые и видовые признаки. К родовым признакам относят: морфологию клеток, окраску по Граму, каталазный тест, проверку подвижности культур при двух инкубационных температурах 22° и 37°С, реакцию агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой к листериям. К видовым признакам относят: сбраживание рамнозы, ксилозы и маннита, бета-гемолитическую активность, САМР-тест. 6.3.2. При окрашивании по Граму (ГОСТ 1044.3) листерий выглядят как короткие грамположительные палочки. 6.3.3. Подвижность проверяют в суточных посевах листерий, выращенных при 22 и 37°С уколом в полужидкий питательный агар. Листерий подвижны при 22°С и слабо подвижны или неподвижны при 37°С. При положительном ответе рост листерий в полужидком агаре напоминает раскрытый зонтик. 6.3.4. Для оценки наличия каталазы на поверхность 1 — 2—суточного штриха проверяемого клона наносят каплю 3-5%-ного свежего водного раствора перекиси водорода. Появление выделяющихся пузырьков газа указывает на наличие каталазы в бактериальных клетках. Листерий образуют катал азу. 6.3.5. Для проведения реакции аглютинации изоляты листерий выращивают при 22-3 0°С на твердой питательной среде в течение 24 ч. Бактериальную массу смывают физиологическим раствором и готовят густую суспензию. Реакцию агглютинации проводят на предметном стекле с помощью поливалентной листериозной агглютинирующей сыворотки согласно инструкции фирмы-изготовителя. Положительная реакция исследуемого изолята с поливалентной сывороткой является признаком, необходимым для его отнесения к роду Listeria, но не достаточным, поскольку у листерий имеются общие поверхностные антигены с бациллами и микрококками. 6.3.6. Для определения сбраживания рамнозы, ксилозы клоны пересевают на короткий пестрый ряд в жидкие среды Гисса. Культивирование проводят при 37°С до 7 дней, ежедневно проверяя кислото- и газообразование. Большинство изолятов L.monocytogenes уже на вторые сутки демонстрирует рост на рамнозе с подкислением без газообразования (табл. 1). Некоторые изоляты L.monocytogenes сбраживают рамнозу на 5-7 день культивирования. Большинство изолятов L.ivanovii и L.seeligeri не сбраживают рамнозу и маннит, но сбраживают ксилозу. 6.3.7. Сбраживание маннита проверяют только у тех клонов, для которых не удалось однозначно установить этот признак на PALCAM-агаре. 6.3.8. Способность к гемолизу. Исследуемые клоны засевают штрихами на питательный агар с кровью или эритроцитами барана. Посевы инкубируют при 37°С 48 ч. Чашки просматривают в проходящем свете и сравнивают с контрольными высевами музейных штаммов листерий. L.monocytogenes обладает низкой бета-гемолитической активностью и образует, как и L.seeligeri, узкую зону лизиса эритроцитов около 1мм шириной. У L.ivanovii зона гемолиза значительно шире, до 10 мм шириной, и более четкая. У некоторых изолятов L.monocytogenes гемолитическая активность настолько мала, что просветление кровяного агара может быть отмечено только после снятия бактериальной массы с агара петлей. Некоторые изоляты L.monocytogenes лишены гемолитической активности. Под штрихами некоторых изолятов L.innocua на кровяном агаре может наблюдаться просветление питательной среды, связанное с образованием кислотных продуктов метаболизма. Таблица 1 Характеристика видов рода Listeria Признак L. mono- L. ivanovii cytogenes L. seeligeri L. innocua L. welshimeri L. grayi — + — + — — + + — + + + — +/— — — +/+ — + — — — — + + — — + — — — — — — Ферментация: маннита рамнозы ксилозы Бета-гемолиз САМР-тест около штриха: Rh.equi S.aureus 6.3.9. Для проведения CAMP-теста используют 2-3-суточ-ные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi. Посев проводят на кровяной агар вертикальными штрихами, как показано на рисунке. Исследуемые клоны листерий высевают параллельными штрихами на расстоянии 1 см друг от друга и 0,5 см от вертикальных штрихов S.aureus и Rh.equi. Желателен одновременный высев музейных штаммов L.monocytogenes и L.ivanovii. Инкубацию проводят 24 ч при 37°С. САМР-тест считают положительным, если имеет место расширение и/или просветление зоны гемолиза в зонах, соседствующих с вертикальными штрихами стафилококка или родококка. Типичной картиной CAMP-теста для L.monocytogenes является расширение или просветление зоны гемолиза около штриха St.aureus и отсутствие изменений гемолитической зоны рядом со штрихом Rh.equi (S+/R-) (табл. 1). Некоторые изоляты L.monocytogenes из неклинических образцов могут давать нетипичный ответ в САМР-тесте (S+/R+; S-/R-). 6.4. Ускоренная идентификации листериозных изолятов. Для повышения эффективности выявления L.monocytogenes в рыбе и рыбных продуктах, как наиболее сложных для анализа, целесообразно изменить последовательность проведения отдельных этапов идентификации изолятов листерий и придать новое значение результатам CAMP-теста. 6.4.1. Колонии листерий с PALCAM-агара (L.monocytogenes, L.innocua, L.seeligeri, L. ivanovii и L.welshimeri) — 10-15 клонов — высевают непосредственно на кровяной агар сразу в варианте САМР-теста. Любой положительный ответ в САМР-тесте является подтверждением наличия у изолята гемолитической активности и целесообразности продолжения изучения его принадлежности к виду L.monocytogenes. При наличии слабой гемолитической активности (ширина зоны до 1 мм) любой положительный ответ в CAMPтесте является подтверждением наличия у изолята гемолитической активности и целе- сообразности изучения его принадлежности к L.monocytogenes. При наличии зоны гемолиза шириной 5-10 мм изолят относят к виду L.ivanovii и далее не рассматривают. Отсутствие гемолитической активности и отрицательный ответ в САМР-тесте у всех исследованных клонов листерий формально позволяет дать отрицательный ответ о наличии L.monocytogenes в исследуемом образце. Тем не менее, некоторые из них могут оказаться L.monocytogenes, но для их идентификации необходимы методы, не связанные с физиологической активностью, например, иммуноферментный анализ. Рис. Схема посева изолятов листерий на кровяной агар при постановке САМР-теста: S и R — штрихи St. aureus и Rh. equi, соответственно; параллельные центральные штрихи — исследуемые клоны листерий 6.4.2. Изоляты листерий, обнаружившие гемолитическую активность в САМР-тесте, высевают на твердые среды Гисса с рамнозой и ксилозой толстыми короткими штрихами. Посевы инкубируют при 37°С 24-48 ч. Пожелтение среды в результате выделения кислых продуктов метаболизма на твердой питательной среде регистрируется быстрее, чем на жидкой. Если среди изучаемых клонов обнаруживаются рамноза-положительные и ксилозаотрицательные изоляты их предварительно относят к виду L.monocytogenes и изучают у них родовые признаки: морфологию, окраску по Граму, подвижность при двух температурах, реакцию агглютинации. 6.4.3. Подтверждение родовых признаков у гемолитичных штаммов листерий, сбраживающих рамнозу и не сбраживающих ксилозу, позволяет дать положительное заключение о присутствии в исследуемой пробе (25 г, 10 г, 1 г или 0,1 г) L.monocytogenes. 6.4.4. Для сокращения числа проверяемых клонов листерий и времени, необходимого для их идентификации, на стадии PALCAM-arapa рекомендуется использовать диагностические хромогенные питательные среды и диагностикумы типа API-тест. 6.4.5. Отобранные с помощью диагностикумов или хромо-генных питательных сред клоны листерий, соответствующие по описанию L.monocytogenes, следует в обязательном порядке перепроверять по стандартным признакам: морфологии клеток, окраске по Граму, каталазному тесту, подвижности при 22° и 37°С, способности потреблять рамнозу, ксилозу, маннит, осуществлять гемолиз эритроцитов барана. 7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 7.1. Результаты выявления L.monocytogenes оценивают по каждой пробе (10 г, 1 г, 0,1 г или 25 г) отдельно. 7.2. В пробе констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если из среды накопления выделены и изучены не менее 10 эскулин-положительных листериозных колоний, и хотя бы для одной из них показано наличие коротких грамположительных, каталазо-положительных, подвижных при 22°С, и неподвижных или слабо подвижных при 37°С палочек, дающих положительную реакцию с поливалентной листериозной сывороткой в реакции агглютинации на стекле, сбраживающих рамнозу и не сбраживающих маннит и ксилозу с образованием кислоты, вызывающих на кровяном агаре бета-гемолиз в виде узкой зоны шириной 0,5-1,0 мм или зоны просветления под штрихом, дающих любую положительную реакцию в САМР-тесте. 7.3. Заключение о выявлении L.monocytogenes в исследуемом продукте. 7.3.1. Для продукции внутреннего рынка содержание L.monocytogenes выражают в виде наиболее вероятного числа. Для его определения составляется трехзначная числовая характеристика образца, в котором первая цифра соответствует числу проб по 10 г, в которых выявлена L.monocytogenes; вторая цифра — число проб по 1 г, в которых выявлена L.monocytogenes; третья цифра — число проб по 0,1 г, в которых выявлена L.monocytogenes. Используя числовую характеристику по табл. 2 находят наиболее вероятное число клеток L.monocytogenes в 10 г. 7.3.2. Содержание L.monocytogenes, согласно СанПиН 2.3.2.1078-01, для нормированных рыбных продуктов должно быть менее 1 клетки в 25 г продукта или менее 0,4 клетки в 10 г. 7.3.3. Для экспортной продукции оценивают присутствие L.monocytogenes в каждой из 5 точечных проб по 25 г. Если L.monocytogenes обнаруживают хотя бы в одной из пяти проб, качество продукта считают недопустимым. 8. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 8.1. К работе по выявлению патогенных листерий допускаются лаборатории, аккредитованные в системе Госсанэпиднадзора на работу с патогенными микроорганизмами III и IV групп. 8.2. Для работы с патогенными листериями желательно выделить отдельное помещение. 8.3. Следует проводить своевременную (до мойки) стерилизацию отработанных сред, бактериальных культур, пробирок, пипеток, стрипов. Рабочие поверхности столов после работы следует обеззараживать в течение 10 мин дезинфицирующими растворами: 3% хлорамином, нейтральным анолитом АНК — 100-200 мг хлора/л, получаемым на установках СТЭЛ. Руки следует мыть бактерицидным мылом. Таблица 2 Наиболее вероятное число (НВЧ) клеток L.monocytogenes в исследуемом продукте, определяемое по числовой характеристике образца* Числовая характеристика 000 НВЧ кл в 10 г 001 0,3 203 - 002 - 210 1,5 003 - 211 2,0 010 0,3 212 3,0 011 0,6 213 - 012 - 220 2,0 013 - 221 з,о 020 0,6 222 3,5 021 - 223 4,0 022 - 230 3,0 030 - 231 3,5 031 - 232 4,0 100 0,4 300 2,5 101 0,7 301 4,0 102 1,1 302 6,5 103 - 303 - 110 0,7 310 4,5 111 1,1 311 7,5 112 - 312 11,5 113 - 313 16,0 120 1,1 320 9,5 0,0 Числовая характеристика 202 НВЧ кл в 10 г 2,0 121 1,5 321 15,0 122 - 322 20,0 123 - 323 30,0 130 1,6 330 25,0 131 - 331 65,0 132 - 332 110,0 200 0,9 333 140,0 201 1,4 * Числовая xaрактеристика — это трехзначное число, в котором первая цифра соотв етствует числу проб по 10 г, в которых выявлена L.monocytogenes; вторая цифра — число проб по 1 г, в которых выявлена L.monocytogenes; третья цифра — число проб по 0,1 г, в которых выявлена L.monocytogenes. 8.4. Накопительные и диагностические среды для листерий содержат токсические компоненты. При попадании на кожу их следует смывать большим количеством воды. 9. ЛИТЕРАТУРА 9.1. Обязательная литература. 9.1.1. ГОСТ Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes. 9.1.2. МУК 4.2.1122-02. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. 9.1.3. ISO 11290-1. Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Горизонтальный метод определения и подсчета L.monocytogenes. 9.1.4. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. 9.1.5. Лабораторная диагностика листериоза животных илюдей, меры борьбы и профилактики (Инструктивные документы).-М., 1996. 9.2. Вспомогательная литература. 9.2.1. Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерий: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // Медицина для всех.- М., 2002. 9.2.2. Бакулов И. А., Котляров В. М., Душко Т. И. Листериоз — пищевая инфекция (масштабы опасности, методы индикации и меры борьбы) // Ветеринария. № 4. 1991. С. 3235. 9.2.3. Васильев Д. А., Барышников П. И., Белоусов В. Е. О серологической диагностике листериоза // Ветеринария № 10 С. 64-65. 9.2.4. McKeller R.C. Use of the CAMP test for identification of Listeria monocytogenes // Applied Environmental Microbiology. 1994. Vol. 60. № 12. P. 4219-4225. Государственный комитет Российской Федерации по рыболовству Национальный центр качества и безопасности рыбной продукции Тел.: (812) 321-96-02 Факс: (812) 320-73-23 E-mail: nfq@mail.ru; www.nfg.org.ru Основные направления нашей работы = Оказание консультативной помощи предприятиям рыбной отрасли в организации производственной деятельности от вылова сырья до реализации готовой продукции в соответствии с международными и отечественными стандартами; = Разработка и внедрение «Системы сертификации процессов производства продукции из гидробионтов» - GMP и системы собственного контроля, основанной на принципах НАССР; = Регистрация предприятий и судов, экспортирующих рыбную продукцию в страны ЕС, Швейцарию, Эстонию, Литву; = Инспекция предприятий и судов, экспортирующих рыбную продукцию в страны ЕС, Швейцарию, Эстонию, Литву. Выдача сертификатов (HEALTH CERTIFICATE) на отгружаемую продукцию; = Организация и проведение всероссийских и международных выставок, смотровконкурсов, конференций с целью расширения контактов, укрепления партнерских отношений, обмена опытом. = Оказание информационной поддержки предприятиям рыбной отрасли. Презентация деятельности предприятий в Мировой сети Интернет. Пропаганда передового опыта отечественных и зарубежных предприятий; = Разработка нормативно-технической документации для рыбной отрасли с учетом международных и отечественных стандартов, норм, правил, а также требований, действующих в ЕС, для создания правовых, экономических и хозяйственных условия эффективного развития предприятий и сбыта рыбной продукции; = Аудит санитарного и материально-технического состояния предприятий с целью выдачи рекомендаций по его совершенствованию, включая мероприятия по предупреждению распространения возбудителя листериоза; = Обучение специалистов по вопросам качества и безопасности рыбной продукции, включая санитарные нормы и требования к производству рыбной продукции от вылова до реализации. Национальный центр качества и безопасности рыбной продукции представляет следующие документы ЕС по рыбной продукции НАЗВАНИЕ Цена с НДС, руб. Директива 91/493/ЕЕС. Производство и поставка на 600 рынок рыбной продукции. Директива 95/71/ЕС. Дополняющая Приложение к Ди60 рективе 91/493. Решение 94/356/ЕС. Подробные правила применения 240 Директивы Совета 91/493/ЕЕС в отношении собственных проверок на рыбопродукцию. Директива 92/48/ЕЕС. Минимальные гигиенические 120 равила, применяемые к рыбе, находящейся на борту определенных судов. Решение 93/140/ЕС. Подробные правила визуальной 60 проверки рыбной продукции для обнаружения паразитов. Правило 1065/2001. Информирование потребителей о 120 рыбной продукции и аквакультуры. Директива 79/923/ЕЕС. Требования, предъявляемые к 140 качеству вод обитания ракообразных. Директива 91/492/ЕЕС. Производство и поставка на 500 рынок живых двустворчатых моллюсков. Решение 93/25/ЕС. Определенная обработка для 60 предотвращения развития патогенных микроорганизмов в двустворчатых и морских брюхоногих моллюсках. Директива 93/43/ЕС. О гигиене пищевых продуктов 300 Решение 93/51/ЕС. Микробиологические критерии произ60 водства готовых ракообразных и моллюсков в раковинах. Решение 95/328/ЕС. Санитарная сертификация рыбной 60 продукции из третьих стран, на которые еще нет отдельного Решения. Решение 96/333/ЕС. Санитарная сертификация живых 60 двустворчатых моллюсков, иглокожих, оболочников и морских брюхоногих моллюсков из третьих стран, для которых нет отдельного Решения. Решение 97/20/ЕС. Список третьих стран, выполняющих 60 условия соответствия для производства и поставки на рынок живых двустворчатых моллюсков, иглокожих, оболочников и морских брюхоногих моллюсков. Правило 1093/94. Прямая отгрузка выловов третьих 75 стран. ЗАО "ЭРИДАН" Тел/факс: (812) 234-42-28, 234-01-68 ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТАЯ ТЕХНОЛОГИЯ XXI ВЕКА Установки СТЭЛ позволяют методом электрохимической активации получить высокоэффективный, экологически безопасный и экономически выгодный дезинфицирующий раствор - нейтральный анолит АНК и моющий раствор - католит. Анолит и католит получают из воды и поваренной соли, расход электроэнергии не превышает 10 Вт/час/литр, что обуславливает их низкую себестоимость. Анолит эффективен против всех групп микроорганизмов, в том числе и листерий, и по своей эффективности превосходит хлорамин и гипохлорид натрия. Установки СТЭЛ допущены Департаментом Госсанэпиднадзора к применению на производствах пищевой промышленности. Варианты использования Анолит и католит могут быть легко получены на месте применения в необходимых объемах. Установки СТЭЛ рекомендуются для проведения всех видов санитарной обработки предприятий рыбообрабатывающей отрасли («Рекомендации по применению дезинфицирующего раствора «нейтральный анолит АНК», вырабатываемого на установках типа СТЭЛ, на рыбоперерабатывающих предприятиях РФ», 2003). Экологическая безопасность Действующие компоненты анолита АНК и католита безопасны и не являются веществами-ксенобиотиками, они не оказывают вредного воздействия на организм человека и теплокровных животных. После использования анолит и католит представляют собой экологически чистые жидкости, которые можно сливать в канализацию без нейтрализации. При использовании анолита отпадает необходимость в закупке и использовании защитной спецодежды и респираторов для персонала. Технические характеристики установок «СТЭЛ» Производительность, л/ч Параметры качества анолита АНК: - концентрация соединений активного хлора, % - водородный показатель, ед. рН Расход поваренной соли на 1 л получаемого анолита, Потребляемая мощность установки для 80 л/час, Вт г. 20, 40, 80 и 250 0,01-0,05 6,5-8,0 5-7 400-450 ЗАО «НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ ЭКРОС» Лаборатория XXI века - экология, контроль, качество ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ: •Производство продукции химико-лабораторного назначения, отвечающей требованиям современных мировых стандартов: - лабораторная мебель; - приборы общелабораторного назначения; - вспомогательное лабораторное оборудование; - хим реактивы; - изделия из пластмасс, в том числе лабораторная посуда из полипропилена. •Комплексное оснащение химических лабораторий предприятий различных отраслей промышленности. В спектр услуг входит: - решение проблем организации лабораторий под конкретные аналитические задачи; - поставка и пуско-наладка оборудования; - сервисное и методическое обеспечение; - снабжение расходными материалами; - обучение персонала лабораторий; - подготовка лабораторий к аккредитации. • Проектирование, строительство и реконструкция лабораторий. • Строительство и поставка модульно-блочных специализированных лабораторий. По поставкам сложного аналитического оборудования Экрос является официальным дистрибьютором крупных зарубежных фирм: Agilent Technologies, Herzog, Tanaca, Lauda, Haver&Boeceker, Oxford, Hanna Instruments, Sartorius, Shimadzu, Equip Labo, Durcon, A&D, Merck, Mettler Toledo GmbH. ЗАО «НПО Экрос» член крупнейших химических и экологических союзов и ассоциаций: «Российский союз химиков», «Росхимреактив», «Российский Экологический конгресс» и др. Наши представительства (офисы, склады) расположены в городах: Архангельск, Астрахань, Екатеринбург, Казань, Краснодар, Москва, Нижний Новгород, Нижневартовск, Новосибирск, Омск, Пермь, Самара, Саратов, Стерлитамак. Наш адрес: 199106, Санкт-Петербург, Среднегаванский пр., д. 13 Контактный тел.: (812) 320-73-24 факс:329-09-72 Диспетчер: (812) 325-38-83 Факс: (812) 325-38-77 E-mail: info@ecros.ru URL: www.ecros.ru Тел.: (812) 321-0825 E-mail: rybtest@smtp.ru Факс: (812) 329-0972 http://rybtest.smtp.ru ЗАО «Экспорт-импорт рыбтест» осуществляет консалтинговые услуги рыбопромышленным предприятиям Сертификация систем управления качеством и безопасностью рыбной продукции на основе принципов ХАССП (аттестат Госстандарта России № ХАССП RU.002) Проектирование новых рыбоперерабатывающих производств и консервных цехов, реконструкция и модернизация действующих. Проектная документация разрабатывается с учетом международных и отечественных стандартов, норм, правил, а также требований, действующих в ЕС. Комплектация производств импортным и отечественным оборудованием: новым, восстановленным, и бывшим в употреблении. Оказываем содействие заинтересованным предприятиям и организациям в оснащении их приборами и оборудованием. Проектирование микробиологических лабораторий, комплектация их оборудованием разработка мини-лабораторий по оценке санитарного состояния и контроля за распространением листерий при производстве рыбной продукции. Принимаем заявки от предприятий и организаций на приобретение экспресс- оборудования по выявлению листерий. Организация семинаров по разработке документов Системы собственного контроля при производстве рыбной продукции с учетом требований ЕС. Аудит Системы собственного контроля при производстве рыбной продукции. Государственный комитет Российской Федерации по рыболовству Национальный центр качества и безопасности рыбной продукции Тел.: (812) 321-96-02 Факс: (812) 320-73-23 E-mail: nfq@mail.ru; www.nfg.org.ru СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛИСТЕРИЙ И КОНТРОЛЯ ЗА ИХ РАСПРОСТРАНЕНИЕМ НА РЫБОПЕРЕРАБАТЫВАЮЩИХ ПРОИЗВОДСТВАХ * НОВЫЕ УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА СЫРЬЯ, ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ, ВОДЫ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ, СМЫВОВ С ОБОРУДОВАНИЯ НА ПРИСУТСТВИЕ ЛИСТЕРИЙ: - экспресс анализ (24 часа) патогенных листерий в сырье и готовой рыбной продукций - API-стрипы и твердофазный иммуноферментный анализатор VIDAS - наборы для мониторирования производственной зоны на присутствие листерий (анализ смывов, ответ ~ да/нет) * НОВЫЕ РЕШЕНИЯ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ ЗА РАСПРОСТРАНЕНИЕМ ЛИСТЕРИЙ НА ПРОИЗВОДСТВЕ - разработка индивидуальных схем контроля за распространением листерий на производстве; — подготовка персонала. Мухина Л. Б., Дмитриева Е. Ю., Борисовская Э. Н. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по выявлению возбудителя листериоза LISTERIA MONOCYTOGENES в рыбе и рыбной продукции Лицензия ИД № 01124 от 01.03.2000 г. Подписано в печать 17.01.2003. Гарнитура Times. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 2000 экз. Издательство ООО «НИЦ «Моринтех» 199026, Санкт-Петербург, В. О., 20-я линия, д. 5/7 197101, Санкт-Петербург, а/я 726, «Моринтех» Отпечатано с готовых диапозитивов в типографии ООО «Турусел», 191186, Санкт-Петербург, ул. Миллионная, д. 1
