Текст отчета

Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное унитарное предприятие
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции
промышленных микроорганизмов
(ФГУП «ГосНИИгенетика»)
УТВЕРЖДАЮ:
В.н.с. лаборатории генетики
бактерий ФГУП
«ГосНИИгенетика»
______________И.В. Манухов
«26» февраля 2014 г.
ОТЧЕТ
о работах
по тестированию с помощью lux-биосенсоров продуктов питания на
содержание антибиотиков: ДНК-тропных, бета-лактамов и
тетрациклинового ряда.
Москва 2013
Исполнители:
к.б.н., с.н.с. Котова В.Ю.
к.б.н., н.с.
Мелькина О.Е.
инж.
Пустовойт К.С.
Материалы и методы
Для тестирования продуктов на содержание антибиотиков применялись цельноклеточные
бактериальные lux-биосенсоры [1, 2]:
Escherichia coli MG1655(pKsu) - биосенсор на антибиотики β-лактамного ряда,
E. coli MG1655 (pColD-lux) -биосенсор на агенты, повреждающие ДНК,
E. coli MG1655 (pTet-lux) – бисенсор на антибиотики тетрациклинового ряда;
E. coli MG1655 (pKatG-lux) - биосенсор на окислительный стресс, обладает достаточно
высоким базовым уровнем люминесценции и в данной работе применялся для проверки
интегральной токсичности исследуемых образцов.
Исследуемые образцы продуктов предоставлены НАЦИОНАЛЬНЫМ СОЮЗОМ
ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ (закуплено в супермаркете «Идея» ООО «ТД
Интерторг», Москва, Варшавское шоссе, д. 143 А)
Список образцов предоставленных продуктов:
1. «Тема» биотворог классический
2. Сок «Любимый»
3. Сок «Добрый»
4. Коктейль «Смешарики»
5. Кефир (Дмитровский завод)
6. Творог «Нежный» («Савушкин продукт»)
7. Сметана 15% «Простоквашино»
8. Молоко 1.5% «Село зеленое»
9. «Актимель» (Danone)
10. Сосиски молочные («Останкино»)
11. Рыба (набор для пива) (Вичюнай-Русь ООО, Россия).
12. Желток яйца (производитель ООО ТД «Золотое яичко»)
13. Белок яйца (производитель ООО ТД «Золотое яичко»)
На графиках пробы продуктов обозначены номерами согласно приведённого выше
списка.
Приготовление образцов для измерения люминесценции:
В виалах к 180 мкл суспензии клеток биосенсора добавляли по 20 мкл. проб продуктов.
Измерялась биолюминесценция полученных образцов с периодичностью 1 минута.
Обозначение биосенсоров:
«k»-MG1655(pKatG-lux) - биосенсор на окислительный стресс,
«a»-MG1655(pKsu) - биосенсор на антибиотики β-лактамного ряда,
«с»-MG1655(pColD-lux) -биосенсор на агенты, повреждающие ДНК,
«t»-MG1655(pTet-lux) – бисенсор на антибиотики тетрациклинового ряда;
Контрольные образцы без добавления антибиотиков или продуктов («отрицательные»
контроли):
kk1, kk2 – два независимых клона MG1655(pKatG-lux)
ak1, ak2 – два независимых клона MG1655(pKsu)
ck1, ck2 – два независимых клона MG1655(pColD-lux),
tk1, tk2 – два независимых клона MG1655(pTet-lux)
В «отрицательные» контрольные образцы была добавлена дистиллированная вода
Контрольные образцы c добавлением антибиотиков («положительные» контроли)
tet - положительный контроль тетрациклин, концентрация в пробе - 1 мкг/мл для
биосенсора MG1655(pTet-lux)
aamp - положительный контроль ампициллин, концентрация в пробе – 1 мг/мл для
биосенсора MG1655(pKsu)
mit - положительный контроль митомицин С, концентрация в пробе - 9х10-6M для
биосенсора MG1655(pColD-lux)
Результаты (1 часть):
Интенсивность люминесценции , мин.
Наличие антибиотиков тетрациклинового ряда. На графиках 1 и 2 представлены
данные измерения интенсивности люминесценции биосенсора MG1655(pTet-lux) от
времени инкубации с образцами.
t1
1000000
t2
t3
100000
t4
t5
10000
t6
t7
1000
t8
t9
100
t10
t11
10
t12
tk1
1
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Время, мин.
tk2
ttet
t13
Интенсивность
люминесценции в отн. ед.
Рис. 1. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора MG1655(pTet-lux) от времени
инкубации с образцами.
1000000
100000
t9
10000
tk1
1000
tk2
100
ttet
10
1
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Время, мин
Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора MG1655(pTet-lux) от времени
инкубации. Взяты только контрольные образцы и №9 (актимель).
Данные измерения показывают, что имеет место индукция биосенсора MG1655(pTet-lux)
при добавлении контрольного образца (ttet), содержащего тетрациклин в концентрации 1 мкг/мл
и при добавлении образца №9 («Актимель» (Danone)). Следует отметить, что индукция в
образце №9 возникает лишь спустя 8,5 часов после добавления, в то время как в норме
промотор, чувствительный к тетрациклину, срабатывает в минутной шкале. Подобная
положительная реакция на добавление образца № 9 может быть вызвана, как наличием
небольшого количества антибиотика тетрациклинового ряда (не более 0,1 мкг/мл в
образце), так и дополнительным ростом бактериальной культуры в результате инкубации
длительное время.
Наличие ДНК-тропных антибиотиков. На графике 3 представлена зависимость
интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pColD-lux) от времени
инкубации с образцами. Как видно из представленных данных образец, содержащий
митомицин С (положительный контроль) индуцируется в течение 40 минут после начала
инкубации. Исследуемые образцы индукцию SOS-промотора, чувствительного к
повреждениям ДНК не вызвали.
1000
c1
c2
c3
Люминесценция, отн. ед.
c4
c5
c6
c7
c8
100
c9
c10
c11
c12
ck1
ck2
c13
cmit
10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Время, мин
Рис. 3. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pColDlux) от времени инкубации с образцами.
Наличие антибиотиков пенициллинового ряда.
На графиках 4 и 5 представлена зависимость интенсивности люминесценции биосенсора
E. coli MG1655(pKsu) от времени инкубации с образцами.
Пенициллиновый ряд
100000
a1
a2
a3
Люминесцецния, отн. ед
a4
10000
a5
a6
a7
a8
a9
a10
a11
1000
a12
ak1
ak2
aamp
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Время, мин
Рис. 4. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pKsu) от времени
инкубации с образцами.
На 5 графике в линейной шкале по оси ординат даны кривые, отражающие
люминесценцию только контрольного образца без добавления ампициллина и образцов
№8 и №13. Как видим, имеет место некоторая индукция биосенсора в образцах №8 и №13
при инкубации более 100 минут. Заметим, что в норме промотор, чувствительный к
антибиотикам пенициллинового ряда (β-лактамы), срабатывает через 15-20 минут после
добавления антибиотика в положительном контроле (aamp). Тем не менее, слабая
положительная реакция на добавление образцов №8 и №13 может быть вызвана наличием
небольшого количества антибиотика пенициллинового ряда (не более 1 мкг/мл).
Для проверки данного предположения следует произвести повторные измерения с целью
проверки воспроизводимости полученных результатов.
Пенициллиновый ряд
4100
3600
Люминесцецния, отн. ед.
3100
2600
a8
2100
ak1
a13
1600
1100
600
100
0
50
100
150
200
250
300
Время, мин
Рис. 5. Зависимость люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pKsu) контрольного образца без
добавления ампициллина и образцов №8 и №13 от времени нкубации.
Интегральная токсичность.
Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pKatG-lux) от
времени инкубации с образцами приведена на графике 6. Биосенсор E. coli
MG1655(pKatG-lux) в данной работе применяется для определения интегральной
токсичности образцов. Интегральную токсичность принято смотреть в течение 30 минут и
определять падение люминесценции по отношению к отрицательному контролю (EC-50),
отражающую гибель клетки.
Как видно из графика 6 падения люминесценции клеток при добавлении исследуемых
образцов не наблюдается.
Интенсивность люминесценции в отн. ед.
10000
k1
k2
k3
k4
k5
k6
k7
1000
k8
k9
k10
k11
k12
kk1
kk2
100
0
10
20
30
40
50
60
Время, мин
Рис. 6. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pKatGlux) от времени инкубации с образцами.
Выводы.
1. Исследования показали:
• наличие антибиотиков тетрациклинового ряда в образце №9 (Актимель «Данон») в
концентрации, не превышающей 1 мг/литр.
• наличие антибиотиков пенициллинового ряда (β-лактамов) в образцах №8
(Молоко 1.5% «Село зеленое») и №13 (яичный белок).
2. Следует провести повторную проверку проб №9, №8 и №13.
Результаты (2 часть):
Проведена повторная проверка наличия антибиотиков в пробах:
№9 - на содержание антибиотиков тетрациклинового ряда.
№8 и №13 - на содержание антибиотиков пенициллинового ряда (β-лактамов).
Наличие антибиотиков тетрациклинового ряда.
На рисунке 7 приведены данные измерения интенсивности люминесценции биосенсора
MG1655(pTet-lux) от времени инкубации. Образцы № 8 и №13 взяты в качестве
отрицательного контроля (в предыдущем измерении не показывали наличие антибиотиков
тетрациклинового ряда).
Как видно из приведённых данных наличие антибиотиков тетрациклинового ряда в
пробе №9 не подтвердилось. Положительный контроль (ttet) открылся, как положено
(амплитуда индукции более трёх порядков при добавлении 1 мкг/мл тетрациклина).
Тетрациклиновый ряд
100000
Люминесценция, отн. ед.
10000
tk1
1000
t9
t8
t13
tk2
100
ttet
10
1
0
100
200
300
400
500
600
700
Время, мин
Рис. 7. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора MG1655(pTet-lux) от времени
инкубации с пробами №№ 8, 9 и 13.
Наличие антибиотиков пенициллинового ряда.
На графике 8 представлена зависимость интенсивности люминесценции
биосенсора E. coli MG1655(pKsu) от времени инкубации с образцами № 8 и №13.
Как видно из представленных данных у биосенсора с добавлением проб № 8 и №13
наблюдается индукция биолюминесценции в 1,5 – 2 раза. Таким образом, подтверждаются
полученные в первой части данные о наличии антибиотиков пенициллинового ряда (βлактамов) в пробах № 8 и №13.
Приведённые измерения не ставили задачу определения концентрации
антибиотиков в исследуемых продуктах, однако полученные данные позволяют оценить
диапазон возможных концентраций. Порог чувствительности биосенсора E. coli
MG1655(pKsu) составляет 0,1-0,2 мкг/мл ампициллина. В положительный контроль
добавлен ампициллин в концентрации 1 мг/мл. Концентрация антибиотиков
пенициллинового ряда в исследуемых образцах, с учётом разведений (к биосенсору 180
мкл добавляли исследуемую пробу 20 мкл, т.е. разведение 1/10) и соотношения амплитуд
ответа контрольного и опытного образцов, находится в пределах от 1 до 100 мкг/мл.
Пенициллиновый ряд
Люминесценция, отн. ед.
100000
10000
ak1
a8
a13
ak2
aamp
1000
100
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Время, мин
Рис. 8. Зависимость интенсивности люминесценции биосенсора E. coli MG1655(pKsu) от времени
инкубации с образцами № 8 и №13.
Заключение:
Проведённые измерения показали наличие антибиотиков пенициллинового ряда (βлактамов) в образцах №8 (Молоко 1.5% «Село зеленое») и №13 (Яичный белок
(производитель ООО ТД «Золотое яичко»).
Оценочно концентрации антибиотиков в исследуемых продуктах находятся в пределах от
1 до 100 мг/литр.
Литература.
1. В. Ю. Котова, К. В. Рыженкова, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский.
Индуцируемые специфические lux-биосенсоры для детекции антибиотиков:
конструирование и основные характеристики. // Прикладная биохимия и
микробиология, 2014, том 50, № 1, с. 112–117
2. Биотехнология 2009, №6, С. 16-25. Манухов И. В., Котова В.Ю., Завильгельский Г.
Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного
стресса.