На правах рукописи СЕРЕБРЕННИКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ

На правах рукописи
СЕРЕБРЕННИКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МОЛЕКУЛ СОСУДИСТОЙ
РЕГУЛЯЦИИ У БОЛЬНЫХ С ПЕРИФРИЧЕСКИМИ
ВИТРЕОХОРИОРЕТИНАЛЬНЫМИ ДИСТРОФИЯМИ
03.03.01 – физиология
14.03.03 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Чита- 2013
1
Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская
академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ, доктор
медицинских наук, професор Витковский Юрий Антонович.
Официальные оппоненты:
Корытов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор
ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет»
Минздрава России, заведующий кафедрой нормальной физиологии.
Харинцева Светлана Владимировна, доктор медицинских наук,
заведующая кафедрой офтальмологии с курсом отоларингологии ГБОУ ВПО
«Читинская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера»
Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г.
Красноярск.
Защита состоится «24» декабря 2013 года в .00 часов на заседании
диссертационного совета при ГБОУ ВПО «Читинская государственная
медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской
Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО
«Читинская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул.
Горького, 39-а).
Автореферат разослан «___»_ноября_2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Д.208.118.01
доктор медицинских наук, профессор
И.Н. Гаймоленко
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
исследования.
Периферические
витреохориоретинальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний,
которая характеризуется различными дегенеративными изменениями
сетчатки крайних отделов глазного дна и встречается у пациентов с
различными видами рефракции. ПВХРД обнаруживаются в общей
популяции в 5-13% случаев [Азнабаев М.Т. и соавт., 2005; Щуко А.Г. и
соавт., 2008].
Наличие прогностически опасных видов ПВХРД является основной
причиной развития отслойки сетчатки и, как следствие этого, - снижения
зрения. По данным литературы, ПВХРД встречаются в 90-96% у больных с
отслойкой сетчатки [Щербакова С.Ю., 2009; Mitry D., 2009; Orozco-Gоmez
L.P., 2008].
Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой
медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в
общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10%
случаев она двухсторонняя [Буткевич В.И. и соавт., 2005, Щуко А.Г. и соавт.,
2008; Meier P., 2008; Mitry D., 2009]. Большинство пациентов с данной
патологией - люди трудоспособного возраста. Слепота, возникающая на фоне
отслойки сетчатки, занимает 6-7 место среди всех возможных причин потери
трудоспособности [Терехович М.В. и соавт., 2009]. Возникновение
дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у
мужчин и женщин [Батманов Ю.Е. и соавт., 2007, 2008; Зимина М.Г., 2009;
Кудинова-Савченко Н.А. и соавт., 2009; Мироненко Л.В. и соавт., 2010].
Учитывая тот факт, что в ранней фазе ПВХРД протекает почти
бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев
происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями
сетчатки. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска
молекулярно-генетических
предикторов
ранней
диагностики
периферических витреохориоретинальных дистрофий. В настоящее время
есть все основания относить ПВХРД к группе мультифакторных
заболеваний, развивающихся на фоне нарушения сосудистой регуляции
сетчатки. В то же время, вероятно, первичные генетические эффекты
определяют особенности продукции молекул сосудистой регуляции и
рецепторов к ним. К сожалению, в наши дни молекулярно-генетические
исследования не коснулись проблемы ПВХРД. Эти обстоятельства
объясняют актуальность исследования полиморфизмов генов сосудистой
регуляции при ПВХРД.
3
Цель исследования - изучить генетический полиморфизм молекул
сосудистой
регуляции
у
больных
с
периферическими
витреохориоретинальными дистрофиями и оценить их клиникопрогностическое значение для развития заболевания в этническом аспекте.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных
вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G),
AGT (Met235Thr) и их сочетаний среди больных с ПВХРД и
относительно здоровых резидентов в русской и бурятской этнических
группах.
2. Установить степень риска формирования ПВХРД у носителей
аномальных аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS
(C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) среди резидентов
Забайкальского края.
3. Сравнить содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и
сосудистого эндотелиального фактора роста в слезной жидкости и
плазме крови у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и
бурятской национальностей с учетом генотипов EDN1 (Lys198Asn),
eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) и их комбинаций.
4. Оценить роль полиморфизма генов молекул сосудистой регуляции в
развитии осложнений ПВХРД.
Научная новизна исследования. Впервые обнаружено, что аллельные
варианты eNOS (C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn)
предрасполагают к развитию ПВХРД, влияют на развитие осложнений
заболевания в русской и бурятской этнических группах. Носители
неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T), AGT
(Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск
формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности.
Впервые установлено, что уровень эндотелина-1 в слезной жидкости
больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со
здоровыми. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов
с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с
аналогичными группами у русских, тогда как в слезной жидкости пациентов
с ПВХРД русской и бурятской национальности их уровень ниже по
сравнению с контрольной группой. У пациентов обеих национальностей
заметно увеличивается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии
осложнений ПВХРД. По мере развития осложнений ПВХРД в виде разрывов
4
и отслойки сетчатки уровень эндотелина-1 повышается, а метаболитов
оксида азота снижается.
Впервые выявлено, что различные аллельные варианты и генотипы
влияют на уровень молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости.
Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn) обуславливает
повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных c
ПВХРД не зависимо от национальности. Носительство аллели С у русских и
аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии
определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной
жидкости здоровых и больных ПВХРД.
Носительство аллели G
полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо- и гетерозиготном состоянии
способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и
больных ПВХРД не зависимо от национальности. У больных - носителей
генотипа С/С и С/G падает содержание VEGF в плазме крови.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате
исследования получены новые данные о
патогенезе ПВХРД,
демонстрирующие роль генов молекул сосудистой регуляции eNOS (C786T),
EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) в механизмах
развития заболевания. Носительство патологических аллелей оказывает
влияние на продукцию молекул сосудистой регуляции и развитие
осложнений ПВХРД среди представителей русской и бурятской этнических
групп Забайкальского края.
Выявленные факты позволяют оценить риск развития ПВХРД в
этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней
диагностики заболевания среди резидентов русской и бурятской
национальностей. Полученные сведения о наличии полиморфизмов eNOS
(C786T), EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) могут быть
включены в генетический паспорт индивидуумов и использоваться для
оценки риска развития ПВХРД.
Внедрение результатов работы. Теоретические положения,
раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах
нормальной физиологии и офтальмологии ГБОУ ВПО «Читинская
государственная медицинская академия».
Апробация работы. Результаты исследования доложены на
Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием, посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской
5
академии «Актуальные вопросы
медицины» 16 октября 2013 года.
клинической
и
экспериментальной
Положения, выносимые на защиту:
1. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T)
и EDN1(Lys198Asn) русской национальности и EDN1(Lys198Asn),
VEGFA(C634G), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют
более высокий риск развития ПВХРД. У пациентов с ПВХРД
независимо от национальности встречаемость генотипа Asn/Asn гена
EDN1 (Lys198Asn) выше при наличии осложнений. У бурят с
отслойками сетчатки отсутствуют нормальные генотипы генов
EDN1(Lys198Asn), VEGFA(C634G) и AGT (Met235Thr). Распределение
полиморфизмов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) у резидентов
Забайкальского края имеет этнические особенности.
2. В слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской
национальностей уровень эндотелина-1 увеличивался, а метаболитов
оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста снижался
по сравнению с контрольной группой. Концентрация молекул
сосудистой регуляции в слезной жидкости зависит от клинических
проявлений ПВХРД.
3. Содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной
жидкости у пациентов с ПВХРД зависит от полиморфизма генов
EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) и VEGFA
(C634G) и их сочетаний, присутствует этнический компонент.
Влияние полиморфизмов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T),
AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) на развитие данной патологии
носит этнический характер.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице
машинописного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 32 таблицами.
Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и
клинической характеристики больных, шести глав собственных результатов
исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов,
практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из
отечественных и зарубежных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы,
предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской
6
Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000
ред.).
Клиническая характеристика группы больных с ПВХРД. Методом
сплошной выборки обследовано 213 пациентов с ПВХРД, проживающих на
территории Забайкальского края. Средний возраст пациентов составил 34±6
лет. С целью изучения этнического компонента все больные были разделены
на 2 группы:
- Первая группа – 131 пациент с ПВХРД (38 мужчин и 93 женщины)
русской национальности;
- Вторая группа – 82 пациента с ПВХРД (17 мужчин и 65 женщин)
бурятской национальности.
Данные об этнической принадлежности выясняли путем опроса,
включая указания на национальную принадлежность предков до третьего
поколения.
Критерии исключения из исследования: пациенты с наличием
сопутствующих заболеваний, таких как гипертоническая болезнь, сахарный
диабет, онкологические заболевания, а также больные с наличием глазной
патологии (глаукома, возрастная макулярная дегенерация, катаракта,
конъюнктивиты, кератиты, увеиты, вторичные отслойки сетчатки,
дегенеративный ретиношизис). Исключены из исследования пациенты,
пользующиеся контактными линзами, беременные, спортсмены, лица,
перенесшие оперативные вмешательства в течение последних трех месяцев, в
том числе лазерные и хирургические операции на глазах.
Контрольную группу составили 196 человек, проживающие на
территории Забайкальского края, сходные по половым и возрастным
характеристикам, не имеющие на момент исследования ПВХРД и
соматической патологии.
Всем испытуемым проводилось офтальмологическое обследование,
включающее определение остроты зрения (без коррекции, с коррекцией),
биомикроскопию переднего отрезка глаза, биомикроофтальмоскопию (в
условиях мидриаза) с помощью контактной трехзеркальной
линзы
Гольдмана, измерение внутриглазного давления - по показаниям.
Молекулярно-генетическое
исследование
для
выявления
полиморфизмов
генов
eNOS
(C786T),
EDN1
(Lys198Asn),
AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G). Забор крови осуществляли утром
натощак из кубитальной вены в вакутейнер с 3,8% цитратом в объеме 5,0 мл.
Выделение ДНК осуществляли при помощи набора реагентов
для
биологических проб (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выявление мутаций
проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ
7
«Литех» - «SNP-экспресс», Россия, Москва). Детекция продуктов
амплификации осуществляли электрофоретическим способом.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения содержания
эндотелина-1, VEGF и метаболитов оксида азота использовалась слезная
жидкость и плазма крови 213 пациентов с ПВХРД и 196 здоровых лиц. В
группе пациентов с ПВХРД забор слезы производился на больном и парном
глазу. Нестимулированную слезную жидкость собирали из нижнего
конъюнктивального мешка с помощью стерильной одноразовой пластиковой
насадки в объеме 20 мкл в стерильные пробирки типа «Эппендорф»
и хранили при температуре -200С. Во время проведения исследования она
разводилась в 10 раз буфером для цитокинов Cytokine Assay Buffer (UpstateMillipore, Watford, UK). Концентрацию ЭТ-1 и VEGF определяли методом
иммуноферментного анализа с применением тест-систем (ЗАО «ВекторБест», Новосибирск; «Biomedica gruppe», Австрия). Уровень оксида азота
изучали по конечным продуктам его метаболизма – нитроксида-нитрита
(NO2) с использованием раствора Грисса.
Статистическая обработка результатов. Обработка результатов
выполнена методами непараметрической и вариационной статистики с
применением программы Statistiсa 6.0 (StatSoft Inc., США) и электронных
таблиц Microsoft Excel, версия XP. При сравнении изучаемых клинических и
лабораторных показателей использовались непараметрические методы в
связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. При
сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни. Различия между
сравниваемыми вариационными рядами считали значимыми при p<0,05.
Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартального (25-й и 75-й
персентили) интервала – указывали в скобках. Статистически значимые
различия между группами по количественным признакам оценивались при
помощи критерия Манна – Уитни (U-тест). Для сравнения групп по
качественному бинарному признаку применялся критерий 2 (точный
критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов
использовался закон Харди-Вайнберга. Вычислялась относительная
вероятность события (ОР).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В основу нашего исследования мы положили гипотезу о ведущем
значении нарушений региональной гемодинамики в патогенезе ПВХРД.
Как известно, в развитии ПВХРД и отслойки сетчатки важную
патогенетическую роль играет нарушение кровообращения глаза [Поздеева
О.Г., 2012; Саксонова Е.О., 2000]. Причины, приводящие к таким
8
изменениям - различные. Однако, факторами, обуславливающими
индивидуальное реагирование механизмов регуляции сосудистого тонуса в
норме и патологии, являются генетические.
В первом блоке наблюдений мы изучили частоты аллельных вариантов
генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT
(Met235Thr) среди пациентов с ПВХРД и здоровых лиц Забайкальского края
с учетом этнических особенностей распределения. Мы исходили их того, что
полиморфизмы генов при различных заболеваниях имеют разные уровни
распространенности в регионах мира. Возможные положительные
ассоциативные связи между полиморфизмами и заболеваниями сетчатки,
установленные внутри одной популяции, необязательно будут таковыми в
других популяциях.
Установлено, что у пациентов с ПВХРД бурятской национальности
превалирует нормальная аллель С, а у русских – аномальная аллель Т
полиморфизма гена еNOS (C786T) (табл. 1).
Таблица 1
Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов гена
еNOS (C786T) среди резидентов русской и бурятской национальностей
Показатель
Русские
Буряты
Группа
Пациенты с
Группа
Пациенты с
контроля
ПВХРД
контроля
ПВХРД
Генотипы
С/C
41 (36,6%)
23 (17,5%)
5 (5,9%)
24 (29,3%)
р=0,016
р1 =0,001
р = 0,002
C/T
46 (41,1%)
50 (38,2%)
26 (31,0%)
41 (50,,%)
T/T
25 (22,3%)
58 (44,5%)
53 (63,1%)
17 (20,7%)
р=0,016
р1=0,001
p =0,001
р1=0,019
Всего
112
131
84
82
Аллели
С
128 (57,1%)
96 (36,6%)
36 (21,4%)
89 (54,3%)
р=0,008
р1=0,001
p =0,001
р1=0,033
Т
96 (42,9%)
166 (63,4%)
132 (78,6%)
75 (45,7%)
р=0,016
р1 =0,001
p=0,004
Всего
224
262
168
164
Примечание: р – уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной
группой; р1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (2тест).
9
Резиденты бурятской национальности - обладатели «дикого» варианта
гена eNOS (С-аллель) в большей степени предрасположены к развитию
ПВХРД, тогда как присутствие аномальной Т-аллели носит протективный
характер. Встречаемость заболевания у носителей Т-аллели значительно
меньше. Учитывая высокую частоту аномальной аллели (Т) в контрольной
группе у резидентов бурятской национальности (78,6%), можно
предположить, что ген eNOS имеет прямое отношение к патогенезу ПВХРД.
Обнаружено, что среди пациентов русской национальности, имеющих
ПВХРД, 82,5%, а среди бурят - 92,7% носителей аномальной аллели гена
EDN1Lys198Asn. Этнических различий встречаемости генотипов
и
аллельных вариантов гена EDN1Lys198Asn между резидентами русской и
бурятской национальностей выявлено не было.
Среди бурят с ПВХРД аномальный генотип G/G гена VEGFA (C634G)
встречался в 2,5 раза чаще по сравнению с контрольной группой. Таким
образом, буряты с ПВХРД – обладатели аномальной аллели G и
патологического генотипа G/G в большей степени предрасположены к
развитию ПВХРД. Этнических различий встречаемости генотипов
и
аллельных вариантов гена VEGFA (C634G) среди резидентов русской и
бурятской национальности выявлено не было.
Выявлено, что 91,4% пациентов с ПВХРД бурятской национальности
являлись носителями аномального варианта гена AGT Met235Thr. У всех
бурят с отслойками сетчатки встречалась Thr-аллель, из них в 50% случаев в
гомозиготном состоянии. В бурятской этнической группе у больных с
разрывами сетчатки мутантная аллель Thr встречалась чаще, чем у русских с
таким же типом ПВХРД. Выявлены этнические различия: у бурят с ПВХРД
аномальная аллель Thr встречалась чаще, а нормальная аллель Met реже, чем
у русских.
Мы не обнаружили изменений концентрации эндотелина-1,
метаболитов оксида азота и VEGF в плазме крови пациентов с ПВХРД и
здоровых лиц. Однако мы выявили изменение уровня молекул сосудистой
регуляции в слезной жидкости.
Обнаружено, что у русских в группе пациентов с ПВХРД содержание
эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза выше по сравнению с
контрольной группой. Такая же закономерность прослеживалась у пациентов
бурятской национальности: содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у
больных в 1,7 раза выше по сравнению со здоровыми (табл. 2).
10
Таблица 2
Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД
русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили)
Русские
Буряты
Контрольна
Глаза с
Парные
Контрольн
Глаза с
Парные
я группа
ПВХРД
глаза
ая группа
ПВХРД
глаза
n=112
n=196
n=66
n=84
n=117
n=47
0,87
2,04
1,56
0,84
1,44
1,02
(0,46; 1,36) (1,22; 2,52) (0,87; 2,21) (0,53; 1,13) (1,14; 2,02) (0,91; 1,44)
р=0,001
р=0,001
р1=0,001
Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по
сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по
сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).
У пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень
метаболитов оксида азота в слезной жидкости оказался в 4 и 4,8 раза ниже по
сравнению с контрольными группами. У
бурят с ПВХРД уровень
метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше по сравнению с
русскими (табл. 3).
Таблица 3
Уровень метаболитов NO (мкг/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД
русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили)
Русские
Буряты
Контрольна
Глаза с
Парные
Контрольн
Глаза с
Парные
я группа
ПВХРД
глаза
ая группа
ПВХРД
глаза
n= 112
n=196
n=66
n=84
n=117
n=47
4,35
0,92
1,25
4,30
1,07
1,75
(3,50; 5,29) (0,46; 1,41) (0,84; 2,41) (3,91; 5,08) (0,61; 3,89)
(0,77;
р=0,001
р=0,001
р=0,001
2,49)
р1 =0,049
р=0,001
Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по
сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по
сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).
Выявлено, что концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови
пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по
сравнению с аналогичными группами у русских.
11
В обеих этнических группах прослеживается увеличение содержания
эндотелина-1 и уменьшение концентрации метаболитов оксида азота в
слезной жидкости пациентов с ПВХРД по сравнению со здоровыми лицами.
Причем максимальный уровень эндотелина-1 и минимальный уровень
метаболитов NO был обнаружен в слезной жидкости пациентов с отслойками
сетчатки.
Проанализировав изменения уровня эндотелина-1, метаболитов оксида
азота в слезной жидкости, мы предложили коэффициент риска развития
осложнений ПВХРД (К), равный соотношению содержания эндотелина-1 и
метаболитов оксида азота. Предварительно все данные были переведены в
единую систему (фмоль/мл) (табл. 4).
Таблица 4
Уровень эндотелина-1, метаболитов NO в слезной жидкости пациентов
русской национальности с различным течением ПВХРД; Me (25-й; 75-й
персентили)
Контрольная Неосложнен
ПВХРД,
ПВХРД,
группа
ные ПВХРД
осложненные осложненные
разрывами
отслойкой
сетчатки
сетчатки
n=112
n=99
n=83
n=14
ЭТ-1
0,87
1,65
1,96
2,35
(фмоль/мл)
(0,46; 1,36)
(0,71; 2,02)
(1,55; 2,33)
(1,18; 3,53)
p=0,035
р=0,001
p1=0,049
NOx
4,35
1,07
0,92
0,53
(мкг/мл)
(3,50; 5,29)
(0,80; 1,60)
(0,46; 1,53)
(0,34; 0,92)
р=0,001
р=0,001
р=0,001
р1=0,022
NOx
94565,2
23260,9
20000,0
11521,7
(фмоль/мл)
(76086,9;
(17391;
(10000,0;
(7391,3;
115000,0)
34782,6)
33260,9)
20000,0)
К=ЭТ-1/NOx
9,20
70,93
98,0
203,96
-6
x 10
(6,05; 11,84) (40,83; 58,08) (70,05; 155,0) (159,65; 176,5)
Примечание: n-количество глаз, p – уровень статистически значимых различий по
сравнению с контролем; p1- уровень статистически значимых различий по сравнению с
группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД (Критерий Манна-Уитни).
Предложенный
нами
коэффициент
отражает
преобладание
вазоконстрикторного или вазодилатирующего эффекта. У пациентов
бурятской национальности мы получили аналогичные результаты. Среди
12
пациентов с отслойками сетчатки обеих этнических групп этот коэффициент
оказался максимальным и превышал норму на два порядка. В связи с этим,
предложенный коэффициент может применяться в качестве предиктора
осложнений ПВХРД.
Обнаружено, что в слезной жидкости здоровых лиц русской и бурятской
национальностей увеличивался уровень VEGF по сравнению с больными.
Также установлено, что у пациентов обеих национальностей заметно
повышается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии
осложнений ПВХРД, что является свидетельством развития репаративных
процессов (рис. 1).
*
* **
** ***
***
нг/мл
40
35
30
♦
♦
25
20
15
Русские
Буряты
10
5
0
Контрольная
группа
Неосложненные
ПВХРД,
ПВХРД
осложненные
ретинальными
разрывами
ПВХРД,
осложненные
отслойкой
сетчатки
* - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем;
** - уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с
неосложненным течением ПВХРД;
***- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с
ПВХРД, осложненных разрывами;
♦ - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими.
Рис. 1. Уровень VEGF в слезной жидкости у пациентов русской и бурятской
национальностей с неосложненным и осложненным течением ПВХРД
Мы изучили зависимость концентрации вазоактивных веществ от
генотипов, а также изменение содержания эндотелина-1, метаболитов оксида
азота и VEGF при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1
(Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr).
На концентрацию эндотелина-1 в слезной жидкости оказывал влияние
генотип EDN1 (Lys198Asn). Установлено, что в слезной жидкости пациентов
с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 среди
13
носителей генотипов Asn/Asn и Lys/Asn выше по сравнению с гомозиготами
по нормальной аллели Lys. У пациентов с ПВХРД обеих национальностей
среди носителей генотипа Lys/Asn и Asn/Asn содержание эндотелина-1 в
слезной жидкости было выше по сравнению со здоровыми резидентами,
обладателями аналогичных генотипов в контрольных группах (табл. 5).
Таблица 5
Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости пациентов с ПВХРД и
здоровых лиц русской и бурятской национальностей в зависимости от
генотипов гена EDN1 (Lys198Asn); Ме (25-й; 75-й персентили)
Генотип
Lys/Lys
Lys/Asn
Asn/Asn
Русские
Контрольная
1,39
0,88
0,87
группа
(1,10; 1,95)
(0,53; 1,51)
(0,79; 3,23)
n=112
Пациенты с
1,12
2,1
2,7
ПВХРД
(0,89; 1,17)
(1,99; 2,10)
(2,19; 3,16)
n=196
p=0,008
р1=0,001
p1 =0,001
Буряты
Контрольная
0,92
0,61
1,35
группа
(0,80; 1,04)
(0,44; 1,76)
(0,91; 1,73)
n=84
р2=0,001
Пациенты с
0,65
2,0
2,13
ПВХРД
(0,45; 0,94)
(1,44; 2,08)
(1,76; 2,35)
n=117
p =0,001
p =0,001
p1 =0,001
p1 =0,008
р2=0,001
Примечание: n – количество глаз; p – уровень статистически значимых различий по
сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий с
генотипом Lys/Lys; p2 - уровень статистически значимых различий по сравнению с
русскими (Критерий Манна-Уитни).
Таким образом, наличие патологического аллельного триплета Asn
полиморфизма EDN1 (Lys198Asn) обуславливают высокое содержание
эндотелина-1 в слезной жидкости у гетерозигот Lys/Asn и гомозигот
Asn/Asn.
Продукция оксида азота и содержание в слезной жидкости его
метаболитов зависит от полиморфизма фермента eNOS (С786Т). Среди
обладателей генотипа Т/Т русской национальности, у которых обнаружены
14
периферические дистрофии сетчатки, уровень метаболитов оксида азота в
слезной жидкости ниже, чем у генотипа С/С. И наоборот, у представителей
бурятской национальности с ПВХРД содержание метаболитов оксида азота в
слезной жидкости выше у гомозигот по аномальной аллели Т, чем у
носителей С/С генотипа.
Снижение уровня метаболитов оксида азота в слезной жидкости
пациентов с ПВХРД, возможно, связано с изменением активности
эндотелиальной NO-синтазы – продукта полиморфного гена.
У пациентов с ПВХРД бурятской национальности концентрация VEGF
в плазме крови и слезной жидкости у носителей генотипа G/G полиморфизма
VEGFA (C634G) существенно выше, чем у гомозигот С/С.
В русской этнической группе обнаружено повышение уровня VEGF в
плазме крови у носителей генотипа G/G по сравнению с гомозиготами по
нормальной С-аллели.
Различия в генах, регулирующих сосудистый тонус, могут сказываться
на уровне продукции кодируемых белков и, тем самым, на соотношении
вазоконстрикторов и вазодилататоров. В связи с этим полиморфизм генов
EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr)
представляет значительный интерес, т.к. именно эти белки вносят
наибольший вклад в регуляцию сосудистого тонуса.
Мы оценили распространенность сочетания отдельных полиморфизмов
генов сосудистой регуляции в норме и при ПВХРД. Под сочетанием
полиморфных вариантов генов мы принимаем комбинацию гомозигот по
аномальной аллели двух и более генов.
В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по
аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G) уровень
эндотелина-1 в слезной жидкости выше, а метаболитов оксида азота – ниже.
Подобные результаты получены при сочетании генотипов eNOS-786 (C/C) и
EDN1-198 (Asn/Asn). А концентрация VEGF в слезной жидкости резко
снижена при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (T/T) и VEGFA634 (G/G).
При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена
VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn) уровень эндотелина-1 в слезной
жидкости пациентов с ПВХРД бурятской национальности оказался выше, а
метаболитов оксида азота – заметно ниже (табл. 6).
15
Таблица 6
Уровень эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной
жидкости бурят с ПВХРД при сочетании полиморфных вариантов генов
EDN1(Lys198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G)
VEGFA-634
VEGFA-634
VEGFA-634
VEGFA-634
(C/C) +
(G/G) +
(C/C) +
(G/G) +
EDN1-198
EDN1-198
AGT-235
AGT-235
(Lys/Lys)
(Asn/Asn)
(Met/Met)
(Thr/Thr)
ЭТ-1
1,1
1,6
0,8
1,7
(фмоль/мл)
(0,8; 1,2)
(1,2; 1,6)
(0,6; 1,1)
(1,2; 2,2)
p=0,023
p=0,010
NO (мкг/мл)
1,75
0,76
1,59
0,79
(1,56; 1,95)
(0,69; 0,85)
(0,97; 2,76)
(0,54; 1,01)
p=0,031
p=0,047
VEGF
22,0
22,1
25,2
16,9
(нг/мл)
(17,3; 60,5)
(19,9; 23,5)
(14,9; 26,8)
(11,2; 25,3)
p=0,05
Примечание: р – уровень статистически значимых различий по сравнению с сочетанием
генотипов по нормальным аллелям (Критерий Манна-Уитни).
Очевидно, уникальный ансамбль аллельных вариантов генов EDN1
(Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) может
отчасти определять характер индивидуального реагирования в механизмах
развития ПВХРД. В связи с этим нами был изучен уровень эндотелина-1 и
метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости и плазме крови у
здоровых лиц и пациентов с ПВХРД с учетом аллельных вариантов генов
EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr).
Полученные результаты подтвердили, что ПВХРД является
полигенным заболеванием. В результате мутаций структура гена или
промотора участка может менять скорость транскрипции, стабильность
мРНК или качество и активность продуцируемого белка. Это, в конечном
итоге, сказывается на активности регуляторных молекул.
Решающее значение в регуляции сосудистого тонуса придается
эндотелиальным факторам. Одно из направлений функционирования
эндотелия – его участие в формировании адекватного кровотока, что
обеспечивается согласованием агрегатного состояния крови и тонуса
сосудов. Сочетание на эндотелии вазоконстрикторов и вазодилататоров в
физиологических условиях является основой для адекватного кровотока,
особенно в сосудах микроциркуляции [Кузник Б.И., 2012; Лупинская З.А.,
16
2003]. Эндотелиальный слой регулирует местный сосудистый тонус и
участвует в формировании системных гемодинамических реакций, являясь
конечным звеном нейрогенной и гуморальной регуляции сосудистого тонуса,
где эта реакция реализуется и моделирует различные внутриклеточные
процессы.
Таким образом, получены новые сведения о роли полиморфизма генов
молекул регуляции сосудистого тонуса в механизмах развития
периферических витреохориоретинальных дистрофий и их осложнений.
Концептуальная схема патогенеза ПВХРД представлена на рис. 2.
Усиление
ретинальной
гипоксии
Гипоксия
Ишемия
ПВХРД
Апоптоз
Развитие
осложнений
ПВХРД
Промотер гена
эндотелина-1
VEGF
Проэндотелин-1
Фактор,
индуцируемый
гипоксией (HIF)
Гладкомышечная
клетка
«Большой» ЭТ-1
Пролиферация
эндотелиоцитов,
развитие сосудов
Вазоконстрикция
ЭТв2
ЭПФ
Просвет
сосуда
Изменение
регионарной
гемодинамики
ЭТ-1
ЭТА
ЭТв1
Эндотелиальная
клетка
Клеточная
пролиферация
Вазодилатация
NO
eNOS
Рис. 2 Концептуальная схема включения отдельных звеньев патогенеза в развитие
осложнений ПВХРД
Мы считаем, что исследование генов молекул сосудистой регуляции
может оказаться востребованным для прогнозирования развития ПВХРД и
его осложнений. Полученные сведения о наличии полиморфизма генов eNOS
(C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn) и VEGFA (C634G) могут быть
включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими
полиморфизмами использоваться для оценки риска развития ПВХРД.
ВЫВОДЫ
1.
Встречаемость полиморфизмов генов сосудистой регуляции у
пациентов с ПВХРД зависит от этнической принадлежности. У лиц
бурятской национальности с ПВХРД превалирует аллель С, а у русских –
17
аллель Т полиморфизма гена еNOS (C786T). Среди здоровых лиц бурятской
национальности чаще встречается генотип С/С, а с ПВХРД – G/G
полиморфизма VEGFA (C634G). Наличие аллели G полиморфизма VEGFA
(C634G) располагает их к развитию ПВХРД. Генотип Met/Met полиморфизма
гена AGT Met235Thr среди русских с ПВХРД встречается в 4 раза чаще, чем
среди бурят. В бурятской этнической группе обладатели аномальной аллели
полиморфизма гена AGT Met235Thr в большей степени предрасположены к
развитию ПВХРД. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов
eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более
высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской
национальности.
2. Уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих
этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми лицами. Среди
пациентов с ПВХРД русской национальности содержание эндотелина-1 в
слезной жидкости в 2,3 раза, а бурятской – в 1,7 раза выше, чем у здоровых.
Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и
здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с
аналогичными группами у русских. Уровень метаболитов оксида азота в
слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности
ниже по сравнению с контрольной группой. Уровень VEGF в слезной
жидкости у больных ПВХРД русской и бурятской национальностей ниже,
чем у здоровых лиц.
3. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивалось
содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. У
русских содержание VEGF в слезной жидкости контрольной группы и
пациентов с ПВХРД, осложненными ретинальными разрывами, ниже в два
раза по сравнению с резидентами бурятской национальности.
4. Коэффициент К, отражающий соотношение концентрации
эндотелина-1 и метаболитов оксида азота существенно повышался по мере
развития осложнений ПВХРД. У пациентов с ретинальными разрывами,
предложенный коэффициент К увеличивался в 10 раз, а с отслойками
сетчатки – в 23 раза по сравнению с неосложненным течением заболевания.
5. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn)
обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости
больных с ПВХРД не зависимо от национальности. У обладателей генотипа
Asn/Asn выявлялся наиболее высокий уровень, генотипа Lys/Asn – средний
и генотипа Lys/Lys - низкий уровень эндотелина-1 в слезной жидкости.
Концентрация эндотелина-1 у пациентов ПВХРД больше относительно
здоровых лиц.
18
6. У пациентов с ПВХРД бурятской национальности - носителей Т/Тгенотипа полиморфизма гена eNOS (C786T) уровень метаболитов оксида
азота в плазме крови выше по сравнению с С/С генотипом. Носительство
аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и
гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание
метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД.
При ПВХРД содержание метаболитов NO в слезной жидкости у бурят,
которые являются носителями аномальной аллели Т в гомозиготном и
гетерозиготном состоянии, в 6 раз выше по сравнению с пациентами русской
национальности.
7. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в
гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции
ростового фактора у здоровых и пациентов с ПВХРД не зависимо от
национальности. У больных-носителей генотипа С/С и С/G падает
содержание VEGF в плазме крови. У пациентов с ПВХРД русской
этнической группы, обладателей генотипа G/G, концентрация VEGF в
слезной жидкости в 5,5 раз выше по сравнению с аналогичной группой
бурятской национальности.
8. В плазме крови пациентов бурятской национальности уровень VEGF
увеличивался при сочетании аномальных генотипов генов EDN1 (Lys198Asn)
и VEGF (C634G). При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной
аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn), генотипов VEGFA634 (G/G) и AGT-235 (Thr/Thr) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости
наиболее сильно повышался, а метаболитов оксида азота – снижался. В
русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по
аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G), eNOS-786
(C/C) и EDN1-198 (Asn/Asn) концентрация эндотелина-1 в слезной жидкости
росла, а метаболитов оксида азота – падала. Содержание VEGF в слезной
жидкости резко снижено при сочетании аномальных генотипов eNOS-786
(T/T) и VEGFA-634 (G/G).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи,
опубликованные
в
рецензируемых
журналах,
рекомендованных ВАК Минобрнауки России:
1. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы
(C786T) у больных с периферическими витреохориоретинальными
дистрофиями в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / С.В.
Серебренникова, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский
19
вестник. – 2012. - №1. – С. 17-21. - Режим доступа:
http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 01.12.2012).
2. Серебренникова С.В. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и
слезной
жидкости
у
больных
с
периферической
витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае
[Электронный ресурс] / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А.
Витковский // Забайкальский медицинский вестник. – 2012. - №2. – С.
17-19. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения
15.03.2013).
3. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелина-1 (Lys198Asn) у
больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в
Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А.
Витковский // Дальневосточный медицинский журнал. – 2012. - №4. –
С. 76-78.
4. Серебренникова С.В. Генетический полиморфизм эндотелина-1
(Lys198Asn) у пациентов с периферической витреохориоретинальной
дистрофией в Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, А.А. Петров,
Ю.А. Витковский // Молекулярная медицина. – 2013. - №2. - С. 54-56.
Работы, опубликованные в других изданиях:
5. Serebrennikova S.V. The levels of endothelin-1 in the plasma of patients
with peripheral vitreoretinal degeneration / S.V. Serebrennikova, Yu.A.
Vitkovsky // Trombosis research: Abstracts and proceedings of the 22 nd
Internashional Congress on Thrombosis. Nice, France, 6 - 9 October, 2012.
– Vol.130. – P. 140.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ген AGT - ген ангиотензиногена
Ген EDN1 - ген эндотелина-1
ДНК
- дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР
- полимеразная цепная реакция
ПВХРД - периферические витреохориоретинальные дистрофии
ЭТ-1
- эндотелин-1
NO
- оксид азота
NOx
- суммарное количество метаболитов оксида азота (нитратов и
нитритов)
eNOS
- эндотелиальная синтаза оксида азота
HIF-1
- фактор, индуцируемый гипоксией
VEGF
- сосудистый эндотелиальный фактор роста
20