2 - Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Базовая кафедра биотехнологии
РЕФЕРАТ
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ ФИЗИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ
СПОРТСМЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ
СИСТЕМЫ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ
Преподаватель
Студент
ФБ13-01М
Красноярск 2014
И.Е. Суковатая
Н.В.Руденко
Содержание
Введение ................................................................................................................... 3
1.1 Биохимия слюны ............................................................................................... 4
1.2 Изменение состава слюны при физических нагрузках ................................. 8
2.1 Биолюминесцентная реакция, катализируемая бактериальной
люциферазой .......................................................................................................... 10
2.2 Кинетические особенности функционирования биферментной системы
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза....................................................... 12
Список литературы ............................................................................................... 14
Введение
Совершенствование современной теории и методики тренировочного
процесса
в
спорте
высших
достижений,
во
многом
определяется
расширенным внедрением научных методов управления и современной
научно-исследовательской аппаратуры в практику спорта.
Оптимальность управления тренировочным процессом реализуется
посредством анализа индивидуальных реакций организма на предлагаемые
тренирующие
воздействия,
периодичности
процессов
адаптации
соответствующих функциональных систем, а также стадийности процессов
приспособления при генерализованном или локальном утомлении.
Методы
индивидуализации
тренировок
возможны
только
при
использовании объективных критериев оценки реакции организма на
физическую нагрузку.
В современном спорте высоких достижений биохимический контроль
состояния атлета является практически обязательной составной частью
процесса его подготовки. Объектами биохимических исследований обычно
являются кровь, моча, реже – выдыхаемый воздух, пот и слюна. Сдвиги,
вызываемые физической нагрузкой, наиболее отчетливо выявляются при
анализе крови, но этот биосубстрат далеко не всегда доступен. Отсюда
существует повышенный интерес к другим биологическим жидкостям таким
как слюна и пот.
Преимущества возможности замены в качестве тестобъекта крови на
слюну трудно переоценить, учитывая простоту и доступность ее получения и
возможность мониторинга как во время тренировки, так и на соревнованиях.
При этом анализ литературы обнаружил отсутствие достоверной
информации о зависимости химического состава и свойств слюны от
характера нагрузок и уровня тренированности. Не выработан также единый
методический подход к сбору и хранению проб слюны. Поэтому одной из
задач
настоящего
исследования
являлась
разработка
подобного
унифицированного метода основанном на биолюминесцентном анализе.
1.1 Биохимия слюны
Слюна является одной из важнейших жидкостей организма и
представляет собой прозрачную бесцветную жидкость. Слюна выделяется в
полость рта тремя парами крупных слюнных желез (подчелюстные,
околоушные, подъязычные) и множеством мелких слюнных желез полости
рта. В полости рта образуется смешанная слюна или ротовая жидкость,
состав которой отличается от состава смеси секретов желез, так как в ротовой
жидкости присутствуют микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности
и различные компоненты пищи, компоненты зубного налета и зубного
камня[1].
Рисунок 1 – Состав смешанной слюны
Секреция слюны носит циркадный характер – изменяется в течение
суток. Средняя скорость не стимулированной секреции слюны составляет
ночью во время сна – 0,05-0,1 мл/мин, днем – 0,3-0,4 мл/мин. Во время
приема пищи (стимулированная секреция) резко увеличивается до 2-7
мл/мин. Таким образом, суточный объем секретируемой слюны составляет
от 600 до 1200мл.
Плотность слюны колеблется в широких пределах и составляет от 1.001
до 1.017.
рН слюны в норме колеблется от 6,5 до 7,4 и зависит от характера
пищи, скорости секреции и гигиены полости рта. При низкой секреции рН
сдвигается в кислую сторону, при высокой – в щелочную.
Слюна выполняет ряд важных функций:

принимает участие в очищении полости рта от остатков пищи,
налета и бактерий;

нейтрализует кислоты и щелочи;

обеспечивает поступление ионов, необходимых для поддержания
структуры гидроксиапатитов эмали;

поддерживает
видовой
состав
микрофлоры
полости
рта,
формирует защитный барьер из муцина, железосодержащих белков и
лейкоцитов;

проявляет
противобактериальные,
противогрибковые
и
противовирусные свойства;

участвует в образовании пелликулы зубов, предотвращает
осаждение из слюны перенасыщенного раствора фосфата кальция;

смачивает
и
размягчает
твердую
пищу,
способствуя
формированию пищевого комка, обеспечивает первый этап гидролиза
крахмала пищи;

регулирует образование пищеварительных соков в желудочно-
кишечном тракте [2].
Слюна имеет сложный состав. Около 99,5% слюны приходится на воду.
Остальное
на
происхождения.
плотный
осадок
органического
и
неорганического
Рисунок 2 – Компоненты слюны
Среди органических компонентов слюны наиболее важными являются
разнообразные белки (альбумины, глобулины, муцин, иммуноглобулины,
ферменты), липиды (холестерол и его эфиры, свободные жирные кислоты,
глицеролипиды),
углеводы
(моно-
и
дисахариды,
свободные
гликозаминогликаны), небелковые азотсодержащие вещества, витамины,
циклические нуклеотиды и другие соединения.
Большую
часть
органических
компонентов
слюны
составляют
белковые соединения. Концентрация белка в слюне околоушной железы
выше, чем в подчелюстной. Слюна содержит те же белковые фракции, что
и сыворотка крови – альбумины, α-, β-, γ-глобулины. Однако среди них
значительно меньше альбуминов и в 4 раза больше β-глобулинов.
В состав слюны входит большое количество ферментов которые
выполняют как пищеварительную, так и защитную функции.
Среди минеральных компонентов слюны преобладают натрий, калий,
кальций и магний. Из всех неорганических веществ слюны наиболее
важны ионы кальция и неорганического фосфата, т.к. они участвуют в
минерализации зубов. Ионы кальция в слюне находятся в двух
состояниях – свободном ионизированном и связанном с белками или
органическими кислотами. Фосфор в слюне также находится в
ионизированной форме – НРО42- и Н2РО4- и в составе белков и других
органических соединений[3,4].
Слюна содержит три буферных системы: бикарбонатную, фосфатную и
белковую.
Основной буферной системой является бикарбонатная, представленная
слабой угольной кислотой – донором протонов и ионом бикарбоната –
акцептором протонов. Данная буферная система наиболее эффективна при
рН 6.1-6.3.
Фосфатная буферная система представлена донором протона – ионом
дигидрофосфата и акцептором – ионом моногидрофосфата. Наиболее
эффективна при рН 6.8-7.0.
Белковая буферная система представлена кислотными и основными
группами радикалов аминокислот, входящих в состав всех белков слюны[2].
1.2 Изменение состава слюны при физических нагрузках
В последние годы проведено большое количество исследований
состояния иммунной системы спортсменов в процессе физических нагрузок с
использованием слюны в качестве тест-объекта. Так как проявляется
преимущество легкой доступности биологической жидкости и возможность
получать тест-объект в процессе самой физической нагрузки [ 5 , 6 ]. Было
выявлено существенное изменение секреции иммуноглобулина А (IgA) у
бегунов на разные дистанции, у футболистов, у теннисистов , при силовых
упражнениях. У участников сверхмарафона (160 км) сначала наблюдалось
снижение секреции IgA, причем у 25% супермарафонцев этот пониженный
уровень сохранялся в течении 2-х недель. Также уровень IgA в слюне оказался
различным в команде пловцов и даже в какой-то мере коррелировал с уровнем
их физической подготовки . Отмечается определенное достоверное снижение
количества IgA в слюне велосипедистов при нагрузке, с последующим
возвращением к норме. Оказалось, что принятие кофеина перед интенсивной
нагрузкой вызывает повышенную секрецию IgA во время тренировки.
Исследование компонентов иммуной системы оказалось полезным при
выявлении наличия в организме алкоголя, а также в процессе допингконтроля у
скаковых лошадей[7,8,9] .
Достаточно
подробно
изучено
циклическое
изменение
спектра
стероидных гормонов в слюне регбистов, волейболистов, гандболистов и
дзюдоистов как во время соревнования, так и в процессе недельного
восстановительного периода. Уровень гормонов в слюне явился тестом в
анализе психологического состояния хоккеистов при играх дома и на выезде
("родные стены помогают")[5,10].
Достаточно широко представлены в литературе изменения у спортсменов
других биохимических показателей слюны. Здесь наибольший интерес
представляет обнаруженная высокая степень корреляции между содержанием
лактата в слюне и в крови испытуемых во время бега на различные дистанции
(от 400 м до 30 км), во время теннисных соревнований, а также при нагрузках
высокой мощности. Важным показателем состояния организма спортсмена во
время марафонского забега являются такие биохимические показатели слюны,
как минеральный состав, содержание гексозамина и свободной сиаловой
кислоты, активность амилазы и пероксидазы. Определение активности
амилазы, являющейся одним из основных ферментов слюны, часто проводится
при спортивно-биохимическом тестировании. Отмечено, что активность
антиоксидантных ферментов слюны (супероксиддисмутазы, пероксидазы,
каталазы) коррелирует с уровнем свободных сиаловых кислот в слюне. Также в
литературе имеются данные о повышении содержания мочевины в слюне
тяжелоатлетов после стандартной тренировки[6].
2.1 Биолюминесцентная реакция, катализируемая бактериальной
люциферазой
Биолюминесценция in vivo и in vitro нашла широкое применение в
качестве аналитических методов и биотестов для решения проблем охраны
окружающей
среды,
Биолюминесцентные
в
научных
методы
исследованиях,
используются
для
в
анализа
образовании.
метаболитов,
ключевых ферментов, токсинов, мутагенов и других веществ, воздействующих
на живые организмы.
Химической основой свечения бактерий является ферментативное
окисление люциферазами восстановленного флавинмононуклеотида ФМНН2 и
длинноцепочечного алифатического альдегида RCHO кислородом воздуха. Все
бактериальные люциферазы – флавин-зависимые монооксигеназы. Все они
представляют собой фермент αβ-гетеродимер, состоящий из двух субъединиц, α
и β , молекулярная масса которых соответственно 40 000 и 35 000.
Индивидуальные субъеденицы неактивны. Эти две субъединицы гомологичны,
но активный центр фермента расположен главным образом на α-субъединице.
Суммарное уравнение процесса может быть записано так:
люцифераза
ФМН  Н2 + RCHO + O2  ФМН + RCOOH + H2O + h,
(1)
где ФМН – флавинмононуклеотид;
RCOOH – карбоновая кислота.
Ни один из исходных реагентов реакции не может существовать в
бактериальной клетке в свободном виде т.к. ФМНН2 подвергается быстрому
автоокислению, тетрадеканаль является ядом и не производится организмами.
Поэтому
бактерии
имеют
специальные
ферментативные
системы,
способствующие восстановлению ФМН и карбоновой кислоты исключительно
для нужд биолюминесценции. Восстановление ФМН в бактериях происходит в
реакции, катализируемой НAД(Ф)H:ФMН-оксидоредуктазой:
ФМН + НАДН + Н+
НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза

НАД+ + ФМН  Н2
(2)
Время, требуемое для одного каталитического цикла моноферментной
биолюминесцентной системы намного больше, чем время жизни одного из
субстратов реакции -
ФМН∙Н2, который автокаталитически окисляется
кислородом менее чем за 1 сек:
ФМН∙Н2 + O2 → ФМН + H2O2 ,
(3)
Поэтому в условиях запуска реакции одной порцией предварительно
восстановленного ФМН фермент успевает совершить всего один оборот.
Наблюдается люминесцентная вспышка, затухающая по экспоненте реакция
протекает в нестационарном режиме.
Восстановление ФМН можно осуществлять и химически с помощью
восстанавливающего реагента НАДН. В этом случае в системе на протяжении
довольно большого интервала времени присутствует ФМН∙Н2, в результате
чего поддерживается стационарное свечение.
Второй субстрат – RCHO подвержен медленному неферментативному
окислению, и скорость окисления зависит от температуры и начальной
концентрации. При комнатной температуре раствор альдегида, используемый
для
измерения
биолюминесценции,
стабилен
в
течение
8
часов.
Неферментативное окисление альдегида в отличие от ФМН∙Н2 не оказывает
влияния на ход люминесцентной реакции, поскольку его скорость значительно
меньше скорости ферментативного окисления. Все бактериальные люциферазы
проявляют биолюминесцентную активность с альдегидами, длина цепи
которых от восьми до шестнадцати углеродов. Существует предположение, что
сродство
альдегида
к
люциферазе
обусловлено
гидрофобными
взаимодействиями между каждым участком алифатической цепи альдегида и
гидрофобными группами фермента. Поэтому с увеличением длины углеродной
цепи альдегид прочнее связывается с люциферазой. Это обеспечивает бóльшую
эффективность превращения химической энергии в световую. Однако эту
гипотезу нельзя считать всеобъемлющей, поскольку не для всех люцифераз
соблюдается монотонная связь параметров биолюминесцентной реакции с
длиной цепи альдегида. Специфичность люцифераз к альдегидам проявляется
в том, что другие алифатические длинноцепочечные соединения (кетоны,
кислоты, спирты) не обнаруживают с люциферазой биолюминесцентной
активности, хотя не исключено, что они реагируют с ней без излучения.
Природным субстратом бактериальной люциферазы считается тетрадеканаль,
поскольку в бактериях ферментативная система, восстанавливающая для нужд
биолюминесценции карбоновую кислоту, имеет специфичность именно к
миристиновой кислоте.
2.2 Кинетические особенности функционирования биферментной
системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза
Любые ферменты, катализирующие синтез субстратов люциферазы,
могут образовывать с ней сопряженную ферментную систему. Одной из таких
является сопряженная ферментная система NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазалюцифераза, осуществляющая следующую цепь ферментативных реакций:
FMN + NAD(P)H → FMN H2 + NAD(P)
(4)
люцифераза



FMN + RCOOH + Н2О + hν,
FMN Н2 + RCHO + O2 
(5)
В
результате
оксидоредуктазой,
первой
реакции,
происходит
катализируемой
восстановление
NADH:FMNс
помощью
люциферазой,
является
FMN
восстанавливающего реагента NADН.
Вторая
реакция,
биолюминесцентной.
В
катализируемая
этой
реакции
восстановленный
флавин
и
алифатический альдегид окисляются кислородом воздуха. В результате
реакции образуется окисленная форма флавина, жирная кислота, а также
испускается квант света. При проведении биолюминесцентной реакции с
использованием химически восстановленного FМNН2 наблюдается длительное
свечение, обусловленное множественными оборотами фермента[11].
Список литературы
1 Durdiakova J., Fabryova H., Koborova I., Ostatnikova D., The effects of
saliva collection, handling and storage on salivary testosterone measurement //
Steroids 2013. №14. P. 1325-1331.
2 Тарасенко Л.М., Непорада К.С. Биохимия органов полости рта :
учеб. пособие для вузов. Полтава: из-во Полтава, 2008. C. 2-21.
3 H.Zauber, S. Mosler, A. Hessberg, W. Schulze Dynamics of salivary
proteins and metabolites during extreme endurance sports – a case study //
Proteomics 2012. № 12. P. 2221-2235.
4 Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта: учеб.
пособие / Вавилова Т.П. – 2-е изд., испр. и доп., 2008. 208с.
5 Розенгард Е.В., Михайлов С.С. Слюна как объект биохимического
контроля в спорте // Ученые записки университета имени П.Ф. Лесгафта.
2008. №6(40). С. 57-61.
6 Хаустова С.А. Оценка функциональных резервов организма
спортсменов различной специализации на основе анализа состава слюны:
дис. … канд. биол. наук: 14.00.51. М., 2012. 167с.
7 Li T., Lin H., Ko M., Chang C., Fang S. Effects of prolonged intensive
training on the resting levels of salivary immunoglobulin A and cortisol in
adolescent volleyball players // The Journal of Sports Medicine and Physical
Fitness. 2012. №5. Р. 569-573.
8 Трищенкова С.Н., Архипова С.В., Краюшкина Н.А. Особенности
местного иммунитета глотки у спортсменов в норме и при хроническом
воспалении небных миндалин // Международный журнал прикладных и
фундаментальных исследований. 2012. №3. С. 19-20.
9 A.Tanner, B. Nielsen, J. Allgrove Salivary and plasma cortisol and
testosterone responses to interval and tempo runs and a bodyweight-only circuit
session in endurance-trained men // Jornal of Sports Sciences. 2013.
10 R. Toone, O. Peacock, A. Smith. D. Thompson, S. Drawer Measurement
of steroid hormones in saliva: Effect of sample storage condition // Scandinavian
Journal of Clinical & Laboratory Investigation. 2013. № 73. Р. 615-621.
11 Суковатая И.Е. Кинетические методы исследования биологических
процессов.
2.
Определение
кинетических
параметров
и
типов
взаимодействия ферментов с эффекторам: метод. указания / И.Е. Скуоватая,
В.А. Кратасюк. – Красноярск: Сибирский федеральный университет. 2007.
25с.