отчетНИСеминар_БФ_Ф_Тема2_Авсиевич

Сибирский федеральный университет
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
Отчет о Научно-исследовательской работе:
Кинетика биолюминесцентной реакции,
катализируемой бактериальной
люциферазой
Магистрант 2-го года:
Авсиевич Татьяна Игоревна
Научный руководитель:
к. ф.-м. н., доцент кафедры биофизики ИФБиБТ
Немцева Елена Владимировна
Фундаментальная проблема
• Структурно-динамическая организация белков
• Принципы функционирования ферментов in vivo
Практическая значимость
Биолюминесценция
Экологический
мониторинг
Клинический анализ
Исследование
экспрессии и
регуляции генов
Модель для
исследования
ферментативных
процессов
Остаются открытыми вопросы:
• Характер взаимодействия реагентов
• Формированиие возбужденного комплекса
• Влияния модифицированных сред на биолюминесцентную реакцию
2
Современное состояние проблемы
Экспериментальные
данные
«биферментная
система+фактор»
?
Математическая модель
моноферментной реакции
(Межевикин, 2011)
Анализ экспериментальных данных с помощью мат. модели позволит:
1) Определить на какие этапы биолюминесцентной реакции влияет вязкость
среды;
2) Проследить за изменением активности бактериальной люциферазы с
увеличением вязкости среды;
3) Определить тип воздействия вязких сред на биолюминесцентную реакцию.
3
Цель и задачи магистерской диссертации
Цель:
Выяснить механизм воздействия вязких сред на кинетику
моноферментной биолюминесцентной реакции.
Задачи:
1) Зарегистрировать нестационарную кинетику биолюминесцентной
реакции бактерий методом остановленной струи;
2) Проанализировать закономерности влияния вязких сред на кинетику
реакции;
3) Проанализировать экспериментальные данные с помощью
математической модели;
4) Выявить стадии реакции, наиболее подверженные влиянию вязких сред.
4
Цель и задачи практики
Цель: Освоить методику регистрации нестационарной кинетики
биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи
Задачи:
1) Освоить методику работы на анализаторе кинетики быстрых процессов
SFM-300/400 (BioLogic);
2) Адаптировать методику фотовосстановления флавинмононуклеотида для
применения на анализаторе кинетики быстрых процессов;
3) Отработать методику регистрации нестационарной кинетики
биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи.
Практика была пройдена в Институте экспериментальной физики IV
университета г. Байройт (Германия) при поддержке гранта ККФНиНТД.
5
Объект исследования
Биолюминесцентная реакция
бактерий
Быстрое окисление субстрата (проблема!):
1) Нестационарная кинетика
2) Многосубстратная
3) Многостадийная
Схема 2
RibP = CH2(CHOH)3CH2OP(O)(OH)2
J. W. Hastings, Q. H. Gibson, 1963
6
Результаты: фотовосстановление ФМН
Этилендиаминтетрауксусная
кислота (ЭДТА) стабилизатор
7
Результаты: фотовосстановление ФМН
Разработанная методика
Приготовление фотовосстановленного дегазированного раствора ФМН
в буфере (в шприце для анализатора кинетики):
1) Вакуумная дегазация с применением ультразвуковой ванны Sonorex
(BANDELIN);
2) Барботирование аргоном в течение 15 минут;
3) Наполнение шприца раствором с аргоновой «подушкой» сверху;
4) Облучение реагента в шприце светом ксеноновой лампы.
Таблица 1. Состав реакционной смеси для фотовосстановления ФМН
Реагент
Объем, мкл
Исходная
концентрация, М
Концентрация в шприце,
М
FMN
488
0,004
81*10-6
EDTA
12 000
0,02
0,01
Buffer
11 512
0,05
0,02
Sonorex (BANDELIN)
8
Результаты: фотовосстановление ФМН
Контроль восстановления на спектрофотометре:
Спектр поглощения восстановленного и окисленного ФМН
Окисленный ФМН
A445 = 0,56
Восстановленный ФМН A445 = 0,11
9
Кинетика окисления ФМН, снятая на
Stopped-Flow SFM 300 (режим абсорбции)
• Кинетика окисления ФМН
при смешивании:
1 - с буфером
2 – с дегазированным буфером
10
Кинетика окисления ФМН при
смешивании с буфером, снятая на
Stopped-Flow SFM 300 (режим флуоресценции)
•
•
•
•
Excitation wavelength : 445 nm
Emission wavelength : 0 nm
HV= 609V
Total volume : 150 µl Flow : 12
mL/s
• Dead time : 2 ms
11
Результаты: освоение анализатора
Анализатор кинетики быстрых процессов
Stopped-Flow SFM 300
• Одновременное смешивание 3-х реагентов
• Минимальное мертвое время для микрокюветы 0.25ms
12
Результаты: освоение анализатора
Оптическая ячейка TC-100/10F
• Мертвый объем 30,2 L
• Мертвое время 3 ms
13
Результаты: регистрация кинетики
Методика регистрации биолюминесцентной
вспышки Stopped-Flow SFM 300
Таблица 2. Реакционная смесь для каждого шприца
Шприц
Реагент
Концентрация в
шприце, µM
Концентрация в
кювете, µM
R1
Альдегид в буфере
6
2
R2
Люцифераза в буфере
0,6
0,2
R3
Восстановленный ФМН
81
27
14
Результаты: регистрация кинетики
Алгоритм регистрации кинетики биолюминесценции:
•
•
•
•
•
Заполнение экспериментальной установки азотом;
Установить 0 для значений длин волн возбуждения и испускания;
Включить напряжение ФЭУ: HV=600 V;
Задать объем в зависимости от отношения смешиваемых объемов из каждого шприца;
Мертвое время оценивается в зависимости от скорости потока и смешиваемого
объема.
•
•
•
•
•
•
Excitation wavelength : 0 nm
Emission wavelength : 0 nm
HV= 609V
Total volume : 150 µl Flow : 12 mL/s
Ratio : S1: 1, S2: 1, S3: 1
Dead time : 2 ms
15
Результаты: регистрация кинетики
Варьирование концентрации альдегида
Подбор адекватной концентрации
альдегида для протекания
биолюминесцентной реакции
16
Результаты: регистрация кинетики
17
Выводы
1.
2.
3.
4.
Для получения кинетической кривой реакции, катализируемоуй
бактериальной люциферазой, необходимо создание условий,
приближенных к анаэробным: дегазация растворов ФМН,
наполнение установки азотом и др.
Экспериментальные условия с «мертвым» временем около 2 ms
позволяют регистрировать полную кинетическую кривую
биолюминесцентной реакции, включающую не только спад, но и
начальный рост светоиспускания;
Требуются дополнительные меры по гомогенизации раствора
альдегида (не только с точки зрения контроля концентрации, но и
для корректной работы установки).
Для более полного отображения механизма действия люциферазы
требуется проведение эксперимента с введением вязких сред.
18