УДК 577.151.6 МЕТОД ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОВЯЗКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ МЕХАНОАКУСТИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
advertisement
УДК 577.151.6 МЕТОД ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОВЯЗКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ МЕХАНОАКУСТИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ Мищенко Д.В., Котельникова Р.А., Богданов Г.Н. Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка Метод триплетных зондов основан на дезактивации триплетного возбужденного состояния фосфоресцентных зондов под действием внешних тушителей, вводимых избирательно в исследуемый объект. В связи с высокими значениями времен жизни фосфоресценции триплетных возбужденных хромофоров (10-4 – 101 с) по сравнению с временами жизни возбужденных синглетных состояний молекул (10-9 – 10-6 с) [1 – 3] или спин-решеточной релаксации нитроксильных радикалов в растворах (10-11 – 10-9 с) [3, 4], чувствительность метода триплетных зондов на несколько порядков выше, чем чувствительность традиционных методов флуоресцентных или спиновых зондов. В качестве тушителей триплетных возбужденных состояний фосфоресцентных хромофоров могут выступать ароматические соединения, слабые окислители и восстановители, парамагнитные комплексы и ионы. Эффективными тушителями фосфоресценции триплетных зондов являются нитроксильные радикалы, химия которых хорошо известна, что позволяет синтезировать нитроксильные радикалы с заданными параметрами (гидрофобностью, размерами, структурой) и вводить их избирательно в определенные участки биологических мембран или белков для получения информации о строении и функционировании изучаемых объектов. Показано, что с помощью метода триплетных зондов по кинетике затухания фосфоресценции эритрозина и аннигиляционной замедленной флуоресценции пирена можно определить время жизни возбужденных состояний зондов [1], что обусловливается изменением вязкости и полярности биологических мембран. Целью данной работы является изучение влияния интенсивных акустических колебаний (ИАК) на структуру мембран форменных элементов крови с помощью метода триплетных зондов и его коррекции с использованием мембранопротекторов из класса биоантиоксидантов. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА. Работа выполнена на 50 крысах-самцах линии Вистар. Изменения в структуре мембран форменных элементов крови при воздействии ИАК изучали на интактных животных и при введении антиоксидантов: феноксана (3,5–ди-трет.бутил–4–оксифенилпропионат калия), ТОП (сукцинат 2,4,6–триметил–3– оксипиридина) и ТОП-NO (нитроксисукцинат 2,4,6 – триметил –3– оксипиридина): OH CH3 CH3 OH OH CH2 H3 C N CH2 H3 C N CH3 * HOOC CH ONO2 COOK феноксан CH3 ТОП CH 2 COOH O2 ТОП-NO Антиоксиданты вводили за 30 минут до воздействия ИАК в эквимолярных дозах (3х10-5 М/кг). Через час после воздействия у животных производили забор крови из нижней полой вены. Использование двух типов зондов позволяет одновременно характеризовать изменение микровязкости внутренних гидрофобных областей мембраны (пирен) и внешних полярных областей (эритрозин). Параметрами, характеризующими кривые затухания фосфоресценции и флуоресценции, являются времена жизни возбужденного состояния используемых зондов. Для определения этих параметров в кварцевую кювету вносили 2 мл эритроцитарной или лейкоцитарной массы в фосфатном буфере (10 % гематокрит), к полученной суспензии добавляли зонд в конечной концентрации 10-5 М. Молекулы пирена и эритрозина возбуждали импульсным азотным лазером (длина волны 337 нм) с использованием светофильтра ЖС-10, и КС-13, соответственно, чтобы исключить вклад в свечение других хромофоров, содержащихся в форменных элементах крови. В автоматическом режиме регистрировали кривые затухания возбужденного состояния молекул зонда, из которых определяли время жизни возбужденных молекул зондов. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Изменения в структуре мембран форменных элементов крови наблюдали по экспоненциальным кривым затухания фосфоресценции триплетного зонда эритрозина и аннигиляционной замедленной флуоресценции зонда пирена. Из полученных данных (табл. 1) следует, что при воздействии ИАК на мембраны лейкоцитов снижается время жизни фосфоресценции молекул эритрозина относительно нормы с (2,45 ± 0,07) 10-5 до (2,10 ± 0,001) 10-5 с. Этот результат указывает на увеличение диффузионой подвижности зонда, вероятно, вследствие понижения вязкости полярных сайтов мембраны. Было показано, что в результате применения антиоксидантов время жизни возбужденного состояния эритрозина увеличивается. Введение ТОП приближает значения времен жизни возбужденного состояния эритрозина к норме, соответствующей возбужденным зондам, введенным в лейкоцитарные мембраны интактных животных. При использовании феноксана время жизни возбужденного состояния эритрозина, встроенного в мембрану лейкоцитов, превышает время жизни возбужденного зонда в нативной мембране на 16 %. Как видно Таблица 1 Влияние антиоксидантов на значения времени жизни триплетных зондов, встроенных в мембраны форменных элементов крови крыс при действии ИАК Время жизни, τ · 10-5 с. в мембранах лейкоцитов в мембранах эритроцитов эритрозин Пирен эритрозин Пирен 2.45+0.07 1.3+0.001 1.7 +0.07 0.8 +0.03 2.1+0.001 1.5+0.001 2.0 +0.1 1.1 +0.03 2.85+0.07 1.25+0.07 2.1 +0.1 0.9 +0.01 2.35+0.1 1.37+0.05 2.6+0.07 1.0+0.001 1.65 +0.07 0.78 + 0.01 Норма Опыт Действие феноксана Действие ТОП Действие ТОП-NO из рис. 1А время жизни возбужденного состояния пирена в результате акустического воздействия увеличивается на 15 % по отношению ко времени жизни замедленной флуоресценции пирена, встроенного в мембраны лейкоцитов интактных животных. Этот факт свидетельствует о том, что увеличивается вязкость гидрофобных сайтов лейкоцитарных мембран при действии ИАК. Фармакологическая коррекция как в случае с феноксаном, так и в случае с ТОП восстанавливает вязкость неполярных сайтов мембран лейкоцитов практически до уровня нормы. При исследовании влияния ИАК на мембраны эритроцитов крыс (рис. 1Б) показано, что значения времен жизни возбужденных молекул триплетных зондов эритрозина и пирена в полярных и неполярных сайтах эритроцитарных мембран в результате ИАК возрастают по сравнению со значениями времен жизни возбужденных состояний зондов, встроенных в мембраны эритроцитов Б А 1.53 пирен эритрозин 1.2 1.16 1.15 1.1 0.8 1.4 1.38 1.3 1.2 1.05 1.24 1.18 1.25 1.13 1.1 1 0.9 1.5 1 0.96 2 3 0.96 0.98 0.97 1 0.9 1 2 3 4 0.85 Рис. 1. Изменение нормированных значений времени жизни (τ) возбужденных молекул пирена и эритрозина в мембранах лейкоцитов(А) и эритроцитов (Б): 1 – воздействие ИАК, 2 – действие феноксана, 3 – действие ТОП, 4 – действие ТОП-NO. интактных животных. Это свидетельствует об увеличении микровязкости как полярных, так и неполярных областей фосфолипидной мембраны эритроцитов в результате воздействия ИАК. Применение фармакологических препаратов поразному влияло на структуру эритроцитарных мембран. В присутствии феноксана и ТОП микровязкость неполярных сайтов мембран несколько снижается, а полярных – увеличивается. Использование антиоксидантов с нитратной группировкой (ТОП-NO) изменяет микровязкость мембран эритроцитов до уровня нормы как в полярной), так и неполярной областях. Высокая эффективность корригирующего действия механоакустических повреждений с помощью ТОП-NO, вероятно, связана с его уникальным строением. Одна молекула ТОП-NO способна ингибировать пероксидное окисление липидов (ПОЛ) двумя путями. Оксиароматическая группировка нейтрализует пероксидные радикалы. Нитратный фрагмент молекулы ведет к образованию монооксида азота и таким образом обеспечивает связывание супероксидрадикалов с образованием пероксинитрита. Ранее в наших работах было высказано положение о том, что повреждающее действие интенсивных акустических колебаний (ИАК) на биосистемы сопровождается возникновением и развитием явлений мембранной патологии по оксидативному типу [5]. Защитное действие антиоксидантов свидетельствует о свободнорадикальных механизмах поражающего действия ИАК и указывает на перспективность использования биоантиоксидантов в качестве средств защиты живых организмов при механоакустических воздействиях. ЛИТЕРАТУРА 1. 2. 3. 4. 1. Меклер В. М., Котельников А.И., Лихтенштейн Г.И., Беркович М.А.: Биофизика, 1982.– Т. 27.– С. 641-645. 2. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика. – Воронеж, Изд-во ВГУ, 1994.- 336 с. 3. Введение в биомембранологию/Под ред. А.А. Болдырева. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – 208 с. 4. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. – М.: Наука, 1974.– 256 с.
