Клиническое значение экспрессии молекул гистосовместимости
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи БУРОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Клиническое значение экспрессии молекул гистосовместимости на клетках рака молочной железы Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.01.12 - онкология Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Владимир Юрьевич Сельчук Доктор медицинских наук, Николай Николаевич Тупицын Москва — 2015 профессор ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 3 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................................... 9 ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ................................................................................................................................................................ 39 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. .................................................................... 47 ГЛАВА 3. ЭСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛ HLA-I и HLA-DR НА КЛЕТКАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. .............................................................................................................................................. 47 ГЛАВА 4. КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HLA-I-ПОЗИТИВНОЙ ГРУППЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. ....................................................................................................... 53 ГЛАВА 5. КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HLA-DR-ПОЗИТИВНОЙ ГРУППЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. ....................................................................................................... 62 ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ С ЭКСПРЕССИЕЙ HLA-I. .................................................................................................................................................... 73 ГЛАВА 7. ВЗАИМОСВЯЗЬ СУБПОПУЛЯЦИЙ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ С КЛИНИЧЕСКИМИ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ....................................................................................................................... 83 ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ. .............................................................................. 104 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 113 ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................................................... 116 2 ВВЕДЕНИЕ В России рак молочной железы (РМЖ) занимает 1 место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований у женщин – 20,7%. В период 1991 – 2012 гг. число заболевших увеличилось с 31,9 тыс. до 59,5 тыс. в год. Смертность женщин от рака молочной железы в России в 2012 году достигла 23 200 случаев. В то же время по мере улучшения ранней диагностики растет доля ранних форм заболевания. В 2012 году 64,5% составили пациентнки с I –II стадиями среди впервые выявленного рака молочной железы (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2014). Одной из причин отсутствия существенного улучшения результатов лечения РМЖ в последние 2 десятилетия является недостаток знаний фундаментальных основ прогрессии этого варианта опухоли и причин ареактивности иммунной системы в отношении раковых клеток. Типичным примером мембранных рецепторов опухолевых клеток, опосредующих взаимодействие с иммунной системой и претерпевающих существенные изменения в ходе прогрессии рака молочной железы, являются молекулы гистосовместимости I и II классов. Функция этих молекул МНС заключается в связывании пептидных фрагментов внутриклеточных белков, их транспорте на мембрану клетки, где комплекс МНС-пептид распознается Т-киллерами или Т-хелперами. Для реализации цитотоксического действия Т-киллеров в отношении опухолевых клеток необходимо распознавание армированным CD8+ Т- лимфоцитом комплекса опухолеспецифического пептида с молекулами HLA-I на мембране клетки рака молочной железы. Только в этом случае возможно осуществление киллерного действия Т-лимфоцита. Универсальным механизмом ускользания рака молочной железы из-под контроля Т-клеточного иммунитета является антигенное упрощение опухоли, заключающееся в утрате экспрессии молекул HLA на мембране раковых клеток по мере их прогрессии. 3 Молекулы HLA-I класса присутствуют на эпителии молочных желез в норме и при доброкачественных процессах, но могут утрачиваться при раке примерно в 50% случаев (Н.Н.Тупицын, 2005). Клиническое значение утраты экспрессии молекул HLA-I на клетках рака молочной железы, их связь с распространенностью опухолевого процесса (стадией, наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы) и прогнозом на различных стадиях заболевания недостаточно ясны. Молекулы HLA-II класса являются примитивными рецепторами для пептидных фрагментов экзогенных антигенов, поступающих в клетку путем фагоцитоза или пиноцитоза, которые в комплексе с молекулами HLA-II транспортируются из цитоплазмы на мембрану клетки для распознавания Тхелперными (CD4) лимфоцитами. На нормальном покоящемся эпителии молочной железы экспрессия HLA-DR отсутствует. Антиген появляется на эпителии в поздние сроки беременности, а также при лактации. Нет единства мнений относительно молекул HLA-II на клетках рака молочной железы: одни авторы считают проявлением опухолевой прогрессии наличие этих молекул, другие - их отсутствие. При раке молочной железы отмечается значительная вариабельность экспрессии молекул HLA-II, причем лишь в небольшом проценте случаев (7 - 12%) присутствует выраженная пропорция позитивных клеток. В большинстве случаев (60%) наблюдается отсутствие экспрессии HLA II на клетках рака молочной железы. В последние годы отмечается повышение научного интереса к анализу мембранных молекул гистосовместимости клеток рака молочной железы. Это обусловлено более детальным пониманием дифференцировки опухолей протокового и долькового присхождения (Turashvili G., 2005), роли молекул HLA в индукции ответа Т-хелперных и Т-киллерных клеток (Oldford S. et al., 2006). Более того, появились публикации (Leth-Larsen R. et al., 2009) относительно роли молекул HLA в метастазировании рака молочной железы. 4 В Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина накоплен большой материал, указывающий на связь экспрессии этих молекул с уровнями Т-клеточной инфильтрации опухоли, что находит отражение в прогнозе ранних стадий рака молочной железы (Артамонова Е.В., 2003). Однако точного соотнесения Т-хелперного звена с экспрессией HLA-Dr на раковых клетках, равно как и уровней цитотоксических (CD8) T-лимфоцитов с экспрессией мономорфных детерминант HLA-I не проводилось. Современные возможности проточно-цитометрического анализа опухолевой ткани, количественной оценки экспрессии молекул HLA на туморинфильтрирующих лимфоцитах и раковых клетках позволяют точно установить ассоциации Проведение активации подобного Т-лимфоцитов анализа с молекулами является ключом гистосовместимости. для интерпретации иммуногистохимических данных относительно клинической роли активации интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Следовательно, изучение молекул главного комплекса гистосовместимости на клетках рака молочной железы с позиций дальнейшего понимания взаимодействия опухоли и иммунной системы и улучшения на этой основе прогноза заболевания является актуальной задачей современной онкологии. Целью настоящей работы является оценка клинического значения экспрессии молекул гистосовместимости на опухолевых клетках при раке молочной железы. Задачи исследования: 1. Оценить частоту экспрессии молекул гистосовместимости I и II классов при раке молочной железы различных стадий. 2. Проанализировать взаимосвязи экспрессии молекул HLA с морфологическими особенностями рака молочной железы. 5 3. Изучить инфильтрацию рака молочной железы субпопуляциями Т- и В- лимфоцитов, их активацию в зависимости от наличия молекул HLA на опухолевых клетках. 4. Оценить особенности распространенности процесса в зависимости от экспрессии молекул гистосовместимости на клетках рака молочной железы. 5. Проанализировать взаимосвязь экспрессии молекул HLA опухолевыми клетками с клиническими и морфологическими факторами прогноза рака молочной железы. Научная новизна В результате проведенного исследования впервые на большом клиническом материале установлены клинико-иммуноморфологические ассоциации в зависимости от экспрессии молекул гистосовместимости на клетках рака молочной железы. Впервые соотнесена экспрессия молекул гистосовместимости с рецепторным статусом и морфологическими особенностями опухоли. Утрата экспрессии молекул характеризует группу HLA-I класса опухолей со на клетках сниженной рака молочной инфильтрацией железы опухоли лимфоцитами (процент CD45+ лимфоцитов среди всех ядросодержащих клеток опухолевой ткани), зрелыми Т-клетками (процент CD3 в пределах лимфоцитов CD45++), Т-хелперами (CD4+ в пределах зрелых CD3+ Т-лимфоцитов). HLA-DR-позитивный иммунофенотип рака молочной железы сопровождается достоверно более выраженной Т-клеточной инфильтрацией (CD45+CD3+), инфильтрацией активированными Т-клетками (CD3+HLA-DR+ и CD3+CD25+). Наиболее более редкая утрата антигена наблюдается при низком пролиферативном индексе опухоли и в случаях, положительных по экспрессии рецепторов эстрогенов. Экспрессия HLA-DR на опухолевых клетках характерна для ранних стадий (I, IIa) рака молочной железы и не наблюдается при IIб-IIIa стадиях (р=0,031). При нарастании степени злокачественности рака молочной железы от I к III доля HLA-DR-негативных случаев увеличивается от 25% до 6 100% (р=0,005). Экспрессия молекул HLA-DR на клетках рака молочной железы характерна для опухолей с низким пролиферативным индексом, и средние уровни Ki-67-позитивных клеток достоверно выше при HLA-DR-негативных опухолях в сравнении с HLA-DR-позитивными (26,6% и 12,5%, р=0,001). Экспрессия HLA-DR на клетках рака молочной железы взаимосвязана со статусом рецепторов прогестерона: частота HLA-DR-отрицательных случаев достоверно выше в рецептор-негативных случаях, р=0,043. При отсутствии метастазов рака молочной железы в регионарных лимфатических узлах (N0) отмечаются более высокое содержание активированных (HLA-DR+) интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), что отражается на более высоких уровнях HLA-DR+CD45+ лимфоцитов у больных с отсутствием метастазов (N0) в сравнении с больными, у которых метастазы обнаружены (N1-N3). При II и III степенях злокачественности рака молочной железы процент тумор-инфильтрирующих лимфоцитов был достоверно выше, чем при опухолях I степени злокачественности (р=0,041), вместе с тем пропорция зрелых Тлимфоцитов (CD3), а также активированных CD3+HLA-DR+ и по CD4+HLA-DR+ клеток была достоверно более низкой. Содержание интратуморальных, а также активированных Т-клеток (CD3) и Т-хелперов (CD4) выше при I стадии рака молочной железы в сравнении со II-III стадиями (р=0,028 – 0,04). При III стадии рака молочной железы повышены CD8+CD45+ лимфоциты. Количество интратуморальных CD3+ Т-лимфоцитов и CD8+ клеток было достоверно более высоким при опухолях с низким уровнем Ki67+ пролиферирующих клеток. В рецептор-положительной группе (по рецепторам эстрогенов, прогестерона) отмечена достоверно более низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами. Впервые показано, что более высокое содержание активированных Т-клеток и активированных CD4+ лимфоцитов наблюдается в Her2/Neu-отрицательных (0 7 баллов) случаях. При отрицательном статусе по Her2/Neu (0-1 баллов) достоверно повышены CD8+ лимфоциты. При инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком выявлены достоверно более высокие уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами, активированными Т-клетками и активированными Ткиллерами CD3+CD8+. Подтипы люминального рака достоверно различаются по уровням туморинфильтрующих лимфоцитов. При люминальном А раке уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами были в 5 раз более высокими, чем при люминальном В. Вместе с тем, люминальный подтип В характеризовался достоверно более высокой инфильтрацией опухоли Т-лимфоцитами – 81% и 70%, р=0,016. Научно-практическое значение Установлена группа опухолей с полной или частичной утратой молекул гистосовместимости I и/или II классов, что позволяет учитывать эти данные при планировании различных видов иммунотерапии. Работа позволяет с научных позиций обосновать особый терапевтический подход, основанный на индукции молекул гистосовместимости в случаях HLAнегативного рака молочной железы. Обнаружение ассоциации экспрессии молекул гистосовместимости с особенностями регионарного и отдаленного метастазирования рака молочной железы позволяет рекомендовать усиление адъювантной химиотерапии в прогностически неблагоприятных группах больных. 8 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Концепция иммунного надзора заключается в поддержании взаимосвязи между тумор-специфическими антигенами (ТАА), образующими комплекс HLA-I класса, и цитотоксическими Т-клетками. Активированные тумор-специфические цитоксические Т-клетки могут специфически уничтожать раковые клетки. Утрата HLA-I класса на клетках опухоли, как полагают, приводит к сбоям в распознавании CD8+ Т-клеток. Известно, что злокачественные новообразования утрачивают экспрессию молекул гистосовместимости на опухолевых клетках (Garrido F et al.,1993; Garrido F et al., 1997; Hicklin DJ et al., 1999). Утрата антигенов HLA-I класса, по-видимому, один из важнейших механизмов, который предотвращает атаку опухолевых клеток со стороны иммунной системы, а также вызывает затруднения в формировании противоопухолевой иммунотерапии (Hicklin DJ et al., 1999). Функция молекул МНС (у человека носят название HLA от англ. Human Leucocyte Antigens) заключается в связывании пептидных фрагментов белков, синтезируемых в клетке или поступающих извне, в их транспорте на мембрану клетки, где комплекс МНС-пептид распознается Т-киллерами или Т-хелперами. Схематично формирование Т-клеточного противоопухолевого иммунитета можно разделить на два этапа. На первом этапе образуется клон армированных Тклеток, то есть зрелых Т-клеток, обученных ответу на опухоле-ассоциированный антиген. Роль раковых клеток во взаимодействиях с иммунной системой при формировании специфических армированных противоопухолевых Т-киллеров на сегодняшний день не совсем ясна. Важное значение отводится профессиональным антиген-презентирующим клеткам (АПК). На мембране АПК экспрессированы костимуляторные молекулы В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86), взаимодействие которых с рецептором CD28 на мембране Т-клеток необходимо для активации последних. Профессиональными АПК являются макрофаги, дендритные клетки, В- лимфоциты. Этим клеточным типам отводится главная роль в формировании опухолеспецифических клонов Т-лимфоцитов. На втором этапе осуществляется 9 цитотоксическое действие Т-киллеров в отношении опухолевых клеток. Для его реализации необходимо распознавание армированным Т-лимфоцитом комплекса опухолеспецифического пептида с молекулами HLA-I на мембране клетки рака молочной железы. Только в этом случае возможно осуществление киллерного действия Т-лимфоцита. Следовательно, иммуногенность опухолевой клетки определяется в равной степени как существованием опухолеспецифических антигенов, так и их экспозицией на мембране раковой клетки в виде комплекса пептид-HLA-I. Универсальным механизмом ухода рака молочной железы из-под контроля Т-клеточного иммунитета является антигенное упрощение опухоли, заключающееся в утрате экспрессии молекул HLA на мембране раковых клеток по мере их прогрессии. Феномен этот давно известен и достаточно хорошо изучен. Вместе с тем, диагностическое значение определения экспрессии молекул HLA на клетках рака молочной железы не установлено. Это обусловлено, с одной стороны, чрезвычайной сложностью и многогранностью наследования, экспрессии и взаимодействия с иммунной системой антигенов главного комплекса гистосовместимости, а с другой - отсутствием единства мнений относительно клинической значимости оценки экспрессии молекул HLA на клетках рака молочной железы. Молекулы HLA класса I в норме экспрессированы на всех ядросодержащих клетках организма человека, включая эпителий молочной железы. В составе функциональной молекулы HLA-I, способной представлять антигенный пептид на мембране клетки для распознавания CD8-позитивными Т-лимфоцитами, имеются две полипептидные цепи: -цепь и -цепь. -цепь в составе молекул HLA-I представлена 2-микроглобулином, который не является продуктом генов главного комплекса гистосовместимости. Наследование молекул HLA и, в частности, HLA-I подчиняется трем главным закономерностям: полигения, полиморфизм, кодоминантность. Это значит, что существует 3 гена -цепей молекул HLA-I: A, B, C. Для каждого из этих генов есть множество аллелей: для 10 HLA-A - 60, для HLA-B - 136, для HLA-C - 38. Оба аллельных варианта каждого из генов экспрессируются во всех клетках организма человека. Таким образом, на мембране клетки может присутствовать до 6 различных -цепей HLA-I. Молекулы HLA-I сочетают два главных свойства - чрезвычайное многообразие (следствие полигении и полиморфизма) и определенную консервативность структуры. Многообразие необходимо в силу того, что HLA-I являются примитивными рецепторами для пептидов (собственных, чужеродных), которые распознаются различными аллелями HLA-I. Так, применительно к раку молочной железы, опухолеассоциированный антиген MUC1 связывается с аллельным вариантом А2 -цепей HLA-I (Brossart P., et al., 1999). В последние годы было определено и охарактеризовано большое количество антигенов, которые специфически или преимущественно экспрессированы на опухолевых клетках в зависимости от их способности вызывать ответы Т-клеток (Van den Eynde BJ et al., 1997) или же В-клеток (Preuss KD et al., 2002). Однако после возникновения опухоли она ускользает от иммунной защиты организма, причем механизмы этого феномена различны (Rabinovich GA et al., 2007). В организме опухоленосителя CD4+ и CD8+ Т-клетки находятся в состоянии толерантности (Willimsky G et al., 2005; Staveley-O’Carroll K et al., 1998). Активация пути Stat-3 в опухолевых клетках уменьшает экспрессию провоспалительных цитокинов и хемокинов, которые активируют врожденный иммунитет и дендритные клетки. Кроме того, Stat-3 стимулирует выработку плейотропных (pleiotropic) факторов, которые ингибируют дендритные клетки функционального созревания, таким образом, подавляя опухольспецифический ответ Т-клеток (Cheng F et al., 2003; Wang T et al., 2004). Помимо вмешательства в эффекторные механизмы иммунной системы, злокачественные клетки могут избегать лизиса специфическими цитотоксическими Т-клетками за счет нарушений презентирования специфичных пептидов самими опухолевыми клетками. Цитотоксические Т-лимфоциты распознают специфический пептид, представляемый комплексом МНС-I класса 11 на опухолевых клетках (Rudolph MG et al., 2006). Для создания комплекса тяжелой цепи MHC-I класса и β2 микроглобулина (β2m) с эндогенными пептидами требуется взаимодействие ряда внутриклеточных белков. Переработка пептида и перемещение его в эндоплазматический ретикулум включает в себя транспортеры процессированного антигена (ТАР-1 и ТАР-2), а также протеосомный комплекс, включающий в себя МНС-I и низкомолекулярные белки LMP-2 и LMP-7. В литературе описаны нарушения любого из звеньев презентирования антигенных пептидов на мембрану опухолевой клетки. При опухолях может наблюдаться как полная утрата экспрессии молекул HLA-I (Cabrera T. et al., 1996; Cabrera T. et al., 1998; Algarra I. et al., 1997), так и частичная потеря отдельных аллелей (Ramal L.M. et al., 2000). К нарушениям экспрессии молекул HLA-I класса могут приводить также мутации в гене β2-микроглобулина, что показано на примере меланомы (Hicklin D.J. et al., 1998). Процесс презентирования антигенных опухолевых пептидов является выcокоспецифичным. Это доказано на примере презентирования пептида опухолевого тестикулярного антигена SSX2103-111 меланомными клетками. Для создания специфических пептидов могут быть использованы некоторые искусственные системы, например, переработка соответствующего белка цистеиновыми протеазами или трипептидил пептидазами (Lopez D. et al., 1997; Seifert U. et al., 2003; Guil S. et al., 2006). Для создания Т-цитотоксических лимфоцитов, специфичных к пептиду SSX2103-111 использован его комплекс с молекулами HLA-A*0201. Последующее доказательство специфичности проводится на основе секреции ИФН-γ методом ELISPOT (zum Buschenfelde C.M., 2001). Для исключения взаимодействия Т-лимфоцитов с самим пептидом (вне комплекса с HLA) использованы библиотеки Fab-фрагментов антител, экспрессированные в фагах, ряд других высокотехнологичных подходов (de Haard H.U. et al., 1999; Held G. et al., 2004; Altman J.D. et al., 1996; Hendrix P. et al., 1998; Chapatte L. et al., 2004). Важным выводом этих работ явилось то, что существует 12 избирательность в ускользании опухоли от иммунной системы организма – могут страдать определенные звенья, определенные комплексы пептидов с HLA, но не вся система презентирования в целом. Консервативность структуры молекул HLA-I вытекает из их свойства служить лигандом для рецептора CD8, который распознает неполиморфный 3домен молекулы HLA-I. Исследования молекул HLA-I при опухолях ведутся по многим направлениям: способности изучение представлять аллельных конкретные вариантов, как опухолеассоциированные отражение антигены; установление наличия или отсутствия молекул HLA-I на раковых клетках, свидетельствующее о возможности распознавания и уничтожения этих клеток Ткиллерами; расшифровка молекулярных механизмов регуляции экспрессии молекул HLA в раковых клетках и т.д. Молекулы HLA-II класса так же, как и HLA-I, являются примитивными рецепторами для антигенных пептидов (в этом случае речь идет о пептидных фрагментах, экзогенных антигенов, поступающих в клетку путем фагоцитоза или пиноцитоза), которые в комплексе с молекулами HLA-II транспортируются из цитоплазмы на мембрану клетки для распознавания Т-хелперными (CD4) лимфоцитами. Молекулы HLA-II класса состоят из 2 полипептидных цепей - и . Как и молекулы HLA-I, молекулы HLA-II характеризуются сочетанием чрезвычайного разнообразия и наличием общности структуры. Разнообразие является следствием полигении, полиморфизма и кодоминантности экспрессии соответствующих генов. Полигения заключается в наличии 3 генов, получивших название HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ. Полиморфизм - это наличие множества аллелей каждого гена. Так, для генов -цепей HLA-DR существует 137 аллелей, HLA-DP - 66, HLA-DQ - 25. Полиморфизм генов -цепей выражен в значительно меньшей степени - 2, 8 и 16 аллельных вариантов соответственно. Отражением общности структуры молекул HLA-II класса является тот факт, что все они служат лигандами для рецептора CD4 Т-хелперных лимфоцитов. 13 Главный комплекс гистосовместимости (МНС у мышей, у человека – HLA) кодирует группу высоко полиморфных антигенов клеточной мембраны, которые распознаются в различных клеточных взаимодействиях в ходе иммунного ответа. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) распознают клетки, инфицированные вирусами или поврежденные неопластической трансформацией, только в контексте MHC антигенов I класса. Это зависит от природы чужеродного антигена и от вовлеченных MHC-аллелей, то есть от того, какие из различных антигенов MHC I класса (H-2K, D, L у мышей и HLA-A, B, C у человека) служат в качестве рестрикционных элементов для ЦТЛ. Иммуногенность опухолей и контроль опухолевого роста иммунной системой зависят не только от существования опухолеассоциированных антигенов, но также и от экспрессии индивидуальных антигенов МНС I класса на мембране опухолевых клеток. Количественные и качественные изменения в экспрессии антигенов гистосовместимости I класса на мембране опухолевых клеток могут влиять на рост опухоли в организме иммунокомпетентного хозяина. Многочисленные исследования продемонстрировали значительные колебания в экспрессии антигенов I класса на опухолях у мышей и крыс, например, на тимомах линии AKR, на карциномах, фибросаркомах, индуцированных метил-холантреном, на фибробластах, трансформированных SV40, на клетках, трансформированных человеческим аденовирусом 12 типа и т.д. В целом считается, что сниженная экспрессия молекул HLA I класса способствует ускользанию опухолевых клеток от иммунного надзора. В определенных случаях антигены МНС I класса влияют на метастатические свойства опухолевых клеток (Hammerling G. et al., 1987). II. Молекулярные основы дефицита экспрессии MHC I класса. IIА. Низкая экспрессия MHC I класса на мышиных опухолях не является артифактом. Существует множество мышиных опухолей, дефицитных по экспрессии молекул гистосовместимости класса I. Для определения того, что это не является артифактом, вызванным длительными пассажами in vitro, Hammerling G. и соавт. 14 (1987) изучена серия фибросарком, свежеиндуцированных метилхолантреном А на линиях C57BL/6 и C3H. Негативными или крайне слабо позитивными по экспрессии как Н-2К, так и Н-2D были 15% опухолей, сильно редуцированные уровни Н-2К установлены в 40%. К Н-2-негативным саркомам относятся Вс2, Вс6, Вс13. Аналогичная ситуация имеет место у человека, где также значительная пропорция первично диагностированных опухолей имеет дефекты экспрессии молекул гистосовместимости I класса. Низкая экспрессия молекул гистосовместимости I класса не является артефактом, а, напротив, является важным свойством, присущим опухолевым клеткам. Высокая частота опухолей, дефицитных по экспрессии MHC I класса, ставит вопрос о молекулярной основе дефекта в этих опухолях. Исследования на серии мышиных опухолей (Hammerling G. et al., 1987) показали, что эти опухоли могут быть разделены на 2 большие категории в зависимости от их способности отвечать на интерферон-γ (ИФН-γ). В Н-2-дефицитных опухолях первого типа экспрессия Н-2 может быть индуцирована ИФН-γ, однако, этого не происходит в Н-2-дефицитных опухолях II типа (таблица 1). Таблица 1 – Способность опухоли отвечать на интерферон-γ (ИФН-γ). Опухоль Линия мышей Источник Гаплотип Н-2 ИФ-γ C57BL/ Meth.A H-2b 6 sarcoma +*) C57BL/ Meth.A Bc6 H-2b 6 sarcoma + C57BL/ Meth.A Bc13 H-2b 6 sarcoma + C57BL/ Spont. CMT H-2b 6 lung carc + C57BL/ B16 melanoma H-2b 6 + C57BL/ Spont. 3LL H-2b 6 lung carc + (C57B L/6 Meth.A b/k IC9 H-2 xC3H) sarcoma + F1 *) Рекомбинантный ИФН-γ – 20 ед/мл, 48 час Bc2 Экспрессия антигенов Н-2 b b K D Kk Dk ± +++ +++ ± +++ +++ +++ +++ +++ +++ ± +++ +++ ++ +++ + - ++ - - Тип опухоли I I I I I II II 15 В Н-2-дефицитных опухолях I типа (индуцируемых интерфероном) Н-2К и Н-2D гены присутствуют, однако, синтезируются лишь незначительные количества соответствующих мРНК и белков. Обработка опухоли интерфероном ведет к резкому увеличению продукции цитоплазматической мРНК и Н-2 антигена. Если клонированные Н-2 гены трансфецировать в опухоли I типа, то никакой экспрессии Н-2 не возникает. Обработка клеток интерфероном ведет к экспрессии аллогенных Н-2 генов. Эти данные свидетельствуют о том, что как эндогенные, так и трансфецированные Н-2 гены находятся под одинаковым контролем в опухолях I типа. Индукция экспрессии молекул H-2 интерфероном осуществляется как на уровне транскрипции, так и на пост-транскрипционном уровне. По-видимому, опухоли I типа не имеют факторов, необходимых для транскрипции гена Н-2. Или, напротив, эти клетки обладают доминантными отрицательными элементами, которые подавляют экспрессию как эндогенных, так и трансфецированных Н-2. Для разграничения между этими двумя возможностями были созданы различные комбинации соматических гибридов между Н-2-позитивными клеточными линиями и дефицитными по Н-2 опухолями I типа. Во всех случаях H-2 гены негативного родителя были включены, и гены позитивного родителя оставались включенными. Это убедительно свидетельствует об отсутствии факторов негативной регуляции экспрессии Н-2 в опухолевых клетках I типа и о наличии факторов позитивной регуляции в Н-2позитивных опухолях. Однако в других соматических гибридах между Н-2негативными опухолями и Н-2-позитивными клетками обнаружена не только трансактивация Н-2, но супрессия этих генов. Можно полагать, что дефект в опухолях I типа вызывается отсутствием активирующих элементов, которые участвуют в экспрессии молекул I класса. Вероятно, интерферон стимулирует активность или синтез этих факторов. Второй тип (II) Н-2 дефицитных опухолей. В опухолях II типа (не индуцируемых интерфероном) молчащие Н-2 гены присутствуют, что доказано обнаружением характерной 10 кб полосы на Саузерн16 блотах, полученных с геномной ДНК. Однако ни мРНК, ни белка не продуцируются. Обычно отключены К-гены. Трансфецированные Н-2 гены могут быть постоянно экспрессированы в опухолях II типа в отсутствие стимуляции интерфероном. В соматических гибридах с Н-2-позитивными клеточными линиями молчащие Н-2 гены не активируются, что противоположно ситуации с опухолями I типа. Постоянная экспрессия трансфецированных, а также некоторых эндогенных Н-2 генов свидетельствует о том, что опухоли II типа обладают активирующим фактором. «Молчащий» Kb ген, клонированный из клеток IC9, является функциональным и может быть экспрессирован после трансфекции в Lклетки. Антигены I класса могут быть индуцированы ИФН-γ не только в опухолях, но и во многих нормальных клетках различных мышиных органов. Для индуцируемого интерфероном повышения экспрессии молекул класса I в нормальных и опухолевых клетках может действовать одинаковый механизм. Факт того, что туморогенный потенциал мышиных фибросарком, зависит от экспрессии антигенов МНС I класса, был доказан экспериментально. При введении 2х105 клеток фибросаркомы, экспрессирующих высокие количества антигенов Kb и Db сингенным мышам, не отмечено роста опухоли, в то время как клоны клеток с низкой экспрессией этих антигенов давали развитие крупным опухолям. Для получения прямого экспериментального доказательства связи туморогенности с экспрессией молекул MHC I (Hammerling G. et al., 1987) восстановили Н-2 экспрессию в Н-2-дефицитных опухолях путем трансфекции клонированных генов Н-2. Были использованы опухоли II типа, поскольку в них трансфецированные гены Н-2 конститутивно (постоянно) экспрессированы. Трансфекция клонированных сингенных генов Н-2 существенно снижала способность опухолевых клеток метастазировать. Для определения того, вовлечена ли иммунная система хозяина в замедление роста опухоли и отмену метастазирования, трансфектанты были 17 инъецированы в сингенных F1 мышей, которых сделали иммунодефицитными путем облучения в дозе 500 рад. Все трансфектанты были способны расти и метастазировать в организме облученных мышей вне зависимости от их Н-2 фенотипа. Следовательно, экспрессия сингенных молекул Н-2 de novo не изменяет миграционные способности опухолевых клеток, но модифицирует иммуногенные свойства опухолевых клеток. Это было подтверждено демонстрацией специфических ЦТЛ у F1 мышей, иммунизированных Н-2трансфецированными опухолевыми клетками. Например, иммунизация мышей F1 клетками IE7 Kb и соответствующая рестимуляция in vitro ведет к появлению ЦТЛ, которые были специфичны к IE7 Kb , но не лизировали родительские IE7 клетки, трансфектанты IE7 Kk или неродственные Kb-позитивные опухоли. То есть, иммунная система распознает опухолевые антигены на IC9 и IE7 в сочетании с Kb или Kk. Существует определенная иерархия в способности индуцировать иммунный ответ среди четырех различных Н-2 антигенов опухолевых клеток (Db, Dk, Kb и Kk). Распознавание опухоле-ассоциированного антигена в сочетании с молекулой Kb индуцирует наиболее сильный противоопухолевый иммунитет, ведущий к полному прекращению опухолевого роста и метастазирования. Таким образом, восстановление экспрессии антигенов МНС I класса может переводить опухолевые клетки в состояние чувствительности к киллерным лимфоцитам и, таким образом, предотвращать опухолевый рост и метастатическое распространение. Модуляция экспрессии Н-2 и туморогенности может быть достигнута интерфероном. Опухолевые клетки, обработанные ИФН, росли в организме мышей значительно более медленно, чем необработанные клетки. Исследования, проведенные Hammerling et al. (1987), подтверждают, что преиммунизация клетками меланомы В16, обработанными ИФН, ведет к частичной защите от последующего введения высокой дозы необработанных клеток, в то время как преиммунизация необработанными клетками не оказывает протективного эффекта. Эти наблюдения еще раз демонстрируют, что усиление 18 экспрессии молекул МНС I класса повышает иммуногенность опухолевых клеток. Модуляция экспрессии молекул I класса с помощью ИФН может привести к разработке лечебного подхода по индукции противоопухолевого иммунитета. Однако следует помнить, что использование обработанных интерфероном клеток В16 может привести и к противоположному действию в зависимости от экспериментального протокола. При внутривенном введении мышам C57BL/6 клеток В16, обработанных ИФН, образуется значительно большее число метастазов в легких. Возможно, обработанные ИФН клетки являются более резистентными для NK-опосредованного лизиса, что может способствовать формированию метастазов. Важно помнить, что иммунная система использует, по меньшей мере, 2 различных защитных механизма против опухолей, в которых участвуют антигены I класса. Первая линия защиты состоит из спонтанных NK-клеток, которые могут элиминировать опухоли с низкой экспрессией антигенов I класса. Вторая линия защиты состоит в индукции антиген-специфичных Т-лимфоцитов, которые реагируют на опухоли с высокой экспрессией Н-2 антигенов I класса. Высокая частота злокачественных опухолей, не экспрессирующих молекулы ГКГ I-класса, может быть обусловлена тем, что в норме значительное количество клеток различных органов экспрессируют низкие или необнаружимые уровни антигенов Н-2. Эти клеточные типы включают гепатоциты, эпителий канальцев почек, эпителий бронхиол легких, слизистые клетки желудка, островковые клетки поджелудочной железы и т.д. Введение in vivo ИФН-γ ведет к индукции экспрессии Н-2К и Н-2D в большинстве ранее негативных тканей. Регуляция экспрессии Н-2 в этих тканях, по-видимому, сходна с таковой в Н-2 дефицитных опухолях I типа, описанных ранее. Существует 2 возможности происхождения класс I негативных опухолей. Во-первых, может иметь место иммуноселекция, при которой опухоль изначально происходит из Н-2-позитивных клеток, и возникающие в ходе прогрессии Н-2негативные клоны отбираются, так как они более устойчивы к действию 19 иммунной системы. Другая возможность состоит в том, что опухоль происходит из Н-2-негативного клеточного типа. Высокая частота МНС класс I негативных или слабо позитивных клеточных типов в различных органах, большинство из которых индуцируется интерфероном к экспрессии Н-2, находится в соответствии с этим допущением. Здесь важно подчеркнуть, что низкие уровни экспрессии молекул I класса на опухолевых клетках могут быть не следствием приобретенного дефекта, а в большей степени отражать нормальное физиологическое состояние клетки, например, состояние дифференцировки и т.д. Антигены главного комплекса гистосовместимости I класса играют важную роль в опосредовании контроля опухолевого роста и метастазирования иммунной системой хозяина. Восстановление экспрессии Н-2 опухолевыми клетками может быть достигнуто у мышей путем трансфекции сингенных генов Н-2 I класса. Трансфецированные опухоли вообще не растут или не дают метастазов у сингенных мышей. Это обусловлено высокой иммуногенностью данных опухолей и эффективным распознаванием опухолеассоциированного антигена в контексте с трансфецированным Н-2 антигеном. Индукция in vitro с помощью ИФН-γ Н-2 антигена на Н-2 негативных опухолях ведет к замедлению опухолевого роста in vivo также вследствие усиления иммуногенности опухолевых клеток. Класс I негативные опухоли могут возникать либо из тканей с низкой или отрицательной экспрессией антигенов I класса, или являются вариантами с потерей HLA, которые ускользнули от атаки иммунной системы. Эти данные демонстрируют важную роль антигенов I класса в реализации противоопухолевого иммунитета. Индукция экспрессии антигенов ГКГ I класса с помощью генной трансфекции или под действием растворимых медиаторов может быть использована для усиления противоопухолевого иммунитета. Экспрессия HLA A,B,C на опухолях человека. Экспрессия HLA-A,B,C антигенов варьирует в различных тканях (Daar A.S. et al., 1984) и находится под влиянием усиливающих стимулов (интерфероны, 20 ТНФ (Heron I. et al., 1978)) и подавляющих стимулов (кортикостероиды (Collins T. et al., 1986)). В нормальной покоящейся молочной железе человека эпителиальные клетки не экспрессируют HLA-D молекулы. В поздние сроки беременности и в период лактации по крайней мере HLA-DR молекулы экспрессированы в больших количествах на железистом эпителии (Bartek J. et al., 1987), наиболее вероятно, в результате индукции пролактином (Newman B.A. et al., 1980; Klareskoy L. et al., 1980). Индукция HLA-DR наблюдается при аденозе и при доброкачественных и злокачественных опухолях (Sawtell N.M. et al., 1984; Bartek J. et al., 1987; Bernard D. Et al., 1984; Perez M. Et al., 1986; Zuk J.A. et al., 1987; van Dunen S.G. et al., 1988). Экспрессия антигенов HLA I класса играет важную роль в противоопухолевом иммунитете у человека. HLA A,B,C антигены играют рестрикционную роль в Т-клеточных иммунных реакциях у человека. Показано существование взаимосвязи между утратой экспрессии антигенов HLA-A,B,C и злокачественными фенотипами. Можно выделить 3 типа экспрессии молекул HLA I класса на опухолевых клетках: 1) все опухолевые клетки позитивны (мономорфная экспрессия), 2) все опухолевые клетки негативны (отрицательный тип экспрессии), 3) фракция опухолевых клеток является позитивной (мозаичный образец экспрессии). На злокачественных клетках в сравнении с нормальными неопухолевыми аналогами потеря HLA I класса происходит значительно более часто (например, при раке молочной железы, таблица 2). 21 Таблица 2 — Иммуногистологическое выявление экспрессии HLA-A,B,C и β2микроглобулина в злокачественных и доброкачественных опухолях молочной железы человека. Количество опухолей ссылка Всего + - мозаичн Рак молочной железы 53 17 20 16 33 Доброкачественные процессы в молочной железе 9 9 0 0 33 Рак молочной железы 17 0 9 8 34 Доброкачественные процессы в молочной железе 16 5 0 11 34 Рак молочной железы 17 9 8 0 40 Рак молочной железы 42 23 19 41 Рак молочной железы 11 0 11 42 Рак молочной железы 18 6 1 11 43 Данные, представленные в таблице 2, отчетливо демонстрирует, что отсутствие экспрессии антигенов HLA A,B,C более присуще злокачественным опухолям, нежели доброкачественным процессам в молочной железе человека. Детальное изучение экспрессии молекул гистосовместимости HLA-I и II классов в нормальной ткани молочной железы в сравнении с доброкачественными опухолями (20 случаев) и раком молочной железы (206 наблюдений) проведено в работе Moller P. et al. (1989). Изучены молекулы гистосовместимости HLA-A, B, C и HLA-DR, DP, DQ, а также инвариантная цепь Ii. Прежде, чем остановиться на 22 результатах этой работы, приведем использованную систему оценки экспрессии молекул HLA, так как она представляется наиболее точной и в полной мере отражающей комплексность анализируемого вопроса, таблица 3. Таблица 3 — Система оценки экспрессии антигенов МНС I и II классов, а также Ii в пределах (неопластических) эпителиальных участков 225 исследованных опухолей молочной железы. Полуколичественная*/качественная† характеристика Антигены I класса + >> (+) +>(+) (+) +/(+) (+)>+ +>- [+/(+)>-] +/- [+/(+)]/+>- (+)/- ->+ ->(+) ->>+ Антигены II класса и Ii + +>>(+) +>- (+) +>- +>(+)>- +/(+)/+/- +/(+)/- (+)/[(+)/-]>+ ->+ ->(+)>+ ->(+) ->>+ ->>(+) - Счет в баллах Характеристика антигенной экспрессии‡ 1 2 3 4 5 Нормальное состояние Существенное снижение Частичная утрата Выраженное подавление экспрессии Полная потеря 1 2 3 4 5 6 Полная индукция Выраженная индукция Частичная индукция Фокальная/слабая индукция Минимальная индукция Отсутствие индукции *Количественные оценки: А/В — образцы экспрессии А и В находятся в примерно равных пропорциях; А>B — Образец экспрессии А явно преобладает над образцом экспрессии В; А >>В – образец В наблюдается лишь крайне редко. †Интенсивность окрашивания: + — сильное окрашивание; (+) — слабое окрашивание; — отсутствие окрашивания. ‡Характеристика отражает тот факт, что нормальный эпителий молочной железы экспрессирует молекулы HLA I класса, но молекулы HLA II класса и Ii не экспрессируются в нормальной молочной железе при отсутствии лактации и проявлений воспаления. В противоположность эпителиальным клеткам доброкачественных процессов при раке в 51,2% наблюдалось аномально низкое содержание молекул HLA-A,B,C на мембране клеток, варьирующее от снижения антигенной плотности на клетку (28,8%) до частичной (15,6%) и полной утраты антигенов (6,8%). Ассоциированные с лимфогистиоцитарными стромальными инфильтратами 23 молекулы HLA-D/Ii были индуцированы в клетках доброкачественных протоков и ацинусов в порядке убывания Ii > HLA-DR > HLA-DP > HLA-DQ. Эти антигены были также экспрессированы, главным образом нескоординировано, в 55% рака (98 случаев) в том же порядке. В 28,6% случаев Ii экспрессия явно преобладала над экспрессией HLA-D антигенов. В 6,2% случаев выявлялся подкласс HLADR+/Ii-. При раке молочной железы редукция экспрессии HLA-A,B,C и отсутствие экспрессии HLA-DR были достоверно взаимосвязаны (р=0,0009). В нормальных молочных железах и при мастопатии HLA-A,B,C антигены были сильно экспрессированы на клетках эпителия протоков и долек. Выраженная экспрессия этих антигенов наблюдалась на эпителии протоков при фиброаденоме, при которой, однако, в 4 из 14 случаев наблюдалась сниженная экспрессия молекул HLA-A, B, C на миоэпителиальных клетках. В 3 случаях филоидной цистосаркомы не наблюдалось нарушений экспрессии молекул I класса на клетках эпителия протоков и миоэпителиальных отделов. В 1 из 3 случаев аденом (аденоме оксифильного типа), имело место полное отсутствие продуктов HLA-1 класса на клетках аденомы. В 100 из 205 случаев рака молочной железы отмечались нормальные уровни HLA-I, в 59 - наблюдалось существенное снижение экспрессии, в 14 – частичная утрата, в 18 - выраженное снижение и в 14 случаях – полное отсутствие экспрессии молекул HLA-I. Таким образом, в 51,2% рака молочной железы наблюдалось значительно сниженное содержание HLA-I детерминант. Не было корреляции с типом роста, типом опухоли наличием/отсутствием воспалительной или десмопластической реакции. Экспрессия продуктов субрегиона II оценена на криостатных срезах ткани молочной железы. В нормальной молочной железе эпителиальные клетки, составляющие железу не экспрессировали HLA-D и Ii. При мастопатиях клетки протоков и долек, но не миоэпителиальные клетки в ряде случаев экспрессировали HLA-D и Ii. Эта неоэкспрессия наблюдалась в расширенных протоках и кистах и была наиболее часто ассоциирована с близко расположенной лимфогистиоцитарной инфильтрацией. Сходный образец антигенной индукции, 24 связанной с лимфогистиоцитарной инфильтрацией, наблюдали на эпителии протоков 2 из 14 фиброаденом. Миоэпителиальный отдел никогда не содержал HLA-D/Ii. Филодные опухоли были негативными по HLA-D/Ii в эпителиальных отделах. Оксифильная аденома была полностью негативна по HLA-D/Ii, также как и одна из интрадуктальных аденом. Одна из 2 аденом этого типа была HLA-DR/Ii позитивной. Частота экспрессии молекул гистосовместимости II класса убывала в направлении HLA-DR, DP, DQ. По данным других авторов полная утрата HLA-A, B, C антигенов наблюдалась в 6,8%-10,5% случаев рака молочной железы (Moller P. et al., 1989; Perez M et al., 1986). Экспрессия этих антигенов не коррелировала с типом и степенью злокачественности рака молочной железы. В большинстве случаев наблюдалась связь снижения уровней экспрессии молекул HLA-I с отсутствием на мембране раковых клеток HLA-DR-антигенов (p < 0,0009). По-видимому, это свидетельствует о существовании особенностей регуляции экспрессии молекул HLA при опухолях, что проявляется в подавлении экспрессии молекул обоих классов HLA (Moller P. et al., 1989). Вместе с тем следует помнить, что тканевая экспрессия молекул HLA-DR является более ограниченной в сравнении с молекулами HLA-I, которые контролируются хорошо известными генетическими механизмами. Более того, экспрессия молекул HLA-DR может быть индуцирована с помощью различных цитокинов, которые способны превращать HLA-DRнегативный эпителий в HLA-DR-позитивный (Cabrera T. et al., 1995). В отношении экспрессии молекул HLA-I класса в литературе нет разночтений: общепринято, что эти антигены присутствуют на нормальном эпителии и могут утрачиваться в процессе опухолевого роста. Однако прогностическая роль этих антигенов не совсем ясна. Conha A. et al. (1991) показали, что эти молекулы экспрессированы во всех случаях в норме и при доброкачественных процессах. Снижение уровней экспрессии HLA-A, B, C наблюдалось в 22 из 94 случаев, а их полное отсутствие - в 31 случае. Интересной представляется селективная потеря HLA-A, B, C, отмеченная на 6 опухолях: 2 - А, 25 4 - В. Авторами установлена прямая связь между выживаемостью больных и HLA-негативным фенотипом (р < 0,001), а также между гистологической степенью злокачественности опухоли и уровнями экспрессии молекул HLA-I (p < 0,0005). Более того, низкая экспрессия HLA-I на клетках рака молочной железы коррелировала с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы (р < 0,02). Следовательно, отсутствие HLA-I на клетках рака молочной железы является неблагоприятным прогностическим фактором. Этот факт подтверждается не всеми авторами. Так, Wintzler H.O. et al. (1990) не установили прогностической роли экспрессии молекул HLA и 2-микроглобулина при раке молочной железы при проведении исследований у 66 женщин (медиана продолжительности наблюдения – 45 мес). Огнерубов Н.А. (1992) показал, что опухоль молочной железы при местно распространенном процессе только в 15% случаев экспрессирует HLA I антиген. Причем экспрессия антигенов HLA I и II класса на опухолевых клетках после химиолучевой терапии характеризуется гетерогенностью как в группе рака молочной железы (часть опухолей является антиген-негативной), так и в пределах одного случая (часть клеток является антиген-отрицательной). Экспрессия молекул HLA I, II класса, как правило, коррелирует с уровнями инфильтрации опухоли лимфоцитами и, в частности CD4-клетками (Zuk J.A. et al., 1987). Интересно отметить, что в этой работе установлена связь степени злокачественности опухоли с экспрессией HLA-A,B,C и 2-микроглобулина, но не с экспрессией HLA-DR на опухолевых клетках. Неожиданным оказалось то, что в случаях поражения регионарных лимфатических узлов опухоли были более интенсивно инфильтрированы макрофагами (Y1/82A). Селективная потеря молекул HLA-A и HLA-B на клетках рака молочной железы была достоверно взаимосвязана с клиническими и патологическими параметрами опухолевого роста: Т, степень дифференцировки, степень злокачественности, уровень лейкоцитарной инфильтрации (Conha A. et al., 1991). При исследовании 94 случаев рака молочной железы авторами показано, что экспрессия молекул HLA 26 II класса наблюдалась при более дифференцированных и прогностически более благоприятных опухолях. Влияние экспрессии раковыми клетками молекул главного комплекса гистосовместимости на процессы регионарного метастазирования ставится под сомнение в работе Maiorana A. и соавт. (1995). Авторы обнаружили редукцию или полное отсутствие экспрессии молекул HLA-A,B,C в 54,3% первичных раков молочной железы, частичная или полная индукция экспрессии молекул HLA II класса наблюдалась в 18,5% (DQ), 30% (DP) и 48,5% (DR). Практически одинаковая экспрессия наблюдалась при раке молочной железы без метастазов в подмышечные лимфатические узлы и при опухолях с наличием метастазов. Экспрессия молекул HLA I и II в метастазах в целом напоминала таковую в первичных опухолях, однако, имели место случаи дискордантной экспрессии (HLA-I – 32%, HLA-DR – 18%). Следовательно, вопрос о роли молекул HLA в развитии регионарных метастазов при раке молочной железы все еще нельзя считать окончательно решенным. В последние годы все большее внимание уделяется механизмам снижения экспрессии молекул HLA-I при раке молочной железы. Одна из причин может состоять в том, что нарушается транспорт этих молекул на мембрану, в норме осуществляемый белками-транспортировщиками ТАР-1 и ТАР-2. Этому вопросу посвящена работа Vitale M. и соавт. (1998). При исследовании 53 образцов раковой ткани и 5 образцов нормальной ткани установлена взаимосвязь экспрессии ТАР-1, ТАР-2 и HLA-I со степенью злокачественности рака молочной железы. При опухолях 1-й степени злокачественности (G1), так же как и в нормальной молочной железе эпителиальные клетки экспрессировали ТАР-1, ТАР-2 и HLA-I. Подобный фенотип обнаружен лишь в 32% (12 из 37) случаев рака высокой степени злокачественности (G2 или G3). В 14 из 37 случаев отмечено снижение экспрессии молекул HLA-I при нормальном окрашивании на ТАР. Одновременное снижение HLA-I и ТАР-1 или ТАР-2 наблюдалось в 8 (22%) опухолях высокой степени злокачественности, причем в 3 случаях (8%) отмечено 27 полное отсутствие этих белков. По-видимому, экспрессия молекул HLA-I является непременным условием появления ТАР-1 или ТАР-2 белков в цитоплазме раковых клеток, т.к. опухоли с иммунофенотипом ТАР+ HLA-I- не встречаются. Интересны данные о влиянии ростовых факторов и интерферонов на экспрессию молекул HLA-I и HLA-II клетками рака молочной железы. Существенное увеличение экспрессии этих молекул наблюдалось под действием эпидермального ростового фактора (Bernard D.J. et al., 1992). Эти опыты поставлены на клетках линий рака молочных желез человека МСF7 и T47D при использовании эпидермального ростового фактора в концентрации 0,02 мкг/мл. Важно отметить, что индукция экспрессии HLA-I и HLA-II под действием эпидермального ростового фактора происходила на посттранскрипционном уровне, т.к. увеличения уровней мРНК для HLA-антигенов практически не происходило. Другим индуктором экспрессии молекул HLA-II в HLA-Iпозитивных линиях клеток рака молочной железы является интерферон- (1000 U/мл). Он увеличивал экспрессию HLA-II как на уровне мРНК, так и белка, причем для молекул DQ данные в части случаев были вариабельными, и появления мРНК-транскриптов не наблюдалось (Jabrane-Ferrat N. et al., 1990). При опухолях, проведении включая иммуногистохимических рак молочной железы, исследований наиболее часто HLA-I при используют моноклональные антитела. Среди их широкого набора отдельного упоминания заслуживает МКА W6/32. Это антитело отобрано из группы антител серии W и направлено против общей детерминанты антигенов HLA-A, B и C или, иными словами, против мономорфной детерминанты -цепей молекул HLA-I с молекулярной массой 43 кД (Barnstable C. et al., 1978). Отличительной чертой МКА W6/32 является исключительно высокая репрезентативность получаемых с его использованием результатов (Hammerling G. et al., 1987; Артамонова Е.В., 1992). Отечественным аналогом МКА W6/32 являются МКА ИКО-53, которые полностью блокируют связывание МКА W6/32 с лимфоцитами периферической 28 крови человека и, следовательно, распознают идентичный или близко расположенный эпитоп (А.Ю.Барышников и др., 1991). Факт утраты экспрессии антигенов HLA-I класса доказан при многих опухолях (Garrido F et al.,1993; Garrido F et al., 1997; Hicklin DJ et al., 1999). Проблема потери молекул HLA-I класса взаимосвязана с агрессивность опухолей по степени гистологической дифференцировки (Eyal A et al., 1990; Levin I et al., 1991; Conha A et al., 1991), их инвазивностью и метастатическим потенциалом (Garrido F et al.,1993; Garrido F et al., 1997; Hicklin DJ et al., 1999; Eyal A et al., 1990; Levin I et al., 1991; Conha A et al., 1999; Petersen BL et al., 1993). Нековалентная взаимосвязь молекул HLA-I с 2-микроглобулином (2m) важна для структурной устойчивости и оптимального функционирования молекул HLA-I класса (Pedersen LO et al., 1995). Некоторые авторы использовали иммунное окрашивание 2m для анализа экспрессии всей поверхности молекул HLA-I класса. (Levin I et al., 1991; Petersen BL et al., 1993; Cabrera T et al., 1996). Эффективность выявления молекул HLA-I, помимо всего прочего, зависит от типа использованных для этих целей моноклональных антител. Описаны определенные трудности при оценке окрашивания моноклональными антителами анти-MHC-I класса W6/32, HC-10, или HC-A2, поскольку эти типы антител не являются идеальными для выявления антигенов после парафиновой заливки и фиксации в формалине. Кроме того, эти антитела не распознают полностью все молекулы HLA-I класса. Предложено новое моноклональное антитело EMR8-5 против тяжелых цепей HLA-I класса (HLA-A, B, C), специфичность которого для HLA-I класса была подтверждена методом иммуногистохимии (Tsukahara T et al., 2006; Kikuchi E et al., 2007; Kitamura H et al., 2007). Данное антитело было использовано для исследования экспрессии HLA-I на клетках остеосаркомы (Tsukahara T et al., 2006), немелкоклеточного рака легкого (Kikuchi E et al., 2007), почечноклеточного рака (Kitamura H et al., 2007). Клиническое значение экспрессии HLAI класса широко обсуждается при раке молочной железы. Однако однозначных четких выводов не было сделано (Campoli M et al., 2008; de Kruijf EM et al., 2010; 29 Boomsma MF et al., 2010; Lavado-Valenzuela R et al., 2009). Исследований экспрессии HLA-I класса на клетках рака молочной железы с помощью моноклональных антител EMR8-5 не проводилось. В исследовании Kaneko K. et al. (2011) оценивается экспрессия HLA-I класса при инвазивном раке молочной железы с помощью иммуногистохимии с использованием антител EMR8-5, анализируются ассоциации (взаимосвязи) с клинико-патоморфологическими факторами, а также обсуждается клиническое значение HLA-I-положительного класса рака молочной железы. Моноклональное антитело EMR8-5 может распознавать все составляющие тяжелой цепи HLA A, B и С даже в фиксированной формалином ткани, то есть целые молекулы HLA. Экспрессия HLA-I класса выявлялась в 30% случаев рака молочной железы с использованием антител W6/32 (Cordon-Cardo C et al., 1991). Отсутствие молекул HLA-I класса на клетках рака молочной железы (антитела НС-10) было связано с лучшим послеоперационным исходом (Madjd Z. et al., 2005), что противоречит данным других исследований (Kaneko K. et al., 2011). Расхождения могут быть объяснены тем, что в то время как антитела НС10 едва реагируют с аллелями HLA-A, антитела EMR8-5 может обнаруживают все белки HLA-A, B и С (Sato N et al., 2009). Кроме того, EMR8-5 могут применяться для исследования парафиновых блоков опухолевой ткани. В этом состоят преимущества антител EMR8-5 для оценки экспрессии антигена HLA-I при раке. В исследовании (Kaneko K. et al., 2011) отсутствие экспрессии молекул HLA-I класса при раке молочной железы составило 66%, что было выше, чем при раке желудка – 32% (Ishigami S et al., 2008), раке пищевода – 43% (Mizukami Y et al., 2008), остеосаркоме – 55% (Tsukahara T et al., 2006), но меньше, чем при раке легкого – 70% (Kikuchi E et al., 2007). Степень утраты молекул HLA-I класса при раке может быть связана с органоспецифичностью. Полагают, что сохранность экспрессии HLA-I класса при раке желудка может быть обусловлена экзогенной стимуляцией при гастрите или бактериальной инфекцией Helicobacter pylori (Ishigami S et al., 2008). Различия в экспрессии HLA-I класса могут быть связаны с 30 воспалением и протеолизом, которые в ряде случаев имеют место при раке молочной железы. Эти наблюдения являются важными при анализе взаимосвязи утраты HLA с агрессивностью опухоли. В исследовании (Kaneko K. et al., 2011) отмечена слабая экспрессия HLA-I класса в ткани нормальной молочной железы. Кроме того, антигены HLA-I класса сохранялись при ранних стадиях рака молочной железы. При размере опухоли Т1 раковые клетки были в 41% случаев HLA-I позитивными, при Т3-4 – в только в 15%. По мере увеличения размера опухоли экспрессия HLA-I класса снижалась. Этот клинический признак был описан и в других злокачественных опухолях, таких как рак желудочнокишечного тракта (Ishigami S et al., 2008; Mizukami Y et al., 2008) и саркоме (Tsukahara T et al., 2006). Возможно, что при увеличении индекса Т (размера опухоли), утрата молекул HLA-I класса препятствовала специфическому лизису злокачественных элементов Т-киллерами, что способствовало распространению опухоли и появлению метастазов. Мизуками и др. показали, что при позитивном HLA-I класса раке пищевода, метастазирующим в лимфатические узлы, опухолевые клетки полностью утрачивают экспрессию HLA-I класса (Ishigami S et al., 2008). При анализе иммунологических характеристик изолированных раковых клеток в костном мозге обнаружено, что эти HLA-I-негативные клетки часто происходят из низкодифференцированных раков, что ассоциируется с коротким периодом выживаемости при при раке молочной железы (Zia A et al., 2001). Пациенты с экспрессией HLA-I класса на опухоли имели лучшую выживаемость без признаков заболевания (DFS) по сравнению с теми, у кого наблюдалось подавление экспрессии HLA-I класса. Результаты отличаются только при раке пищевода (Mizukami Y et al., 2008). При раке молочной железы общая выживаемость (OS) лучше, чем при других злокачественных опухолях. Нарушение функции молекул HLA-I класса зависит не только от их экспрессии, но и от пост-транскрипционных изменений что, главным образом, определяется геном β2-микроглобулина. Даже при экспрессии молекул HLA-I 31 класса, различные типы изменений этих молекул могут иметь место, причем в основе дефектов лежат различные молекулярные механизмы (Aptsiauri N et al., 2007). В этом контексте, молекулы HLA-I класса, сохраняющиеся при раке молочной железы, могут проявлять измененную функцию презентации антигенных пептидов. По этим причинам перспективным представляется исследование экспрессии HLA-I класса вместе с экспрессией β2 микроглобулина с использованием антител EMR8-5. Образцы экспрессии молекул HLA II класса различаются на клетках нормального, гиперплазированного и малигнизированного эпителия молочной железы. Молекулы HLA II класса постоянно присутствуют на неопухолевой ткани молочной железы. Экспрессия этих антигенов значительно возрастает при доброкачественных опухолях и гиперпластических процессах. Напротив, лишь в 32 из 94 раковых опухолей обнаружена экспрессия HLA-DR, в 17 - HLA-DP и в 11 - HLA-DQ (Conha A et al., 1995). Экспрессия антигенов HLA II класса коррелировала со степенью гистологической дифференцировки (р<0,05), но не зависела от стромальной лейкоцитарной инфильтрации. Антигены HLA-DR были сильно экспрессированы на внутрисосудистых опухолевых тромбах, в особенности, при воспалительных карциномах. При доброкачественных опухолях количество воспалительных клеток было значительно более высоким, чем при злокачественных. Различий в количественном составе и строении воспалительных инфильтратов между HLA-DR+ и HLA-DR- опухолями не найдено. Факт утраты экспрессии антигенов HLA-I класса доказан при многих опухолях (Garrido F et al.,1993; Garrido F et al., 1997; Hicklin DJ et al., 1999). Проблема потери молекул HLA-I класса взаимосвязана с агрессивность опухолей по степени гистологической дифференцировки (Eyal A et al., 1990; Levin I et al., 1991; Conha A et al., 1991), их инвазивностью и метастатическим потенциалом (Garrido F et al.,1993; Garrido F et al., 1997; Hicklin DJ et al., 1999; Eyal A et al., 1990; Levin I et al., 1991; Conha A et al., 1999; Petersen BL et al., 1993). 32 Молекулы HLA-II класса обнаружены на 75% клеток в ткани молочной железы при отсутствии в ней злокачественной опухоли, причем экспрессия антигенов характеризовалась примерно одинаковой интенсивностью (Zuk J.A., Walker R.A., 1988). В большинстве (61%) случаев рака наблюдалась утрата экспрессии HLA II, причем в 28% - полная. Снижение экспрессии HLA II не коррелировало с величиной воспалительного инфильтрата и метастазами в регионарные лимфатические узлы. При высоко дифференцированных карциномах не наблюдалось полной потери экспрессии HLA-II. По данным Perez M. et al. (1986) полное отсутствие экспрессии HLA-DR наблюдалось в 10,5% рака молочной железы. Прямо противоположные данные относительно экспрессии мономорфных детерминант молекул HLA-DR представлены Bartek J. и др. (1987). Авторы не обнаружили экспрессии молекул HLA-DR на нормальном, покоящемся эпителии молочной железы. Антиген появлялся на эпителии в поздние сроки беременности, а также при лактации. В большинстве случаев при доброкачественных поражениях молочных желез отмечено гетерогенное окрашивание эпителия - от единичных до 25% клеток. Значительная вариабельность отмечена при раке молочных желез, причем лишь в небольшом проценте случаев (7%) обнаружена выраженная пропорция позитивных клеток (40 - 95%). Плотность лейкоцитарного инфильтрата была более высокой при раке в сравнении с нормальной тканью и доброкачественными процессами. Экспрессия HLA-DR на клетках инфильтрата не коррелировала с экспрессией этого антигена на опухоли. При использовании методов иммуногистохимии и авторадиографии установлено, что молекулы HLADR не экспрессированы на пролиферирующих клетках. Эти данные указывают на то, что иные, нежели клеточная кинетика, факторы ведут к появлению HLA-DR на эпителии молочной железы при беременности, лактации и раке. Согласно данным Огнерубова Н.А. (1992, 1994) при местнораспространенном раке молочной железы клетки, экспрессирующие HLA II обнаружены только в 30,8 % случаев. Он показал, что под влиянием 33 специального лечения (химиолучевая терапия) происходит трансформация фенотипа первичной опухоли при её метастазировании в лимфатические узлы. Отмечена связь экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Утрата опухолевыми клетками антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II классов может иметь связь с дифференцировкой опухоли. Автор обращает внимание на то, что в случаях, где опухоли были антигенотрицательными по этим маркерам, частота прогрессирования процесса была выше. Индукция экспрессии молекул HLA II класса на клетках рака молочной железы отмечена в 120 из 203 случаев. Уровни экспрессии антигенов расположились в следующем порядке: Ii HLA-DR HLA-DP HLA-DQ. Степень индукции этих последовательно появляющихся антигенов коррелировала с плотностью локальной лимфогистиоцитарной инфильтрации (Ii: p=0,003; HLADR: p = 0,0005; HLA-DP: p = 0,0000005; HLA-DQ: p = 0,001). Таким образом, экспрессия Ii/HLA-D антигенов на раковых клетках непосредственно взаимосвязана с уровнями близлежащей лимфогистиоцитарной инфильтрации. Однако в 26% рака молочной железы не отмечено связи между уровнями экспрессии HLA-II на раковых клетках и интенсивностью инфильтрации опухоли мононуклеарными клетками. Это явление названо неадекватной экспрессией Ii/HLA-D (Koretz K. et al., 1989). Экспрессия Ii/HLA-D антигенов не коррелировала со степенью злокачественности опухоли и являлась самостоятельным параметром. Отсутствие корреляции появления экспрессии молекул HLA-DR на клетках рака молочной железы с прогностическими параметрами подтверждено Lucin K et al. (1994). Авторы иммуногистохимическим методом изучили 75 инвазивных протоковых раков молочной железы и в 25 обнаружили экспрессию HLA-DR. Исследованная параллельно Т-клеточная инфильтрация опухоли также не влияла на прогноз и, более того, отрицательно коррелировала с индексом N. Связи уровней Тклеточной инфильтрации с экспрессией на опухолевых клетках 234 микроглобулина не отмечено. Экспрессия HLA-DR коррелировала со степенью дифференцировки опухоли и экспрессией прогестероновых рецепторов - двумя параметрами благоприятного прогноза (Brunner C.A. et al., 1991). Спектр МКА, используемых для изучения HLA-DR антигенов при раке молочной железы, достаточно большой. Нами в работе применены МКА ИКО-1, достаточно надежно зарекомендовавшие себя в таких исследованиях (Барышников А.Ю. и др., 1987; Тупицын Н.Н. и др., 1990). В последние годы отмечается повышение научного интереса к анализу мембранных молекул гистосовместимости клеток рака молочной железы. Это обусловлено более детальным пониманием дифференцировки опухолей протокового и долькового присхождения (Turashvili G., 2005), роли молекул HLA в индукции ответа Т-хелперных и Т-киллерных клеток (Oldford S. et al., 2006). Более того, в 2009 году появились публикации (Leth-Larsen R. et al., 2009) относительно роли молекул HLA в метастазировании рака молочной железы. Все это свидетельствует об актуальности изучения молекул гистосовместимости на клетках рака молочной железы с позиций дальнейшего понимания взаимодействия опухоли и иммунной системы и улучшения на этой основе прогноза заболевания. Понимание биологической и клинической роли экспрессии молекул HLA-I класса требует комплексной оценки данных молекул на мембране с учетом экспрессии не только тяжелых цепей, но и β2-микроглобулина, а также комплекса этих молекул. Утрата или подавление экспрессии HLA часто наблюдается в первичных и метастатических карциномах молочной железы (Goepel JR et al., 1991; Kaklamanis L et al., 1995; Cabrera T et al., 1996; Vitale M et al., 1998), а также при других гистологических типах опухолей (Garrido F et al., 1997). Недостаточная экспрессия HLA считается одним из основных механизмов, которые помогают опухолевым клеткам избежать иммунного распознавания и уничтожения цитотоксическими Т-лимфоцитами, хотя и может привести к увеличению чувствительности к естественным киллерам (NK). Подавление HLA 35 может быть результатом множества механизмов, в том числе, снижением синтеза субъединиц I класса (тяжелой цепи и/или β2 микроглобулина), вызванного мутациями или потерей гетерозигитности хромосомами (6р21 и 15q21) (Cabrera T. et al., 2003); изменением процессинга антигена, а также нарушениями транспортировки молекул HLA на поверхность клетки (York I.A. et al., 1996). До сих пор в большинстве исследований HLA-I класса при раке молочной железы изучались молекулярные механизмы, лежащие в основе дефектов HLA, и лишь в нескольких работах рассматривалась их роль в канцерогенезе, метастатической прогрессии (Redono M. et al., 2003) или прогнозе (Gudmundsdottir I. et al., 2000). При анализе экспрессии HLA-I класса на 25 первичных опухолях молочной железы и нормальных тканях путем использования иммуногистохимии и биохимии (Pistillo M.P. et al., 20004 Palmisano G.L. et al., 2002), а также с помощью RT-PCR было продемонстрировано, что утрата экспрессии HLA-I класса при раке молочной железы преимущественно связана с посттранскрипционными изменениями β2 микроглобулина (Palmisano GL et al., 2001). В исследовании Morabito A. et al. (2009) иммуногистохимическим анализом ткани рака молочной железы показано подавление экспрессии всего комплекса HLA-I класса в 76% случаев, а раздельное подавление тяжелых цепей и β2 микроглобулина в 57% и 46% случаев соответственно. Частота снижения HLA-I, вероятно, немного занижена, по сравнению с данными более ранних исследований (Cabrera T. et al., 1996) в силу того, что использованы моноклональные антитела против мономорфных детерминант (Pistillo M.P. et al., 2000), которые не позволяют обнаружить HLA-селективных и гаплоидных нарушений экспрессии. Подавление экспрессии всего комплекса HLA-I класса и β2 микроглобулина было достоверно лимфоваскулярной взаимосвязано инвазией с (только отсутствием HLA-I некроза класса) - опухоли и маркерами, рассматриваемые как неблагоприятные прогностические факторы при раке молочной железы (Hasebe T et al., 2008; Mohammed RA et al., 2007). В то же время 36 утрата HLA-I была достоверно связана с более молодым возрастом пациенток. В многофакторном анализе по всей группе больных установлена близкая к значимой связь нарушения экспрессии β2-микроглобулина с более длительной общей выживаемостью. Статистически значимая связь имелась со статусом лимфатических узлов. Пациенты с наличием метастазов в лимфатические узлы и нарушенной экспрессией β2-микроглобулина имели заметно более высокие показатели общей и бессобытийной выживаемости по сравнению с N+ пациентами с нормальной экспрессией β2-микроглобулина. Этот вывод также подтверждается тем, что пациенты с метастазами в лимфатических узлах и снижением β2-микроглобулина лимфатических узлов, чем имели таковые меньшее с количество нормальной пораженных экспрессией β2- микроглобулина. Эти результаты указывают на более важную роль β2микроглобулина в прогнозе рака молочной железы по сравнению с данными по экспрессии всего комплекса HLA-I класса или же только тяжелых цепей. β2-микроглобулин образует инвариантную цепь молекул HLA-I класса и имеет важное значение для структурной стабильности этих молекул и оптимального функционирования (то есть представления антигенных пептидов цитотоксическим CD8+ Т-клеткам) (Pedersen L.O. et al., 1994; Vitello A. et al., 1990). Однако β2-микроглобулин имеет и другие биологические функции, в том числе индукцию роста опухолевых клеток и апоптоза, а также антагонистический эффект TGFβ-1 (Rowely D.R. et al., 1995; Nomura T. et al., 2006; Wang M. et al., 2008). Поскольку β2-микроглобулин может высвобождаться из тканей рака молочной железы во внеклеточную среду (Klein T et al., 1996), то нарушения как растворимого, микроглобулина, так и могут экспрессированного снижать опухолевыми пролиферацию клетками опухолевых клеток β2или активировать эффекторные NK-клетки. Большинство случаев подавления β2m, наблюдаемых Morabito A. et al. (2009), характеризовались также подавлением экспрессии HLA-I класса, что является необходимым условием для атаки NKклетками. 37 На сегодняшний день, лишь несколько исследований проведено с изучением клинической значимости экспрессии HLA при раке молочной железы, и результаты их весьма противоречивы. В двух исследованиях с участием небольшого количества пациентов и коротким сроком клинического наблюдения, утрата экспрессии HLA-I класса или β2-микроглобулина ассоциировалась с плохим прогнозом (Redondo M. et al., 2003; Conha A. et al., 1991). В то же время в другом крупном исследовании с более долгосрочным анализом, полная утрата HLA ассоциировалась с хорошим прогнозом (Madjd A. et al., 2005). Более того, корреляция между отсутствием антигенов HLA-I класса и лучшими показателями выживаемости наблюдалась и в других видах опухолей, таких как меланома (Ericsson C. et al., 2001) и колоректальный рак (Menon A.G. et al., 2002), где выдвигалась гипотеза о потенциальной роли NK- клеточного контроля метастатического распространения опухолей. В целом, данное исследование указывает на возможное влияние подавления HLA-I класса, расставляя особый акцент на взаимосвязь β2-микроглобулина m с клиническим исходом лечения больных с пораженными лимфатическими узлами. Тем не менее, для верификации этих выводов необходимо провести исследование с большим количеством пациентов. Представленные в обзоре данные свидетельствуют о большом научном интересе к проблеме экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости на клетках рака молочной железы. Этот интерес обусловлен, в первую очередь, потребностями клиники, так как стимуляция или индукция экспрессии молекул может способоствовать более эффективному распознаванию опухоли клетками иммунной системы и позволит добавить иммунотерапевтический компонент к лечению этих больных. 38 ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалом клинического, для настоящего морфологического исследования и послужили данные иммуногистохимического (ИГХ) обследования, а также данные проточно-цитометрического исследования 58 больных раком молочной железы, получавших лечение в отделении опухолей молочных желез ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период с 2009 по 2013 годы. Критерием отбора (маммографически) и больных служил морфологически клинически, рентгенологически верифицированный диагноз рака молочной железы без неоадъювантной терапии. На основании клинических, рентгенологических, гистологических, иммунологических данных, а также данных проточной цитометрии, полученных в ходе обследования и лечения больных отобранной группы, был составлен кодификатор с параметрами, отражающими сведения о каждой больной. Кодификатор был разделен на четыре части. Первая его часть включала информацию о паспортных данных больной, стадии, локализации и размере первичной опухоли, определенных клинически и рентгенологически. Вторая его часть включала сведения об объеме и характере оперативного вмешательства, операционных находках, локализации и размере опухоли, определенных при гистологическом исследовании, гистологическом типе опухоли, дополнительных морфологических факторах, количественную оценку наличия или отсутствия метастатического поражения РЛУ. Третья часть кодификатора отображала данные рецепторного статуса стероидных гормонов и Her-2/Neu. Четвертая часть кодификатора отражала иммунологические данные, полученные в ходе проточной цитометрии и ИГХ исследования. Возраст больных находился в пределах от 26 до 77 лет, медиана - 53 года. Нами выделены 6 возрастных групп. Распределение пациенток по возрастным категориям отображено в таблице 4. Как видно из приведённых данных, 39 наибольшие группы составили больные в возрасте 40-49 лет (26%) 50-69 лет (26%) (таблица 4, диаграмма 1). Таблица 4 — Распределение больных РМЖ по возрасту. Возраст Кол-во больных Частота до 29 лет 1 2,0% 30-39 лет 9 16% 40-49 лет 15 26% 50-59 лет 15 26% 60-69 лет 11 18% более 70 лет 7 12% до 29 лет 30-39 40-49 50-59 60-69 более 70 Рисунок 1 — Распределение больных РМЖ по возрасту. Поражение правой молочной железы было выявлено у 23 пациенток (38%), левой – у 31 (62%). Степень распространенности опухолевого процесса окончательно устанавливалась после результатов морфологического исследования (таблица 2, диаграмма 2). Стадия заболевания определялась на основании международной классификации TNM (1997г), а также клинической классификации рака молочной железы. 40 Наибольшее число больных (44%) относилось ко IIа стадии. У двух больных был диагностирован местнораспространенный вариант процесса. Таблица 5 — Распределение больных по стадиям опухолевого процесса. Стадия Количество Частота (%) I (T1N0M0) 14 24% 25 44% 10 18% IIIa (T2N2M0) 7 12% IIIб (Т4N0М0) 2 4% IIа (Т1N1М0,T2N0M0) IIб (Т2N1M0,T3N0M0) I (T1N0M0) II a (T1N1M0, T2N0M0) II б (T2N1M0, T3N0M0) III a (T2N2M0) III б (T4N0M0) Рисунок 2 — Распределение больных по стадиям опухолевого процесса. В изучаемой группе больных преобладал инфильтрирующий протоковый рак (ИПР) - 42 случая (72%). Значительно реже была выявлена инфильтрирующая дольковая аденокарцинома (ИДР) - 8 случаев (14%). Все остальные гистологические формы рака молочной железы встречались в 2 - 6 случаях (таблица 6). 41 Таблица 6 — Распределение больных в зависимости от гистологической формы рака молочной железы. Гистологическая форма Количество Частота (%) 8 14% 42 72% рак in situ 6 10% редкие формы 2 4% Всего 58 100% опухоли инфильтрирующий дольковый рак Инфильтрирующий протоковый рак Морфологически были охарактеризованы на наличие метастазов регионарные подмышечные лимфатические узлы различных уровней: нижнеподмышечные лимфоузлы, расположенные латерально по отношению к малой грудной мышце (I уровень), межпекторальные лимфоузлы, расположенные между медиальным и латеральным краем малой грудной мышцы (II уровень), апикальные и подключичные лимфоузлы, расположенные медиально по отношению к малой грудной мышце (III уровень). При гистологическом исследовании метастазов в РЛУ не обнаружено (N0) у 35 (60,3%) больных, метастазы в лимфатические узлы (N+) идентифицированы в 39,7% случаев.( N1- 20; N2-3). Для всех пациенток было дано детальное морфологическое описание. Лечение у всех пациенток начиналось с хирургического вмешательства различного объема: радикальная резекция молочной железы была произведена в 12 случаях (21%), радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц была выполнена 46 больной (79%). При оценке рецепторного статуса в соответствии с классификацией определения подтипов рака молочной железы (St. Gallen, 2011) люминальный А 42 25,9%, люминальный В (72,4%), 1,7% - базально подобный (тройной негативный) рак. Данные историй болезни и всех исследований были занесены в специально созданную базу данных. Критериями учета признаков являлись их наличие и степень выраженности. Вычисление и сравнение достоверности различий средних величин (с использованием критерия Стьюдента, различий по таблицам сопряженности признаков с использованием критерия Хи-квадрат, а также коэффициента корреляции Пирсона) производилось с помощью пакета программ SPSS. Достоверными считались различия с вероятностью не менее 95% (р<0.05). Основными реактивами, использовавшимися в проводимых исследованиях, являются отечественные и зарубежные моноклональные антитела (МКА), представленные в таблице 7. Таблица 7 — Моноклональные антитела, использованные в работе. № Название МКА Антигены опухолевых клеток 1 EpCam (CD326) Эпителиальный мембранный антиген 2 HLA-I Молекулы гистосовместимости I класса 3 HLA-II (HLA-DR) Молекулы гистосовместимости II класса Антигены иммунокомпетентных клеток 4 CD45 общелейкоцитарный антиген 5 CD3 Т – клетки 6 CD8 Т-киллеры 7 CD4 Т-хелперы Использованы прямые конъюгаты представленных антител с флуорохромами - FITC, PE, PE-Cy5, ECD - производства фирмы Becton Diсkinson (США) или Beckman Coulter (США). 43 Проточная цитометрия. Определение экспрессии молекул HLA на опухолевых клетках (EpCam+) методом четырех-цветной проточной цитометрии на цитометре Epics-XL-MCL. Окраску проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием антител, меченых флуорохромами. Количество иммунологически изучаемых проб составляло 5: 1 проба: Syto16_FITC/CD326_PE/CD45_ECD/CD3_PC-5 2 проба: HLA-DR_ FITC/CD326_PE/CD45_ECD/CD3_PC-5 3 проба: HLA-I_ FITC/CD326_PE/CD45_ECD/CD3_PC-5 4 проба: HLA-DR_ FITC/CD8_PE/CD45_ECD/CD3_PC-5 5 проба: CD4_ FITC/HLA-DR_PE/CD45_ECD/CD3_PC-5 Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или (в случаях, требующих дополнительной компенсации параметров флуоресценции) программы FCS, версия 3. Нами оценены следующие иммунологические показатели интратуморальных лимфоцитов: Общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к числу ядросодержащих клеток (Syto16+). Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). Процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов. Процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ Соотношение CD4/CD8 Процент активированных CD4+HLA-DR+ клеток Процент активированных CD8+HLA-DR+ клеток Процент эпителиальных клеток EpCam+ экспрессирующих молекулы HLA-I и HLA- DR Иммуногистохимическое исследование было проведено по стандартной методике (Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G. et al., 1995) на криостатных срезах 44 опухолей с использованием мышиных моноклональных антител к общелейкоцитарному антигену CD45 и панцитокератинам KL-1, а также субпопуляциям лимфоцитов. Проявление мышиных антител осуществляли с помощью FITC-меченой антисыворотки против иммуноглобулинов мыши (BDB, USA). Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ) на криостатных срезах. Замороженные срезы (толщина 4-6 мкм) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при 4С. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199 рН 7,2-7,4. МКАТ наносили на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Наносили ФИТЦ-меченные F(ab)2 –фрагменты антисыворотки против глобулинов белой мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы накрывали покровным стеклом, и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе Axioplan-2 (Германия). Учет реакций. Иммунофенотипирование опухолевых клеток. При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом, предложенным Hammerling et al. (1987). Выделяли 3 типа взаимодействия антител с опухолевыми клетками: Отрицательная реакция (-): менее 10% антигенположительных опухолевых клеток. Мозаичная реакция (+/-): антиген присутствовал на части (от 10% до 80%) опухолевых клеток. 45 Мономорфная реакция (+): антиген экспрессируется большинством (более 80%) опухолевых клеток. Статистическая обработка результатов исследования. Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 17. С применением теста Колмогорова-Смирнова проверялась гипотеза о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: МаннаУитни (две выборки) или Краскела-Уоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест 2 по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения использовались коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману. 46 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. ГЛАВА 3. ЭСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛ HLA-I и HLA-DR НА КЛЕТКАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. 3.1. Экспрессия молекул HLA-I Экспрессию молекул HLA-I класса оценили у 37 больных раком молочной железы. Средние уровни экспрессии антигена составили 65,7±4,9%, диапазон 4,1 – 100%. Частота HLA-I-положительных случаев в зависимости от порогового процентного уровня антиген-позитивных клеток представлена в таблице 8. Таблица 8 — Частота (доля) HLA-I-положительных случаев в зависимости от порогового процентного уровня антиген-позитивных клеток. Процент HLA-I+ опухолевых клеток, выше Число (процент) Число (процент) которого случаи относили к позитивным отрицательных положительных 20% 3 (8,1) 34 (91,9) 30% 6 (11,2) 31 (83,8) 40% 7 (18,9) 30 (81,1) 50% 13 (35,1) 24 (64,9) 60% 14 (37,8) 23 (62,2) 70% 18 (48,6) 19 (51,4) 80% 22 (59,5) 15 (40,5) При мономорфной экспрессии молекул HLA-I и HLA-DR на опухолевых клетках (> 70%) отмечена высокая корреляция экспрессии HLA-I и HLA-DR, р=0,025. В действительности, лишь в одном из 18 HLA-I-негативных случаев (5,6%) отмечена экспрессия HLA-DR. Этот случай, действительно, выделялся из общей группы, процент HLA-I-позитивных клеток составил всего 13%. 47 Таблица 9 — Взаимосвязь экспрессии молекул HLA-I и HLA-DR на клетках рака молочной железы HLA-DR <70% >70% Итого Частота 17 1 18 % в строке 94,4% 5,6% 100% Частота 12 7 19 % в строке 63,2% 36,8% 100% Частота 29 8 37 % в строке 78,4% 21,6% 100% HLA-I менее 70% более 70% Итого 3.2. Экспрессия молекул HLA-DR. Экспрессия молекул HLA-DR изучена методом проточной цитофлуориметрии у 57 больных раком молочной железы. Использовали FITCмеченые антитела L243 (BD, USA) к мономорфным детерминантам HLA-DR. Оценку экспрессии проводили в гейте эпителиальных клеток, выявляемых с помощью антител к EpCam1 (CD326), меченых фикоэритрином (РЕ). Средние уровни экспрессии HLA-DR составили 39,64,0% (диапазон от 0,6% до 100,0%). Наши данные указывают на то, что в популяции опухолевых клеток рака молочной железы, как правило, отсутствуют 2 четко разграничимые фракции опухолевых клеток – положительная и отрицательная. Обычно, сигнал непрерывно нарастает от отрицательных к положительным клеткам. Поэтому, первый вопрос, который встал перед нами, заключался в определении уровня интенсивности флуоресцентного сигнала, выше которого клетки можно было считать антиген-позитивными (HLA-DR-позитивными). Ответ на этот вопрос достаточно сложен и, по-видимому, должен решаться индивидуально для многих антигенов. Поскольку в нашем исследовании оценивалась реакция HLA-DR не только на опухолевых клетках, но и на лимфоцитах, то использовали следующий методический прием. Известно, что на В-лимфоцитах молекулы HLA-DR представлены во всех случаях, а на Т-лимфоцитах – обычно отсутствуют и появляются при их активации. На рисунке 1 представлена схема определения 48 порогового уровня HLA-DR, значения выше которого считали позитивными. Кратко. Выделяли гейт лимфоцитов на основании экспрессии CD45++ и с низкими характеристиками рассеяния света лазерного луча. Анализировали экспрессию HLA-DR в гейте лимфоцитов. По оси абсцисс устанавливали интенсивность сигнала HLA-DR, по оси ординат – экспрессию маркера CD3. Таким образом, становилось возможным, раздельно оценить экспрессию HLA-DR на В-клетках (или, точнее, на не-Т-клетках, отрицательных в реакции на CD3) и на CD3-позитивных Т-лимфоцитах. За пороговый уровень экспрессии принимали наименьшую величину сигнала позитивных В-лимфоцитов. Этот же уровень считали в дальнейшем пороговым для опухолевых клеток. Z0017909.LMD 10 CD3_PC-5 10 10 10 10 4 71,91% 11,55% Gate 1 3 2 1 5,13% 0 0 10 11,40% 1 10 2 10 HLA-DR_FITC 3 10 4 10 Рисунок 3 — Схема определения порогового уровня HLA-DR На рисунке 3 показаны клетки в гейте лимфоцитов CD45++/SSCLow. На точечной диаграмме: по оси абсцисс - HLA-DR_FITC, по оси ординат – CD3_PC5. Хорошо видна возможность оценки экспрессии молекулы HLA-DR на Вклетках (CD3 негативные), этот же уровень использовали для оценки процента позитивных Т-клеток (CD3 позитивные). К антиген-положительным случаям относили таковые с наличием более 20% HLA-DR-позитивных клеток. У 38 из 57 (66,7%) больных отмечена экспрессия HLA-DR на опухолевых клетках. 49 Частота HLA-DR-позитивных случаев в зависимости от порогового процента HLA-DR-позитивных клеток представлена в таблице 10. Таблица 10 — Частота HLA-DR-положительных случаев в зависимости от порогового процентного уровня антиген-позитивных клеток Процент HLA-DR+ опухолевых клеток, Число (процент) Число (процент) отрицательных положительных 20% 19 (33,3) 38 (66,7) 30% 27 (47,4) 30 (52,6) 40% 32 (56,1) 25 (43,9) 50% 38 (66,7) 19 (33,3) 60% 41 (71,9) 16 (28,1) 70% 45 (78,1) 12 (21,1) 80% 48 (84,2) 9 (15,8) выше которого случаи относили к позитивным Представленные данные дают основание к интерпретации данных проточной цитометрии в выявлении экспрессии молекул HLA на клетках рака молочной железы. Как правило, метод проточной цитометрии выявляет мономорфную экспрессию молекул HLA-I и HLA-DR на раковых клетках. И здесь очень важными являются определение уровня экспрессии антигена, выше которого клетки можно считать антиген-позитивными, и процента антигенположительных клеток, выше которого данный случай можно считать антигенпозитивным. Как известно, молекулы HLA-I класса представлены на всех клетках человека за исключением эритроцитов. Поэтому определение порогового уровня экспрессии молекул HLA-I на опухолевых клетках мы проводили на основании сравнительной оценки с экспрессией антигена на лейкоцитах. Молекулы HLA-DR представлены не на всех клетках человека. Для определения порогового уровня экспрессии этих молекул использовали в качестве положительного контроля В-лимфоциты. 50 Следует отметить, что частота антиген-положительных случаев рака молочной железы по экспрессии антигенов HLA-I и HLA-DR является очень высокой – 91% и 66% соответственно (при пороговом уровне 20% антигенпозитивных клеток). Это значительно выше, чем частота соответствующих антиген-позитивных случаев, выявляемых иммуногистохимически в оценке люминисцентным методом на криостатных срезах. Так, по данным наиболее обширного исследования Е.В.Артамоновой (2009) частота HLA-I-положительного рака молочной железы составила 56,2%, включая случаи с мономорфной и мозаичной экспрессией. Аналогичная цифра для HLA-DR-позитивных случаев равнялась 25%. Разница в частоте, определяемой проточно-цитометрически, и в люминисцентной микроскопии обусловлена тем, что проточно-цитометрически выявляются довольно слабые сигналы, которые невозможно определить человеческим глазом, проводя микроскопию люминисцентным методом. В определении порогового процента антиген-позитивных клеток для отнесения того или иного случая к антиген-положительному в проточноцитометрических определениях мы руководствовались следующим. Во-первых, частотой выявления антиген-позитивных случаев в люминисцентном методе. Вовторых, высокой сопряженностью экспрессии молекул HLA-I и HLA-DR при выявлении их экспрессии на клетках рака молочной железы методом люминисцентной микроскопии. Такой уровень соответствует 70% опухолевых клеток, экспрессирующих молекулы HLA-I и HLA-DR. При этом уровне частота экспрессии HLA-I и HLA-DR полностью соответствует таковой, выявляемой в люминисцентном методе, и наблюдается высокая сопряженность экспрессии данных антигенов на клетках (р=0,025). Разумеется, проточно-цитометрический метод в силу своей высокой чувствительности открывает значительно большие возможности, чем метод люминисцентной микроскопии. По этой причине в последующих главах при анализе клинического рассматриваем при значения и необходимости иммунологических не только взаимосвязей уровень 70% мы антиген51 положительных клеток, но и более низкие уровни. В ряде случаев мы приводим при изложении результатов не все, а лишь наиболее информативные результаты, полученные при иных, нежели 70%, уровнях (40%, 50% и т.п.). 52 ГЛАВА 4. КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HLA-I-ПОЗИТИВНОЙ ГРУППЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Возраст. Распределение больных раком молочной железы по возрасту в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 11. Таблица 11 — Взаимосвязь экспрессии HLA-I с возрастом больных. Возраст до 29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет 60-69 лет более 70 лет Итого Частота % Частота % Частота % Частота % Частота % Частота % Частота % HLA-I <70% 0 0 3 42,9% 3 37,5% 1 11,1% 3 42,9% 3 60% 13 35,1% >70% 1 100% 4 57,1% 5 62,5% 8 88,9% 4 57,1% 2 40% 24 64,9% Итого 1 100% 7 100% 8 100% 9 100% 7 100% 5 100% 37 100% Взаимосвязь возраста больных с экспрессией молекул HLA-I на клетках рака молочной железы по таблицам сопряженности признаков не достоверна (представлен уровень 70%), р=0,47. При других уровнях отнесения опухолей к HLA-I- позитивным достоверной связи также не обнаружено. Стадия заболевания. Распределение больных раком молочной железы по стадиям заболевания в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 12. 53 Таблица 12 — Взаимосвязь экспрессии HLA-I на опухолевых клетках со стадиями рака молочной железы. HLA-I Стадия Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % строке Частота % строке Частота % строке Iа Iб IIа IIб IIIа Итого <70% 2 33,3% 0 0% 6 31,6% 4 57,1% 1 25,0% 13 35,1% >70% 4 66,7% 1 100% 13 68,4% 3 42,9% 3 75,0% 24 64,9% Итого 6 100% 1 100% 19 100% 7 100% 4 100% 37 100% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи со стадией не отмечено, р=0,68. Размер опухоли. Распределение больных раком молочной железы по размеру опухоли в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 13. Таблица 13 — Взаимосвязь экспрессии HLA-I с размером опухоли. HLA-I Размер Т1 Т2 Т4 Итого Частота % Частота % Частота % Частота % <70% 3 33,3% 9 33,3% 1 100% 13 35,1% >70% 6 66,7% 18 66,7% 0 0% 24 64,9% Итого 9 100% 27 100% 1 100% 37 100% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с размером опухоли не отмечено, р=0,38. Средний размер опухолевого узла. В HLA-I негативной группе больных максимальный средний размер опухолевого узла составил 2,5 см (n=7 при 54 использовании уровня 40% для отнесения к HLA-негативной группе). А в HLA-I положительной группе больных максимальный средний размер опухолевого узла составил 2,8 см. Различия не достоверны, р=0,6. Наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы (индекс N). Распределение больных раком молочной железы по наличию метастазов в регионарные лимфатические узлы в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 14. Таблица 14 — Взаимосвязь экспрессии HLA-I с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы. Индекс N 0 1 2 Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке HLA-I <50% 6 28,6% 7 46,7% 0 0% 13 35,1% >50% 15 71,4% 8 53,3% 1 100% 24 64,9% Итого 21 100% 15 100% 1 100% 37 100% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с пораженнием регионарных лимфоузлов (индекс N по классификации TNM) не отмечено, р=0,404. Наибольшую группу составили больные без поражения лимфоузлов и с положительной экспрессией молекулы HLA-I. Данные патоморфологии. Гистологические варианты рака молочной железы. При анализе экспрессии молекул гистосовместимости I класса (пороговый уровень 70%) в зависимости от гистологического варианта рака молочной железы нами не установлено достоверной связи: при инфильтративном дольковом и инфильтративном протоковом раке отрицательные по HLA-I случаи выявлялись с одинаковой частотой. При раке in situ отмечен лишь 1 HLA-I-негативный случай, таблица 15а. 55 Таблица 15а — Взаимосвязь экспрессии HLA-I (пороговый уровень 70%) с гистологическим вариантом рака молочной железы. Гистологический диагноз Инфильтративный Инфильтративный Редкие дольковый рак протоковый рак формы HLA-I Частота <70% >70% Итого Рак in situ Итого 2 14 1 1 18 %в столбце Частота 50% 51,9% 100% 20% 48,6% 2 13 0 4 19 %в столбце Частота 50% 48,1% 0% 80% 51,4% 4 27 1 5 37 %в столбце 100% 100% 100% 100% 100% Вместе с тем, при использовании в качестве порогового уровня 20% HLA-I+ клеток выявлены достоверные взаимосвязи (р=0,007), таблица 15б. Таблица 15б — Взаимосвязь экспрессии HLA-I (пороговый уровень 20%) с гистологическим вариантом рака молочной железы. Гистологический диагноз Инфильтративный Инфильтративный Редкие дольковый рак протоковый рак формы HLA-I Частота <20% >20% Итого Рак in situ Итого 0 2 1 0 3 %в столбце Частота 0% 7,4% 100% 0% 8,1% 4 25 0 5 34 %в столбце Частота 100% 92,6% 0% 100% 91,9% 4 27 1 5 37 %в столбце 100% 100% 100% 100% 100% Наиболее четко различия между группами долькового и протокового рака проявляются при 50% уровне (хотя и не достоверно, р=0,076) – различный процент HLA-I-негативных случаев при инфильтративном дольковом и 56 инфильтративном протоковом раке, 100% позитивность при раке in situ (таблица 15в). Таблица 15в — Взаимосвязь экспрессии HLA-I с гистологическим вариантом рака молочной железы (пороговый уровень 50%). Гистологический диагноз HLA-I Инфильтративный Редкие Рак in дольковый рак протоковый рак формы situ 2 10 1 0 13 50,0% 37,0% 100% 0% 35,1% 2 17 0 5 24 50,0% 63,0% 0% 100% 64,9% 4 27 0 5 37 100% 100% 100% 100% 100% Частота <50% %в столбце Частота >50% %в столбце Частота Итого Итого Инфильтративный %в столбце Степень злокачественности. Анализ взаимосвязи экспрессии молекул HLA-I в зависимости от степени злокачественности опухоли проведен нами при всех уровнях экспрессии, расцениваемых как позитивные (от 20% до 80%). Только при уровне 40% взаимосвязь была достоверной (р=0,044). Распределение больных раком молочной железы по степени злокачественности в зависимости от экспрессии HLA-I (использован уровень 40%) на опухолевых клетках представлено в таблице 16. 57 Таблица 16 — Взаимосвязь экспрессии и HLA-I степени злокачественности. HLA-I Степень злокачественности <40% 0 0% 7 28,0% 0 0% 7 18,9% Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке 1 ст. 2 ст. 3 ст. Итого Итого >40% 2 100% 18 72,0% 10 100% 30 81,1% 2 100% 25 100% 10 100% 37 100% Данная, взаимосвязь со степенью злокачественности заключалась в том, что все отрицательные злокачественности. по Ни HLA-I при 1, случаи ни при наблюдались при 3 злокачественности степенях 2 степени отрицательных по HLA-I случаев не было. Вместе с тем, при 2 степени злокачественности частота HLA-I негативных случаев была высокой – 28%. Деление на подтипы (люминальный A, люминальный B). Разделение больных на подтипы (люминальный A, люминальный B) в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 17. Таблица 17 — Взаимосвязь экспрессии HLA-I с подтипами люминальный A, люминальный B. HLA-I Подтипы Люминальный A Люминальный B Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке <40% 3 27,3% 4 15,4% 7 18,9% >40% 8 72,7% 22 84,6% 30 81,1% Итого 11 100% 26 100% 37 100% Достоверной связи не отмечено, р=0,4 Пролиферативный индекс Ki-67. При оценке взаимосвязи двух качественных показателей (индекс Ki-67 и экспрессия молекул HLA-I класса) по таблицам сопряженности признаков достоверности не получено. Вместе с тем, 58 обращает на себя внимание тот факт, что при низком пролиферативном индексе частота утраты молекул HLA-I на опухолевых клетках минимальная, что особенно отчетливо проявляется при пороговом уровне HLA-I 70%. В этом случае взаимосвязь близка к достоверной (р=0,086), таблица 18. Таблица 18 — Взаимосвязь пролиферативного индекса Ki-67 с экспрессией молекул HLA-I на клетках рака молочной железы (пороговый уровень 70%). HLA-I <70% >70% Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Пролиферативный индекс Ki-67 Низкий высокий 3 15 27,3% 57,7% 8 11 72,7% 42,3% 11 26 100% 100% Итого 18 48,6% 19 51,4% 37 100% Аналогичным образом, сравнили средние уровни Ki-67-позитивных клеток в зависимости от HLA-I-позитивности. Ни при одном из уровней отнесения опухоли к HLA-I-негативной процент Ki-67-позитивных клеток в сравниваемых группах не различался. Экспрессия рецепторов эстрогенов. Взаимосвязь экспрессии молекул HLA-I на клетках рака молочной железы в зависимости от статуса рецепторов представлена в таблице 19. Использован пороговый уровень 40% для HLA-I . Таблица 19 — Взаимосвязь экспрессии молекул HLA-I на клетках рака молочной и статуса рецепторов эстрогенов. Рецепторы эстрогенов Отрицательны Положительны Итого HLA-I Итого <40% >40% Частота 5 8 13 % в строке 38,5% 61,5% 100% Частота 2 22 24 % в строке 8,3% 91,7% 100% Частота 7 30 37 59 % в строке 18,9% 81,1% 100% Как видно из представленных данных, наименьшая частота HLA-Iнегативных случаев отмечена в группе пациенток, позитивных по рецепторам эстрогенов (8,3%). Это в 4,5 раза ниже, чем в рецептор-отрицательной группе (38,5%). Признаки достоверно взаимосвязаны, р=0,039. При данном пороговом уровне различия в среднем балле рецепторов эстрогенов между HLA-Iнегативными и HLA-I-позитивными опухолями были близки к достоверным: 2,86±1,3 и 4,97±0,5, соответственно, р=0,09. Экспрессия рецепторов прогестерона. При том же пороговом уровне HLA-I оценили взаимосвязь рецепторов прогестерона с позитивностью по HLA-I. Распределение больных раком молочной железы по экспрессии рецепторов прогестерона в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 20. Таблица 20 — Взаимосвязь экспрессии молекул HLA-I на клетках рака молочной и рецепторов прогестерона. Рецепторы прогестерона Отрицательный Положительный Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке HLA-I <40% 4 25,0% 3 14,3% 7 18,9% >40% 12 75,0% 18 85,7% 30 81,1% Итого 16 100% 21 100% 37 100% В этом случае, как и в случае эстрогеновых рецепторов наименьшая частота HLA-I-позитивных случаев имела место в рецептор-положительной группе. Однако для рецепторов прогестерона эта взаимосвязь не была достоверной, р=0,34. Ни при одном из пороговых уровней отнесения к HLA-I-негативности различия в средних баллах рецепторов прогестерона не были значимыми. 60 Экспрессия Her2/Neu. Распределение больных по экспрессии Her2/Neu в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках представлено в таблице 21. Таблица 21 — Взаимосвязь экспрессии молекул HLA-I на клетках рака молочной с Her2/Neu-статусом. HLA-I Статус по Her2/Neu (баллы) Частота 0/1+ % в строке Частота 2+ % в строке Частота 3+ % в строке Частота Итого % в строке <40% 5 20,0% 1 14,3% 1 20,0% 7 18,9% >40% 20 80,0% 6 85,7% 4 80,0% 30 81,1% Итого 25 100% 7 100% 5 100% 37 100% Взаимосвязи с экспрессией Her2/Neu не обнаружено, р=0,94 Заключение. Подводя итоги исследований, можно констатировать существование определенных клинико-патоморфологических связей с экспрессией молекул гистосовместимости I класса на клетках рака молочной железы. Эти взаимосвязи касаются степени злокачественности опухоли, пролиферативного индекса, а также статуса по рецепторам эстрогенов. Общая тенденция такова – при нарастании степени злокачественности, пролиферативного индекса частота HLAI-негативных опухолей возрастает. Доля этих опухолей в случаях негативных по статусу эстрогеновых рецепторов выше, чем в рецептор-позитивных случаях. 61 ГЛАВА 5. КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HLA-DR-ПОЗИТИВНОЙ ГРУППЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. Возраст. Взаимосвязи экспрессии HLA-DR с возрастом больных не установлено ни при каких пороговых уровнях антиген. При пороговом уровне 20% (наибольшие группы сравнения) средний возраст больных HLA-DRнегативной группы составил 51,92,7 года (n=19), в антиген-позитивной группе – 53,22,2 года (n=38), различия не достоверны, р=0,73. Распределение больных по возрасту в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 22. Таблица 22 — Распределение больных по возрасту в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. Возраст HLA-DR Итого До 29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет 60-69 лет 70 лет и старше Частота 0 4 5 4 4 2 19 %в строке 0,0% 21,1% 26,3% 21,1% 21,1% 10,5% 100% Частота 1 5 10 10 7 5 38 %в строке 2,6% 13,2% 26,3% 26,3% 18,4% 13,2% 100% Частота 1 9 15 14 11 7 57 %в строке 1,8% 15,8% 26,3% 24,6% 19,3% 12,3% 100% Отрицательный Положительный Итого 62 Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с возрастом не отмечено, р=0,73. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группе, наблюдается равномерное распределение больных. Стадия заболевания. Взаимосвязь экспрессии HLA-DR со стадией заболевания оценена при различных пороговых значениях антигена. При уровне 70% связь была достоверной, р=0,031. Распределение больных по стадиям в зависимости от экспрессии HLA-DR представлено в таблице 23. Таблица 23 — Распределение больных раком молочной железы по стадиям заболевания в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. HLA-DR Стадия Iа Iб IIа IIб IIIа IIIб Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке <70% 9 75,0% 0 0% 18 72,0% 9 100,0% 7 100,0% 1 50,0% 44 78,6% >70% 3 25,0% 1 100,0% 7 28,0% 0 0% 0 0% 1 50,0% 12 21,4% Итого 12 100% 1 100% 25 100% 9 100% 7 100% 2 100% 56 100% Взаимосвязь, отмеченная в таблице 23, заключается в том, что экспрессия молекул HLA-DR наиболее характерна для стадий I-IIa и не наблюдается при стадиях IIб и IIIа. Размер опухоли. Распределение больных раком молочной железы по размеру опухоли в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 24. 63 Таблица 24 —- Распределение больных раком молочной железы по размеру опухоли в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. Т HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота %в строке Частота %в строке Частота %в строке Итого 1 7 2 11 3 0 4 1 36,8% 57,9% ,0% 5,3% 100,0% 9 26 1 2 38 23,7% 68,4% 2,6% 5,3% 100,0% 16 37 1 3 57 28,1% 64,9% 1,8% 5,3% 100,0% 19 Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи со стадией не отмечено, Р=0,68. Как среди HLA-DR отрицательной группы, так и HLA-DR положительной наибольшую часть (57,9% и 68,4% соответственно), составляет Т2 стадия. При других пороговых уровнях HLA-DR связи с размером опухоли также не отмечено. Средние размеры опухолевых узлов были достоверно большими при HLADR-позитивных опухолях в сравнении с HLA-DR-негативными: 3,050,25 см (n=38) и 2,370,19 (n=19), p=0,037 (пороговый уровень – 20%). Регионарные лимфатические узлы. Связи поражения регионарных лимфатических узлов с экспрессией HLA-DR на опухолевых клетках не установлено. Распределение больных по наличию метастазов в регионарные лимфатические узлы в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 25. Таблица 25 - Распределение больных по пораженности регионарных лимфатических узлов в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Индекс N по классификации TNM 0 1 2 11 7 1 57,9% 36,8% 5,3% 23 13 2 60,5% 34,2% 5,3% 34 20 3 59,6% 35,1% 5,3% Итого 19 100,0% 38 100,0% 57 100,0% 64 Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с количеством пораженных регионарных лимфатических узлов не отмечено, р=0,98. Степень злокачественности. Распределение больных по степени злокачественности в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 26. Таблица 26 — Распределение больных по степени злокачественности в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Степень злокачественности 1 2 3 1 15 3 5,3% 78,9% 15,8% 3 25 10 7,9% 65,8% 26,3% 4 40 13 7,0% 70,2% 22,8% Итого 19 100,0% 38 100,0% 57 100,0% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи со степенью злокачественности при пороговом уровне экспрессии HLA-DR в 20% не отмечено, р=0,59. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группе, наибольшую часть (78,9% и 65,8% соответственно), составили опухоли со 2 степенью злокачественности. Мы оценили взаимосвязи при других уровнях (30%80%). При уровнях 70% и 80% взаимосвязи были достоверными (р=0,005 и р=0,049, соответственно). Приводим таблицу наиболее значимых взаимосвязей (таблица 27). Таблица 27 — Распределение больных по степени злокачественности в зависимости от экспрессии HLA-DR (70% уровень) на опухолевых клетках. Степень злокачественности 1 2 3 Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке HLA-DR <70% 1 25,0% 31 77,5% 13 100,0% 45 78,9% >70% 3 75,0% 9 22,5% 0 ,0% 12 21,1% Итого 4 100,0% 40 100,0% 13 100,0% 57 100,0% 65 Хорошо видно, что по мере нарастания степени злокачественностиот I до III увеличивается доля HLA-DR-негативных случаев (до 100%) и снижается доля HLA-DR-позитивных случаев (до 0%). Это очень интересное наблюдение, которое свидетельствует, что при нарастании степени злокачественности экспрессия HLA-DR утрачивается. Пораженные лимфоузлы. Распределение больных по количеству пораженных лимфоузлов в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 28. Таблица 28 — Распределение больных по количеству пораженных лимфоузлов в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. Количество пораженных лимфоузлов Итого HLA-DR Отрицательный Положительный Итого 0 1 2 3 5 7 Частота 12 4 0 2 0 1 19 %в строке 63,2% 21,1% 0% 10,5% 0% 5,3% 100,0% Частота 22 8 5 2 1 0 38 %в строке 57,9% 21,1% 13,2% 5,3% 2,6% 0% 100,0% Частота 34 12 5 4 1 1 57 %в строке 59,6% 21,1% 8,8% 7,0% 1,8% 1,8% 100,0% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с количеством пораженных лимфоузлов не отмечено, р=0,77. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группах, наибольшую часть (63,2% и 57,9% соответственно), составили опухоли без поражения регионарных лимфатических узлов. Патоморфологические данные. Гистологический вариант опухоли. 66 В целом достоверной взаимосвязи экспрессий HLA-DR на опухолевых клетках с гистологическим вариантом опухоли не отмечено. Связь была наиболее близкой к достоверной при пороговом уровне 60% (р=0,057), таблица 29. Таблица 29 — Взаимосвязь экспрессий HLA-DR на опухолевых клетках с гистологическим вариантом опухоли. HLA-DR (пороговый уровень 60%) Гистологический вариант опухоли Инфильтративный Инфильтративный Редкие дольковый рак протоковый рак формы Рак in situ Итого Частота 8 27 1 5 41 % в строке 100,0% 64,3% 100,0% 83,3% 71,9% Частота 0 15 0 1 16 % в строке ,0% 35,7% ,0% 16,7% 28,1% Частота 8 42 1 6 57 % в строке 100,0% 100,0% Отрицательный Положительный Итого 100,0% 100,0% 100,0% Деление на подтипы (люминальный A, люминальный B). Распределение больных по делению на подтипы (люминальный A, люминальный B) в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 30. Таблица 30 — Распределение больных по делению на подтипы (Luminal A, Luminal B) в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках. HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Люминальный А 6 31,6% 9 24,3% 15 26,8% B 13 68,4% 28 75,7% 41 73,2% Итого 19 100,0% 37 100,0% 56 100,0% 67 Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с подтипами Luminal A, Luminal B не отмечено, р=0,58. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группе, наибольшую часть (68,4% и 75,7% соответственно) составили опухоли люминального B подтипа. Пролиферативный индекс. Имела место тесная достоверная взаимосвязь HLA-DR-позитивности опухоли с пролиферативным индексом Ki-67, таблица 31. Таблица 31 — Взаимосвязь пролиферативного индекса Ki67 экспрессий HLA-DR на опухолевых клетках (пороговый уровень 70%). Ki67 HLA-DR <70% >70% Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке Низкий 6 50,0% 6 50,0% 12 100,0% Итого Высокий 30 93,8% 2 6,3% 32 100,0% 36 81,8% 8 18,2% 44 100,0% При высоком пролиферативном индексе лишь в 6,3% случаев имела место HLA-DR-позитивность, в то время как при низком пролиферативном индексе соответствующая частота составила 50%, р=0,001. Подобные закономерности имели место также при пороговых уровнях 60% (р=0,019) и 80% (р=0,02). Сравнение средних процентов Ki-67-позитивных клеток выявило достоверные различия между HLA-DR-позитивными и HLA-DR-негативными опухолями: 12,5±1,8% (n=8) и 26,6±2,5% (n=36), соответственно, р=0,000. Аналогично, различия получены и при пороговом уровне 80%, р=0,001. Следовательно, уровень пролиферативной активности HLA-DR-позитивных опухолей достоверно ниже, чем в HLA-DR-негативных опухолях. 68 Рецепторы эстрогенов. Распределение больных по экспрессии рецепторов эстрогенов в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 32. Таблица 32 — Распределение больных по экспрессии рецепторов эстрогенов в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках (пороговый уровень – 20%). HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота Рецепторы эстрогенов 0-4 балла 5-8 баллов 6 13 Итого 19 % в строке 31,6% 68,4% 100,0% Частота 14 24 38 % в строке 36,8% 63,2% 100,0% Частота 20 37 57 % в строке 35,1% 64,9% 100,0% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с экспрессией рецепторов эстрогенов не отмечено, р=0,7. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группе, наибольшую часть (68,4% и 63,2% соответственно), составили опухоли с экспрессией эстрогенов в 5-8 баллов. При других пороговых уровнях экспрессии HLA-DR связи с рецепторным статусом (рецепторы эстрогенов) не обнаружено. Рецепторы прогестерона. Распределение больных по экспрессии рецепторов прогестерона в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 33. 69 Таблица 33 — Распределение больных по экспрессии рецепторов прогестерона в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках (при пороговом уровне 20%). HLA-DR (уровень 20%) Отрицательный Положительный Итого Частота Рецепторы прогестерона 0-4 балла 5-8 баллов 8 11 Итого 19 % в строке 42,1% 57,9% 100,0% Частота 16 22 38 % в строке 42,1% 57,9% 100,0% Частота 24 33 57 % в строке 42,1% 57,9% 100,0% Как видно из представленных в таблице данных, взаимосвязи с экспрессией рецепторов прогестерона при пороговом уровне HLA-DR 20% не отмечено, р=1,00. Как в HLA-DR позитивной, так и в HLA-DR негативной группах, наибольшую часть – 57,9% составили опухоли с экспрессией рецепторов прогестерона в 5-8 баллов. Вместе с тем, оценка при различных уровнях указывает на то, что при 70%-ном уровне позитивности взаимосвязь носит достоверный характер, таблица 34. Таблица 34 — Распределение больных по экспрессии рецепторов прогестерона в зависимости от экспрессии HLA-DR на опухолевых клетках (при пороговом уровне 70%). Статус прогестероновых рецепторов Частота Отрицательный % в строке Частота Положительный % в строке Частота Итого %в строке HLA-DR <70% 22 91,7% 23 69,7% 45 78,9% >70% 2 8,3% 10 30,3% 12 21,1% Итого 24 100,0% 33 100,0% 57 100,0% 70 В рецептор-отрицательной группе частота случаев, отрицательных по HLADR значительно выше, чем в рецептор-положительных случаях (92% и 70%), р=0,043. Экспрессия Her2neu. Распределение больных по экспрессии рецепторов Her2/Neu в зависимости от наличия HLA-DR на опухолевых клетках представлено в таблице 35. Таблица 35 — Распределение больных по экспрессии Her2/Neu в зависимости от наличия HLA-DR на опухолевых клетках. HLA-DR Отрицательный Положительный Итого Частота % в строке Частота % в строке Частота % в строке 0/1+ 11 57,9% 29 76,3% 40 70,2% Her2/Neu 2+ 6 31,6% 4 10,5% 10 17,5% 3+ 2 10,5% 5 13,2% 7 12,3% Итого 19 100,0% 38 100,0% 57 100,0% Взаимосвязи между признаками близки к достоверным (р=0,05) и заключаются в том, что экспрессия Her2/Neu (2+) в HLA-DR-позитивной группе встречается существенно реже, чем в HLA-DR-отрицательной группе (10,5% и 31,6% соответственно). Заключение. Выявлены определенные клинико-патоморфологические взаимосвязи с экспрессией молекул HLA-DR. Они касаются стадии заболевания, размера опухоли, степени злокачественности, уровня пролиферативной активности, статуса рецепторов прогестерона. Взаимосвязь со стадией заболевания заключается в том, что отсутствовали HLA-DR-негативные опухоли при IIб и IIIa стадиях рака молочной железы при пороговом уровне негативности 70%. В HLA-DR-позитивной группе средний размер опухоли был большим в сравнении с HLA-DR-негативными опухолями. Интересная ассоциация отмечена со степенью злокачественности – при 3 степени 71 злокачественности все опухоли были HLA-DR-негативными. Уровень пролиферативной активности HLA-DR-позитивных опухолей достоверно ниже, чем в HLA-DR-негативных опухолях. При опухолях с отрицательным статусом прогестероновых рецепторов частота случаев, негативных по HLA-DR значительно выше, чем в рецептор-положительных случаях (92% и 70%), р=0,043. 72 ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ С ЭКСПРЕССИЕЙ HLA-I. Во-первых, мы оценили, насколько уровни экспрессии молекул HLA-I и II классов взаимосвязаны со степенью инфильтрации опухоли субпопуляциями Тлимфоцитов. Сравнили среднее содержание клеток в HLA-I-антиген-позитивной и негативной группах для каждого порогового уровня экспрессии молекул HLA-I, выше которого опухоль расценивалась как антиген-позитивная. Изучены следующие субпопуляции Т-лимфоцитов: o CD45+ Syto-1+ - процентное содержание лимфоцитов (CD45++SSClow) среди ядросодержащих клеток в опухоли (Syto-1+); o CD3+CD45+ процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди интратуморальных лимфоцитов (CD45+SSClow); o CD4+CD3+ процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди зрелых Тлимфоцитов; o CD4+CD45+ процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди лимфоцитов (CD45+); o CD8+CD3+ процентное содержание Т-киллеров (CD8+) среди зрелых Тлимфоцитов; o CD4+CD45+ процентное содержание Т-киллеров (CD8+) среди лимфоцитов (CD45+); o CD3+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+) среди зрелых Т-лимфоцитов CD3+ (в гейте CD3+ клеток); o CD45+ HLA-DR+ процентное содержание HLA-DR+ клеток (В-клетки и активированные Т-клетки) среди лимфоцитов; o CD4+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-хелперов (CD4+HLA-DR+) среди зрелых Т-клеток CD3+ (в гейте CD3+ клеток); o CD8+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-киллеров (CD8+HLA-DR+) среди зрелых Т-клеток CD3+ (в гейте CD3+ клеток); 73 В таблице 36 приведены только достоверные и близкие к достоверным различия. Таблица 36 – Сравнение средних уровней интратуморальных T-клеток и их субпопуляций в зависимости от экспрессии HLA-I на опухолевых клетках. % позитивн. Группа по HLA-I Субпопуляция P Т-клеток HLA-I+ (M±m, n) HLA-I- (M±m, n) CD3+CD45+ 75,3±2,2 (29) 54,6±13,6 (3) 0,014 CD4+CD3+ 49,7±2,1 (26) 34,2±12,2 (3) 0,043 CD8+HLA-DR+ 19,0±4,1 (27) 48,3±3,8 (3) 0,058-0,002 30% CD3+CD45+ 75,9±2,4 (26) 62,3±7,4 (6) 0,033 40% CD3+CD45+ 76,1±2,5 (25) 63,7±6,4 (7) 0,041 CD3+CD45+ 76,8±2,99 (20) 67,7±4,2 (12) 0,08 CD3+HLA-DR+ 27,3±6,1 (19) 13,4±3,6 (12) 0,06 CD3+CD45+ 76,4±3,1 (19) 68,9±4,0 (13) 0,15 CD4+CD3+ 51,8±3,2 (16) 43,6±3,2 (13) 0,086 CD3+HLA-DR+ 28,3±6,3 (18) 13,0±3,4 (13) 0,043 70% CD3+CD45+ 77,1±3,3 (17) 69,2±3,7 (15) 0,12 80% CD45+ в Syto 6,5±1,99 (15) 3,1±0,7 (22) 0,07 20% 50% 60% При анализе взаимосвязи экспрессии молекул HLA-I с содержанием интратуморальных лимфоцитов различных субпопуляций выявляется совершенно четкая картина. Экспрессия HLA-I положительно влияет на уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами (процент CD45+ лимфоцитов среди всех ядросодержащих клеток опухолевой ткани), зрелыми Т-клетками (процент CD3 в пределах лимфоцитов CD45++), Т-хелперами (CD4+ в пределах зрелых CD3+ Тлимфоцитов). На определенных этапах отмечается взаимосвязь с активацией Тклеток (CD3+HLA-DR+) и обратная связь с уровнями активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+HLA-DR+). Каждый из этих параметров нуждается в серьезном рассмотрении. 74 1. Уровень лимфоцитарной инфильтрации опухоли. Для этой цели использован показатель количества CD45++ клеток с низкими характеристиками бокового рассеяния света лазерного луча SSClow, то есть лимфоцитов в пределах всех ядросодержащих клеток опухолевой ткани (использован ядерный краситель Syto16). Уровни интратуморальных лимфоцитов были выше во всех случаях в HLA-I-позитивной группе больных (вне зависимости от порогового уровня HLAI-позитивных клеток, используемого для отнесения к HLA-I-позитивной группе). Наибольшие различия получены между группами с наличием более 80% HLA-I+ опухолевых клеток и с наличием меньшего количества этих клеток. Иными словами, рак молочной железы, состоящий более чем на 80% из HLA-Iпозитивных клеток вдвое более сильно инфильтрирован лимфоцитами, чем группа опухолей с меньшим количеством HLA-1-позитивных клеток (6,5% и 3,1% лимфоцитов в опухолевой ткани соответственно). Подобная тенденция сохраняется и при других пороговых уровнях экспрессии HLA-I на опухоли, используемых для отнесения к HLA-I-позитивной группе. То есть уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки) напрямую зависит от экспрессии на опухоли молекул HLA-I класса. 2. Из числа проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов наибольшую связь с экспрессией молекул HLA-I на опухолевых клетках имели зрелые Т-клетки (CD3), пропорция которых в пределах лимфоцитов (CD45++) была выше в группе HLA-I-позитивных опухолей в сравнении с HLA-I-негативными опухолями. Наиболее достоверные данные получены при пропорции HLA-I-позитивных клеток 20%, 30%, 40% среди всей популяции опухолевых клеток (EpCAM, CD326+). 3. В пределах зрелых Т-клеток (CD3+) популяция Т-хелперов (CD4+) напрямую зависит от уровней экспрессии HLA-I в опухолевой ткани. Достоверно более высокие уровни CD4+CD3+ лимфоцитов наблюдаются при уровне HLA-I выше 20%, то есть при достаточно высокой пропорции HLA-I-негативных клеток в опухолевой ткани. 75 4. Еще одним важным признаком роли экспрессии в HLA-I молекул на клетках рака молочной железы является нарастание пропорции активированных зрелых Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) HLA-I-позитивных опухолях в сравнении с HLA-I-негативным раком молочной железы. При наличии 60% и более HLA-Iпозитивных опухолевых клеток содержание активированных Т-лимфоцитов вдвое выше, чем в опухолях, содержащих меньшую пропорцию HLA-I-позитивных клеток (27,3±6,1% и 13,0±3,4 соответственно, р=0,043). Таким образом, HLA-I-позитивные опухоли характеризуются более высокими уровнями лимфоцитарной инфильтрации за счет зрелых Т-хелперных клеток и активированных CD3+ зрелых Т-лимфоцитов. Взаимосвязь интратуморальных лимфоцитов с экспрессией HLA-DR на опухолевых клетках. Во-первых, мы оценили, насколько уровни экспрессии молекул HLA-DR антигенов взаимосвязаны со степенью инфильтрации опухоли субпопуляциями Тлимфоцитов. Изучены те же самые, что и в случае HLA-I субпопуляции Тлимфоцитов (средние значения представлены в таблице 36): o CD45+ Syto-1+ - процентное содержание лимфоцитов (CD45++SSClow) среди ядросодержащих клеток в опухоли (Syto-1+); o CD3+CD45+ процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди интратуморальных лимфоцитов (CD45+SSClow); o CD4+CD3+ процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди зрелых Тлимфоцитов; o CD4+CD45+ процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди лимфоцитов (CD45+); o CD8+CD3+ процентное содержание Т-киллеров (CD8+) среди зрелых Тлимфоцитов; o CD4+CD45+ процентное содержание Т-киллеров (CD8+) среди лимфоцитов (CD45+); 76 o CD3+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+) среди зрелых Т-лимфоцитов CD3+ (в гейте CD3+ клеток); o CD45+ HLA-DR+ процентное содержание HLA-DR+ клеток (В-клетки и активированные Т-клетки) среди лимфоцитов; o CD4+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-хелперов (CD4+HLA-DR+) среди зрелых Т-клеток CD3+ (в гейте CD3+ клеток); o CD8+HLA-DR+ процентное содержание активированных Т-киллеров (CD8+HLA-DR+) среди зрелых Т-клеток CD3+ (в гейте CD3+ клеток); 77 Таблица 37 — Сравнение средних уровней интратуморальных Т-лимфоцитов и их субпопуляций в зависимости от экспрессии молекул HLA-DR на опухолевых клетках. Группа по HLA-DR % Субпопуляция позитивн. Т-клеток HLA-DR+ (M±m, n) HLA-DR- (M±m, n) 20% CD3+HLA-DR+ 24,8±4,8 (25) 11,4±4,8 (7) 0,06 30% CD3+HLA-DR+ 27,2±5,5 (21) 11,6±3,6 (11) 0,024 CD45+CD4+ 42,3±2,3 (15) 48,6±2,2 (17) 0,059 CD4+CD25+ 10,9±2,3 (7) 5,97±1,3 (9) 0,069 CD3+CD45+ 82,3±2,3 (17) 75,3±2,8 (31) 0,057 CD45+CD4+ 41,2±2,5 (11) 48,0±2,0 (21) 0,046 CD3+HLA-DR+ 16,6±4,1 (21) 31,9±8,0 (11) 0,069 CD4+HLA-DR+ 23,9±4,3 (15) 15,3±2,1 (32) 0,055 CD3+CD25+ 13,3±2,7 (6) 7,5±1,5 (10) 0,054 CD4+CD25+ 11,6±2,6 (6) 6,0±1,1 (10) 0,037 CD45+ Syto+ 1,9±0,8 (8) 5,0±1,1 (30) 0,035 CD45+CD3+ 83,8±2,9 (10) 76,2±2,4 (38) 0,05 CD3+CD25+ 14,7±3,7 (4) 7,99±1,3 (12) 0,048 CD4+CD25+ 13,7±3,7 (4) 6,2±0,9 (12) 0,01 CD3+CD25+ 15,2±5,2 (3) 8,39±1,3 (13) 0,07 CD4+CD25+ 13,97±4,97 (3) 6,75±1,0 (13) 0,031 40% 50% 60% 70% 80% P При анализе субпопуляций интратуморальных Т-лимфоцитов в группах рака молочной железы достоверные данные были получены, в основном, для активированных клеток. Так, процентное содержание активированных зрелых Тклеток (CD3+HLA-DR+) при HLA-DR+ фенотипе рака молочной железы было выше, чем при HLA-DR-негативном, наиболее значимые различия получены при пороговом уровне HLA-DR, принимаемом за положительный 20%, 30% и 50%. Причем при уровне 30% различия были достоверными (р=0,024). Уровни активированных Т-хелперов (CD4+HLA-DR+) также были более высокими в HLA-DR+ группе рака молочной железы. 78 Общее содержание интратуморальных Т-лимфоцитов (CD45+CD3+) также было выше при HLA-DR+ иммунофенотипе, причем при использовании порогового уровня 70% различия достоверны. Уровни активированных Т-клеток (CD3+CD25+) и активированных Тхелперных клеток (CD4+CD25+) также были более высокими при наличии HLADR на опухолевых клетках. Вместе с тем, общий уровень инфильтрации опухоли Т-хелперными клетками был выше при HLA-DR-негативном иммунофенотипе. При пороговом уровне HLA-DR+ клеток в 50% различия между группами достоверны. Следовательно, HLA-DR-позитивный иммунофенотип сопровождается более выраженной Т-клеточной инфильтрацией (CD45+CD3+), инфильтрацией активированными Т-клетками (CD3+ HLA-DR+ и CD3+CD25+), а также активированными Т-хелперными клетками (CD4+HLA-DR+ и CD4+CD25+). Однако, общее содержание Т-хелперов в группе HLA-DR+ опухолей более низкое. 79 Корреляции между субпопуляциями интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Таблица 38 — Уровни интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы. Показатель Кол-во исследован. Диапазон (%%) M±m (%%) Процент лимфоцитов 38 0,14-23,0 4,4±0,9 CD3+CD45+ 48 37,8-97,8 77,8±2,0 CD4+CD3+ 46 10,3-82,5 48,8±1,9 CD4+CD45+ 32 32,0-69,0 45,6±1,7 CD8+CD3+ 44 17,0-72,7 45,6±1,8 CD8+CD45+ 31 16,7-56,8 41,0±1,7 CD3+HLA-DR+ 32 0,8-83,6 21,9±4,0 CD45+HLA-DR+ 49 3,3-83,2 32,0±3,2 CD4+HLA-DR+ 47 0,68-75,0 18,0±2,1 CD8+HLA-DR+ 47 0-87,0 24,5±2,9 Процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) находилось в положительной корреляционной связи только с процентом CD4+ клеток среди лимфоцитов (CD45+), R=0,46; p=0,011 (n=30). Процентное содержание Т-хелперов (CD4+) среди зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) находилось в отрицательной корреляционной связи с: o процентным содержанием Т-киллеров (CD8+) среди зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), R=-0,6; p=0,000 (n=43); o процентным содержанием HLA-DR-позитивных лимфоцитов (CD45+HLADR+), R=-0,28; p=0,068 (n=45). Процентное содержание Т-киллеров (CD8+) среди зрелых Т-лимфоцитов (CD3) находилось в положительной корреляционной связи с: o процентом CD8+ клеток среди лимфоцитов (CD45), R=0,34; p=0,069 (n=29), 80 o процентом активированных Т-клеток (CD3=HLA-DR+), R=0,34; p=0,069 (n=29), o процентом HLA-DR-позитивных лимфоцитов (CD45=HLA-DR+), R=0,36; p=0,017 (n=43), o процентом активированных Т-киллеров (CD8+HLA-DR+), R=0,47; p=0,001 (n=44). o Процентное содержание активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+) находилось в положительной корреляционной связи с: o процентом Т-киллеров (CD8+) среди лимфоцитов (CD45+), R=0,31; p=0,091 (n=30), o процентом HLA-DR-позитивных лимфоцитов (CD45+HLA-DR+), R=0,795; p=0,000 (n=31), o процентом активированных Т-киллеров (CD8+HLA-DR+), R=0,65; p=0,000 (n=30), o процентом активированных Т-хелперов (CD4+HLA-DR+), R=0,63; p=0,000 (n=30) Процентное содержание HLA-DR-позитивных лимфоцитов (CD45+HLADR+) отрицательно коррелировало с процентом Т-клеток (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+), R=-0,28; p=0,068 (n=45). Процентное содержание HLA-DR-позитивных лимфоцитов (CD45+HLADR+) положительно коррелировало с: o процентом Т-хелперов (CD4+) среди лимфоцитов (CD45+), R=0,36; p=0,017 (n=43), o процентом активированных Т-хелперов (CD4+HLA-DR+), R=0,62; p=0,000 (n=46), o процентом активированных Т-киллеров (CD8+HLA-DR+), R=0,5; p=0,000 (n=46). 81 При оценке связей процентного содержания клеток изученных субпопуляций с процентом HLA-DR-позитивных опухолевых клеток отмечена отрицательная корреляция (недостоверна) с пропорцией Т-хелперов (CD4+) среди лимфоцитов (CD4+CD45+), R=-0,287; p=0,11 (n=32) и положительная корреляция (недостоверна) с пропорцией активированных Т-клеток (CD3+HLA-DR+), R=0,311; p=0,083 (n=32). При оценке связей процентного содержания клеток изученных субпопуляций с процентом HLA-I-позитивных опухолевых клеток отмечена отрицательная корреляция (недостоверна) с пропорцией Т-киллеров (CD8+) среди Т-лимфоцитов (CD8+CD3+), R=-0,316; p=0,1 (n=28). При оценке связей процентного содержания клеток изученных субпопуляций с процентом HLA-I-позитивных опухолевых клеток отмечена положительная корреляция (недостоверна) с: пропорцией лимфоцитов в опухоли (CD45+ клеток среди ядросодержащих клеток Syto1+), R=0,279 p=0,094 (n=37), o процентом CD3+ клеток среди лимфоцитов (CD45+), R=0,32; p=0,076 (n=32), o процентом Т-хелперов (CD4+) среди Т-клеток (CD3+), R=0,34; p=0,075 (n=29). Разумеется, эти корреляции были лишь близки к достоверным и отражали общую тенденцию нарастания или снижения тех или иных субпопуляций клеток в зависимости от HLA-фенотипа опухоли. Детальный разбор этих связей в зависимости от уровней позитивности опухоли по молекулам HLA дан в таблицах (см. выше). Особый интерес, на наш взгляд, представляет то, что уровень лимфоцитарной инфильтрации нарастает по мере увеличения пропорции HLA-Iпозитивных клеток. Вместе с тем, уровень экспрессии (процент клеток) молекул рестрикции для CD4-лимфоцитов – HLA-DR – находится в обратной корреляции с процентом CD4-позитивных лимфоцитов. А уровень экспрессии молекул HLA-I (рестрикционные элементы для CD8-рецепторов) находится в обратной корреляции с процентом Т-киллеров (CD8+) в опухолевой ткани. Это совершенно новое положение, которое еще предстоит осмыслить. 82 ГЛАВА 7. ВЗАИМОСВЯЗЬ СУБПОПУЛЯЦИЙ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ С КЛИНИЧЕСКИМИ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ОСОБЕННОСТЯМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Возраст. При сопоставлении процентного содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных моложе и старше 50 лет близкие к достоверным различия получены только в отношении CD4+CD45+ лимфоцитов, таблица 39. Таблица 39 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в Возраст Показатель Кол-во случаев зависимости от возраста больных. Процент клеток Среднее Стд. ошибка P среднего CD45+ лимфоциты среди >= 50 ядросодержащих клеток (Syto16+) в < 50 ткани молочной железы >= 50 CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) < 50 21 4,2629 1,18041 17 4,4994 1,46021 28 75,7536 3,07767 20 80,5825 2,07560 >= 50 27 50,0481 2,67369 < 50 19 46,9579 2,57880 >= 50 18 48,3500 2,35111 < 50 14 42,1571 1,99482 >= 50 26 45,2846 2,49760 < 50 18 46,0333 2,79662 >= 50 18 40,0333 2,67805 < 50 13 42,4385 1,72138 >= 50 19 19,5684 4,80368 < 50 13 25,2269 7,03314 >= 50 30 31,7867 4,25170 < 50 19 32,2863 4,94344 >= 50 27 17,8196 2,40652 < 50 20 18,2465 3,77620 >= 50 28 25,8129 3,47004 < 50 19 22,6753 5,05425 >= 50 10 8,9500 1,52128 CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток cd3 CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ >0,05 >0,05 >0,05 0,054 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 83 CD4+CD25+ < 50 6 10,8667 3,24897 >= 50 10 7,6400 1,27220 < 50 6 8,8833 3,07120 >0,05 Как видно из таблицы, у больных старшего возраста (>=50 лет) средние уровни CD4 лимфоцитов были выше 48% и 42%, различия близки к достоверным (р=0,54). 84 Таблица 40 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от размера опухоли (сопоставление Т1-Т2 и Т3-Т4) Показатель CD45+ лимфоциты ядросодержащих (Syto16+) в ткани Процент клеток Размер Кол-во опухоли случаев Среднее 1 ,7600 . 37 4,4662 ,93011 3 75,8333 8,10480 Т1, Т2 45 77,8944 2,09182 Т3, Т4 4 61,2250 9,20483 Т1, Т2 42 47,5857 1,81986 1 40,2000 . среди Т3, Т4 Стд. ошибка P среднего клеток молочной Т1, Т2 >0,05 железы CD3+ среди лимфоцитов Т3, Т4 (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов Т3, Т4 (CD45+) Т1, Т2 31 45,8161 1,69984 CD8+ Т3, Т4 4 35,6250 6,56346 среди Т-клеток cd3 Т1, Т2 40 46,5875 1,87766 1 46,0000 . Т1, Т2 30 40,8767 1,75353 Т3, Т4 1 2,7000 . Т1, Т2 31 22,4855 4,07935 Т3, Т4 3 41,2000 21,43766 Т1, Т2 46 31,3791 3,18954 Т3, Т4 4 17,0000 4,39223 Т1, Т2 43 18,0944 2,26319 Т3, Т4 4 13,5750 6,56536 Т1, Т2 43 25,5649 3,05974 Т3, Т4 1 41,1000 . Т1, Т2 36 66,3989 4,97006 Т3, Т4 3 5,9000 2,87112 Т1, Т2 13 10,5385 1,67338 CD8+ среди (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ лимфоцитов Т3, Т4 >0,05 0,041 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 85 Среднее содержание интратуморальных Т-клеток CD4+CD3+ в опухолях более крупного размера (Т3, Т4) было достоверно более высоким, чем при опухолях меньшего размера (Т1, Т2) – 61% и 47,6% соответственно (р=0,041). Таблица 41 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от размера опухоли (сопоставление Т1 с Т2-4) Процент клеток Показатель Размер Кол-во опухоли случаев Стд. Среднее ошибка P среднего лимфоциты CD45+ ядросодержащих среди Т2-4 29 4,8503 1,16260 9 2,8167 ,74316 36 75,3097 2,43715 Т1 12 85,1333 2,33132 Т2-4 35 50,5657 2,24447 Т1 11 43,0636 2,91293 27 46,6741 1,81390 клеток (Syto16+) в ткани молочной Т1 >0,05 железы CD3+ среди лимфоцитов Т2-4 (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов Т2-4 (CD45+) Т1 5 40,0600 3,34254 CD8+ Т2-4 34 44,4206 2,15872 среди Т-клеток cd3 Т1 10 49,5700 3,36720 26 40,2731 1,96189 Т1 5 45,0400 2,27368 Т2-4 27 23,0648 4,57245 Т1 5 15,4000 6,82158 Т2-4 36 31,5694 3,88614 Т1 13 33,1185 5,68174 Т2-4 36 17,4169 2,49017 Т1 11 19,9136 3,83825 Т2-4 36 22,6406 3,42491 Т1 11 30,7755 4,87450 Т2-4 28 64,4986 5,90770 Т1 9 69,5000 8,49116 Т2-4 10 7,3200 1,03578 Т1 6 13,5833 3,13618 CD8+ среди (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ лимфоцитов Т2-4 >0,05 >0,05 0,006 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,038 86 При сопоставление опухолей Т1 с Т2-Т4 содержание различных субпопуляций лимфоцитов сохраняется та же тенденция, что и для сопоставлений Т1-Т2 с Т3-Т4 – более выраженная пропорция Т-хелперов CD4+ при более крупных опухолях (47% и 40% соответственно р=0,006). При опухолях малого размера отличается достоверно более высокий процент интратуморальных CD4+CD25+ клеток – 13,6% и 7,3% соответственно, р=0,038. Таблица 42 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от индекса N. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (сd3) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Индекс N Кол-во случаев N1-N3 16 Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего 5,9075 1,63376 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 22 19 29 19 27 3,2495 73,8574 80,3262 47,5789 49,6111 ,99746 3,46558 2,34944 3,46766 2,14859 N1-N3 14 47,9286 2,87355 N0 N1-N3 18 17 43,8611 45,3647 1,88269 3,60014 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 N1-N3 N0 27 14 17 13 19 22 27 20 27 20 27 6 10 6 10 45,7333 39,7357 42,1176 14,4538 26,9395 24,8382 37,8000 14,2415 20,7863 20,7330 27,3678 6,5000 11,5700 5,6000 9,6100 2,04197 3,28457 1,59674 5,04857 5,58718 4,05034 4,54036 2,37538 3,12376 5,03395 3,33672 ,97091 2,14492 ,79624 1,98637 P >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,038 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Количество HLA-DR позитивных лимфоцитов при опухолях с отсутствием регионарных метастазов (N0) было более высоким в сравнении с опухолями, при 87 которых имелись метастазы (N1-N3) – 38% и 25% соответственно, р=0,038. HLADR лимфоциты являются достаточно широкой группой и включают В-клетки, активированные Т-клетки и активированные NK-клетки. Судя по данным, представленным в таблице, все субпопуляции активированных (HLA-DRположительных) Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8) при отсутствии метастазов были повышены, что и нашло отражение в интегральных значениях HLA-DRположительных лимфоцитов. Таблица 43 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от степени злокачественности опухоли. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Степень злокач. Кол-во случаев II, III 36 4,4989 0,95706 I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I II, III I 2 44 4 42 4 30 2 40 4 40 4 30 2 45 4 43 4 43 4 14 2 14 2 2,0250 76,7125 89,3500 48,5024 51,6000 45,4667 48,2500 45,2925 48,5750 45,2925 48,5750 22,3717 14,3000 32,7987 22,7750 17,6130 22,1750 23,6858 33,7750 7,8500 22,4000 6,4929 19,4000 0,02500 2,11121 2,06982 2,00808 5,91876 1,69692 9,95000 1,88987 8,38156 1,88987 8,38156 4,25044 2,80000 3,38647 9,18054 2,19657 7,61746 3,05386 7,82990 ,90492 3,10000 ,75654 4,40000 P 0,014 0,001 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,000 0,000 88 Как видно, содержание целого ряда субпопуляций интратуморальных лимфоцитов было взаимосвязано со степенью злокачественности рака молочной железы. При II и III степенях злокачественности процент тумор- инфильтрирующих лимфоцитов в опухолях был достоверно выше, чем при опухолях I степени злокачественности – 4,5% и 2% соответственно, р=0,041. Что же касается пропорций зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), то она, напротив, снижалась при нарастании степени злокачественности: при II, III степени злокачественности – 76,7%, при I – 89,4%, р=0,001. Интересные данные получены по активированным CD3+HLA-DR+ и по CD4+HLA-DR+ клеткам: количество этих клеток при I степени злокачественности было достоверно более высоким (р=0,000). Однако, учитывая тот факт, что в группе сравнения больных с опухолями I степени злокачественности было всего две пациентки, потребуется дальнейшее накопление материала для подтверждения этих данных. 89 Таблица 44 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от степени злокачественности. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Степень злокач. Кол-во случ. III 10 7,6780 2,52513 I, II 28 3,1868 ,76568 III 12 79,4250 3,51197 I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II 36 12 34 10 22 10 34 9 22 9 23 13 36 12 35 12 35 3 13 3 13 77,2125 47,2167 49,3206 48,2300 44,4636 41,7500 46,7206 39,3333 41,7409 23,0000 21,4239 31,8615 32,0233 16,7483 18,4309 18,8833 26,4854 8,2333 10,0000 5,6000 8,6846 2,42308 3,07741 2,33356 3,76050 1,70782 3,42213 2,15467 2,95748 2,09811 9,75645 4,21409 6,41613 3,74434 6,15403 1,93636 7,13572 3,00048 3,57973 1,70640 1,90000 1,58028 P 0,025 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 При сопоставлении III степени злокачественности с I, II степенями по уровням интратуморальных лимфоцитов подтверждено, что у больных с опухолями III степени злокачественности количество этих клеток достоверно выше – 7,7% и 3,2% соответственно, р=0,025. 90 Таблица 45 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от стадии рака молочной железы. Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего 4,6675 1,06854 Показатель Стадия Кол-во случаев CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы Iб-III 32 Ia 6 2,7750 ,70637 CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia Iб-III Ia 38 9 37 8 29 3 35 8 28 3 29 3 39 9 38 8 38 8 10 5 10 5 75,7013 84,7222 49,9784 45,4125 45,8241 43,8667 43,6286 51,5375 40,7214 44,0333 22,3879 16,8333 29,7251 36,0622 17,9055 18,2313 22,1332 31,4412 7,2900 14,6400 6,4500 12,0400 2,33390 2,79676 2,16521 3,52199 1,79064 4,15786 1,99275 3,93037 1,87794 ,88192 4,30752 10,84087 3,43003 7,14909 2,47787 3,89518 3,18160 5,65095 1,03209 3,61643 1,03336 3,34568 CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ P >0,05 0,028 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,019 0,044 Наиболее важный вывод, вытекающий из этой таблицы, заключается в том, что содержание интратуморальных Т-клеток выше при I стадии рака молочной железы в сравнении со Iб-III стадиями – 84,7% и 75,7%, р=0,028. Кроме того, при Iа стадии отмечены более высокие уровни активированных Т-лимфоцитов и Тхелперов (CD3+ и CD4+) в сравнении с содержанием этих клеток при Iб-III стадиях, р=0,02 и р=0,04 соответственно. 91 Таблица 46 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от стадии рака молочной железы. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Стадия Кол-во случаев II-III 31 4,8123 1,09341 I II-III I II-III 7 37 10 36 2,4043 75,8203 83,3800 49,1944 ,70273 2,39474 2,83885 2,07517 I II-III I II-III I II-III I II-III I II-III I II-III I II-III I II-III I II-III I 9 28 4 34 9 27 4 28 4 38 10 37 9 37 9 10 5 10 5 49,0556 45,8393 44,2500 43,9618 49,4000 40,9926 41,3750 22,2304 19,3250 30,2771 33,3310 17,9976 17,8167 21,9908 30,9922 7,2900 14,6400 6,4500 12,0400 4,78746 1,85571 2,96493 2,02336 4,07233 1,92840 2,73050 4,46122 8,06044 3,47562 6,95321 2,54401 3,46015 3,26551 5,00386 1,03209 3,61643 1,03336 3,34568 P >0,05 0,068 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,019 0,044 Те же тенденции отмечены при сопоставлении I и II-III стадий: более высокое содержание CD3+ лимфоцитов при I стадии и достоверно более высокое содержание CD3+CD25+ и CD4+CD25+ клеток. 92 Таблица 47 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от стадии рака молочной железы. Показатель Стадия Кол-во случаев CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы IIб – III I - IIa 11 27 Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего 5,6318 1,77161 3,8541 1,06469 IIб – III 15 73,6793 3,48397 I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa 32 15 30 10 22 79,1863 51,6867 47,9067 51,4400 43,0045 2,45016 4,20509 1,92387 3,27255 1,65450 IIб – III 15 42,7933 4,17668 I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa IIб – III I - IIa 28 10 21 10 22 15 33 16 30 16 30 6 9 6 9 46,3357 37,3000 42,8238 15,3600 24,8250 26,7793 32,7924 14,0438 20,0520 17,2938 27,1963 6,3000 12,0333 5,8333 9,9667 1,71054 3,92830 1,62202 6,27466 5,03153 5,12208 3,83453 2,18293 3,02531 5,31105 3,18043 1,29974 2,26231 1,25238 2,09357 CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ P >0,05 >0,05 >0,05 0,016 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,055 При сопоставлении IIб-III стадий с более ранними стадиями оказалось, что при прогрессировании заболевания достоверно повышено количество Тхелперных лимфоцитов (CD4+) – 51% и 43%, р=0,016. При этом количество CD25+ субпопуляции этих клеток при стадиях I-IIа было также высоким, р=0,055. 93 Таблица 48 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от стадии рака молочной железы. Показатель Стадия CD45+ лимфоциты среди III ядросодержащих клеток (Syto16+) в I, II ткани молочной железы III CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) I, II III CD4+ среди Т-клеток (CD3+) I, II III CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) I, II Кол-во случаев Процент клеток Стд. ошибка P Среднее среднего 4 5,3225 2,96974 34 6 41 6 39 3 29 4,2565 79,7667 77,0866 61,0833 47,3333 55,4333 44,6276 ,97005 4,19767 2,24257 5,90443 1,84548 8,35550 1,56210 CD8+ среди Т-клеток (CD3+) III 6 40,6833 7,03910 I, II 37 45,8162 1,81243 CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) III 3 50,8667 3,16298 I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II III I, II 28 3 29 6 42 7 39 7 39 4 11 4 11 39,9893 31,3667 20,8845 29,8917 31,0593 13,7429 18,7195 19,0143 24,6023 6,0000 11,1000 5,3000 9,4091 1,75176 19,65726 4,03774 11,00459 3,21231 3,37320 2,44482 9,23323 2,94200 2,03265 1,93447 1,90657 1,73464 CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ >0,05 >0,05 0,01 0,056 >0,05 0,049 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 В сравнении с I, II стадиями, III стадия рака молочной железы характеризуется дальнейшим нарастанием содержания Т-хелперов (CD4+CD3+) (61% и 47%, р=0,01) и CD8+ клеток среди лимфоцитов (50,9% и 40%, р=0,049). Последнее, по-видимому, обусловлено NK-клетками, так как пропорции CD8+CD3+ клеток достоверно не увеличивается. 94 Таблица 49 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от индекса пролиферации Ki67 (15%). Показатель Ki67 CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток P Среднее Стд. ошибка среднего 27 5,1344 1,22027 11 2,4891 ,77280 >= 15,00 27 71,4352 2,74058 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 10 25 9 24 8 24 9 23 8 23 9 28 83,4900 49,0560 46,1778 45,7708 45,2500 43,6125 47,0000 38,8174 47,4375 19,2783 28,4833 27,0396 3,02308 2,41563 3,85075 1,70260 4,46402 2,24221 3,56121 1,92762 2,60267 4,61712 7,92373 3,93412 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 >= 15,00 < 15,00 10 26 9 26 9 3 1 3 1 22,5830 14,6100 17,8444 20,9881 26,3778 6,4667 6,3000 6,0667 6,2000 5,80936 3,12217 3,59054 4,11428 6,86939 ,43716 . ,83533 . CD45+ лимфоциты среди >= 15,00 ядросодержащих клеток (Syto16+) в < 15,00 ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) Кол-во случаев >0,05 0,019 >0,05 >0,05 >0,05 0,018 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Количество интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3+) было достоверно более высоким при опухолях с низким уровнем пролиферирующих клеток – 83% и 71%, р=0,019. Аналогичным образом, содержание CD8+ лимфоцитов было более высоким при низком уровне Ki67 клеток – 47,4% и 39%, р=0,018. 95 Таблица 50 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от индекса пролиферации Кi67 (сравнение группы 1 и 2) 1,00 11 2,00 27 Процент клеток Стд. ошибка P Среднее среднего 2,4891 ,77280 >0,05 5,1344 1,22027 1,00 2,00 1,00 CD4+ среди Т-клеток (CD3+) 2,00 1,00 CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) 2,00 1,00 CD8+ среди Т-клеток (CD3+) 2,00 CD8+ среди лимфоцитов 1,00 (CD45+) 2,00 1,00 CD3+HLA-DR+ 2,00 1,00 CD45+ HLADR+ 2,00 1,00 CD4+HLA-DR+ 2,00 1,00 CD8+HLA-DR+ 2,00 1,00 CD3+CD25+ 2,00 1,00 CD4+CD25+ 2,00 9 28 8 26 8 24 8 25 8 23 9 23 9 29 8 27 8 27 0a 4 0a 4 82,9000 72,0554 44,8250 49,3615 45,2500 45,7708 48,8000 43,1720 47,4375 38,8174 28,4833 19,2783 22,3144 26,9693 17,7125 14,7689 28,4500 20,5737 . 6,4250 . 6,1000 Кол-во случаев Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) Закономерности в таблице практически 3,31491 2,71273 4,08804 2,34089 4,46402 1,70260 3,48425 2,19530 2,60267 1,92762 7,92373 4,61712 6,48812 3,79669 4,06854 3,00850 7,42630 3,98059 . ,31192 . ,59161 соответствуют >0,05 0,02 >0,05 >0,05 0,018 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 таковым, отмеченным при пороговом уровне Ki67 в 15%. Вместе с тем, при сравнении этих групп выявились достоверные различия по CD4+ Т-лимфоцитам (CD3+) увеличенным в группе с высоким пролиферативным потенциалом – 45% и 49%, р=0,02. 96 Таблица 51 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от статуса рецепторов эстрогенов. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Статус рецепторов эстрогена Кол. случ Отриц. 13 7,9131 2,27914 Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. 25 16 32 17 29 13 19 2,5256 73,1100 80,0934 48,1176 49,1552 45,1000 46,0105 ,42254 3,02765 2,53002 2,64578 2,59870 2,64532 2,17623 Отриц. 15 44,1267 2,99434 Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. 29 12 19 12 20 18 31 18 29 17 30 5 11 5 11 46,3483 41,6500 40,6579 19,1792 23,4800 35,8594 29,7281 18,7283 17,5500 24,5271 24,5543 10,9400 9,0909 8,6800 7,8455 2,35993 2,92548 2,13820 6,85271 5,00475 6,07819 3,64477 4,26021 2,19638 6,08635 3,00865 1,38550 2,10754 1,36066 1,89499 P 0,004 0,085 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 В рецептор-положительной группе (по рецепторам эстрогенов) отмечена достоверно более низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами – 2,5% и 7,9% соответственно, р=0,004. Однако, уровни Т-клеток (CD3) в рецептор-позитивной группе были более высокими, различия близки к достоверным (р=0,085) 97 Таблица 52 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от рецепторов прогестерона в баллах. Показатель CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Статус рецепторов прогестерона Кол случ Отриц. 16 6,8406 1,93178 Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. 22 20 28 21 25 16 16 2,5709 75,8680 79,1211 49,0667 48,5240 46,2312 45,0500 ,46804 2,96433 2,72345 2,08769 3,04557 2,43409 2,31357 Отриц. 19 44,8158 2,62759 Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. Отриц. Полож. 25 15 16 15 17 22 27 21 26 21 26 6 10 6 10 46,1800 41,6467 40,4750 20,0133 23,5029 34,9091 29,5941 15,7624 19,8096 22,0695 26,5435 7,9000 10,7300 6,9500 8,8000 2,60531 2,35825 2,51829 6,22522 5,29297 5,39703 3,82821 3,56610 2,46665 5,04394 3,28943 ,88619 2,32174 ,78983 2,11576 P 0,018 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 В случаях положительных по экспрессии рецепторов прогестерона наблюдалось достоверно более низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами – 2,6% и 6,8%. 98 Таблица 53 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от статуса Her2/Neu в баллах. Показатель Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Her2Neu Кол-во случаев 1-3 13 4,6669 1,39585 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 25 16 32 15 31 12 20 4,2136 77,1531 78,0719 44,9867 50,6032 49,3500 43,4150 1,19722 3,79253 2,37786 3,38677 2,24125 2,83478 1,91449 1-3 14 44,9714 3,36276 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 1-3 0 30 11 20 11 21 16 33 15 32 15 32 4 12 4 12 45,8800 36,7364 43,4100 11,0909 27,5119 27,3881 34,2070 11,6820 20,9634 18,2687 27,4862 8,9000 9,9250 6,8500 8,5250 2,24580 2,90965 1,95556 2,88836 5,56162 4,86555 4,11769 2,36325 2,73745 4,46142 3,60660 1,93305 1,92815 ,85391 1,77794 CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ P >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,014 >0,05 0,014 >0,05 >0,05 >0,05 Данные, представленные в таблице 52, вызывают значительный интерес, так как впервые, в сравниваемых группах больных показывают достоверно более высокое содержание активированных Т-клеток в Her2/Neu-отрицательных (0 баллов) случаях (28% и 11%, р=0,014). Более того, продемонстрировано, что это обусловлено популяцией активированных CD4+ лимфоцитов, содержание которых в Her2/Neu-негативных случаях вдвое выше, чем при Her2/Neuпозитивных (21% и 12%, р=0,014). 99 Таблица 54 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от статуса Her2/Neu в баллах (0-1 против 23). Процент клеток Her2/Ne Кол-во u случаев Среднее 2-3 5 3,2680 ,73870 0-1 33 4,5355 1,04257 CD3+ среди лимфоцитов 2-3 7 73,5571 7,64064 (CD45++) 0-1 41 78,4841 1,98668 2-3 6 38,8500 7,28188 0-1 40 50,2600 1,81327 CD4+ среди лимфоцитов 2-3 4 50,8500 6,59274 (CD45+) 0-1 28 44,8964 1,65556 CD8+ 2-3 5 48,6000 8,40851 среди Т-клеток (CD3+) 0-1 39 45,2051 1,83473 CD8+ среди лимфоцитов 2-3 3 28,5667 6,21432 (CD45+) 0-1 28 42,3786 1,60683 2-3 4 11,8000 4,16193 0-1 28 23,3054 4,48164 2-3 6 32,5667 7,85997 0-1 43 31,8986 3,50856 2-3 5 13,0360 5,34914 0-1 42 18,5924 2,25753 2-3 5 31,9200 8,21720 0-1 42 23,6664 3,07629 2-3 2 10,7000 3,70000 0-1 14 9,5214 1,67221 2-3 2 7,6000 ,60000 0-1 14 8,1786 1,54266 Показатель CD45+ лимфоциты среди Стд. ошибка среднего ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной P >0,05 железы CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ >0,05 0,041 >0,05 >0,05 0,014 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 100 В группе пациенток со статусом Her2/Neu 2-3 балла отмечено достоверно более высокое содержание CD4+ Т-лимфоцитов (CD3+) в сравнении с больными с отрицательным статусом (0-1 баллов) – 50% и 39%, р=0,041. Отмечено также более высокое содержание CD8+ лимфоцитов при отрицательном статусе по Her2/Neu (0-1 баллов) – 42% и 29%, р=0,014. Последнее обусловлено, повидимому, NK-клетками, поэтому достоверное повышение CD3+CD8+ лимфоцитов не выявлено. Таблица 55 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от морфологии рака молочной железы. КолПоказатель во случ. CD45+ лимфоциты среди Процент клеток Среднее Стд. ошибка среднего дольковый 5 1,9360 ,66152 протоковый 27 4,9804 1,24907 CD3+ среди лимфоцитов дольковый 5 75,5520 5,78881 (CD45++) протоковый 36 78,7247 2,33923 дольковый 5 48,3200 2,92804 протоковый 34 48,7088 2,41231 CD4+ среди лимфоцитов дольковый 4 42,4500 ,89861 (CD45+) протоковый 22 45,9682 1,88714 CD8+ дольковый 5 43,3200 2,68689 среди Т-клеток (CD3+) протоковый 33 46,1273 2,17400 CD8+ среди лимфоцитов дольковый 4 43,8500 1,49136 (CD45+) протоковый 22 40,4136 2,21376 дольковый 4 15,0000 6,09111 протоковый 22 24,4523 5,01638 дольковый 5 21,2460 5,39903 протоковый 37 36,6962 3,85954 дольковый 5 9,2000 2,70370 ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной P 0,04 железы CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ CD4+HLA-DR+ >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,009 >0,05 >0,05 101 CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ протоковый 35 20,6337 2,49248 дольковый 5 11,6400 4,47243 протоковый 36 25,0747 3,22584 дольковый 1 6,3000 . протоковый 14 9,2214 1,54034 дольковый 1 6,2000 . протоковый 14 7,7500 1,44780 0,038 >0,05 >0,05 Чрезвычайно интересно, что проведя количественную оценку содержания интрамурольных лимфоцитов в зависимости от гистологического типа рака молочной железы, при сравнении инфильтративного долькового и инфильтративного протокового рака, нами выявлены достоверные различия. При инфильтративном протоковом раке выявлены достоверно более высокие уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами (р=0,04), активированными Т-клетками (р=0,009) и активированными Т-киллерами CD3+CD8+ (р=0,038). Таблица 56 — Сопоставление уровней интратуморальных лимфоцитов в зависимости от подтипа люминального рака. Процент клеток Стд. ошибка Среднее среднего Показатель люминальный Кол случ CD45+ лимфоциты среди ядросодержащих клеток (Syto16+) в ткани молочной железы CD3+ среди лимфоцитов (CD45++) А 9 10,5100 2,90345 В 23 2,1548 ,40879 А В А В А В А В А В А В А В 10 30 11 27 9 17 10 27 9 17 8 18 12 29 69,8500 81,1750 50,5364 47,6556 45,4444 45,4176 45,0900 46,1037 42,2333 40,2588 19,9875 24,3361 38,1808 33,3869 4,02018 2,44304 3,31691 2,76930 3,16676 1,89316 3,72822 2,35818 3,68770 2,21020 9,95928 4,68422 8,55014 3,78345 CD4+ среди Т-клеток (CD3+) CD4+ среди лимфоцитов (CD45+) CD8+ среди Т-клеток (CD3+) CD8+ среди лимфоцитов (CD45+) CD3+HLA-DR+ CD45+ HLADR+ P 0,026 0,016 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 102 CD4+HLA-DR+ CD8+HLA-DR+ CD3+CD25+ CD4+CD25+ Подтипы люминального инфильтрующим лимфоцитам. А В А В А В А В 12 27 12 28 3 11 3 11 рака Так, 20,4775 18,8685 26,0883 22,9582 9,0333 9,6636 7,4333 8,2273 достоверно при 5,74541 2,29353 8,41392 2,44749 1,31698 1,84771 1,54524 1,73871 различны люминальном А >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 по тумор- раке уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами были в 5 раз более высокими, чем при люминальном В (10,5% и 2,2%, р=0,026). Вместе с тем, люминальный подтип В характеризовался достоверно более высокой инфильтрацией опухоли Тлимфоцитами – 81% и 70%, р=0,016. Таким образом, уровни интратуморальных лимфоцитов имеют прямую взаимосвязь с клиническими, морфологическими и биологическими характеристиками опухоли. Как мы уже отмечали в предыдущих главах, уровни инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами и их субпопуляциями напрямую взаимосвязаны с экспрессией молекул HLA-I и II классов на опухолевых клетках. 103 ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Проведенная нами работа была направлена на дальнейший анализ клинического значения роли молекул HLAI и HLA II классов на клетках рака молочной железы. Исследование проведено у 58 женщин, проходивших обследование и лечение в ФГБНУ «РОНЦ имени Н.Н. Блохина». Все больные были прооперированы в отделении опухолей молочных желез (рук. проф. И.К. Воротников) в объеме радикальной резекцией или радикальной мастэктомии. Иммунологические исследования выполнены на материале удаленной опухоли методом проточной цитометрии. Метод проточной цитометрии оказался более чувствительным в выявлении экспрессии молекул HLA I и HLA II классов на клетках опухолей молочных желез в сравнении с методом люминисцентной микроскопии на криостатных срезах опухоли, использовавшихся ранее. Об этом свидетельствует частота выявления антигена методом проточной цитометрии. Поскольку ранее в люминисцентном методе были получены интересные и клинически значимые данные (Е.В. Артамонова, 2009), то первым вопросом, который встал перед нами, явился вопрос сопоставления наших данных с данными предшествующих исследований. Ответ на этот вопрос был получен нами при детальном анализе уровней флуорисцентного сигнала, позволяющем расценить опухолевую клетку как антигенпозитивную. Для HLA-I класса молекул таким уровнем явился уровень экспрессии антиген на лимфоцитах, так как молекулы HLA-I класса экспрессированы на всех лейкоцитах. Для HLA-DR уровень позитивного сигнала соответствовал уровню HLA-DR на В-лимфоцитах. Но даже при столь точном соотнесении экспрессии HLA-I и HLA-DR антигенов с экспрессией этих молекул на заведомо позитивных популяциях клеток, частота HLA-положительных опухолей, определяемая методом проточной цитометрии, была значительно выше, чем таковая, определяемая люминесцентной микроскопией. При ранних исследованиях на криостатных срезах отмечена высокая корреляция в экспрессии этих антигенов, оцененная при использовании таблицы сопряженности признаков. Подобное совпадение результатов, полученнных методом проточной 104 цитометрии, мы наблюдали при отнесении к антигенположительным случаям таковые с наличием более 70% HLA-позитивных клеток. Именно этот уровень использован в работе. Вместе с тем, тот факт, что данные получены количественным методом (проточная цитометрия) позволил оценить роль различных уровней экспрессии антигена при проведении клинических, морфологических и иммунологических сопоставлений. Начнем с достоверные иммунологических взаимосвязи данных. экспрессии Нами молекул установлены HLA с высоко уровнями интратуморальных лимфоцитов, в первую очередь, с активированными Тлимфоцитами и их субпопуляциями. Во-первых, необходимо отметить существование высоко достоверных корреляционных связей между различными типами интратуморальных лимфоцитов. Так, содержание Т-киллеров (CD8+CD3+) было достоверно взаимосвязано с содержанием HLA-DR-позитивных лимфоцитов и процентами активированных CD8+ лимфоцитов. Уровень активации зрелых CD3+ лимфоцитов (HLA-DR+) зависел от общего содержания HLA-DR+ лимфоцитов, CD8+HLA-DR+ клеток и CD4+HLA-DR+ клеток. Как и следовало ожидать, Тхелперы (CD4+CD3+) и Т-киллеры (CD8+CD3+) находились в реципрокных взаимоотношениях (отрицательная корреляция, R=-0,6, p=0,000). Экспрессия молекул HLA-I и HLA-DR по-разному отражалась на уровнях интратуморальных лимфоцитов и их субпопуляций. Наличие молекул HLA-I класса на опухоли было взаимосвязано с уровнем лимфоцитарной инфильтрации опухоли интратуморальными (CD4+CD3+), Т-клетками активированными (CD3+), Т-клетками уровнями Т-хелперов (CD3+HLA-DR+) и активированными Т-киллерами (CD8+HLA-DR+). Для оценки общего уровня лимфоцитарной инфильтрации опухоли нами применен особый методический прием, при котором количество CD45+ лимфоцитов выражали в виде пропорции, процента от всех ядросодержащих клеток в суспензии клеток, полученный из удаленной опухоли. Для подсчета 105 ядросодержащих клеток использовали нуклеотропный краситель Syto16. Такой подход применен нами впервые и позволил получить надежные результаты. Оказалось, что инфильтрации в случаях HLA-I-позитивных значительно выше, чем уровень лимфоцитарной случаях. HLA-I-негативных Это, несомненно, важно, так как по нашим данным значительную (доминирующую) долю среди интратуморальных лимфоцитов составляют зрелые Т-лимфоциты и их субпопуляции. Именно зрелые Т-клетки существенно повышены в случаях экспрессии молекул HLA-I класса на опухолевых клетках. Даже при пороговом уровне 20% антиген (HLA-I)-позитивных клеток пропорции CD3+ Т-клеток среди интратуморальных лимфоцитов была достоверно выше, чем в HLA-I-негативных случаях (р=0,014). Та же закономерность прослеживалась и при других уровнях HLA-I-положительных клеток. Следовательно, уровни Т-клеточной инфильтрации, а именно Т-лимфоциты, являющиеся наиболее убедительными эффекторами противоопухолевого иммунитета, напрямую зависят от наличия молекул гистосовместимости I-класса на клетках рака молочной железы. Это важное положение впервые доказано нами в работе с применением строго количественного подхода для оценки как Т-клеток, так и HLA-I-позитивных опухолевых клеток. Важно отметить, что не только уровни Т-лимфоцитов в опухолевой ткани, но и активация Т-клеток напрямую зависела от экспрессии HLA-I на опухоли. Так, содержание CD3+HLA-DR+ лимфоцитов было достоверно выше в случаях экспрессии молекул HLA-I класса. Из числа субпопуляций Т-лимфоцитов Т-хелперов (CD4+CD3+) в большей степени ассоциировались с HLA-I-положительным фенотипом, нежели Ткиллеры. Причем активация последних (CD8+HLA-DR+) была достоверно менее выраженной в HLA-I-позитивных опухолях. Вполне возможно. Что в данном случае повышение пропорции HLA-DR-позитивных CD8-лимфоцитов при высоких уровнях HLA-I-негативности обусловлено NK-клетками, реагирующими 106 на нарушения в экспрессии молекул гистосовместимости на клетках рака молочной железы. Иные взаимосвязи отмечены нами при анализе HLA-DR-позитивного рака молочной железы. Здесь на первое место выходят ассоциации HLA-DRпозитивного рака молочной железы с активированными лимфоцитами – CD3+HLA-DR+, CD4+HLA-DR, CD3+CD25+, CD4+CD25+. Таким образом, высказанные нами предположения о том, что экспрессия HLA-DR на опухолях молочных желез может быть отражением состояния активации, свойственного для опухолевых клеток и интратуморальных лимфоцитов, нельзя считать полностью исключительными. Популяции CD3+HLA-DR+лимфоцитов были достоверно повышены при значительной пропорции HLA-DR-негативных клеток (30% HLA-DR+), p=0,024. Уровни CD4+CD25+ и CD3+CD25+ клеток также были повышены в HLADR-позитивных случаях. Безусловно, мы до конца не можем исключить наличие супрессорных клеток. Среди CD4+CD25+ лимфоцитов, однако, отмечены достаточно низкие уровни CD25, что более соответствует активированным Тхелперам. Уровни экспрессии молекул HLA на клетках рака молочной железы были взаимосвязаны не только с интратуморальными лимфоцитами, но и нашли отражение в клинических и патоморфологических характеристиках опухолевого роста. С клинических пропорций нами не установлено взаимосвязей распространенности опухолевого процесса по стадиям, наличию метастазов, размерам опухоли с экспрессией молекул HLA-I класса. Вместе с тем, биологические и морфологические характеристики опухоли были связаны с экспрессией молекул HLA-I. Мы не наблюдали утраты экспрессии молекул HLA-I при карциноме in situ, а при инфильтративном дольковом и инфильтративном протоковом раке антиген был экспрессирован с высокой частотой. 107 Обычно утрату экспрессии молекул HLA-I класса связывают с опухолевой прогрессией, степенью анаплазии, большей агрессивностью в силу способности «уходить» от иммунной защиты организма из-за неспособности презентировать опухолеассоциированные антигены(пептиды) Т-киллеров. Наши результаты во многом согласуются с этой концепцией. Действительно, при раке молочной железы с высоким пролиферативным индексом отсутствие молекул HLA-I наблюдалось достоверно чаще, чем при опухолях с низким пролиферативным индексом. Определённая связь отмечена также со степенью злокачественности опухоли. Несомненно интересной является установленная нами связь утраты экспрессии HLA-I с рецепторным статусом рака: в опухолях позитивных по эстрогеновым рецепторам утрата антигена наблюдалась реже, чем в рецепторнегативных случаях. Особое значение уделено анализу взаимосвязей с туморинфильтрирующими лимфоцитами. С этой целью применен новый подход. Оценка процента лимфоцитов проводилась среди всех ядросодержащих клеток в опухоли. Процент интратуморальных лимфоцитов в HLA-I-негативных опухолях был достоверно ниже, чем в случаях экспрессии этих молекул. Это обусловлено тем, что практически все изученные субпопуляции клеток обнаруживались с большей частотой в опухолевой ткани в случаях экспрессии молекул гистосовместимости I-класса. Главными лимфоцитарными субпопуляциями, снижение которых отмечено при HLA-I+ фенотипе, явились зрелые Т-клетки CD3+CD4+. Важно, что не только общее количество Т-клеток снижалось, но и нарушалась их активация, уменьшалась субпопуляция CD3+HLA-DR+. А вот с цитотоксическими лимфоцитами CD8+CD45+ отмечена обратная ситуация. Их количество было повышено в HLA-I-негативных случаях. Казалось бы, это противоречит тому, что Т-цитотоксические лимфоциты, мишенью которых является комплекс HLA-I с опухолевым пептидом могут, напротив, накапливаться в случаях экспрессии молекул HLA-I-класса. Однако, по CD8+ Т-клеткам различий не было. И 108 выявленная особенность может быть объяснена только за счет NK-клеток, которые накапливаются в HLA-I-негативных опухолях и экспрессируют CD8/ Молекулы HLA-DR выявляются на опухолевых клетках со значительно меньшей частотой, чем молекулы HLA-I/ Их обнаружение было связано с целым рядом клинических и патоморфологических характеристик. Убедительно доказано, что экспрессия молекул HLA-DR на опухолевых клетках характерна для ранних стадий рака (I-IIа). Вполне, возможно, что эти опухоли характеризуются более быстрым ростом, так как средний максимальный размер опухолевого узла в HLA-DR+ случаях был достоверно большим (3,1 и 2,4 см, р=0,037). При HLA-DR-негативном раке молочной железы пролиферативный индекс опухолевых клеток был вдвое более высоким, чем при HLA-DR-позитивном – 27% и 13% соответственно, р=0,001. О большей агрессивности опухолей, утративших HLA-DR, свидетельствует и тот факт, что при III степени злокачественности данный феномен наблюдался в 100% случаев (р=0,005). Рецепторный статус опухоли, в данном случае – рецепторы прогестерона – также был ассоциирован с утратой HLA-DR. Частота HLA-DR случаев была достоверно выше у рецептор-негативных больных. Все сказанное свидетельсвует об особых свойствах опухолей молочных желез, выявленными на основании утраты экспрессии молекул гисто- совместимости I и II классов. Поскольку данные молекул в комплексы с антигенным пептидом на опухолевых клетках являются мишенью различных эффекторных Т-лимфоцитов (киллеров, хелперов и т.д.), мы оценили, насколько каждая из этих субпопуляций взаимосвязана с клиническим течением и патоморфологическими свойствами рака молочной железы. Именно эти субпопуляции могут контролировать рост опухоли, ее распространение, что может найти отражение во взаимосвязи со стадией, размером опухоли, наличием регионарных метастазов. 109 И данные предположение, действительно, оказалось справедливым. Уровни CD4-лимфоцитов, но не их субпопуляции CD4+CD25+, которая включает наряду с Т-хелперами и Т-регуляторные клетки, нарастали по мереувеличения размера опухоли, индекса рТ. При отсутствии метастазов рака молочной железы в регионарные лимфоузлы (N0) уровни активированных Т-клеток всех субпопуляций в первичной опухоли были достоверно более высокими, чем у больных с наличием метастазов (N1-N3). Суммарная популяция HLA-DR-CD45+ лимфоцитов при отсутствии метастазов была достоверно повышена. Данные взаимосвязи нашли отражение и при анализе интратуморальных лимфоцитов со стадией рака молочной железы. При I стадии в сравнении со II-III стадиями общее содержание интратуморальных Т-лимфоцитов и их активированных форм (CD3+CD25+ и CD4+CD25+) было более высоким, чем при поздних стадиях (р=0,002-0,014). По мере увеличения стадии рака молочной железы нарастает количество CD4+ Т-лимфоцитов в опухоли. Интересной особенностью III стадии рака явилось резкое возрастание CD8+CD45+ лимфоцитов. Наиболее вероятное объяснение этому феномену состоит в нарастании уровней NK-клеток по мере прогрессии опухоли. Такие показатели как степень злокачественности опухоли, ее пролиферативный индекс являются базисным морфологическим признаком, обязательными для клинического использования. Уровень интратуморального иммунного ответа при II-III степенях злокачественности был достоверно более высоким, чем при I степени. Вместе с тем пропорция Т-лимфоцитов, их активированных форм и субпопуляций снижалась. Это, неудивительно, ведь, как показали наши исследования, частота HLA-негативных случаев в этой группе достоверно выше. Аналогичным образом, снижалось содержание СВ3+ и CD8+ лимфоцитов при нарастании уровней пролиферативного индекса опухолевых клеток. 110 В группе больных, положительной по рецепторам эстрогенов и прогестерона, отмечена более низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами. Однако уровни Т-клеток (CD3) в рецептор-положительных случаях были более высокими, чем у рецептор-отрицательных больных, различия близки к достоверным (р=0,085). Проводя количественную оценку содержание интратуморальных лимфоцитов в зависимости от гистологического типа рака молочной железы, мы установили различия между инфильтративным дольковым и инфильтративным протоковым раками по уровням тумор-инфильтрующих лимфоцитов. При инфильтративном протоковом раке выявлены достоверно более высокие уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами, активированными Т-клетками (р=0,009) и активированными Т-киллерами (CD3+CD8+), р=0,038. Подтипы люминального рака также различались по уровням интратуморальных лимфоцитов. Так, при люминальном А подтипе инфильтрация опухоли лимфоцитами была в 5 раз более высокой, чем при люминальном В (10,5% и 2,2%, р=0,026). Вместе с тем люминальный В подтип характеризовался более высокой инфильтрацией опухоли Т-лимфоцитами (CD3+) – 81% и 70%, р=0,016. Таким образом, новые подтипы рака молочной железы характеризуются особенностями иммуннореактивности и выраженностью интратуморальных Тклеточной реакции. Совершенно новым в нашей работе при проведении количественных сопоставлений субпопуляций лимфоцитов с экспрессией рецептора Her2/Neu явилось обнаружение взаимосвязи рецептор-позитивного статуса с содержанием интратуморальных активированных Т-клеток. Наибольшие уровни этих клеток наблюдались в случаях полного отсутствия рецептора (0 баллов). Это было обусловлено популяцией активированных Т-хелперов (CD4+), содержание которых в Her2/Neu –негативных случаях было вдвое выше, чем в группе сравнения (1-3 балла): 21% и 12%, р=0,04. При отрицательном Her2/Neu статусе 111 (0-1 баллов) достоверно повышены уровни CD8+ лимфоцитов, что по-видимому, обусловлено NK-клетками. Полученные данные дают новую информацию к характеристике иммунореактивности особой группы Her2/Neu- негативного рака молочной железы. Подводя итог вышесказанному, можно отметить, что утрата экспрессивности молекул HLA на клетках рака молочной железы сопровождается изменениями иммунореактивности опухоли, взаимосвязано с ее биологическими и морфологическими характеристиками, а также рецепторными статусами. Субпопуляции лимфоцитов, ассоциированные с утратой экспрессии молекул HLA, находят отражение в клинических параметрах опухолевого роста – размере, стадии, наличии регионарных метастазов. Следовательно, оценка HLA-статуса опухолевых клеток является очень важным компонентом обследования больных раком молочной железы, так как может способствовать поиску индукторов экспрессии этих молекул, что, соответственно, может положительно сказаться на противоопухолевой иммунореактивности организма, будет способствовать более полному контролю опухолевого роста со стороны иммунной системы. 112 1. ВЫВОДЫ На основании экспрессии молекул HLA-I и II классов возможно выделение подтипов рака молочной железы, характеризующихся особой интратуморальной иммунореактивностью, патоморфологическими свойствами и клиническим течением. 2. Утрата экспрессии молекул HLA-I класса на клетках рака молочной железы характеризует группу опухолей со сниженной инфильтрацией опухоли лимфоцитами (процент CD45+ лимфоцитов среди всех ядросодержащих клеток опухолевой ткани), зрелыми Т-клетками (процент CD3 в пределах лимфоцитов CD45++), Т-хелперами (CD4+ в пределах зрелых CD3+ Т-лимфоцитов). При определенных уровнях экспрессии антигена отмечается прямая взаимосвязь с активацией Т-клеток (CD3+HLA-DR+) и обратная - с уровнями активированных цитотоксических лимфоцитов (CD8+HLA-DR+). 3. HLA-DR-позитивный иммунофенотип рака молочной железы сопровождается достоверно более выраженной Т-клеточной инфильтрацией (CD45+CD3+), инфильтрацией активированными Т-клетками (CD3+HLA-DR+ и CD3+CD25+), а также активированными Т-хелперными клетками (CD4+HLADR+ и CD4+CD25+). 4. Патоморфологическими особенностями HLA-I-негативной группы рака молочной железы являются отсутствие утраты антигена при раке in situ, а также при II степени злокачественности опухоли; более редкая утрата антигена при низком пролиферативном индексе опухоли и в случаях, положительных по экспрессии рецепторов эстрогенов. 5. Экспрессия HLA-DR на опухолевых клетках характерна для ранних стадий (I, IIa) рака молочной железы и не наблюдается при IIб-IIIa стадиях (р=0,031), вместе с тем, максимальный средний размер опухолевого узла в HLA-DRпозитивных случаях рака молочной железы выше, чем в HLA-DR-негативных случаях (3,1 и 2,4 см, р=0,037). 6. При нарастании степени злокачнственности рака молочной железы от I к III доля HLA-DR-негативных случаев увеличивается от 25% до 100% (р=0,005). 113 7. Экспрессия молекул HLA-DR на клетках рака молочной железы не характерна для опухолей с высоким пролиферативным индексом (р=0,001). Средние уровни Ki-67-позитивных клеток достоверно выше при HLA-DRнегативных опухолях в сравнении с HLA-DR-позитивными (26,6% и 12,5%, р=0,000). 8. Экспрессия HLA-DR на клетках рака молочной железы взаимосвязана со статусом рецепторов прогестерона: частота HLA-DR-отрицательных случаев достоверно выше в рецептор-негативных случаях, р=0,043. 9. Уровни CD4+ лимфоцитов нарастают по мере увеличения размера опухоли (индекс Т), р=0,006. Вместе с тем, содержание интратуморальных CD4+ CD25+ лимфоцитов является максимальным при опухолях малого размера (Т1), р=0,038. 10. При отсутствии метастазов рака молочной железы в регионарных лимфатических узлах (N0) отмечаются более высокое содержание активированных (HLA-DR+) интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), что отражается на более высоких уровнях HLA-DR+CD45+ лимфоцитов у больных с отсутствием метастазов (N0) в сравнении с больными, у которых метастазы обнаружены (N1-N3), р=0,038. 11. При II и III степенях злокачественности рака молочной железы процент тумор-инфильтрирующих лимфоцитов был достоверно выше, чем при опухолях I степени злокачественности (р=0,041), вместе с тем пропорция зрелых Тлимфоцитов (CD3), а также активированных CD3+HLA-DR+ и по CD4+HLA-DR+ клеток была достоверно более низкой. 12. Содержание интратуморальных, а также активированных Т-клеток (CD3) и Т-хелперов (CD4) выше при I стадии рака молочной железы в сравнении со II-III стадиями (р=0,028 – 0,04). При IIб-III стадиях достоверно повышено количество Т-хелперных лимфоцитов (CD3+CD4+), р=0,016. При III стадии рака молочной железы повышены CD8+CD45+ лимфоцитов (р=0,049). 13. Количество интратуморальных CD3+ Т-лимфоцитов и CD8+ клеток было достоверно выскоким при опухоляхз с низким уровнем Ki67+ пролиферирующих 114 клеток. Количество интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3+) было достоверно более высоким при опухолях с низким уровнем пролиферирующих клеток – 83% и 71%, р=0,019. В рецептор-положительной группе (по рецепторам эстрогенов, прогестерона) отмечена достоверно более низкая инфильтрация опухоли лимфоцитами (р=0,004). 14. Достоверно более высокое содержание активированных Т-клеток и активированных CD4+ лимфоцитов отмечено в Her2/Neu-отрицательных (0 баллов) случаях (р=0,014). При статусе Her2/Neu 2-3 балла отмечено достоверно более высокое содержание CD4+CD3+ Т-лимфоцитов в сравнении с больными с отрицательным статусом (0-1 баллов), р=0,041. При отрицательном статусе по Her2/Neu (0-1 баллов) достоверно повышены CD8+ лимфоциты, р=0,014. 15. При инфильтративном протоковом раке выявлены достоверно более высокие уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами (р=0,04), активированными Т-клетками (р=0,009) и активированными Т-киллерами CD3+CD8+ (р=0,038). 16. Подтипы люминального рака достоверно различаются по уровням тумор- инфильтрующих лимфоцитов. При люминальном А раке уровни инфильтрации опухоли лимфоцитами были в 5 раз более высокими, чем при люминальном В (10,5% и 2,2%, р=0,026). Вместе с тем, люминальный подтип В характеризовался достоверно более высокой инфильтрацией опухоли Т-лимфоцитами – 81% и 70%, р=0,016. 115 ЛИТЕРАТУРА 1. Артамонова, Е.В. Иммунологическая микрогетерогенность рака молочной железы./ Е.В. Артамонова // Автореф. дисс. канд. мед наук, Москва, Онкологический научный центр РАМН. — 1992.- 28 с. 2. Артамонова, Е.В. Роль иммунофенотипирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы/ Е.В. Артамонова// Иммунология. — 2009. — Том 6. —№1. — С.8-51. 3. Барышников, А.Ю. Стандартизация моноклональных антител ИКО-1 против мономорфных 1a-подобных (DR) антигенов / А.Ю. Барышников, Н.Г. Блохина, З.Г. Кадагидзе [и др.] // Эксперим. Онкология. — 1987. — Т.9. — №6. — C.45-48. 4. Барышников, А.Ю. Моноклональные антитела ИКО-53 против мономорфных HLA-антигенов I класса / А.Ю. Барышников, З.Г. Кадагидзе, О.В. Короткова О.В. [и др.] // Вестник РОНЦ имени Н.Н. Блохина. — 1991. — №1. — С.9-11. 5. Барышников, А.Ю. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике/ А.Ю. Барышников, А.Г. Тоневицкий. – М.: типография ВНИТЦ, 1997.— С.99-105. 6. Огнерубов, Н.А. Неоадъювантная терапия местнораспространенного рака молочной железы/ Н.А. Огнерубов. — Автореф. дисс. докт.мед.наук . — М.1992 7. Тупицын, Н.Н. Экспрессия лейкоцитарных и родственных антигенов на клетках рака молочной железы человека/ Н.Н. Тупицын, З.Г. Кадагидзе, Н.Г. Блохина [и др.] // Эксперим. онкология. — 1990. — Т.12. — №2. — C.54-58. 8. Algarra, I Altered MHC class I antigens in tumors/ I. Algarra, A. Collado, F. Garrido// Int J Clin Lab Res 1997. — №27. — Р. 95-102. 9. Altman, J.D. Phenotypic analysis of antigen— specific T lymphocytes/ J.D. Altman, P.A. Moss, P.J. Goulder, D.H. Barouch [et al.] // Science 1996.—№274. — Р. 94–96. 116 10.Aptsiauri, N. Role of altered expression of HLA class I molecules in cancer progression/ N. Aptsiauri, T. Cabrera, R. Mendez, A. Garcia— Lor [et al.] // Adv Exp Med Biol. — 2007. — Vol. 601. — P. 123-131. 11.Barak, V. Changes in cytokine production of breast cancer patients treated with interferons / V. Barak, I. Kalickman, B. Nisman, H. Farbstein [et al.] // Cytokine. — 1998. —Vol.10. —977-983. 12.Barnstable, C. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens — new tools for genetic analysis / C. Barnstable, W. Bodmer, G. Brown. // Cell. — 1978. — Vol.14. — №1. —Р.9-20. 13.Bartek, J. HLA— DR antigens on differentiating human mammary gland epithelium and breast tumours/ J. Bartek, M. Petrek, B. Vojtesek [et al.] // Br. J. Cancer. — 1987. –Vol.56. –P.727-733 14.Bennink, JR. Identification of human cancers deficient in antigen processing / JR. Bennink// J Exp Med. — 1993. —Vol.177. — P.265-72. 15.Bernard, D.J. Presence of HLA— D/DR antigens on the mambrate of breast tumour cells/ D. Bernard, J.C. Maurizis, F. Ruse [et al.].//Clin. Exp. Immunol. — 1984. —Vol. 56. — P.215-221 16.Bernard, D.J. Effect of epidermal growth factor in HLA class I and class II transcription and protein expression in human breast adenocarcinoma cell lines / D.J. Bernard, F. Courjal, J.C. Maurizis [et al.] //. Br. J. Cancer. — 1992. — Vol.66. — №1. — P.88-92. 17.Boomsma, M.F. Breast cancer surgery— induced immunomodulation / M.F. Boomsma, B. Garssen, E. Slot, M. Berbee, J. Berkhof [et al.] // J Surg Oncol. — 2010. —Vol.102. — №6. —Р. 640— 8. 18.Brossart, P. Identification of HLA— A2— restricted T— cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies / P. Brossart, K.S. Heinrich, G. Stuhler [et al.]. //Blood. — 1999. — Vol.93. — №12. — P.4309— 4317. 117 19.Brunner, C.A. Expression of HLA— D subloci DR and DQ by breast carcinomas is correlated with distinct parameters of favourable prognosis / C.A. Brunner, G.M. Gokel, G. Riethmuller. [et al.]. // Eur. J. Cancer. — 1991. — Vol.27. —№4. —P.411-416. 20.Buzzi, F. Combination of beta— interferon and tamoxifen as a new way to overcome clinical resistance to tamoxifen in advanced breast cancer / F. Buzzi, M. Brugia, G. Rossi, L. Giustini [et al.] // Anticancer Res. — 1992. —№.12. — P.869-871. 21.Buzzi, F. Natural interferon— beta and tamoxifen in hormone— resistant patients with advanced breast cancer / F. Buzzi, M. Brugia, F. Trippa, G. Rossi [et al.] // Anticancer Res. — 1995. —№15. —P.2187-2190. 22.Cabrera, T. High frequency of altered HLA class I phenotypes in invasive breast carcinomas / T. Cabrera, M. Angustias Fernandez, A. Sierra, A. Garrido [et al.] // Hum Immunol. — 1996. —№50. —Р.127-134. 23.Cabrera, T. Analysis of HLA expression in human tumor tissues / T. Cabrera, M.A. Lоpez— Nevot, JJ. Gaforio, F. Ruiz— Cabello [et al.] // Cancer Immunol Immunother. — 2003. —№ 52.—Р.1-9. 24.Cabrera, T. Analysis of HLA class I alterations in tumors: choosing a strategy based on known patterns of underlying molecular mechanisms / T. Cabrera, I. Maleno, A. Collado, M.A. Lopez Nevot [et al.] // Tissue Antigens. — 2007. — №69(Suppl 1). — Р.264-268. 25.Campoli, M. HLA antigen changes in malignant cells: epigenetic mechanismsm and biologic significance / M. Campoli, S. Ferrone.//Oncogene. — 2008. – Vol.27. —№45. –P.5869-5885 26.Chames, P. Direct selection of a human antibody fragment directed against the tumor T— cell epitope HLA— A1— MAGE— A1 from a nonimmunized phage— Fab library / P. Chames, SE. Hufton, PG. Coulie, B. Uchanska— Ziegler [et al.]// Proc Natl Acad Sci USA. — 2000. —№97. —Р. 7969–74. 118 27.Chapatte, L. Final antigenic Melan— A peptides produced directly by the proteasomes are preferentially selected for presentation by HLA— A*0201 in melanoma cells / L. Chapatte, C. Servis, D. Valmori, O.J. Burlet— Schiltz [et al.] // Immunol. — 2004.—№173.—Р.6033-40. 28.Conha, A. Can the HLA phenotype be used as a prognostic factor in breast carcinomas / A. Conha, T. Cabrera, F. Ruiz— Cabello, F. Garrido // Int. J. Cancer. –1991. — Vol.6. — P.146-154. 29.Conha, A. Different patterns of HLA— DR antigen expression in normal epithelium, hyperplastic and neoplastic malignant lesions of the breast / A. Conha, F. Ruiz— Cabello, T. Cabrera [et al.] // Eur. J. Immunogenet. —1995. — Vol.22. — №4. — P.299-310. 30.Collins, T. Recombinant human tumor necrosis factor increases mRNA levels and surface expression of HLA— A, B antigens in vascular endothelial cells and dermal fibroblasts in vitro / T. Collins, L.A. Lapierre, W. Fiers [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. –Vol.83. —P.446-450 31.Cordon— Cardo, C. Expression of HLA— A,B,C antigens on primary and metastatic tumor cell populations of human carcinomas / C. Cordon— Cardo, Z. Fuks, M. Drobnjak, C. Moreno [et al.] // Cancer Res. — 1991. —Vol. 51. — P.6372-6380. 32.Daar, A.S. The detailed distribution of HLA— A, B, C antigens in normal human organs/ A.S. Daar, S.V. Fuggle, J.W. Fabre [et al.] // Transplantation. — 1984. – Vol.38. —P.287-292. 33.de Haard, H.J. A large nonimmunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies / H.J. de Haard, N. van Neer, A. Reurs, SE. Hufton [et al.] // J Biol Chem. — 1999. — Vol.274. —P.18218–30. 34.de Kruijf , E.M. HLA— E and HLA— G expression in classical HLA class I— negative tumors is of prognostic value for clinical outcome of early breast cancer 119 patients / E.M. de Kruijf , A. Sajet, JG. van Nes, R. Natanov [et al.] // J Immunol. — 2010. —№185. —P.7452— 7459. 35.de Kruijf, E.M. The predictive value of HLA class I tumor cell expression and presence of intratumoral Tregs for chemotherapy in patients with early breast cancer / E.M. de Kruijf, JG. van Nes, A. Sajet, QR. Tummers [et al.] // Clin Cancer Res. — 2010. — №16. —Р.1272— 80. 36.Denkberg, G. Direct visualization of distinct T cell epitopes derived from a melanoma tumor— associated antigen by using human recombinant antibodies with MHC— restricted T cell receptor— like specificity / G. Denkberg, CJ. Cohen, A. Lev, P. Chames [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. — 2002.—№99— Р.9421–6. 37.Engelhard, VH. Insights into antigen processing gained by direct analysis of the naturally processed class I MHC associated peptide repertoire / VH. Engelhard, AG. Brickner, AL. Zarling // Mol Immunol.—2002.—№39.—Р.127–37. 38.Ericsson, C. Association of HLA class I and class II antigen expression and mortality in uveal melanoma / C. Ericsson, S. Seregard, A. Bartolazzi, E. Levitskaya [et al.] // Invest Ophthalmol Vis Sci.—2001.—№42.—Р.2153–6. 39.Eyal, A. Variation of HLA— ABC surface antigen expression on adenocarcinoma of the colon in correlation with the degree of differentiation / A. Eyal, I. Levin, S. Segal // Nat Immun Cell Growth Regul—1990.— №9—Р.222227 40.Garrido, F. Natural history of HLA expression during tumour development / F. Garrido, T. Cabrera, A. Concha, S. Glew [et al.] // Immunol Today.—1993.— №14.—Р.491-499. 41.Garrido, F. HLA and cancer: 12th International Histocompatibility Workshop study. Genetic diversity of HLA functional and medical implications / F. Garrido, T. Cabrera, RS. Accolla, JC. Bensa [et al.] // Charron D, editor. Histocompatibility 1997. Paris, Medical and Scientific International Publisher, 1997. 120 42.Garrido, F. Implications for immunosurveillance of altered HLA class I phenotypes in human tumours / F. Garrido, F. Ruiz— Cabello, T. Cabrera, JJ. Perez— Villar [et al.] // Immunol Today.—1997.— №18—Р.89-95. 43.Goepel, JR. Loss of monomorphic and polymorphic HLA antigens in metastatic breast and colon carcinoma / JR. Goepel, RC. Rees, K. Rogers, CJ. Stoddard [et al.] // Br J Cancer.—1991.—№64—Р.880-3. 44.Gudmundsdоttir, I. Altered expression of HLA class I antigens in breast cancer: association with prognosis / I. Gudmundsdоttir, J. Gunnlaugur Jоnasson, H. Sigurdsson, K. Olafsdоttir [et al.] // Int J Cancer.—2000.—№89.—Р.500-5. 45.Hammerling, G.J. The influence of major histocompatibility complex class I antigens on tumor growth and metastasis / G.J Hammerling, D. Klar, F. Pulm, F.Momburg [et al.] // Biochimica et biophysica acta1.— 1987. — Vol.907. – P.245-259 46.Heron, I. Enchanced expression of 2— microglobulin and HLA— antigens on human lymphoid cells by interferon /I. Heron, M. Hokland, K. Berg //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1978. –Vol.75. –P.6215-6219 47.Hasebe, T. Histopathologic factors significantly associated with initial organ— specific metastasis by invasive ductal carcinoma of the breast: a prospective study / T. Hasebe, S. Imoto, T. Yokose, G. Ishii [et al.] // Hum Pathol.—2008.— №39.— Р.681–93. 48.Held, G. Dissecting cytotoxic T cell responses towards the NY— ESO— 1 protein by peptide/MHC— specific antibody fragments / G.Held, M. Matsuo, M. Epel, S. Gnjatic [et al.] // Eur J Immunol.—2004.—№34.—Р.2919–29. 49.Held, G. MHC— peptide— specific antibodies reveal inefficient presentation of an HLA— A*0201— restricted. Melan— A— derived peptide after active intracellular processing / G. Held, A. Wadle, N. Dauth, G. Stewart— Jones [et al.] // Eur J Immunol.—2007.—№37.—Р.2008–17. 50.Henderikx, P. Human single— chain Fv antibodies to MUC1 core peptide selected from phage display libraries recognize unique epitopes and 121 predominantly bind adenocarcinoma / P. Henderikx, M. Kandilogiannaki, C. Petrarca, S. von Mensdorff— Pouilly [et al.] // Cancer Res.—1998.—№58.— Р.4324–32. 51.Hicklin, DJ. b2— Microglobulin mutations. HLA class I antigen loss, and tumor progression in melanoma / DJ. Hicklin, Z. Wang, F. Arienti, L. Rivoltini [et al.] // J Clin Invest.—1998.—№101.—Р.2720–9. 52.Hicklin, DJ. HLA class I antigen downregulation in human cancers: T— cell immunotherapy revives an old story / DJ. Hicklin, FM. Marincola, S. Ferrone // Mol Med Today.—1999.—№5.—Р.178— 186. 53.Jabrane— Ferrat, N. Effect of gamma interferon on HLA class I and II transcription and protein expression in human breast adenocarcinoma cell lines / N. Jabrane— Ferrat, A. Faille, P. Loiseau // Int. J. Cancer.—1990.—Vol.45, №6.—Р.1169— 1176. 54.Ishigami, S. HLA— class I expression in gastric cancer / S. Ishigami, S. Natsugoe, A. Nakajo, T. Arigami [et al.] // T J Surg Oncol.—2008.—№97.— Р.605— 608. 55.Kaklamanis, L. Loss of transporter in antigen processing 1 transport protein and major histocompatibility complex class I molecules in metastatic versus primary breast cancer / L. Kaklamanis, R. Leek, M. Koukourakis, KC. Gatter [et al.] // Cancer Res.—1995.—№55.—Р.5191–4. 56.Kaneko, K. Clinical implication of HLA class I expression in breast cancer / K. Kaneko, S. Ishigami, Y. Kijima // BMC cancer. — 2011. –Vol.11. –P.454-459 57.Klareskog, L. Hormanal regulation of the expression of Ia antigens on mammary gland epithelium /L. Klareskog, U. Forsum, P.A. Peterson // Eur. J. Immunol. – 1980. — Vol.10. – P.958-963 58.Klein, T. Correlation between tumour and serum beta 2m expression in patients with breast cancer / T. Klein, I. Levin, A. Niska, R. Koren [et al.] // Eur J Immunogenet.—1996.—Vol.23.—P.417–23. 122 59.Kikuchi, E. HLA class I antigen expression is associated with a favorable prognosis in early stage non— small cell lung cancer / E. Kikuchi, K. Yamazaki, T. Torigoe, Y. Cho [et al.] // Cancer Sci.—2007.—Vol.98.—P.1424— 1430. 60.Kitamura, H. Downregulation of HLA class I antigen is an independent prognostic factor for clear cell renal cell carcinoma / H. Kitamura, I. Honma, T. Torigoe, H. Asanuma [et al.] // J Urol.—2007.—Vol.177.—P.1269— 1272. 61.Koretz, K. Correlation of HLA— d/Ii antigen expression in breast carcinoma with local lymphohistiocytic infiltration reveals considerable dysregulation in a subset of tumors / K. Koretz, G. Moldenhauer, O. Majdic, P. Moller // Int. J. Cancer.— 1989.—Vol.44.—№5.—P.816— 822. 62.Korkolopoulou, P. Loss of antigen— presenting molecules (MHC class I and TAP— 1) in lung cancer / P. Korkolopoulou, L. Kaklamanis, F. Pezzella, AL. Harris // Br J Cancer.—1996.—№73.—Р.148–53. 63.Kornek, G. Effect of interferon alpha— 2a on hormone receptor status in patients with advanced breast cancer / G. Kornek, A. Reiner, P. Sagaster, M. Stierer [et al.] // Cancer Invest.—1999.—№17.—Р.189–194. 64.Lavado— Valenzuela, R. MHC class I chain— related gene A transmembrane polymorphism in Spanish women with breast cancer / R. Lavado— Valenzuela, M. Benavides, F. Carabantes, A. Alonso [et al.] // Tissue Antigens.—2009.— №74.—Р.46-9. 65.Levin, I. Expression of class I histocompatibility antigens in transitional cell carcinoma of the urinary bladder in relation to survival / I. Levin, T. Klein, J. Goldstein, O. Kuperman [et al.] // Cancer.—1991.— №68.—Р.2591— 2594. 66.Leth— Larsen, R. Metastasis— related plasma membrane proteins of human breast cancer cells identified by comparative quantitative mass spectrometry / R. Leth— Larsen, R. Lund, H.V. Hansen //Molecula and cellular proteomics. — 2009. –Vol.8. –P.1436— 1449. 123 67.Lopez, D. Selective involvement of proteasomes and cysteine proteases in MHC class I antigen presentation / D. Lopez, M. Del Val // J Immunol.—1997.— Vol.159.—P.5769–72. 68.Lucin, K. Prognostic significance of T— cell infiltrates, expression of beta 2— microglobulin and HLA— DR antigens in breast carcinoma / K. Lucin, Z. Iternicka, N. Jonjic// Pathol. Res. Pract..—1994.—Vol.190.—№12.—Р.1134— 1140. 69.Macheledt, JE. Phase II evaluation of interferon added to tamoxifen in the treatment of metastatic breast cancer / JE. Macheledt, AU. Buzdar, GN. Hortobagyi, DK. Frye [et al.] // Breast Cancer Res Treat.—1991.—№18.— Р.165–170. 70.Madjd, Z. Total loss of MHC class I is an independent indicator of good prognosis in breast cancer / Z. Madjd, I. Spendlove, S.E. Pinder //Int. J.Cancer. — 2005. –Vol.117. –P.248-255 71.Maiorana, A. Expression of MHC class I and class II antigens in primary breast carcinomas and synchronous nodal metastases / A. Maiorana, A.M. Cesinaro, R.A. Fano // Clin. Exp. Metastasis.—1995.—Vol.13.—№1.—Р.43— 48. 72.Marincola, F.M. Escape of human solid tumors from T— cell recognition: molecular mechanisms and functional significance / F.M. Marincola, E.M. Jaffee, DJ.Hicklin, S. Ferrone // Adv Immunol.—2000.—Vol.74.—P.181— 273. 73.Menon, AG. Downregulation of HLA— A expression correlates with a better prognosis in colorectal cancer patients / AG. Menon, H. Morreau, RA. Tollenaar, E. Alphenaar [et al.] // Lab Invest.—2002.—Vol.82.—P.1725–33. 74.Miglietta, L. Tamoxifen and alpha interferon in advanced breast cancer / L. Miglietta, L. Repetto, G. Gardin, D. Amoroso [et al.] // J Chemother.—1991.— Vol.3.—P.383–386. 75.Mizukami, Y. Downregulation of HLA Class I molecules in the tumour is associated with a poor prognosis in patients with oesophageal squamous cell 124 carcinoma / Y. Mizukami, K. Kono, T. Maruyama, M. Watanabe [et al.] Br J Cancer.—2008.—Vol.99.—P.1462— 1467. 76.Mohammed, RA. Improved methods of detection of lymphovascular invasion demonstrate that it is the predominant method of vascular invasion in breast cancer and has important clinical consequences / RA. Mohammed, SG. Martin, MS. Gill, AR. Green [et al.] // J Surg Pathol.—2007.—Vol.31.—P.1825–33. 77.Moller, P. Expression of HLA— A, — B, — C, — DR, — DP, — DQ and HLA— D— associated invariant chain (Ii) in non— neoplastic mammary epithelium, fibroadenoma, adenoma and carcinoma of the breast / P. Moller, T. Mattfeldt, C. Gross // American Journal of Pathology. — 1989. –Vol.135. – P.73— 83 78.Nagorsen, D. HLA typing demands for peptide— based anti— cancer vaccine / D. Nagorsen, E. Thiel // Cancer Immunol Immunother 2008, 57:1903— 1910. 79.Newman, R.A. The presence of HLA— DR antigens on lactating human breast epithelium and milk fat globule mambranes / R.A. Newman, R.G. Ormerod, M.F. Greaves //Clin. Exp. Immunol. — 1980. –Vol.41. –P.478— 486 80.Nicolini, A. Immune Manipulation of Advanced Breast Cancer: An Interpretative Model of the Relationship Between Immune System and Tumor Cell Biology / A. Nicolini, A. Carpi // Medicinal Research Reviews.—2009.—Vol. 29.—No. 3.— P.436-471 81.Nicolini, A. Advanced breast cancer: An update and controversies on diagnosis and therapy/ A. Nicolini, A. Carpi// Biomed Pharmacother.—2003.—Vol.57.— P.439–446. 82.Nomura, T. Beta2— microglobulin promotes the growth of human renal cell carcinoma through the activation of the protein kinase A, cyclic AMP— responsive elementbinding protein, and vascular endothelial growth factor axis / T. Nomura, WC. Huang, HE. Zhau, D. Wu [et al.] // Clin Cancer Res.—2006.— Vol.12.—P.7294–305. 125 83.Olivotto, IA. Long— term survival of patients with supraclavicular metastases at diagnosis of breast cancer / IA. Olivotto, B. Chua, SJ. Allan, CH. Speers [et al.] // J Clin Oncol.—2003.—Vol.21.—P.851–854. 84.Ozzello, L. Cellular events accompanying regression of skin recurrences of breast carcinomas treated with intralesional injections of natural interferons alpha and gamma / L. Ozzello, DV. Habif, CM. De Rosa, K. Cantell [et al.] // Cancer Res.—1992.—Vol.52.—P.4571–4581. 85.Palmisano, GL. Analysis of HLA— G expression in breast cancer tissues / GL. Palmisano, MP. Pistillo, P. Fardin, P. Capanni [et al.] // Hum Immunol 2002;63:969–76. 86.Palmisano GL, Pistillo MP, Capanni P, Pera C, Nicolо G, Salvi S, et al. Investigation of HLA class I downregulation in breast cancer by RT— PCR. Hum Immunol 2001;62:133–9. 87.Pedersen, LO. The interaction between beta 2— microglobulin (beta 2m) and purified class— I major histocompatibility (MHC) antigen / LO. Pedersen, AS. Hansen, AC. Olsen, J. Gerwien [et al.] // Scand J Immunol 1994;39:64–72. 88.Peretz, M. Heterogeneity of the expression of class I and II HLA antigens in human breast carcinoma/ M. Peretz, T. Cabrera, M.A. Lopez Nevot [et al.] // J.Immunogenetics. — 1986. –V.13. –P.247— 253 89.Peretz, T. Combination of interferon and tamoxifen for patients with advanced breast cancer and negative oestrogen receptors/ T. Peretz, A. Kaplan— DeNour, L. Baider, A. Hubert [et al.] // Breast.—1997.—Vol.6.—P.190–193. 90.Petersen, B.L. Expression of beta 2— microglobulin by premalignant epithelium/ B.L. Petersen, C.L. Petersen, O. Braendstrup, S. Mouritsen [et al.]// APMIS.— 1993.—Vol.101.—P.529— 536. 91.Pistillo, M.P. Biochemical analysis of HLA class I subunits expression in breast cancer tissues/ M.P. Pistillo, G. Nicolо, S. Salvi, P. Capanni [et al.] // Hum Immunol.—2000.—Vol.61.—P.397–407. 126 92.Ramal, L.M. Molecular strategies to define HLA haplotype loss in microdissected tumor cells/ L.M. Ramal, I. Maleno, T. Cabrera, A. Collado [et al.] // Hum Immunol.—2000.—Vol.61.—P.1001–12. 93.Redondo, M. Major histocompatibility complex status in breast carcinogenesis and relationship to apoptosis / M. Redondo, J. Garcoa, E. Villar, I. Rodrigo [et al.] // Hum Pathol.—2003.—Vol.34.—P.1283–9. 94.Recchia, F. Minimal residual disease in metastatic breast cancer: Treatment with IFN— beta, retinoids, and tamoxifen / F. Recchia, L. Frati, S. Rea, P.J. Torchio [et al.] // Interferon Cytokine Res.—1998.—Vol.18.—P.41–47. 95.Recchia, F. Beta— interferon, retinoids and tamoxifen combination in advanced breast cancer / F. Recchia, S. Rea, S. De Filippis, M. Rosselli [et al.] // M Clin Ter.—1998.—Vol.149.—P.203–208. 96.Restifo, N.P. Coordinated downregulation of the antigen presentation machinery and HLA class I/b2— microglobulin complex is responsible for HLA— ABC loss in bladder cancer / N.P. Restifo, F. Esquivel, Y. Kawakami, J.W. Yewdell [et al.] // Int J Cancer.—2005.—Vol.113.—P.605–10 97.Repetto, L. Tamoxifen and interferon— beta for the treatment of metastatic breast cancer / L. Repetto, P.G. Giannessi, E. Campora, P. Pronzato [et al.] // Breast Cancer Res Treat.—1996.—Vol.39.—P.235–238. 98.Rowley, D.R. Beta— 2 microglobulin is mitogenic to PC— 3 prostatic carcinoma cells and antagonistic to transforming growth factor beta 1 action / D.R. Rowley, T.D. Dang, L. McBride, M.J. Gerdes [et al.] // Cancer Res.—1995.—Vol.55.— P.781–6. 99.Sato, N. Molecular pathological approaches to human tumor immunology / N. Sato, Y. Hirohashi, T. Tsukahara, T. Kikuchi T, [et al.] // Pathology International.—2009.—Vol.59.—P.205-217. 100. Sawtell, N.M. Expression of normal and tumor— associated antigens in human breast carcinoma/ N.M.Sawtell, L. DiPersio, J.G. Michael //Lab. Invest. — 1984. –Vol.51. –P.225-232 127 101. Seifert, U. An essential role for tripeptidyl peptidase in the generation of an MHC class I epitope/ U. Seifert, C. Maranon, A. Shmueli, J.F. Desoutter [et al.] // Nat Immunol.—2003.—Vol.4.—P.375–9. 102. Serrano, A. Rexpression of HLA class I antigens and restoration of antigen— specific CTL response in melanoma cells following 5— aza— 20— deoxycytidine treatment / A. Serrano, S. Tanzarella, I. Lionello, R. Mendez [et al.] // Int J Cancer.—2001.—Vol.94.—P.243–51. 103. Seymour, L. Interferon plus tamoxifen treatment for advanced breast cancer: In vivo biologic effects of two growth modulators / L. Seymour, W.R. Bezwoda // Br J Cancer.—1993.—Vol.68.—P.352–356. 104. Sica, G. Steroid receptor enhancement by natural interferon— beta in advanced breast cancer / G. Sica, F. Iacopino, G. Lama, D. Amadori [et al.]// Eur J Cancer.—1993.—Vol.29.—P.329–333. 105. Tangri, S. Structural features of peptide analogs of human histocompatibility leukocyte antigen class I epitopes that are more potent and immunogenic than wild— type peptide/ S. Tangri, G.Y. Ishioka, X. Huang, J.Sidney [et al.] // J Exp Med.—2001.—Vol.194.—P.833-846. 106. Tsukahara, T. Prognostic significance of HLA class I expression in osteosarcoma defined by anti— pan HLA class I monoclonal antibody, EMR8— 5 / T. Tsukahara, S. Kawaguchi, T. Torigoe, H. Asanuma [et al.] // Cancer Sci.— 2006.—Vol.97.—P.1374-1380. 107. Vitale, M. HLA class I antigen and transporter associated with antigen processing (TAP— 1 and TAP— 2) down— regulation in high grade primary breast carcinoma lesions / M. Vitale, R. Rezzani, L. Rodella, P.Grigolato [et al.] // Cancer Research.—1998.—Vol.58.—№4.—Р.737— 742. 108. Vitale, M. HLA class I antigen and transporter associated with antigen processing (TAP1 and TAP2) downregulation in high— grade primary breast carcinoma lesions / M. Vitale, R. Rezzani, L. Rodella, P.Grigolato [et al.] // Cancer Res.—1998.—Vol.58.—P.737–42. 128 109. Vitiello, A. The role of beta 2— microglobulin in peptide binding by class I molecules / A. Vitiello, T.A. Potter, L.A. Sherman // Science.—1990.— Vol.250.—P.1423–26. 110. Wagner, C. Identification of an HLA— A*02 restricted immunogenic peptide derived from the cancer testis antigen HOM— MEL— 40/SSX2 / C. Wagner, F. Neumann, B. Kubuschok, E. Regitz [et al.] // Cancer Immunol.— 2003.—Vol.3.—Abst.18. 111. Wintzer, H.O. Lacking prognostic significance of beta 2— microglobulin and MHC class I and class II antigen expression in breast carcinomas / H.O. Wintzer, M. Benzing, S. von Kleist [et al.] // Br. J. Cancer.—1990.—Vol.62.— №2.— Р.289-295. 112. Wang, M. Cellular expression or binding of desLys58— beta2 microglobulin is not dependent on the presence of the tri— molecular MHC class I complex / M. Wang, D.B. Corlin, N.H. Heegaard, M.H. Claesson [et al.]// Scand J Immunol.—2008.—Vol.67.—P.105–12. 113. York, I.A. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex/ I.A. York, K.L. Rock // Annu Rev Immunol.— 1996.—Vol.14.—P.369–96. 114. Zia, A. MHC class I negative phenotype of disseminated tumor cells in bone marrow is associated with poor survival in R0M0 breast cancer patients / A. Zia, F.W. Schildberg, I. Funke // Int J Cancer.—2001.—Vol.93.—P.566-570. 115. Zuk, J.A. Immunohistochemical analysis of HLA antigens and mononuclear infiltrates of bengn and malignant breast/ J.A. Zuk, R.A. Walker //J. Pathol. — 1987. –Vol.152. –P.275-285 116. Zuk, J.A.HLA class II sublocus expression in bengn and malignant breast epithelium/ .A. Zuk, R.A. Walker // J.Pathol. — 1988. –Vol.155. –P.301— 309 117. zum Buschenfelde, C.M. The generation of both T killer and Th cell clones specific for the tumor— associated antigen HER2 using retrovirally transduced 129 dendritic cells / C.M. zum Buschenfelde, J. Metzger, C. Hermann, N. Nicklisch // J Immunol.—2001.—Vol.167.—P.1712–19. 130
