Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при иммунокорригирующей терапии рака молочной железы
advertisement
на правах рукописи ШАМИЛОВ ФАРХАД АЗЕРОВИЧ Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при иммунокорригирующей терапии рака молочной железы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.01.12 онкология Москва 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет МГМСУ имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Ректор: доктор медицинских наук, профессор Янушевич Олег Олегович и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук. Директор академик РАН Давыдов Михаил Иванович Научные руководители: заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Сельчук Владимир Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Тупицын Николай Николаевич Официальные оппоненты: Высоцкая Ирина Викторовна доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии ГБОУ ВПО «1 МГМУ им. И.М.Сеченова» Минздрава России доктор медицинских наук, заведующий отделением онкологии и реконструктивно-пластической хирургии молочной железы и кожи ФГБУ «Московский научноисследовательский института им. П.А.Герцена» Минздрава России Зикиряходжаев Азиз Дильшодович Ведущее учреждение: ФГБУ «Государственный научный центр (ГНЦ) институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (ФМБА РФ). Защита диссертации состоится « »______2014 года в___часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) при ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru Автореферат разослан « »_______2014 года Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы В структуре онкологических заболеваний женского населения в России, как и в большинстве развитых стран мира, рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место, причем отмечается рост как показателей заболеваемости, так и рост смертности. В России в 2007 году его доля составила 20%. 1 млн. новых случаев рака молочной железы ежегодно регистрируется в мире по данным Всемирной организации здравоохранения. В Москве и Санкт-Петербурге 5-летняя выживаемость при РМЖ составляет 59,3-59,6%. У вновь выявленных больных около 35% случаев составляют III-IV стадии. Отдаленные метастазы возникают у 50% больных раком молочной железы, медиана выживаемости больных с метастатическим раком молочной железы составляет 24-36 месяцев, и только 15% живут более 5 лет (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). У больных злокачественными опухолями отмечаются значительные нарушения различных звеньев иммунного ответа организма. Проведенные исследования у онкологических больных указывают на снижение количества естественных киллеров, Тхелперов, функциональной активности Т-лимфоцитов, увеличение Т-супрессоров и их функциональной активности. Снижение уровня Т-клеточной инфильтрации опухоли имеет определенную связь с регионарным метастазированием или наличием микрометастазов (Паниченко А.В., 2002; Крохина О.В., 2003). Доказано, что увеличение количества интратуморальных Т-киллеров является фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы, преимущественно без регионарного метастазирования (Артамонова Е.В., Тупицын Н.Н., 2005). Наибольшее значение имеет инфильтрация опухоли CD8+ лимфоцитами. Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе неоадъювантной химиотерапии РМЖ взаимосвязана с прогнозом заболевания (Субботина А.А., Тупицын Н.Н., 2009). Доказано, что инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы цитотоксическими лимфоцитами (CD8+) является фактором благоприятного прогноза, а выраженная инфильтрация CD4+ лимфоцитами и макрофагами, напротив, ухудшает прогноз (DeNardo D.G. et al., 2011; Ruffel B. et al., 2012). Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При однофакторном анализе главенствующая прогностическая роль принадлежит CD8+ лимфоцитам (Артамонова Е.В., 2009). В отсутствие выраженной инфильтрации рака молочной железы CD8+ клетками CD4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную 3 активность опухолеассоциированных макрофагов (DeNardo D.G. et al., 2009). Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа – CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также CD68+ макрофаги – могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. Предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы (DeNardo D.G. et al., 2011). Иммунный профиль CD68LowCD4LowCD8High характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы CD68HighCD4HighCD8Low соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и низкими показателями выживаемости. Таким образом, установлены прогностически благоприятные иммунологические характеристики интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Актуальной является задача по поиску путей иммунотерапевтического воздействия на субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов с целью его коррекции и улучшения прогноза у больных. Решению данной актуальной задачи и посвящена наша работа. Цель исследования Изучение количественного состава интратуморальных лимфоцитов, динамики их субпопуляций при проведении иммунокорригирующей терапии рака молочной железы. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучить количественный субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (на материале хирургически удаленной опухоли) методом ткани, полученном многопараметровой проточной цитометрии. 2. На материале опухолевой при кор-биопсии, определить уровень субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по следующим показателям: 2.1 общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии; 2.2 процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+); 2.3 процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов; 2.4 процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+; 4 2.5 соотношение CD8/CD4; 2.6 процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток; 2.7 процент NK-клеток – CD3-CD56+; 2.8 процент TNK клеток – CD3+CD56+. Провести лечение препаратом «Полиоксидоний» 3. больным раком молочной железы с оценкой клинических показателей и морфологических признаков его эффективности (индукция апоптоза) Изучить 4. динамику показателей интратуморальных лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием. Сопоставить иммунологические изменения в ходе иммунотерапии с 5. клиническими характеристиками, морфологическими признаками и рецепторным статусом опухоли Определить показания для проведения иммунокорригирующей терапии у 6. больных операбельным раком молочной железы. Научная новизна Впервые на достаточном клиническом материале проведен анализ субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов больных раком молочной железы. Уровень общей лимфоидной инфильтрации рака молочной железы определяется, в первую очередь, Т-цитотоксическими клетками (CD8+). Установлено, что в материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,2±0,5%. Новым является факт, что в процессе иммунотерапии полиоксидонием большинство субпопуляций интратуморальных лимфоцитов не изменяются, вместе с тем, достоверно снижается количество интратуморальных естественных киллеров, а выраженность эффекта полиоксидония (индукция патоморфоза) определяется, в первую очередь, нарастанием пропорции интратуморальных CD4+ лимфоцитов. 5 Практическая значимость Научно-практическое значение проведенной работы определяется двумя основными аспектами – диагностическим и лечебным. В диагностическом плане убедительно доказана возможность проведения полноценного изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по материалу кор-биопсии методом многоцветной проточной цитометрии. Это дает основание для формирования групп больных, которым показана иммунотерапия в неоадъювантном режиме, т.е. до проведения хирургического лечения. Лечебный аспект выполняемого диссертационного исследования заключается в том, что применение полиоксидония у больных раком молочной железы вело к развитию иммуно-опосредованного апоптоза. Данный феномен наблюдался у 30% больных. Также научно-практическое значение данной работы являются полученные сведения по целесообразности включения полиоксидония в арсенал препаратов, применяемых в неоадъювантном режиме у больных операбельным раком молочной железы. Апробация диссертации Апробация диссертации состоялась 30 октября 2013 года на совместной научной конференции подразделений: кафедры онкологии факультета последипломного образования ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» и кафедры онкологии ГБОУ ВПО « I ММУ им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также отделений опухолей молочных желез, опухолей женской репродуктивной системы, радиохирургии и лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН. Личный вклад автора Аавтором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Разработан дизайн исследования, статистическая обработка материала, полученном в ходе исследования. Под руководством и при непосредственном участии автора проведено внедрение новых форм диагностики и лечения рака молочной железы. Автором осуществлен анализ, интерпретация собранных материалов, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертационная работа. 6 Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения соответствуют паспорту специальности 14.01.12 – «онкология», конкретно пункту 6. Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе в 3 журналах, рекомендованных ВАК России. Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы, включающего 38 источников отечественной и 169 источников зарубежной литературы. Иллюстрирована 31 таблицей и 10 рисунками. ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Пациенты, характеристика клинического и биопсийного материала. Материалом для настоящего исследования послужили результаты исследований 57 образцов опухолевой ткани от 37 больных раком молочной железы Т1-2N1-3M0 стадий. Установление диагноза рака молочной железы и лечение пациенток проведено в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН в 2010-2012 годах. Все пациентки, включенные в исследование, проходили лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез (зав. отделением профессор. И.К.Воротников) НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза (зав. лабораторией д.м.н. профессор Н.Н.Тупицын) централизованного клинико-лабораторного отдела (зав. доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе З.Г.) НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (директор - академик РАН и РАМН профессор М.И.Давыдов). Морфологическая часть исследования проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (зав. отделом доктор медицинских наук, профессор Карселадзе А.И.). Критерием для отбора больных в исследовании служил гистологический верифицированный диагноз рака молочной железы. 7 В нашу работу вошли женщины в возрасте от 32 до 78 лет. Средний возраст больных составил 55 лет. Менструальная функция была сохранена у 9 больных (24,3%), в периоде менопаузы – 28 женщин (75,7%). Клинический диагноз рака молочной железы у всех больных подтвержден данными гистологического исследования опухоли. Стандартный объем предоперационного обследования у пациенток РМЖ включал ультразвуковое исследование и рентгеновскую маммографию обеих молочных желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических узлов, органов малого таза и печени, рентгенографию органов грудной клетки, сканирование скелета. Распространенность опухоли оценивалась согласно Международной классификации злокачественных опухолей по системе ТNM, 7-ой редакции. Полученные данные представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, наибольшее число больных относилось к IIa, IIb и IIIa стадиям (по 27,0%). До проведения настоящей работы больным специфического лечения не проводили. Таблица 1. Распределение больных РМЖ по стадиям в соответствии с классификацией ТNM. Стадия Число больных абс. I стадия: T1N0M0 6 IIа стадия: 10 T1N1M0 1 T2N0M0 9 IIб стадия: 10 Т2N1M0 10 IIIа стадия: 10 T1N2M0 1 T2N2M0 9 IIIc стадия: 1 T2N3M0 1 Всего 37 20 больным в возрасте от 32 до 78 лет ( медиана Частота % 16,2 27,0 2,7 24,3 27,0 27,0 27,0 2,7 14,3 2,7 2,7 100 – 52,5 года) проводили кор- биопсию опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальную операцию. Полиоксидоний применяли внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й дни (1-й день – день кор-биопсии). Препарат был предоставлен для выполнения протокола совместных исследований ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН и НПО «Петровакс». Протокол был утвержден этическим комитетом ГБОУ ВПО «МГМСУ им А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Все больные 8 подписывали информированное согласие. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония. По данным гистологического исследования хирургически удаленных опухолей, обнаружено, что наиболее часто встречался инфильтративный протоковый рак – 29 наблюдений (78,4%), инфильтративный дольковый рак - 6 случаев (16,2%), тубулярный и медуллярный раки – по одному наблюдению. У 15 (40,5%) пациенток не обнаружено метастазов в лимфатических узлах (критерий N0) у 11 (29,7% ) - имелись метастазы в 1 - 4 лимфоузлах (N1), в 10 (27,0%) случаях определялись конгломераты увеличенных плотных лимфатических узлов подмышечной области или поражение от 5 до 9 лимфоузлов (N2). Мы наблюдали 1 (3,7%) случай, соответствующий индексу N3 поражения регионарных лимфатических узлов при раке молочной железы. Степень злокачественности опухоли была определена у 34 больных исследуемой группы. В большинстве случаев - 29 (85,3%) обнаружена II степень злокачественности, реже - III степень – у 5 (14,7%) больных. Хирургическое вмешательство различного объема выполнено всем больным изучаемой группы. Радикальная резекция выполнена у 8 больных, у остальных – хирургическое лечение проведено в объеме радикальной мастэктомии с сохранением грудных мышц. Помимо клинико-морфологических критериев прогноза (размер опухолевого узла, гистологический тип опухоли, количество пораженных лимфатических узлов), у больных оценивали рецепторный статус опухоли, пролиферативный индекс (Ki-67), экспрессию рецептора Her2/neu. Исследование рецепторов эстрогенов было проведено у 32 больных раком молочной железы, из которых у 27 (84,4%) больных опухоль была рецепторположительной по рецепторам эстрогенов, у 5 (15,6%) – рецептор-отрицательной. Уровень рецепторов прогестерона в первичной опухоли определен также у 32 больных. В 25 (78,1%) случаев опухоль содержала рецепторы к прогестерону, у 7 (21,9%) больных опухоль была рецептор отрицательной. Распределение больных в зависимости рецепторного статуса опухоли следующим: у большинства больных опухоли было содержали рецепторы эстрогенов и прогестерона (РЭ+РП+) 25 (78,1%). В 5 (15,6%) клинических случаях не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Отрицательный рецепторный статус по рецепторам эстрогенов и положительный по рецептору прогестерона (РЭ-РП+) – не наблюдались. Опухоль, 9 положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по прогестерону (РЭ+РП-) обнаружена у 2 (6,3%) больных. Уровень рецептора Her2/neu в первичной опухоли также определен у больных. В 17 (53,1%) случаев опухоль не содержала рецепторы к Her2/ neu (-), у 10 (31,3%) больных уровни рецепторов к Her2/neu (1+) были крайне низкие, у 3-х (9,4%) больных — Her2/neu (2+) /в одном из этих случаев методом FISH подтвержден положительный рецепторный статус/, у 2 (6,3%) больных Her2/neu (3+). Реактивы и методы исследования. Характеристика специфичности использованных в работе моноклональных антител представлена в таблице 2. Таблица 2. Специфичность использованных моноклональных антител № Кластер дифференцировки, название CD45 CD 8 CD4 CD3 CD56 Специфичность Все лейкоциты Т-киллеры Т-хелперы T-клетки NK-клетки Рецептор ИЛ-2; активированные лимфоциты, 6 CD25 Трег Примечание: Использованы прямые конъюгаты представленных антител с флуорохромами - FITC, PE, PE-Cy5, ECD - производства фирмы Becton Diсkinson (США) или Beckman Coulter (США). 1 2 3 4 5 Проточная цитометрия. Иммунологическое исследование материала кор-биопсии и удаленной опухолевой ткани проводили методом 4-цветной проточной цитометрии с использованием следующих комбинаций антител: 1-ая проба – CD4/CD3/CD25/CD45, 2-ая проба – CD8/CD3/CD56/CD45. Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или программы FCS, версия 3. Нами оценены следующие иммунологические показатели интратуморальных лимфоцитов: 1. Общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии. 2. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). 3. Процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов. 4. Процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ 10 5. Соотношение CD8/CD4 6. Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток 7. Процент NK-клеток – CD3-CD56+ 8. Процент TNK клеток – CD3+CD56+ Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 13. Использовали тест Колмогорова-Смирнова для проверки гипотезы о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: Манна-Уитни (две выборки) или Краскела-Уоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест 2 по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения использовали коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману. Результаты исследований Характеристика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы методом проточной цитометрии. Исследование материала хирургически удаленных опухолей Мы изучили субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у 17 больных на материале опухоли, удаленной в ходе радикальной хирургической операции. В материале удаленной опухоли у больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 84,02±2,0%. Количество цитотоксических лимфоцитов (CD8+) незначительно преобладало над количеством CD4+ лимфоцитов – в среднем 47,1±3,1% и 46,4% ±3,9% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,24. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 1,48 до 9,09%, в среднем – 4,4±0,8%. По результатам исследования операционного материала уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1,0% лимфоцитов от общего числа клеток) – 12 из 17 больных (70,6%) и умеренные/высокие (более 1%) 5/17 (29,4%). 11 Только уровни NK-клеток были взаимосвязаны с общим уровнем лимфоидной инфильтрации опухоли и были более выраженными при незначительной инфильтрации: 2,54±0,52% и 0,61±0,15%, р=0,03. В случаях с умеренной/выраженной инфильтрацией процент Т-цитотоксических клеток был несколько выше (55,02±7,28), чем при незначительной инфильтрации (43,56±2,71), р=0,09. Исследование субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы. Исследование субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы на материале кор-биопсии проведено у 20 больных операбельным раком молочной железы, у которых в процессе комплексного обследования с целью верификации диагноза проводилась данная процедура. Для иммунологических исследований клетки опухоли дезагрегировали с использованием аппарата “Medimashin” (Becton Dickinson, США), специально разработанного для выделения лимфоцитов из опухолевой ткани. Окраску клеток проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, меченых флуорохромами. Количество проб, изучаемых иммунологически, было сведено до двух, учитывая крайне малое количество материала кор-биопсии: 1. CD4-FITC/CD25-PE/CD3-ECD/CD45-PE.Cy5. 2. CD8/FITC/CD56-PE/CD3-ECD/CD45-Pe.Cy5. Эти комбинации антител позволяли оценить общий уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами, пропорцию Т-клеток среди лимфоцитов, субпопуляции CD4 и CD8 клеток, активационные маркеры (CD25), и, в частности, CD4+CD25+ T-регуляторные клетки, TNK-лимфоциты (CD3+CD56+) и естественные киллеры (CD3-CD56+). Сбор клеток проводили на проточном цитометре EPICS XL MCL, общее количество набираемых событий – от 75 000 до 500 000. Уровень лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани колебался от незначительного до выраженного. На рисунке 1 представлена умеренная лимфоидная инфильтрация ткани рака молочной железы лимфоцитами. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили в гейте R1, как показано на рисунке 1. 12 Рис. 1. Умеренная инфильтрация рака молочной железы лимфоцитами (клетками с яркой экспрессией CD45 /ось Х/ и низкими уровнями бокового светорассеяния SSC /ось Y/). В представленном случае общее количество накопленных при цитометрии событий 75 453, из них лимфоцитов (CD45++ SSCLOW) – 1216 (1,61%). Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов по материалу корбиопсии представлена в таблице 3. Таблица 3. Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы (кор-биопсийный материал) Субпопуляция (CD) Процент клеток Число больных min max cреднее Стд. ошибка 1,50 1,97 2,24 0,07 0,72 1,48 0,32 CD3 19 72,90 95,00 88,02 CD8 19 25,38 57,38 40,87 CD4 19 24,49 60,82 45,18 CD8/CD4 19 0,43 1,43 0,96 CD4+CD25+ 15 0,58 9,13 4,03 CD3+CD56+ 18 0,59 28,00 4,36 CD3-CD56+ 18 0,00 4,12 1,59 Процент 20 0,10 9,54 2,05 0,65 CD45++SSCLow В материале кор-биопсии рака молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95% от числа лимфоцитов, в среднем 88,0±1,5%. Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем, 45,2% и 40,9%, соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 0,96. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 4,12%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,0±0,7%. Таким образом, материала кор-биопсии, в большинстве случаев достаточно для оценки субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов. Для минимизации количества необходимого для исследования материала необходимо использовать многопараметровую (четырехцветную) проточную цитометрию, позволяющую 13 количественно оценить как уровни инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами, так и субпопуляции наиболее значимых эффекторных клеток противоопухолевого иммунитета. На материале кор-биопсии уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1% лимфоцитов от общего числа клеток) – 7 из 20 больных (35,0%) и умеренные/высокие (более 1%) – 13/20 (65,0%). Из числа проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов только Т-цитотоксические (CD8+) клетки и TNK-клетки имели взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно более высоким: 44,2% и 35,2%, р=0,022. Взаимоотношения общего уровня лимфоидной инфильтрации (CD45++ SSCLow) с процентом TNK-клеток были иными: более высокое содержание TNKклеток отмечено при низкой лимфоидной инфильтрации опухоли (8,65±4,05 и 2,21±0,31, р=0,03). При сопоставлении состава лимфоцитов в материале кор-биопсии и в материале удаленной опухоли ни по одной из субпопуляций (CD3, CD4, CD8, индекс CD8/CD4, CD4+CD25+, CD3+CD56+, CD3-CD56+) не выявлено достоверных различий (р>0,05). Полученные результаты свидетельствуют о сходстве субпопуляционного состава лимфоцитов при проведении исследования по материалу кор-биопсии и при изучении удаленной опухоли. Следовательно, материал кор-биопсии является адекватными для изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов. Это позволило нам представить результаты исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов в целом по группе 37 больных раком молочной железы, таблица 4. Таблица 4. Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы Процент клеток Субпопуляция (CD) Число больных min max среднее CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ 36 35 35 35 24 34 70,95 25,38 23,25 0,43 0,58 0,39 95,20 81,80 67,80 3,52 9,13 28,00 86,54 43,74 45,74 1,09 4,15 4,24 Стд. ошибка 1,19 1,83 2,11 0,10 0,53 1,02 CD3-CD56+ Процент CD45++SSCLow 34 0,00 5,29 1,75 0,26 37 0,08 27,90 2,17 0,80 14 В материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Тклетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,2±0,5%. Уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами были чаще низкими (менее 1% лимфоцитов от общего числа событий) – 21 из 37 больных (56,8%), чем умеренныеми/высокими (более 1%) – 16/37 (43,2%). Лишь одна из проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов имела достоверную взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно выше, чем при низких уровнях инфильтрации: 48,1% и 40,5%, р=0,039. Сравнительный анализ состава интратуморальных лимфоцитов, клинических характеристик и морфологических признаков у больных раком молочной железы. У 37 больных мы сопоставили иммунологические параметры интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками опухоли, такими как стадия заболевания, размер опухоли (рТ), вовлеченность регионарных лимфатических узлов (индекс N). Взаимосвязи с клинической стадией мы не отметили, вместе с тем, при ранних (12а) стадиях процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) было достоверно ниже, чем при более поздних стадиях (2б-3с): 83,9±1,9 и 89,3±1,2%, р=0,016. Эти различия, в основном, обусловлены нарастанием уровней CD3+ интратуморальных лимфоцитов при стадии 2б. Различия между стадиями 2а и 2б высоко достоверны, р=0,013. Различия, установленные нами при различных стадиях опухолевого процесса, нашли отражение и во взаимосвязях с размером опухоли (Т) и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах. При опухолях большего размера (сравнение рТ1 и рТ2) отмечены более высокие уровни CD3 лимфоцитов (недостоверно) и более низкий процент интратуморальных TNK-клеток (CD3+CD56+) - 9,8±4,2% и 2,8±0,44%, р=0,004. Уровни интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3+) были выше при наличии метастатического поражения лимфатических узлов (N+), однако, различия не достоверны (р=0,07). Уровни Т-клеток резко возрастали при возникновении регионарных метастазов, т.е. при индексе N1 в сравнении с N0 (P=0,005): 90,9±1,0% и 83,8±1,99%. 15 При дальнейшем распространении процесса (N2) различия с начальными стадиями были не столь достоверными и на первый план выходило достоверное повышение уровней интратуморальных киллеров (CD8+) -49,9±4,1% и 38,3±2,1%, р=0,019. Подобное достоверное нарастание уровней интратуморальных Т-киллеров при наличии регионарных метастазов, соответствующем индексу N2, возможно, свидетельствует о том, что интратуморальная иммунная система реагирует на опухоль достаточно поздно – при наличии обширного регионарного метастазирования. При сопоставлении с гистологическим типом опухоли установлено, что уровни CD8+ Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком – 45,6±2,1% и 36,0±3,1%, p=0,027. Различий в субпопуляционном составе интратуморальных лимфоцитов в зависмости от рецепторного статуса нами не установлено, как в отношении рецептора эстрогенов, так и в отношении рецептора прогестерона, р=0,05. Аналогичным образом, степень злокачественности опухоли не была взаимосвязана ни с одной из субпопуляций иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих рак молочной железы, р=0,05. Для сопоставлений с экспрессией Her2/neu мы не располагали достаточным материалом, так как в изучаемой группе было всего 3 рецептор-позитивных случая. Влияние поликсидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы Оценено влияние иммуномодулятора полиоксидония на уровни интратуморальных лимфоцитов у 20 женщин, больных раком молочной железы. Диагноз во всех случаях был установлен на основании морфологического исследования опухолевой ткани. Возраст больных - от 32 до 78 лет ( медиана – 53,5). Проводилась кор-биопсия опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальная операция и исследование послеоперационного материала. Полиоксидоний применяли внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й дни. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония. Инфильтративный протоковый рак установлен у 14 пациенток (70,0%), инфильтративный дольковый – 4 (20%), тубулярный – 1 (5%), медуллярный – 1 (5%). Рецепторы эстрогенов были положительны в 16 случаях из 20 (80%), рецепторы прогестерона – в 14 из 20 (70%). Статус по Her2/neu: 0 – 9 (45%), 1+ - 7 (35,0%), 2+ - 3 (15,0%), 3+ - 1 (5,0%). В одном из 3 случаев, расцененных как 2+, экспрессия рецептора расценена как положительная на основании результатов FISHреакции. Таким образом, положительный статус по Her2/neu имел место у 2 больных (20%). Пролиферативный индекс (Ki-67) находился в диапазоне от 7 до 75% (среднее 16 33,9±17,4%). У 12 больных установлена 2-ая степень злокачественности (70,6%), у 5 – 3-я (29,4%). Размеры опухоли в основном (95,0%, 19 больных) соответствовали индексу рТ2, лишь в одном случае (5,0%) – рТ1. Метастазы в регионарные лимфатические узлы установлены у 14 (70,0%) больных (N1 – 7 /35%/, N2 – 7 /35%/), у 6 больных (30%) метастазы отсутствовали. В соответствии с клиническими стадиями заболевания больные распределились следующим образом: 1 стадия -1 (5%), 2а – 5 (25%), 2б – 7 (35%), 3а – 7 (35%). Все больные хорошо переносили введение полиоксидония. Осложнений нами не отмечено. Ни у кого из больных во время проведения иммуномодулирующей терапии и в послеоперационном периоде не было инфекционных заболеваний. Интересно отметить, что по результатам морфологического исследования хирургически удаленной опухоли у 6 из 20 больных (30%), получавших в неоадъювантном режиме только полиоксидоний, отмечен лечебный патоморфоз: у 3 больных – 1 степени, у двух – второй, у 1 больной – патоморфоз 4 степени. Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов до назначения полиоксидония по материалу исследования кор-биопсии рака молочной железы представлен в предыдущем разделе (таблица №3). Сравнительная оценка субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов, выделенных из удаленной опухоли, проведена в 2 группах больных: у 20 больных исследование проводилось после применения полиоксидония, у 17 - полиоксидоний в неоадъювантном режиме не применяли. Ни по одному из изученных показателей нами не установлено различий между группами больных, получавших полиоксидоний и не получавших данный препарат. При расширении группы сравнения, при объединении всех первичных больных раком молочной железы (37 пациенток, не получавших полиоксидоний) достоверных различий с группой пациенток, у которых исследование проведено после применения полиоксидония, также не получено. Наиболее убедительные данные относительно влияния полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов получены при непосредственном (попарном) сравнении данных материала кор-биопсии (до применения полиоксидония) и удаленной опухоли (после применения полиоксидония) тех же самых больных. После лечения полиоксидонием у больных не отмечено по большинству изученных показателей достоверного увеличения или снижения процента интратуморальных лимфоцитов в опухолевой ткани (р>0,05). Исключение составили уровни NK-клеток, 17 которые были достоверно более низкими после лечения полиоксидонием (1,68±0,33 и 1,16±0,26, р=0,029). Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе применения полиоксидония у больных раком молочной железы. Помимо оценки средних значений процентного содержания антигенпозитивных клеток в пуле тумор-инфильтрирующих лимфоцитов у больных раком молочной железы мы сопоставили динамику различных субпопуляций лимфоцитов. Если разница процента антиген-позитивных лимфоцитов в материале удаленной опухоли и материале корбиопсии не превышала 5%, то это расценивали как отсутствие изменений в уровнях экспрессии маркера. Если разница в процентах антиген-позитивных клеток в материале кор-биопсии и удаленной опухоли превышала 5%, то это расценивали как снижение уровней соответствующих антиген-позитивных клеток (более высокий процент в корбиоптате) или их повышение (более высокий процент в материале удаленной опухоли). При анализе динамики CD8-позитивных клеток у 19 больных отсутствие изменений в проценте CD8+ лимфоцитов установлено в 3 случаях (15,8%), снижение – в 7 случаях (36,8%) и повышение – в 9 случаях (47,4%). При этом уровни снижения процента CD8+ лимфоцитов были, как правило, незначительными – от 5,9% до 10,79%. Уровни повышения CD8+ клеток были более высокими – от 6,1% до 22,28%. В двух случаях отмечено повышение CD8+ клеток на 19,93 и 22,28%. Взаимосвязи изменений CD8 в зависимости от исходного цитотоксического индекса не установлено, р=0,11. Повышение процента CD8+ клеток отмечено в 55,6% случаев при низком исходном цитотоксическом индексе (менее 1) и в 44,4% случаев с индексом более 1. Аналогичным образом оценили динамику содержания CD4+ лимфоцитов. Изменения также были разнонаправленными: снижение процента CD4+ клеток отмечено в 5 случаях (26,3%), в 8 случаях (42,1%) процент CD4 клеток практически не изменялся, в 6 наблюдениях отмечено повышение процентного содержания CD4+ лимфоцитов (31,6%). В случаях снижения процента CD4 клеток диапазон изменений был от 10,37% до 20,57%, причем в 2 случаях отмечены высокие проценты отличий – 19,85% и 20,57%. Характеристика клинико-иммунологических особенностей больных раком молочной железы, у которых применение полиоксидония вело к индукции апоптоза опухолевых клеток. Одним из важных свойств полиоксидония явилась индукция патоморфоза клеток рака молочной железы. Этот феномен наблюдали у 6 из 20 пациенток (30%). Преобладали больные 2б и 3а стадий. Каких-либо взаимосвязей с размером опухоли, гистологическим типом и вовлеченностью регионарных лимфатических узлов не отмечено. Больная, у 18 которой наблюдалась 4-ая степень патоморфоза опухолевой ткани, имела стадию 2б и очень высокий уровень пролиферативного индекса (75%). У всех 6 больных, у которых отмечен лечебный патоморфоз опухоли, иммунологическое исследование интратуморальных лимфоцитов проводились дважды – до назначения полиоксидония (по материалу кор-биопсии) и после лечения полиоксидонием (по материалу удаленной опухоли). Сравнили исходное процентное содержание различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы, у которых после введения полиоксидония наблюдался лечебный патоморфоз или таковой отсутствовал. К сожалению, на основании исходного содержания клеток той или иной субпопуляции было невозможно прогнозировать результат действия полиоксидония. Достоверных различий между субпопуляциями лимфоцитов больных, у которых был получен лечебный патоморфоз, субпопуляциями больных, у которых подобного эффекта не наблюдалось, не выявлено. Мы провели сравнительный анализ субпопуляционного состава лимфоцитов удаленной опухоли в группах больных с наличием и отсутствием патоморфоза, таблица 5. Таблица 5 Сравнение процентного содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов после лечения полиоксидонием больных раком молочной железы при наличии и отсутствии лечебного патоморфоза (по материалу удаленной опухоли). Популяция клеток, CD Патоморфоз N нет 10 CD3 есть 6 нет 10 CD8 есть 6 нет 10 CD4 есть 6 нет 10 CD8/CD4 есть 6 нет 10 CD4+CD25+ есть 6 нет 9 CD3+CD56+ есть 6 нет 9 CD3-CD56+ есть 6 нет 11 Процент лимфоцитов есть 6 Среднее 88,49 86,51 45,97 39,46 40,89 50,91 1,17 0,79 3,89 3,13 2,82 4,18 1,46 1,19 2,90 1,76 Стд. ошибка среднего 2,003 1,11 3,41 2,91 2,26 2,05 0,13 0,09 0,68 0,56 0,90 0,94 0,43 0,48 0,95 0,82 Р 0,48 0,21 0,006 0,03 0,4 0,33 0,7 0,44 19 Как видно из представленных данных, только два показателя интратуморальных лимфоцитов имеют связь с патоморфозом опухоли после терапии полиоксидонием – уровень интратуморальных Т-хелперов (CD3+CD4+) и соотношение CD8/CD4 в опухолевой ткани. Средний процент CD4+ лимфоцитов в случаях наличия патоморфоза был достоверно более высоким, чем в группе с отсутствием патоморфоза. Именно это, также как и более низкое (не достоверно) количество CD8+ лимфоцитов в опухолевой ткани при наличии патоморфоза отражается на соотношении CD8/CD4 интратуморальных лимфоцитов, которое значимо снижается. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что стратегия иммунотерапии и иммунокоррекции при раке молочной не может быть основана на стремлении повысить или понизить относительное содержание того или иного типа интратуморальных Тклеток. По-видимому, для реализации полноценного противоопухолевого иммунного ответа необходимо взаимодействие нескольких субпопуляций иммунокомпетентных клеток, также как это реализуется в ходе нормальных иммунных ответов, например, на вирусные антигены. Конечным результатом действия препарата должно быть усиление цитотоксического действия лимфоцитов на опухолевые клетки. Именно эти случаи могут служить основой для изучения эффективной композиции интратуморальных лимфоцитов. Критерии эффективности неоадъювантной иммуномодулирующей терапии полиоксидонием у больных раком молочной железы. Оценили взаимосвязь динамики CD8+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями CD8+ клеток в материале кор-биопсии, таблица 6. Таблица 6 Связь динамики CD8+ лимфоцитов с исходными уровнями этих клеток в опухоли при иммунотерапии полиоксидонием. Маркер Исходный уровень CD8 > медианы <= медианы *Процент в строке снижение 6 (67%)* 1 (10%) Как видно, препарат, действительно, Динамика CD8 без изменений 1 (11%) 2 (20%) повышение 2 (22%) 7 (70%) характеризовался иммуномодулирующим действием. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD8+ клеток в 67% случаев при исходных значениях выше медианы (медиана – 40,78%) и лишь в 10% случаев – при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента 20 CD8+ лимфоцитов отмечено в 70% случаев при их исходном значении не более медианы и лишь в 22% (2 из 9) при исходном значении выше медианы (р=0,036). Достоверной связи динамики интратуморальных CD8+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не наблюдалось, р=0,68. Более того, у половины больных с наличием патоморфоза (3 из 6) данный феномен наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD8+ лимфоцитов. Аналогичным образом оценили взаимосвязь динамики CD4+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями CD4+ клеток в материале кор-биопсии, таблица 7. Таблица 7 Связь динамики CD8+ лимфоцитов с исходными уровнями этих клеток в опухоли в процессе иммунотерапии полиоксидонием. Исходный уровень > медианы CD4 <= медианы *Процент в строке Маркер снижение 4 (44%)* 1 (10%) Как видно, препарат, действительно, Динамика CD4 без изменений 5 (56%) 3 (30%) повышение 0 (0%) 6 (60%) характеризовался иммуномодулирующим действием на уровни интратуморальных CD4+ клеток. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD4+ клеток в 40% случаев при исходных значениях выше медианы (медиана 47,06%) и лишь в 25% случаев – при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента CD4+ лимфоцитов отмечено в 60% случаев при их исходном значении ниже медианы и не наблюдалось в 0% (0 из 9) при исходном значении выше медианы (р=0,016). Достоверной связи динамики интратуморальных CD4+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не наблюдалось, р=0,17. Более того, ни у одной из больных с наличием патоморфоза (0 из 6) данный феномен не наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии. 21 Выводы 1. Интратуморальные лимфоциты рака молочной железы представлены в основном (86,5±1,2 ) зрелыми Т-лимфоцитами, с примерно равным содержанием Т-хелперов (CD4+) и Т-цитотоксических клеток (CD8+) – 45,7±2,1 и 43,7±1,8, соответственно, соотношение CD8/CD4 составляет 1,1. 2. NK-клетки и Т-регуляторные клетки (CD4+CD25+ лимфоциты) представляют незначительную фракцию среди интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы: NK-клетки – 1,8±0,3%, CD4+CD25+ клетки – 4,2±0,5%. 3. Исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы методом многопараметровой проточной цитометрии может проводиться по материалу кор-биопсии: результаты не отличаются от таковых, полученных при изучении хирургически удаленной опухоли. 4. Существуют определенные взаимосвязи между субпопуляционным составом интратуморальных лимфоцитов и клиническими характеристиками опухолевого процесса. Содержание CD3+ зрелых Т-клеток в опухоли достоверно более высокое при стадиях 2б3с в сравнении со стадиями 1-2а (89,3±1,2% и 83,8±1,9%, р=0,016). Это обусловлено, в первую очередь, нарастанием CD3+ клеток при стадии 2б в сравнении со стадией 2а (91,3±0,8% и 84,2±2,6%, р=0,013). 5. Увеличение размера опухоли (Т2 в сравнении с Т1) сопровождается достоверным снижением (р=0,004) уровней интратуморальных TNK (CD3+CD56+) лимфоцитов. Возникновение регионарных метастазов (N1 в сравнении с N0) ассоциируется с достоверным возрастанием интратуморальных CD3+ лимфоцитов, а нарастание метастатического процесса (N2) характеризуется более высокими уровнями интратуморальных Т-киллеров (CD8) в сравнении с группой больных с индексом N1 (p=0,019). 6. Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов взаимосвязан с морфологическим вариантом опухоли: уровни Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком: 45,6±2,1 и 35,9±3,1; p=0,027. 7. Применение полиоксидония в неоадъювантном режиме хорошо переносится больными, не имеет побочных эффектов и в 30% случаев приводит к патоморфозу опухолевых клеток. Степень выраженности патоморфоза – от 1 до 4. 8. Использование полиоксидония в неоадъювантном режиме не ведет к изменению субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов больных раком молочной 22 железы по большинству субпопуляций. Достоверные различия отмечены для NK-клеток (р = 0,029 ), уровни которых после применения полиоксидония были более низкими. 9. Больные, у которых применение полиоксидония сопровождалось патоморфозом опухолевых клеток, не имели особенностей субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов до применения иммуномодулятора (материал корбиопсии), но характеризовались достоверно более высокой пропорцией интратуморальных CD4+ Т-клеток (р = 0,006) и более низким соотношением CD8/CD4 после иммунотерапии (р = 0,03). 10. Полиоксидоний обладает иммуномодулирующим действием на субпопуляции интратуморальных CD4 (p=0,016) и CD8-лимфоцитов (p=0,036), что характеризуется достоверным повышением уровней этих клеток при их исходно низких значениях и снижением – при исходно высоких значениях. 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1. Шамилов Ф.А. Влияние полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы / Шамилов Ф.А., Ельшина Г.А., Буров Д.А., Вишневская Я.В., Чхиквадзе Н.В., Зернов Д.И., Тимошенко В.В., Сельчук В.Ю. , Тупицын Н.Н // Иммунология — 2013 №4.- с.209-213. 2. Шамилов Ф.А.,. Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы / Шамилов Ф.А, Вишневская Я.В., Сельчук В.Ю., Погодина Е.М., Зернов Д.И., Чхиквадзе Н.В., Тимошенко В.В., Тупицын Н.Н. // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2012г.- №3-4.- с. 29-33 3. Скотаренко Л.В. Особенности Т-клеточного иммунитета при раке молочной железы / Скотаренко Л.В., Воротников И.К., Кадагидзе З.Г., Шамилов Ф.А. // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2011г.- №4.- с. 24-27 Другие публикации по теме диссертации: 4. Шамилов Ф.А., Вишневская Я.В., Сельчук В.Ю., Погодина Е.М., Зернов Д.И., Чхиквадзе Н.В., Тимошенко В.В., Тупицын Н.Н.. Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале корбиопсии опухоли у больных раком молочной железы. // Материалы VII общероссийского медицинского форума в Приволжском федеральном округе – 2012г. С.180 5. Шамилов Ф.А. Субпопуляции интратуморальных лимфоцитлв при раке молочной железы / Шамилов Ф.А // РМЖ онкология – 2012 №2.- с.60-64. 24
