ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ СТРУКТУРЫ

ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ СТРУКТУРЫ
ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
С.П. Ярков∗, И.В. Шиленко∗, Х.Х. Валиев♣, Ю.Н.Карнет*, Н.С. Снегирева♣, Ю.Г. Яновский♣
∗
Государственный научный центр - Государственный научно-исследовательский институт
биологического приборостроения, Москва, niibp@dol.ru;
♣
-Институт прикладной механики РАН, г. Москва, hhvlv@mail.ru
Методом атомно-силовой микроскопии изучена структура поверхности полимерных мембран,
используемых для
конструирования иммунохроматографических тестов. Получены данные по
топографии мембран, с нанесенными на них антителами и иммунными комплексами, образовавшимися
в процессе анализа суспензий бактериальных клеток.
Метод иммунохроматографического анализа (ИХА) широко применяется для
целей медицинской диагностики и экологического и санитарно-гигиенического
контроля. ИХА основан на латеральной диффузии компонентов иммунохимической
реакции в полимерной мембране [1]. Высокая чувствительность, специфичность,
исключительная простота процедуры,
делает его удобным аналитическим
инструментом биологического микроанализа в различных отраслях знаний [2 - 4].
Тем не менее, существующие данные о структуре
аналитических
нитроцеллюлозных мембран, а также вспомогательных мембран (для конъюгатов
антител с маркерными золями золота или латексов, впитывающих образец мембран)
недостаточны.
Отсутствуют
микрофотографии
иммунных
комплексов,
образовавшихся на иммунохроматографических мембранах в аналитической и
контрольных зонах, в результате прохождения фронта элюента, содержащего аналит,
связывающийся с конъюгатами маркерных золей и антителами. Мало изучено
механическое воздействие на хрупкие нитроцеллюлозные мембраны иглы диспенсера
наносящего растворы антител в аналитическую и контрольную зоны.
Положительный
опыт изучения методом атомно-силовой микроскопии
наноструктур трековых мембран и фильтрующих мембран фирмы Millipor [5],
позволял надеяться на успешный подход и при изучении специально изготовленных
для целей иммунохроматографии мембран Millipor серии HF (США).
Нами были сконструированы иммунохроматографические индикаторные
элементы на основе мембран Millipor HF120. В качестве конъюгатов использовали
золи наноразмерного золота и фракцию иммуноглобулинов кролика против бактерий
рода Bacillus. В аналитическую зону наносили те же иммуноглобулины, а в
контрольную зону мембраны козьи антикроличьи антитела. Иммунохроматография
бактериальной суспензии
приводила к появлению окрашенных полос на
нитроцеллюлозной мембране, свидетельствующих об образовании иммобилизованных
на мембране комплексов коллоидного золота, антител и бактериальных клеток в
аналитической зоне, и комплексов конъюгат-антивидовое антитело в контрольной
зоне.
Снимки топографии поверхности изученных объектов, полученные с помощью
атомно-силового микроскопа easyScan (Nanosurf, Швейцария), приведены на рис. 1 – 4.
Микроскоп работал в динамической моде ДСМ “Intermittent Contact”).
Измерения проводили на воздухе при комнатной температуре. Время, затрачиваемое
на сканирование линии - 0.5 с, параметр цепи обратной связи 11, задаваемая рабочая
точка амплитуды колебаний кантилевера 50 % (относительно колебаний вдали от
резонанса). Число точек сканирования в каждом опыте 128 × 128. Использовалась
377
дополнительная защита ДСМ от внешних возбуждений с помощью динамического
антивибрационного столика TS – 150. Области сканирования указаны на рис.1 – 4;
слева приведены изображения вида сверху, а справа – трехмерные изображения.
Рис. 1. Топография поверхности мембраны Millipor НF 120
Рис. 2. Топография поверхности мембраны Millipor НF120 c нанесенными иммуноглобулинами кролика
против споровой формы бактерий Bacillus.
378
Рис. 3 - Топография поверхности аналитической линии иммунохроматограммы споровой
формы бактерий Bacillus на мембране Millipor НF120.
Рис. 4. Топография поверхности контрольной линии иммунохроматограммы споровой формы бактерий
Bacillus на мембране Millipor НF120.
На рис.1 выявляются характерные особенности структуры поверхности чистой
исходной полимерной мембраны. На рис.2 приведены изображения мембраны с
нанесенными антителами захвата в аналитической полосе. На рис.3 представлено
изображение
поверхности
аналитической
полосы
после
прохождения
иммунохимической реакции связывания золотого конъюгата с клетками Bacillus и
последующей
иммобилизации
образовавшегося
комплекса
на
иммунохроматографической мембране. Видны конгломераты иммунных комплексов
клеток Bacillus с линейными размерами около 3 мкм, «окрашенных» конъюгатом
379
золота имобилизованные на волокнах иммунохроматографической мембраны. На рис.4
показано изображение поверхности контрольной линии иммунохроматографической
тест полоски. Волокна поверхности мембраны «окрашены» конъюгатом золота,
иммунохимически связанного
с козьими антикроличьими иммуноглобулинами,
иммобилизованными в контрольной зоне. Конгломератов, присущих клеткам
бактерий, не наблюдается.
Таким образом, изучение топографии поверхности иммунохроматографических
мембран с помощью атомно – силовой микроскопии до и после прохождения
иммунохимической реакции позволяет наблюдать иммунохимические комплексы
клеток, конъюгатов нано размерного коллоидного золота и антител,
иммобилизованных на мембране.
1. Lim D.V., Simpson J.M., Kearns E.A. et al. Current and developing technologies for
monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (4): 583607.
2. Grunow R., Splettstoesser W., McDonald S. et al. Detection of Francisella tularensis in
biological specimens using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an
immunochromatographic handheld assay, and a PCR. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology. 2000; 7(1):86-90.
3. Chanteau S., Rahalison L., Ratsitorahina M. et al. Early diagnosis of bubonic plague
using F1 antigen capture ELISA assay and rapid immunogold dipstick. J. Med. Microbiol.
2000; 290: 279-283.
4. Shin H. S., Kim C. K., Shin K. S. et al. Pretreatment of whole blood for use in
immunochromatographic assays for hepatitis B virus surface antigen. Clinical and
Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8(1):9-13.
5. Valiev H H, Zhogin V A, Karnet Yu.N. et al. Studies on surface structure of polymer
membranes – biosensor carriers with dynamic force microscopy. J. of Physics: Conference
Series 2007; 61: 384 - 388
STUDIES ON THE SURFACE STRUCTURE OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC
MEMBRANES BY DYNAMIC FORCE MICROSCOPY
S.P. Yarkov, I.V. Shilenko,
State Scientific Center - State Scientific Research Institute of Biological Engineering, Moscow, niibp@dol.ru
H.H. Valiev, Yu.N.Karnet, N. S. Snegireva, Yu. G. Yanovsky
Institute of Applied Mechanics Russian Academy of Science, Moscow, hhvlv@mail.ru
The surface structure of polymer membranes, used in the design of immunochromatograthic tests, was
studied by the method of atomic force microscopy. Data on the topography of membranes piled up with
antibodies and immune complexes, forming in the process of analyses bacteria cells suspensions, were obtained.
380