Центральный научно-исследовательский институт
advertisement
На правах рукописи Ситдыкова Юлия Равильевна Влияние антиретровирусной терапии на динамику CD4-лимфоцитов и экспрессию Т-клетками иммунологических маркеров у пациентов, инфицированных ВИЧ 14.00.10 – инфекционные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2006 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Покровский Вадим Валентинович Научный консультант: Кандидат медицинских наук Серебровская Лидия Васильевна Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Кожевникова Галина Михайловна Доктор медицинских наук Полякова Алла Марковна Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Росздрава Защита состоится 3 ноября 2006 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.114.01 ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123,г. Москва, ул. Новогиреевская, 3а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Автореферат разослан «___» ___________ 2006 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич 2 Актуальность проблемы Инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), является одной из наиболее актуальных проблем системы здравоохранения. Пандемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным Объединенной программы Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИДу и Всемирной Организации Здравоохранения, в 2005 году унесла жизни около 3,1 миллионов жителей Земли [Юнэйдз, ВОЗ, 2005]. Количество российских граждан, инфицированных ВИЧ, с каждым годом увеличивается. Согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом на 30 сентября 2006 года на территории Российской Федерации было официально зарегистрировано более 370 тысяч человек, живущих с ВИЧ-инфекцией. В течение последних 13 лет в г. Москве, как и в других регионах страны, наблюдался ежегодный рост числа погибших ВИЧ-инфицированных больных [Тишкевич О.А., Шахгильдян В.И., Пархоменко Ю.Г., 2004]. Из-за широкого распространения внутривенных наркотиков ВИЧ инфекция поражает людей преимущественно молодого возраста, что приводит к тяжелым демографическим и социально-экономическим последствиям. ВИЧ-инфекция характеризуется постепенным снижением числа CD4 лимфоцитов и прогрессирующей иммунной дисфункцией. Количество CD4 Тклеток продолжает оставаться основным лабораторным маркером прогрессии ВИЧ-инфекции и является критерием для назначения антиретровирусной терапии. Многочисленными исследованиями показано, что уровень CD4 лимфоцитов перед началом лечения определяет его эффективность и прогноз течения болезни. Несмотря на то, что огромная значимость показателя CD4 очевидна, технологии для подсчета количества CD4-лимфоцитов развиваются медленно. Количество проточных цитометров – приборов для определения количества CD4на территории Российской Федерации до сих пор ограничено. Однако даже в лабораториях, оснащенных проточными цитометрами, для анализа часто используются устаревшие методики. Отсутствие надежных, доступных, а 3 главное, стандартных и общепринятых подходов для определения количества CD4-лимфоцитов результаты и на проточном приводит к цитометре, неправильной неизбежно оценке компрометирует состояния пациента, несвоевременному назначению терапии и неадекватному мониторингу ее эффективности. Традиционно используемый двух-платформенный метод (ДП) включает определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов на проточном цитометре с использованием моноклональных количественного содержания клеток гематологического анализатора, позволяющего антител. необходимо Для оценки использование определить количество лейкоцитов и лимфоцитов в образце периферической крови, после чего путем математического пересчета получают окончательный результат. В отличие от двух-платформенного одно-платформенный (ОП) метод позволяет получить абсолютные значения числа CD4-лимфоцитов с помощью только одного проточного цитометра, путем добавления к образцу частиц известной концентрации. Использование данного подхода позволяет увеличить сроки хранения образцов до 72 часов, значительно уменьшает внутрилабораторную и межлабораторную вариабельность абсолютных показателей [Gratama JW.et al, 2002]. Трех и четырехцветный анализ с гейтированием по CD45 и одноплатформенным методом является стандартной методикой для определения CD4 Т-клеток у ВИЧ-инфицированных в Европе и Северной Америке. На территории Российской Федерации до настоящего времени одно-платформенный метод практически не использовался. В 2002 году Деборой Гленкросс была предложена методика PLG (Panleukogating), в основе которой лежит использование общего лейкоцитарного маркера CD45 для идентификации популяции лейкоцитов. Первоначально этот метод был предложен, как двух-платформенный: для подсчета абсолютного количества CD4 клеток использовалось общее количество лейкоцитов, полученное на гематологическом анализаторе. Преимущество данного подхода по сравнению с традиционным двух-платформенным методом заключается в том, что из подсчета абсолютного количества CD4 клеток исключается наиболее 4 уязвимое звено – определение процентного содержания лимфоцитов на гематологическом анализаторе. Именно этот показатель наиболее скомпрометирован у тяжелых пациентов с лимфопенией и ранее всего страдает при старении образцов крови. Позднее было предложено использовать методику PLG в качестве одноплатформенного метода, путем добавления к образцу частиц для абсолютного счета. В таком варианте методика позволяет осуществлять подсчет общего количества лейкоцитов, процентное и абсолютное содержание лимфоцитов, процентное и абсолютное содержание CD4 клеток, исключая необходимость использования гематологического анализатора. Таким образом, апробация и внедрение новых методик для определения количества CD4-лимфоцитов является одной из первоочередных задач для становления инфраструктуры мониторинга ВИЧ-инфекции в Российской Федерации. Развитие вторичных заболеваний, как правило, наблюдается при снижении количества CD4 лимфоцитов ниже 200 кл/мкл, однако тяжелые оппортунистические инфекции могут развиваться и у пациентов с относительно высоким содержанием CD4. [Рахманова А.Г. и соавт., 2002]. Таким образом, исследование только количества CD4 Т-клеток недостаточно для того, чтобы в полной мере оценить глубину поражения иммунной системы у больных ВИЧинфекцией. В настоящее время иммунофенотипирование у ВИЧ-инфицированных больных, как правило, ограничивается определением содержания CD4 и CD8 лимфоцитов, исследование же других поверхностных маркеров используется крайне редко. Это объясняется малой изученностью экспрессии поверхностных молекул у ВИЧ-инфицированных лиц и ее клинического значения. В ранее проведенном исследовании было выявлено, что определение основных субпопуляций лимфоцитов – Т-клеток, В-клеток, натуральных киллеров – недостаточно для оценки нарушений в системе иммунитета [Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Шахгильдян В.И., 1999]. В то же время, исследование других иммунологических маркеров может дать дополнительную информацию о 5 состоянии пациента, прогнозе течения заболевания и эффективности антиретровирусной терапии. У больных ВИЧ-инфекцией CD4 и CD8-лимфоциты имеют ряд аномалий фенотипа, в частности, увеличение экспрессии CD25– рецептора к интерлейкину 2, CD95–маркера, обусловливающего повышенную чувствительность к апоптозу, а также маркера активации CD38. Кроме того, наблюдается изменение соотношения «наивных» Т-клеток (зрелых неиммунных лимфоцитов) – ранее не встречавшихся с антигеном, и клеток памяти, отмечается нарушение экспрессии CD28, CD40L – важнейших ко-стимуляторных молекул, необходимых для эффективного иммунного ответа [Carcelain C., Li T, 1999]. Лимфоциты при ВИЧ-инфекции имеют повышенный уровень экспрессии CD57, отражающий сниженную способность клеток к делению [Brenchley J.M., Karandikar N.J., 2003]. В то же время вопрос о клиническом значении этих маркеров и возможности коррекции иммунных нарушений под влиянием антиретровирусной терапии остается открытым. Таким образом, использование современных методик подсчета СD4 Тклеток и их стандартизация, а также определение дополнительных иммунологических маркеров необходимы для оптимизации мониторинга течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности лечения. Цель исследования: разработка методов прогноза эффективности антиретровирусной терапии с помощью исследования динамики количества CD4 лимфоцитов и экспрессии Т-клетками иммунологических маркеров. Задачи: 1. Оценить точность и надежность современных методов определения количества CD4 лимфоцитов на проточном цитометре 2. Выявить влияние ВИЧ-инфекции на содержание «наивных» CD4 лимфоцитов и CD4 Т-клеток памяти, и оценить их динамику при проведении антиретровирусной терапии. 3. Изучить экспрессию CD4 Т-клетками молекул CD28, CD40L у пациентов, инфицированных ВИЧ, под влиянием антиретровирусной терапии. 4. Оценить содержание CD8+CD38+ (активированных) клеток у ВИЧинфицированных пациентов и их динамику в процессе лечения. 6 5. Исследовать содержание CD8+CD57+ и CD8+CD28+ лимфоцитов при ВИЧ-инфекции и под влиянием антиретровирусной терапии. 6. Оценить экспрессию CD4 Т-клетками рецепторов к интерлейкину 2 (CD25) и CD95 (Fas) и их динамику на фоне антиретровирусной терапии. 7. Определить значение исследуемых иммунологических маркеров для оценки эффективности антиретровирусной терапии и прогноза течения ВИЧ-инфекции. Научная новизна исследования Впервые в России у пациентов, инфицированных ВИЧ, исследовано содержание «наивных» CD4 Т-клеток и клеток памяти, изучена частота экспрессии Т-клетками активационных и функциональных маркеров в сравнении с контрольной группой здоровых лиц, а также экспрессия Т-клетками иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии. Впервые была выявлена зависимость исходного фенотипа лимфоцитов и иммунного ответа на лечение. Практическое значение работы В результате данной работы оптимизирована и стандартизована технология подсчета СD4 Т-клеток на проточном цитометре. Подготовлены и изданы Методические рекомендации по определению количества СD4 лимфоцитов на проточном цитометре у пациентов, инфицированных ВИЧ [Минздравсоцразвития России, 2004]. Предложены дополнительные критерии для оценки эффективности антиретровирусной терапии и прогноза течения ВИЧ-инфекции. Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, а также используются при подготовке лекций для врачей-инфекционистов и врачей лаборантов в рамках обучающих семинаров на базе Федерального научнометодического центра по профилактике и борьбе со СПИДом. Апробация диссертации По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Материалы диссертации были доложены на II Российской научно-практической конференции 7 по вопросам ВИЧ-инфекции и парентеральных вирусных гепатитов, г. Суздаль, 2002 г.; на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», г. Санкт-Петербург, 2004 г.; на 6 Международной конференции по лекарственной терапии ВИЧ-инфекции, г. Глазго, 2002 г.; на 9 Европейском конгрессе по СПИД, г. Варшава, 2003 г. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 10 отечественных и 92 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 6 таблицами и 3 клиническими примерами. Содержание работы Материалы и методы исследования Для изучения динамики иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии в исследование были включены 45 пациентов, 31 мужчина и 14 женщин, средний возраст составил 28+9,9 лет. Все пациенты имели подтвержденный диагноз ВИЧ-инфекции. У 25 пациентов (55,6%) заражение произошло путем внутривенного употребления наркотических средств, 13 пациентов (28,9%) заразились при гетеросексуальных, а 7 (15,6%)– при гомосексуальных половых контактах. У 40 пациентов (88,9%) на момент включения в исследование была установлена латентная стадия ВИЧ-инфекции (стадия III в соответствии с классификацией В.И. Покровского 2001 года), то есть клинические проявления ВИЧ-инфекции отсутствовали. При физикальном осмотре у этих больных, как правило, удавалось лимфатических узлов; обнаружить чаще лишь всего - увеличение периферических подчелюстных, переднешейных, заднешейных, затылочных, надключичных и подмышечных. У 25 пациентов (55,6%) на момент начала исследования были выявлены антитела к вирусному гепатиту С, у одного пациента (2,2%) помимо этого обнаруживали поверхностный антиген вируса гепатита В. У 13 из них (52%) 8 регистрировали повышение уровней аминотрансфераз, не превышающее верхнюю границу нормальных значений более чем в 3 раза. У 10 пациентов (40%) выявляли умеренную гепатомегалию. У 5 пациентов (11,1%) на момент начала лечения или в анамнезе были клинические проявления вторичных заболеваний (IV стадия ВИЧ-инфекции): у двух пациентов (4,4%) в анамнезе был рецидивирующий опоясывающий лишай, у двух других больных (4,4%) на момент начала исследования выявляли кандидоз слизистой оболочки полости рта; у одного пациента до начала лечения были диагностированы остроконечные кондиломы перианальной области. Среднее содержание CD4 лимфоцитов до начала исследования составило 275+141 клеток/мкл (медиана 271 клеток/мкл). Количество РНК ВИЧ в плазме на момент начала антиретровирусной терапии в среднем составляло 4,75+0,53 log10 копий/мл (медиана 4,69 log10 копий/мл). В контрольную группу было включено 27 человек (16 мужчин и 11 женщин), средний возраст которых составил 28+10,8. Критерием отбора лиц в контрольную группу было отсутствие ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов, аутоиммунных состояний, а также любых острых заболеваний на момент обследованиям. Всем пациентам была назначена антиретровирусная терапия. Показаниями для ее назначения было наличие клинических проявлений вторичных заболеваний и/или снижение абсолютного количества CD4 лимфоцитов менее 350 клеток в мкл и/или уровень РНК ВИЧ в плазме более 55 000 копий в 1 мл [DHHS Guidelines, 2002]. Терапевтическая схема включала два препарата из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы – ламивудин (3ТС) по 150 мг 2 раза в сутки и ставудин (d4T) по 40 мг 2 раза в сутки (при массе больного менее 60 кг – 30 мг 2 раза в день) и усиленный ингибитор протеазы (ИП), - калетра (лопинавир/ритонавир) по 400/100 мг 2 раза в сутки или типрановир с ритонавиром по 500/200 мг 2 раза в сутки. Период наблюдения составил 6 месяцев. Обследование больных проводили до начала терапии и через 4, 12 и 24 недели лечения. При каждом визите 9 осуществляли физикальный осмотр пациента, забор крови для исследования: анализ периферической крови, биохимический анализ крови, определение количества CD4 лимфоцитов, вирусной нагрузки, а также исследование экспрессии иммунологических маркеров. Методом проточной цитометрии (проточный цитометр Epics XL, Beckman Coulter) с использованием моноклональных антител (Iotest, Beckman Coulter) определяли процентное содержание CD4+CD28+, CD4+CD25+, CD4+CD95+, CD4+CD40L+, CD4+CD45Ro+, CD8+CD28+, CD8+CD38+, CD8+CD57+ клеток в популяции лимфоцитов, а также процент CD4 и CD8 лимфоцитов, несущих каждый из вышеуказанных маркеров, процент CD4, ко-экспрессирующих CD45Ra и CD62L («наивные» клетки) и процент CD3, ко-экспрессирующих CD8 и CD57. На всех визитах с пациентами проводили консультирование, направленное на повышение приверженности лечению. Критерием эффективности лечения было снижение количества РНК ВИЧ в плазме ниже уровня, определяемого тест-системой (менее 400 копий/мл, Amplicor HIV-1 Monitor, Roche), а также прирост CD4 лимфоцитов. Для сравнения методик определения количества CD4 лимфоцитов использовали образцы цельной крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Для сравнения одно-платформенного и двух платформенного методов подсчета абсолютного количества CD4 было исследовано 106 образцов свежей цельной крови, для изучения возможности отсроченного исследования был проанализирован 51 образец крови в день забора и через 72 часа (на 3 сутки) после забора. Содержание CD4 лимфоцитов определяли с использованием трехцветного анализа с гейтированием по CD45 (моноклональные антитела Iotest, Beckman Coulter) Для оценки методики PLG ОП было исследовано 106 образцов свежей крови, PLG ДП - 100 образцов. Для статистического анализа использовали критерии Стьюдента, МаннаУитни, парный критерий Стьюдента и критерий Уилкоксона, в зависимости от характера распределения значений выборки. Согласие методов определения количества CD4 лимфоцитов оценивали при помощи регрессионного анализа, анализа Блэнда-Алтмана (БА) и выявления процентного сходства (определяли среднее процентное сходство, среднюю 10 процентную разницу - MPD, коэффициент вариации - CV). Статистическую обработку данных осуществляли при помощи компьютерных программ GraphPadPrizm 4 и Microsoft Excel. Результаты исследования и их обсуждение При сравнении одно-платформенного и двух-платформенного методов подсчета абсолютного количества CD4, анализ Блэнда-Алтмана показывает отсутствие систематического расхождения и относительно небольшой разброс значений (0,7+76,5 кл/µ). Среднее процентное сходство составило 102%, MPD=2+12%, CV=12%. Сравнительный анализ значений, полученных при исследовании образцов непосредственно после забора крови и на 3 сутки, показал почти полное отсутствие систематического расхождения (1 кл/µ). При этом разброс абсолютных значений также был относительно небольшим (+81 кл/µ). Анализ процентного сходства дал очень хорошие результаты: среднее процентное сходство составило 99,8%, MPD=0,2+4%, CV=4%. Методика PLG ОП по сравнению с трехцветным протоколом в сочетании с одно-платформенным методом подсчета CD4-лимфоцитов показала небольшие систематическое расхождение (-16 кл/µ) и разброс значений. Анализ процентного сходства дал хорошие результаты: среднее процентное сходство составило 102%, MPD=2+4,6%, CV=4,5%. Основным преимуществом вышеперечисленных методик является возможность исследований образцов в течение 72 часов. Результаты наших исследований показали, что при хранении образцов при комнатной температуре анализ на третьи сутки дает надежный результат, в то время как использование двух-платформенного ограничивает сроки хранения образцов 6-12 часами. При сравнении методики PLG ДП и стандартного метода стандартное расхождение и разброс значений был несколько выше и составил -24+85 кл/µ. При этом показатели анализа процентного сходства были достаточно неплохими: среднее процентное сходство составило 103%, MPD=3+7,9%, CV=7,6%. Таким образом, оптимальными методиками для определения количества CD4 Т-лимфоцитов можно считать трех и четырехцветный анализ с гейтированием по CD45 и методику PLG с одно-платформенным методом 11 подсчета абсолютного количества при наличии постоянного мониторинга скорости потока частиц. Использования современных стандартизованных лабораторных методов исследования позволяет получить объективную оценку нарушений в системе иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией, а также осуществлять мониторинг эффективности антиретровирусной терапии. Наиболее сложным этапом нашей работы было изучение динамики количества CD4 лимфоцитов и экспрессии Т-клетками иммунологических маркеров под влиянием антиретровирусной терапии. Высокоактивная антиретровирусная терапия была назначена 45 пациентам, 44 из которых завершили 24 недели лечения. Один пациент самостоятельно прервал терапию после 4 недели. За время наблюдения ни у одного из больных клинических признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции выявлено не было. Состояние больных оставалось удовлетворительным, большинство пациентов отмечало улучшение общего самочувствия. На фоне терапии у 68% пациентов были нежелательные явления, чаще всего - диспептические расстройства, проявлявшиеся тошнотой, жидким стулом. Данные симптомы, как правило, имели легкое течение, транзиторный характер и самостоятельно купировались через 10-14 дней лечения. Однако у одного пациента диарея на протяжении всего периода терапии требовала медикаментозной коррекции. У пациентов, имеющих маркеры гепатитов С и В, клинических и лабораторных признаков ухудшения течения хронического заболевания печени не было. Больные с проявлениями вторичных заболеваний на фоне лечения отмечали улучшение самочувствия. У пациента с остроконечными кондиломами в перианальной области их рост прекратился. У больных, страдавших кандидозом слизистых полости рта до начала ВААРТ, отметили исчезновение клинической симптоматики после короткого курса флуконазола и в дальнейшем, в процессе ВААРТ, не наблюдали рецидивов заболевания. У двух пациентов, 12 имевших в анамнезе опоясывающий лишай, на фоне применения антиретровирусной терапии не отмечали возникновения его рецидивов. Исследование поверхностных иммунологических маркеров у ВИЧ- инфицированных пациентов показало значительные изменения фенотипа CD4 и CD8 лимфоцитов по сравнению с ВИЧ-негативными лицами. Необходимо отметить, что определение процентного содержания клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры, в популяции CD4 и CD8 лимфоцитов было более информативным, чем исследование этих клеток в общей популяции лимфоцитов, поскольку истинные тенденции были часто завуалированы уменьшением количества CD4 или увеличением числа CD8 лимфоцитов. Так, например, у больных ВИЧ-инфекцией в общей популяции лимфоцитов отмечено выраженное уменьшение процентного содержания CD4+CD45Ra+CD62L+ клеток («наивных») и CD4+CD45Ro+ (памяти) (p<0,0001 по сравнению с контрольной группой). В то же время при исследовании процента клеток, имеющих фенотип памяти среди CD4-лимфоцитов было обнаружено его увеличение (р=0,0121). При этом было выявлено уменьшение доли «наивных» клеток (р=0,0156). Таким образом, у больных ВИЧ-инфекцией в популяции CD4-лимфоцитов соотношение «наивных» клеток и клеток памяти было достоверно снижено и в среднем составило 0,6 по сравнению с 0,85 в контрольной группе (р=0,02). В общей популяции лимфоцитов за счет уменьшения числа CD4 наблюдалось уменьшение количества CD4+CD40L+, CD4+CD28+, CD4+CD25+ клеток. Однако при исследовании процентного содержания CD4 лимфоцитов, несущих вышеперечисленные маркеры, мы выявили, что у ВИЧ- инфицированных пациентов по сравнению со здоровыми лицами отмечается увеличение доли клеток, несущих CD40L (p<0,0001), уменьшение процента клеток, экспрессирующих CD28 (р=0,0019), а экспрессия CD25 достоверно не отличается от значений в контрольной группе. Повышенная экспрессия CD40L у больных ВИЧ-инфекцией отражает активацию CD4 лимфоцитов в ответ на наличие вируса в организме. Снижение экспрессии CD4 лимфоцитами молекулы CD28, по данным зарубежных исследований, сопровождается уменьшением 13 эффективности вакцинации у больных ВИЧ-инфекцией, что свидетельствует о неполноценности иммунного ответа [Lange C.G. et al, 2003]. Достоверной разницы в процентном содержании CD4+CD95+ в общей популяции лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных больных по сравнению со здоровыми лицами получено не было, однако процент CD4 клеток, экспрессирующих CD95, был значительно выше у ВИЧ-инфицированных пациентов (p<0,0001). Проведенный регрессионный анализа позволил выявить зависимость и отрицательную корреляцию этого показателя и абсолютного содержания CD4 лимфоцитов (r=-0,3291,р = 0,0273). Регрессионный анализ также выявил зависимость между экспрессией CD95 и содержанием CD4 клеток памяти. Была обнаружена прямая корреляция этих показателей (r=0,4651; p=0,0015). Эти наблюдения подтверждают существенное значение апоптоза как одного из механизмов уменьшения количества CD4 при ВИЧ-инфекции. CD8 лимфоциты у больных ВИЧ-инфекцией также имели выраженные аномалии фенотипа. Обнаружено значительное увеличение числа CD8+CD38+ лимфоцитов и процента CD8 клеток, экспрессирующих CD38, по сравнению с контрольной группой (p<0,0001). При регрессионном анализе была выявлена зависимость и прямая корреляция этих изменений с вирусной нагрузкой (r=0,5165, р=0,0003 и r=0,4449, р=0,0022 соответственно). Кроме того, регрессионный анализ выявил наличие зависимости и обратной корреляции содержания CD8+CD38+ лимфоцитов и процента CD8 клеток, экспрессирующих CD38, с абсолютным количеством CD4 (r=-0,315; р=0,0348 и r= -0,37; р=0,012 соответственно). Эти явления отражают хроническую активацию CD8 лимфоцитов в ответ на постоянное присутствие вируса Исследование процентного содержания CD8+CD28+ клеток в популяции лимфоцитов было совершенно неинформативным, поскольку за счет увеличения количества CD8 в целом, истинные тенденции, как и в предыдущих случаях, были замаскированы. В то же время у ВИЧ-инфицированных пациентов было обнаружено значительное уменьшение процента CD8 лимфоцитов, несущих CD28 (p<0,0001) по сравнению со здоровыми лицами. По данным западных исследований потеря CD28 сопровождается уменьшением способности CD8 14 лимфоцитов к пролиферации, что отчасти может объяснять потерю контроля над вирусом [Effros, 2003] Еще одной особенностью фенотипа CD8 лимфоцитов при ВИЧ-инфекции была повышенная экспрессия CD57. У наших больных отмечено значительное увеличение числа CD8+CD57+ клеток и процента CD8, несущих CD57 (p<0,0001 и p<0,0001 соответственно) по сравнению со здоровыми донорами. Полученные нами данные согласуются с результатами других авторов, по мнению которых повышенный уровень экспрессии CD57 также как и снижение экспрессии CD28 CD8-лимфоцитами отражает сниженную способность клеток к делению [Brenchley J.M., Karandikar N.J., 2003]. Сравнительная характеристика аномалий фенотипа у ВИЧ- инфицированных пациентов по сравнению с контрольной группой представлена на рисунке 1. Следующим этапом нашей работы было изучение динамики CD4лимфоцитов и экспрессии поверхностных маркеров CD4- и CD8-лимфоцитами под влиянием высокоактивной антиретровирусной терапии. Через 24 недели в результате ВААРТ отмечено снижение вирусной нагрузки ниже порога определения тест-системой у 39 из 44 больных (88,6%) в результате чего регистрировали рост относительного и абсолютного содержания CD4 лимфоцитов (таблица 1). Рис. 1. Процентное содержание CD4 и CD8 лимфоцитов, несущих исследуемые маркеры, у ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ-негативными донорами. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ВИЧ- CD 4+ CD CD 28 4+ + CD 40 CD L+ 4+ CD CD 95 CD 4+ + 4+ CD CD 45 25 Ra + +C D 62 CD L+ 4+ CD 45 CD Ro 8+ CD 28 CD + 8+ CD 38 CD + 8+ CD 57 + ВИЧ+ 15 Увеличение количества CD4 наблюдали в течение первых 12 недель лечения, причем в максимальный прирост - в первые 4 недели, в дальнейшем повышение числа CD4-клеток было незначительным. Параллельно с увеличением числа CD4 лимфоцитов обнаруживали уменьшение процентного содержания CD8 лимфоцитов. Под влиянием ВААРТ мы наблюдали значительные изменения экспрессии поверхностных маркеров CD4 лимфоцитами. Через 4 недели лечения отмечали увеличение процентного содержания CD4+CD45Ra+CD62L+ клеток («наивных») и CD4+CD45Ro+ (памяти) в общей популяции лимфоцитов (p<0,0001), при этом изменения соотношения этих субпопуляций не выявляли. С 4 по 12 неделю терапии увеличилась доля «наивных» клеток в популяции CD4-лимфоцитов, (р=0,0037), а с 12 по 24 неделю уменьшилась доля клеток памяти (р=0,0035). Таким образом, уже к 12 неделе лечения соотношение «наивных» клеток и клеток памяти в популяции CD4-лимфоцитов достоверно увеличилось по сравнению с исходным значением. Эти тенденции сохранялись и к 24 неделе. Таким образом, прирост количества CD4 лимфоцитов в первый месяц лечения был обусловлен в равной степени увеличением содержания «наивных» клеток и клеток памяти, а в последующем - преимущественно «наивных» CD4. Для оценки возможного влияния содержания клеток памяти на динамику количества CD4 лимфоцитов на фоне ВААРТ мы разделили пациентов на 2 группы. Таблица 1. Динамика РНК ВИЧ и количества CD4 и CD8 лимфоцитов под влиянием ВААРТ Показатели До лечения 4 недели 12 недель 24 недели CD4%, медиана 20 22**** 23**** 23,5*** CD4 клеток/мкл, медиана 271 326**** 346,5**** 323**** CD8%, медиана 54 49**** 49,5**** 47*** CD8 клеток/мкл, медиана 791,5 684 755 698 РНК ВИЧ, log 10 копий/мл, медиана 4,69 3,1**** 2,48**** 2,25**** % CD4+CD45RA+CD62L, медиана 33 30 38** 36* % CD4+CDRA+, среднее 7,6 8,7** 9,4*** 10* 16 %CD4, несущих CD45RO, медиана 59 59 59 53 %CD4+CD45RO+, медиана 11 12*** 13*** 13** %CD4, несущих CD40L, медиана 34 31** 32* 28**** %CD4+CD40L+, медиана 7 7 8 6 %CD4, несущих CD95, медиана 35 27*** 26**** 27**** %CD4+CD95+, медиана 7 6 5** 5,5* %CD4, несущих CD25, медиана 26 23 26 25 %CD4+CD25+, медиана 5 5 5 5,5* %CD4, несущих CD28, медиана 84 85 83,5 83 %CD4+CD28+, медиана 17 18**** 19**** 18**** %CD8, несущих CD28, медиана 23 25*** 27,5**** 26,5** %CD8+CD28+, медиана 13 14 13,5 13 %CD8, несущих CD38, медиана 66 59**** 58**** 51,5**** %CD8+CD38+, медиана 37 30**** 28,5**** 21**** 23 21* 24 22 18 16** 18 17 %CD3, несущих CD8 и CD57, медиана %CD8+CD57+, медиана * P< 0,05;** P< 0,01; *** P<0,001; **** P<0,0001 с показателями до лечения В первой группе (17 пациентов) до начала ВААРТ более 60 % CD4лимфоцитов имели фенотип CD4+CD45Ro+, во второй (27 больных) – 60% и менее. Проведенный анализ показал отличия в динамике количества CD4 лимфоцитов в этих двух группах. Через 24 недели лечения медиана прироста CD4 у больных 1 первой группы была значительно ниже и составила 34,5 кл/мкл по сравнению с 133 кл/мкл во второй группе. Абсолютное содержание CD4 лимфоцитов на 24 неделе лечения было достоверно выше у пациентов второй группы (р=0,0317), тогда как до начала терапии значения этого показателя у пациентов обеих групп статистически не различались. Мы также провели анализ иммунологического ответа на ВААРТ в зависимости от исходного содержания «наивных» клеток. Мы разделили пациентов на 2 группы: в первую группу пошли пациенты, у которых до начала лечения содержание CD4+CD45Ra+CD62L+ лимфоцитов («наивных») составляло 17 менее 30%, во вторую – 30% и более (в среднем этот показатель составлял 28%). Численность первой группы составила 18 человек, второй – 26. Результаты этого анализа были сходными с результатами предыдущего. У больных из группы с низким содержанием «наивных» клеток прирост абсолютного количества CD4 лимфоцитов к 24 неделе ВААРТ был значительно меньше и составил 47,5 кл/мкл по сравнению со 133 кл/мкл в группе с высоким содержанием «наивных» клеток. На 24 неделе лечения количество CD4 в группе пациентов с исходно высоким содержанием «наивных» клеток было достоверно выше (р=0,0227) при том, что статистически значимых отличий в этих двух группах исходно обнаружено не было. При использовании в качестве маркера соотношение «наивных» клеток и клеток памяти в исследуемой группе его значение в среднем составило 0,6. Мы разделили пациентов на две группы: в первую вошли пациенты с соотношением менее 0,6, во вторую – 0,6 и более. В результате в первой группе оказалось 24 пациентов, во второй – 20. Сравнительный анализ групп показал те же закономерности, что и два предыдущих. Увеличение числа CD4 лимфоцитов был выше в группе с высоким соотношением «наивных» клеток и клеток памяти, медиана его составила 161 кл/мкл. В группе с низким показателем соотношения медиана прироста оказалось равной 10 кл/мкл (таблица 2). На 24 неделе лечения абсолютное количество CD4 было достоверно выше в группе с высоким показателем соотношения (р=0,0235), в то время как до лечения содержание CD4-клеток у больных обеих групп было одинаковым, а динамика РНК ВИЧ также не имела существенных отличий. Регрессионный анализ подтвердил наличие этой зависимости, была выявлена статистически значимая корреляция: r = 0,3141, p < 0,05. Таким образом, определение процентного содержания «наивных» клеток и клеток памяти и их соотношения до начала терапии может служить прогностическим маркером иммунологической эффективности ВААРТ. Таблица 2. Сравнительный анализ динамики CD4 лимфоцитов под влиянием ВААРТ в зависимости от исходного значения соотношения «наивных» CD4 клеток и клеток памяти. 18 Группа n Медиана %CD4 Неделя 0 19 Медиана %CD4 Неделя 24 21 Медиана CD4 кл/мкл Неделя 0 281 Медиана CD4 кл/мкл Неделя 24 291 Приро ст (%) 25 Соотношение «наивных» CD4 и клеток памяти <0,6 1 2 20 >0,6 20 26 262 423 61,5% 3,6% Достоверное увеличение процента CD4+CD28+ клеток в общей популяции лимфоцитов наблюдали уже к 4 неделе терапии (p<0,0001), после чего прирост остановился. В тоже время каких-либо значительных изменений в проценте CD4, экспрессирующих CD28, не выявлено. Исключением были 2 пациента, страдавшие вторичными заболеваниями и исходно имевшие очень низкий уровень экспрессии CD28: к 4 неделе ВААРТ у них отмечено двукратное увеличение процента CD4, несущих CD28. К 4 неделе лечения мы выявили снижение процента CD4 лимфоцитов, экспрессирующих CD40L (р=0,001), которое замедлилось в течение следующих двух месяцев, а затем снова возобновилось после 12 недель терапии (p<0,0001). Это, вероятно, обусловлено снижением активации клеток вследствие подавления репликации ВИЧ. Однако зависимости между уровнем экспрессии CD40L и количеством CD4 лимфоцитов или уровнем вирусной нагрузки мы не обнаружили. В первые 12 недель ВААРТ наблюдали резкое уменьшение процента CD4, несущих CD95, причем наиболее выраженное снижение отмечали в первые 4 недели терапии (р=0,004). К 24 неделям достоверность изменений этого показателя стала еще выше (p<0,0001). Снижение экспрессии CD95 было настолько сильным, что, несмотря на существенное увеличение количества CD4, выявляли достоверное уменьшение CD4+CD95+ клеток в популяции лимфоцитов (р=0,024). Содержание CD4+CD25+ клеток под влиянием лечения постепенно увеличивалось и к 24 неделе стало статистически достоверным (р=0,0256), при этом процент CD4 клеток, экспрессирующих CD25, в течение первых 4-х недель лечения уменьшился (p=0,0011), а затем имел тенденцию к увеличению, в 19 результате чего к 24 неделе ВААРТ статистически достоверных изменений по сравнению с исходными данными получено не было. Под влиянием терапии наблюдаются изменения фенотипа CD8 лимфоцитов. В течение 24 недель ВААРТ наблюдалось прогрессирующее снижение CD8+CD38+ лимфоцитов и процента CD8-лимфоцитов, несущих CD38 (p<0,0001). На 12 и 24 неделе была выявлена прямая корреляция обоих значений с вирусной нагрузкой (r=0,4759; p=0,0013 и r=0,4680; p=0,0014 соответственно). Изучение экспрессии CD38 CD8-лимфоцитами может иметь большое клиническое значение, поскольку данный показатель, с одной стороны, напрямую коррелирует с вирусной нагрузкой, с другой стороны имеет обратную корреляционную связь с количеством CD4-клеток. Таким образом, экспрессию CD8-лимфоцитами CD38 можно рассматривать как независимый маркер, имеющий собственную значимость для оценки эффективности лечения. Исследование этого маркера может быть полезным в тех случаях, когда по какойлибо причине анализ количества РНК ВИЧ невозможен. Под влиянием ВААРТ наблюдали достоверное увеличение процента CD8лимфоцитов экспрессирующих CD28 (через 24 недели лечения, р=0,0098), которое было наиболее существенным в первые 4 недели терапии. Анализ пациентов, у которых исходно процент CD8-лимфоцитов, экспрессирующих CD28, был ниже среднего значения (менее 20%), показал, что большинство этих больных попадает в группу с низким соотношением «наивных» клеток и клеток памяти. Статистически достоверной зависимости между экспрессией CD28 CD8лимфоцитами и приростом CD4 выявлено не было, однако при этом была выявлена взаимосвязь этого показателя и соотношения «наивных» клеток и клеток памяти (р = 0,047). Таким образом, обнаружение до начала терапии значительного снижения экспрессии CD8-лимфоцитами CD28 может служить дополнительным маркером, определяющим слабый иммунный ответ на лечение. Динамика CD8-клеток, экспрессирующих CD57, среди общей популяции лимфоцитов имела волнообразный характер. В течение первых 4-х недель лечения обнаруживали снижение процента CD8+CD57+ лимфоцитов (р=0,0166), 20 с 4 по 12 неделю наблюдали его повышение (р=0,0007), а с 12 по 24 неделю – вновь снижение (р=0,0194). Изменения процентного содержания CD8+CD57+ клеток среди Тлимфоцитов в процессе ВААРТ имели сходный характер. Сравнив динамику CD4 лимфоцитов под влиянием лечения в группе пациентов с исходно высоким и низким содержанием CD8+CD57+ лимфоцитов, мы обнаружили, что в группе с высоким содержанием этих клеток статистически достоверного прироста абсолютного количества CD4 клеток не было в отличие от группы с низким содержанием клеток данной популяции. Несмотря на то, что регрессионный анализ не выявил зависимости между этими показателями, высокое содержание CD8+CD57+ лимфоцитов до начала лечения можно отнести к неблагоприятным факторам прогноза эффективности терапии. Таким образом, исследование поверхностных иммунологических маркеров дает дополнительную информацию о состоянии больного, прогнозе течения заболевания и эффективности антиретровирусной терапии. В условиях глобального распространения противоретровирусных препаратов и появления новых схем лечения, актуальным становится сравнение их эффективности. При одинаково эффективном подавлении репликации ВИЧ схемы ВААРТ могут различаться по способности восстанавливать нарушения в системе иммунитета. Дальнейшие исследования иммунологических показателей у пациентов, получающих лечение разными схемами антиретровирусных препаратов, помогут оптимизировать походы к выбору схемы ВААРТ в зависимости от выраженности исходных нарушений параметров клеточного иммунитета. Важной проблемой является так называемая иммунологическая неэффективность антиретровирусной терапии, характеризующаяся отсутствием прироста CD4 лимфоцитов, несмотря на стойкое подавление репликации вируса под влиянием лечения. Исследование дополнительных иммунологических маркеров еще до назначения противоретровирусных препаратов позволяет выявить пациентов с высоким риском слабого иммунного ответа на терапию. В дальнейшем это может определять тактику ведения таких пациентов. 21 Выводы 1. Методика трехцветного анализа с гейтированием по CD45 и одноплатформенным методом подсчета абсолютного содержания клеток и методика PLG характеризуются хорошим согласием со стандартной технологией, а также позволяют исследовать образцы крови в течение 72 часов после забора. Методика PLG является более простой в выполнении, и поэтому может быть рекомендована для использования в лабораториях, осуществляющих большое количество исследований. 2. У пациентов, инфицированных ВИЧ, выявлено снижение числа «наивных» CD4 Т-клеток и клеток памяти, а также их соотношения среди популяции CD4-лимфоцитов: уменьшение доли «наивных» клеток и увеличение доли клеток памяти. Под влиянием антиретровирусной терапии наблюдался прирост обеих субпопуляций CD4 Т-клеток, увеличение соотношения «наивных» клеток и клеток памяти за счет большего прироста числа «наивных» клеток. 3. У больных ВИЧ-инфекцией обнаружено снижение экспрессии CD28 и повышение экспрессии CD40L CD4-лимфоцитами. На фоне антиретровирусной терапии отмечена тенденция к восстановлению экспрессии этих маркеров. 4. У пациентов, инфицированных ВИЧ, выявлена повышенная экспрессия CD8лимфоцитами маркера активации CD38, характеризующаяся наличием прямой корреляции с вирусной нагрузкой и обратной – с количеством CD4 клеток. Под влиянием антиретровирусной терапии происходило уменьшение количества CD8+CD38+ клеток, что свидетельствовало об эффективности лечения. 5. У больных ВИЧ-инфекцией обнаружено снижение экспрессии CD28 и повышение экспрессии CD57 CD8-лимфоцитами, что отражает снижение способности клеток к делению. Под влиянием ВААРТ экспрессия CD28 повышалась, экспрессия CD57 имела волнообразную динамику. 6. Существенных изменений экспрессии CD4-лимфоцитами маркера CD25 у больных ВИЧ-инфекцией по сравнению со здоровыми лицами обнаружено не было. В то же время выявлена повышенная экспрессия маркера CD95 (Fas) CD4-лимфоцитами, имеющая обратную корреляцию с количеством CD4, что подтверждают существенное значение апоптоза как одного из механизмов уменьшения количества CD4 при ВИЧ-инфекции. Под влиянием ВААРТ экспрессия CD25 и CD95 CD4 клетками снижалась, что отражало уменьшение активации Т-лимфоцитов. 7. Благоприятный прогноз эффективности антиретровирусной терапии связан с высоким соотношением «наивных» CD4 и клеток памяти, относительно низкой экспрессией CD4 Т-лимфоцитами маркера CD95, а также высокой экспрессией CD8 Т-лимфоцитами молекулы CD28 и низкой - маркеров CD38, CD57, обратные тенденции в значениях перечисленных показателей прогнозируют слабый иммунный ответ на лечение. 22 Практические рекомендации Врачам, наблюдающим больных ВИЧ-инфекцией, рекомендуется следующая тактика иммунологического обследования: • перед назначением антиретровирусной терапии целесообразно исследовать содержание «наивных» CD4 клеток и клеток памяти, их соотношение, процентное содержание CD4 и CD8-лимфоцитов, экспрессирующих CD28, процентное содержание CD4, экспрессирующих CD95, процентное содержание CD8, экспрессирующих CD38, CD57. Снижение соотношения «наивных» CD4 и клеток памяти, повышение экспрессии CD4 Т-лимфоцитами маркера CD95, повышение экспрессии CD8-лимфоцитами маркеров CD38, CD57 и снижение экспрессии CD28 являются прогностически неблагоприятными факторами в отношении течения заболевания и эффективности лечения. • исследование экспрессии CD8-лимфоцитами CD38 может быть рекомендовано в качестве маркера для оценки эффективности антиретровирусной терапии, в случае, если по какой-либо причине исследование вирусной нагрузки невозможно. Диагностическую ценность представляет и процент CD8, экспрессирующих CD38, и процент CD8+CD38+ в популяции лимфоцитов. Для получения достоверных результатов необходимо использовать моноклональные антитела одного производителя на протяжении всего периода наблюдения. • исследование динамики содержания «наивных» CD4 клеток и клеток памяти, их соотношения, процентного содержания CD4 и CD8 Тлимфоцитов, экспрессирующих CD28, процентного содержания CD4, экспрессирующих CD95, а также исследование экспрессии CD38 CD8 Тлимфоцитами под влиянием антиретровирусной терапии может быть рекомендовано для дополнительной оценки эффективности лечения. Врачам-лаборантам для исследования количества CD4 лимфоцитов рекомендуется использовать трех или четырехцветный анализ с гейтированием по CD45 и одно-платформенным методом подсчета абсолютного содержания клеток или методику PLG с одно-платформенным методом. При этом необходимо осуществлять ежедневный контроль качества дозирования, включающий мониторинг скорости потока частиц. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Ситдыкова Ю.Р., Серебровская Л.В., Кравченко А.В. Влияние высокоактивной антиретровирусной терапии на систему иммунитета больных с ВИЧ-инфекцией // Терапевтический архив. – 2002. –Т.74, № 11. – С.80-81 2. Применение «усиленных» ингибиторов протеазы ВИЧ – новое направление в антиретровирусной терапии / Кравченко А.В., Ситдыкова Ю.Р., Беляева В.В., Серебровская Л.В., Богословская Е.В., Гургенов А.Г., 23 Пронин А.Ю., Покровский В.В.// Материалы II Российской научнопрактической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и парентеральных вирусных гепатитов. Суздаль, 1-3 октября, 2002 г. 3. Therapy with saquinqvir/ritonavir once daily and didanozine, phosphazid in HIV-infected patients in Russia./ A.V. Kravchenko, Y.R. Sitdykova, V.V. Beliaeva, L.V. Serebrovskaya, E.V. Bogoslovskaya, A.G. Gurgenov, A.Y. Pronin, V.V. Pokrovsky // Glasgow 2002. Sixth International Congress on Drug Therapy HIV Infection, Glasgow, UK. November, 17-21, 2002, Abstract 3602377 4. Комбинированная антиретровирусная терапия больных ВИЧ-инфекцией с использованием «усиленных» ингибиторов протеазы ВИЧ/ Кравченко А.В., Ситдыкова Ю.Р., Серебровская Л.В.. Богословская Е.В.. Иванова Л.А., Покровский В.В. //Инфекционные болезни. – 2003. – Т, №1. – С.14-19. 5. Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Богословская Е.В., Ситдыкова Ю.Р./ Первый опыт применения схемы ВААРТ, включающий ингибиторы протеазы ВИЧ с «двойным усилением» //Материалы III Всероссийской научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и парентеральных вирусных гепатитов. Суздаль, 14 -16 октября, 2003 г. 6. Sitdykova Y.R., Serebrovskaya L.V., Kravchenko A.V. Immune reconstitution on treatment of HIV-infected patients with phosphazid, didanosine and saquinavir/ritonavir once daily in Russia. // 9th European AIDS Conference, October 25-29, 2003, Warsaw, Poland, abstract 2.7/1 7. Л.В.Серебровская, Ю.Р.Ситдыкова, Е.В. Буравцова, В.В. Покровский, Фрэнсис Мэнди, Мишель Бержерон. Определение количества CD4 Тлимфоцитов на проточном цитометре у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Рекомендации. // Министерство Здравоохранения Российской Федерации. Москва, 2004. 8. Антиретровирусная терапия острой ВИЧ-инфекции. Кравченко А.В., Мирошниченко А.В., Беляева В.В., Серебровская Л.В.. Богословская Е.В., Ситдыкова Ю.Р.// Терапевтический архив. – 2004. - № 4, С.15-18 9. Беляева В.В., Кравченко А.В., Ситдыкова Ю.Р.Влияние приверженности лечению на эффективность ВААРТ.// Материалы Российской научнопрактической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией». Санкт-Петербург, 1-2 декабря, 2004 г. 10. Кравченко А.В., Беляева В.В., Ситдыкова Ю., Богословская. Факторы, определяющие эффективность высокоактивной антиретровирусной терапии у больных ВИЧ-инфекцией.// Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2005. - №5. – С. 53-58. 11. Ситдыкова Ю.Р., Серебровская Л.В., Кравченко А.В.. Покровский В.В. Влияние высокоактивной антиретровирусной терапии на экспрессию поверхностных антигенов лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных. // Фарматека. – 2005. - №19. – С. 78-80. 24
