Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Институт биоорганической химии
имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Российской Академии Наук
На правах рукописи
ХАИДУКОВ
Сергей Валерьевич
МНОГОЦВЕТНЫЙ АНАЛИЗ В ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика,
14.00.36 - аллергология и иммунология
Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург - 2008
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор Тотолян Арег Артемович
доктор биологических наук профессор Полевщиков Александр Витальевич
доктор биологических наук профессор Зыбина Наталья Николаевна
Ведущая организация:
ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломно­
го образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию».
Защита состоится «25» декабря 2008 г. в 12.00 часов на заседании диссерта­
ционного совета Д 2005.001.01 при Федеральном государственном учреждении
здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины
имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебеде­
ва, 4/2).
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке
Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский
центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС
России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).
Диссертация в виде научного доклада разослана «
Ученый секретарь
диссертационного совета''
ІУ/ У///J///'
»
2008 г.
M.B. Санников
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. За последние годы проточная цитометрия стано­
вится одним из наиболее востребованных методов, как для фундаментальных иссле­
дований, так и для диагностики в клинико-иммунологической практике. Расширилась
приборная база, и значительно увеличились возможности анализа клеток иммунной
системы, позволяющие охарактеризовать не только качественные и количественные
параметры основных популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный
состав. Используя различные методологические подходы и новую реагентную базу,
при помощи проточной цитометрии стало возможным оценивать функциональные
свойства популяций и субпопуляций клеток иммунной системы. Значительно расши­
рились возможности для диагностики иммунодисфункций, аллергии, специфических
Т-эффекторов и многое другое (Mandy F.F. et al, 2003; Boumiza R. et al., 2005; He X.H.
et al., 2006).
Логика развития современной технической, методологической и идеологической
базы проточной цитометрии формируется на основе очень широких возможностей со­
временных приборов. Оснащенные гибким программным обеспечением, они способ­
ны одновременно анализировать колоссальное количество клеток, идентифицировать
отдельные их группы, классы, популяции, субклассы, субпопуляции и т.д., измерять
их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивать их функциональное со­
стояние (Shapiro H.M. 2003).
Развитие современных клеточных технологий и разнообразие новых методологи­
ческих подходов к исследованиям, связанным с использованием проточной цитомет­
рии в биологии и медицине, поставило целый ряд вопросов о стандартизации данного
метода. Эти вопросы особенно важны как для врачей лабораторной диагностики, так и
для ученых и специалистов (Луговская С.А. и др., 2005; Gallego A. et al., 2003; Luider J.
etal.,2004).
Столь высоко информативный инструмент анализа создает предпосылки для по­
явления множества новых методологических подходов для диагностики различных
клеточных дисфункций. Например, уже сейчас 4-5 параметрический анализ позволяет
выявить не только ту или иную субпопуляцию клеток, но и ее функциональную акти­
вацию или депрессию. В то же время, если увеличить анализ до 9-15 параметровой
системы оценки рецепторов клеток, появляется возможность значительно более уг­
лубленного анализа, который оправдан для научных исследований, но с точки зрения
практической медицины такой подход навряд ли применим, поскольку связан со зна­
чительными методологическими трудностями. Именно поэтому возникла необходи­
мость остановиться на тех методологических подходах, которые позволяют по-новому
взглянуть на динамическую систему взаимодействия клеток иммунной системы во
всем ее разнообразии с четкой характеристикой субпопуляций клеток.
Цель работы. Обосновать методологию, критерии и направления применения
многоцветного цитометрического анализа субпопуляций лимфоцитов в медикобиологических исследованиях и оценить их эффективность.
2
Задачи исследований:
1. Разработать критерии применения многоцветных параметров для иммунофенотипирования клеток на основе стандартизации протоколов исследований в проточной
цитометрии.
2. Экспериментально обосновать возможные пути применения и расширения спек­
тра исследований с использованием многоцветного анализа в проточной цитометрии.
3. Обосновать и оценить эффективность применения многоцветного анализа при
изучении фенотипа лимфоцитов для лабораторной диагностики нарушений иммунно­
го статуса человека.
4. На основе применения цитометрического анализа разработать алгоритм исполь­
зования панели для скрининговых исследований и расширенной панели для более уг­
лубленного анализа при выявлении отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры
которых не попадают в референтные значения.
5. Обосновать методологию использования многоцветного анализа для проведения
углубленных научных исследований активности субпопуляций лимфоцитов.
Научная новизна исследований.
Впервые предложен алгоритм оптимизации работы на проточных цитометрах от
пре-аналитического, аналитического до пост-аналитического этапов исследований,
позволивший разработать критерии стандартизации методов исследований. Па их ос­
нове разработаны критерии включения тех или иных параметров исследований клеток
для практического использования.
Экспериментально обоснованы современные подходы к расширению спектра ис­
следований с учетом использования многоцветного анализа в клинической и научноисследовательской практике.
Обоснована возможность оценки функциональной активности клеток иммунной
системы в процессе их дифференцировки при воздействии различных химических со­
единений (например, к действию кальциевых ионофоров).
Предложена и внедрена многопараметрическая панель моноклональных антител к
различным кластерам дифференцировки, которая охватывает большинство лимфоци­
тов периферической крови и включает степень активации различных субпопуляций Тклеток, В-клеток и NK-клеток, что позволяет более точно диагностировать наиболее
часто встречающиеся нарушения иммунной системы. Данная панель включает:
IgG/IgG/lgG/CD45 - изотипический контроль
CD19/CD5/CD27/CD45 - В1, В2, В-клетки памяти
CD16/CD56/CD3/CD45 - субпопуляции NK-клеток
CD8/CD4/CD3/CD45 - субпопуляции Т-клеток
CD8/CD38/CD3/CD45 - активированные Т-цитотоксические и NK-клетки
CD4/CD25/HLA-DR/CD45 - активированные Т хелперы
CD45RA/CD45R0/CD4/CD45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти
TCR-ap7TCR-yS/CD3/CD45 - сф- и у5-Т-клетки
CD4/CD25/CD127/CD45 - регуляторные Т-клетки.
3
Предложенные подходы позволили повысить качество диагностики нарушений
иммунного статуса и значительно расширили возможности исследования клеток им­
мунной системы в норме и патологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов
для многопараметрического анализа применим при работе на большинстве проточ­
ных питометров ведущих фирм производителей, и может быть использован для
стандартизации исследований и разработки критериев включения новых параметров
для исследования клеток иммунной системы.
2) Среднестатистические значения параметров иммунного статуса условно здоровых
лиц в различных регионах России сопоставимы со среднестатистическими значе­
ниями параметров иммунного статуса человека, опубликованными в литературе.
3) Введение в первичную панель скринигового исследования иммунной системы ан­
тител для выявления аутореактивных клонов В-клеток (CD19,CD5) улучшает ди­
агностику и мониторинг за пациентами с аутоиммунными заболеваниями.
4) При наличии отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попа­
дают в референтные значения в ходе скрининговых исследований иммунной сис­
темы человека, необходимо проведение дополнительных исследований с оценкой
некоторых минорных субпопуляций лимфоцитов и анализа функциональных ха­
рактеристик клеток.
5) В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный
цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возмож­
ность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный со­
став, так и ряд функционатьных параметров иммунокомпетентных клеток при
уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечно­
го результата.
6) Изменение репертуара поверхностных рецепторов CD4+ T лимфоцитов в процессе
активации и дифференцировки сопровождается резистентностью их к действию
кальциевых ионофоров.
Практическая значимость работы. Разработанные подходы, предложенные в рабо­
те, предназначены и используются для стандартизации исследований в проточной цитометрии, в качестве алгоритмов оптимизации исследований отдельных субпопуляций и
комплексной оценки клеток иммунной системы в повседневной практике клиникодиагностических и научно-исследовательских лабораторий, оснащенных современными
приборами.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс обучения врачей на курсе
клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО Челябинской государственной ме­
дицинской академии Росздрава, Санкт-Петербургского государственного медицинского
университета им. академика И.П. Павлова; в работу научно-исследовательских лабора­
торий Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН (Москва), ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (Москва), ФГУЗ «Всероссий-
4
сюш центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России
(Санкт-Петербург), ММА им. И.М. Сеченова (Москва), Пятигорского ГНИЙ курорто­
логии, и ряде других.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы апробированы как на
отечественных, так и на международных симпозиумах и конференциях: Первый Все­
союзный иммунологический съезд (Сочи, 1989); 1 Ith Meeting of European Federation of
Immunological societies. (Espoo, Finland. 1991); 8Ih International Congress of Immunology,
(Budapest, Hungary, 1992); 5th International Workshop and Conference on Human Leuko­
cyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens (Boston, USA, 1993); 6th International Work­
shop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens,
(Kobe, Japan, 1996); Fourth International Symposium on Clinical Immunology (Amsterdam,
Holland 1997); 10 International Congress of Immunology (New Delhi, India, 1998); John
HUMPHRY Advanced Summer Program in Immunology (Pushchino, 1998, 2000, 2002,
2004); The 8th Annual Meeting of Tissue Engineering Society International, (Shanghai Inter­
national Conventional, P.R. China, 2005); "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге"
(Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2007); 2-я конференция
"Иммунология репродукции" (Сочи, 2007); Симпозиум "Иммунология слизистых
оболочек и аллергология: теория и практика" (Анталия, Турция, 2007); XX Зимняя
международная молодежная научная школа "Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008).
Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом
многолетних (1986-2008 гг.) исследований по изучению механизма функционирования
иммунной системы человека и животных при помощи метода проточной цитометрии и
различных флуоресцентных зондов. Все результаты получены лично автором или при
его непосредственном участии. Доля личного участия в совместных публикациях про­
порциональна числу соавторов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 89 работ, в том числе 3 моно­
графии, 82 работы опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Ми­
нистерства образования и науки Российской Федерации.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Материалы и методы исследования.
Пациенты. При скрининговом исследовании использовали для анализа перифери­
ческую кровь 356 условно здоровых лиц.
Для исследования гомеостаза ионов кальция у CD4+ T лимфоцитов в процессе их
активации и дифференцировки in vivo использовали кровь лиц, показатели иммунного
статуса которых соответствовали нормам для здоровых людей. Было обследовано 112
человек.
Для оценки активности и количества, различных субпопуляций клеток иммунной
системы было обследовано 214 человек с заболеваниями, в основе которых лежат им­
мунные механизмы (аутоиммунный тиреоидит, ревматоидный артрит и др.).
5
Выделение клеточных популяций и реагенты для исследования. Фракцию мононуклеаров выделяли из венозной крови доноров центрифугированием на FicollPaque. Клетки инкубировали с иономиципом при 37° в течение 10 мин в среде Хенкса
с 1% ФСК. После инкубации с иономицином клетки промывали ФСБ с 5% ФСК для
удаления Са2+-ионофора. Чувствительные и резистентные к иономицину Т-клеткн
разделяли на Ficoll-Paque (d = 1,077 г/смЗ). Чувствительные к иономицину клетки не
сохраняли жизнеспособность после обработки ионофором. Фракцию иономицинрезистентных (ИР-фракция) клеток собирали с поверхности Ficoll-Paque, окрашивали
МЛ.
В работе использовали среду Хенкса, брефелдин А, ФСК, ФСБ, ДМСО, ФМА,
СопА, ФГА и культуральный пластик фирмы ICN (США), иономицин и гепарин
(Calbiochem, Швейцария), Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция). Все используемые в ра­
боте моноклональные антитела (МА) получены от фирмы Beckman Coulter (США).
Проточная цитофлуориметрия. Для разработки алгоритма настройки цитометров, создания протоколов и последующего анализа были использованы контрольный
материал ImmunoTrol, ImmunoTrol Low (Beckman-Coultcr, США) и цельная перифе­
рическая кровь, полученная от условно здоровых лиц. Для окрашивания клеток ис­
пользовали следующую панель МА меченых FITC (изотиоцианат флуоресцеина), РЕ
(фикоэритрин), РС5 (комплекс РЕ с цианином-5), ECD (комплекс РЕ с техасским крас­
ным) или РС5 (комплекс РЕ с цианином-7): CD4, CD5, CD8, CD 14, CD 19, CD25,
CD26, CD27, CD29, CD38, CD45, CD45RA, CD45R0, CD62L, CD69, CD95 CD 127,
CD234, CD294, Y5-TCR, сф-TCR, V|31-TCR, Vp2-TCR, VpI4-TCR и HLA-DR (Beckman
Coulter, США). Для удаления эритроцитов пробоподготовку проводили по безотмывочной технологии с использованием следующих лизирующих растворов: OptiLyse С,
OptiLyse В, ImmunoPrep и Whole Blood Lysing Reagents (Beckman Coulter, США).
Для анализа окрашенных клеток и настройки были использованы следующие про­
точные цитометры: EPICS XL, EPICS XL-MCL, EPICS "Elite", EPICS "Altra", Cytomics
FC500, Cytomics FC500 MPL (Beckman Coulter, США), FACSCalibur (BectonDickinson, США) и PAS-Ш (Partec GmbH, Германия).
Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответст­
вовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили необходимые ло­
гические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боко­
вому светорассеянию и CD45. Математическую обработку цитометрических данных
проводили при помощи программ ЕХРО-32 и СХР ѵ. 2.2 (Beckman Coulter, США). В
каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Абсолютные значения получены
как в одноплатформенной (с помощью реагента Flow Count (Beckman Coulter, США)),
так и в двухплатформенной (с использованием результатов гематологического анали­
за) системах.
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов
проводилась с использованием стандартного пакета прикладных программ «Statistic
for Windows 6.0». Полученные данные обрабатывали дискриптивными методами и
представляли в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (М±т).
6
Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и меди­
цине.
Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характери­
стик клеток появилась в результате естественного развития традиционных гистохими­
ческих и цитохимических методов анализа. Созданная для ускорения анализа в клини­
ческой цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффек­
тивный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, кле­
точной инженерии и т д.
Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особен­
но ценным для клинической практики:
- во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные по­
пуляции по фенотипу. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, про­
исходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитомет­
рии связано в первую очередь с анализами по фенотипу;
- во-вторых, это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е.
встречающиеся с частотой 10'5-10"7, что возможно благодаря огромной производи­
тельности. Так, современные цитомегры могут регистрировать несколько параметров
для каждой отдельной клетки со скоростью до 100000 клеток в секунду.
Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени про­
лета клеток через зону анализа, позволила исследователям судить о морфологических
характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, грануляр­
ности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). В свою очередь, это привело к воз­
можности типировать клетки без применения флуоресцентных красителей, что осо­
бенно ценно при работе с периферической кровью. Данный подход позволяет разде­
лить и расположить в виде гистограммы лейкоциты периферической крови на три
группы клеток - лимфоциты, моноциты и гранулоциты (Bossuyt X. et al., 1997).
Развитие гибридомной технологии привело к тому, что у исследователей появился
в руках такой инструмент, как моноклональные антитела. МА предоставили возмож­
ность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за
счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных
клеток и их функционального состояния (Leucocyte typing VI., 1997). В настоящее
время известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клеток
человека (Zola H., et al., 2005).
Использование МА, напрямую меченых различными флуорохромами, позволило
значительно повысить информативность цитометрического анализа за счет многоцветности. Поскольку современные цитометры, как правило, оборудованы более чем
тремя фотоэлектронными умножителями (от 3 до 12 ФЭУ), это позволяет на одном
образце периферической крови анализировать практически все основные субпопуля­
ции клеток.
Высокий уровень автоматизации, простота в эксплуатации, небольшие размеры
современных приборов, их высокая точность, специфичность и воспроизводимость
7
результатов позволяют использовать их не только как исследовательские, но и как
клинико-диагностические.
Перечисленные возможности метода проточной цитометрии определяют клиниче­
ские и общебиологические области его применения. К первой относятся - иммунология,
онкология, онкогематология (включая диагностику, оценку эффективности лечения и
мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантология, общая гематология
и др. Ко второй - клеточная кинетика, клеточная энзимология, клеточная физиология, ге­
нетика и др.
Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или
какие-либо другие воздействия сопровождается значительными изменениями субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению
абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляционного соста­
ва, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных мо­
лекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на
это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров.
Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является моду­
ляция экспрессии функционально значимых молекул. В свою очередь, не менее важ­
ным является и изменение абсолютных количеств иммунокомпетентных клеток в пе­
риферической крови.
Определение субпопуляционного состава или фенотипа лимфоцитов в настоящее
время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении
процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокуп­
ность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий
дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибе­
ли (апоптоза). Относительное и абсолютное количество клеток, имеющих тот или
иной фенотип, как раз и является конечным результатом иммунофенотипирования.
При подтвержденной ВИЧ инфекции на «абсолютном содержании CD4+ Т-клеток в
единице объема» построена система стадарования течения заболевания, что является
одним из основных критериев назначения антиретровирусной терапии.
Иммунофенотипирование позволяет судить о типе клеток и их функциональном со­
стоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. В отличие от флуо­
ресцентной микроскопии, метод проточной цитометрии позволяет наиболее полно и
наиболее корректно оценить иммунофенотип пациентов. Иммунофенотипирование с
использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высоко
специализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической
памяти, антиген-специфические, регуляторные Т клетки и субтипы NK-клеток.
Очень важным разделом для биологии и медицины при появлении новых методик
исследования является формирование нормативных показателей. Не является исключе­
нием и проточная цитометрия. Проведенные исследования условно здоровых лиц в раз­
личных регионах России с использованием скрининговой панели позволили определить
среднестатистические значения параметров иммунного статуса человека. Результаты,
представленные в таблице 1, свидетельствуют о близости среднестатистических пара-
8
метров иммунного статуса условно здоровых лиц к данным в отечественной и зарубеж­
ной литературе (Zidovec Lepej S., et al., 2003, Pope V., et al., 1994, Comans-Bitter W.M., et
al., 1997).
Таблица 1. Среднестатистическое содержание основных субпопуляций лим­
фоцитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц полученное в
результате скринингового исследования (N = 362).
Относительные ко­ Абсолютные количе­
Субпопуляции лимфоцитов
личества
ства (кл./л)
1,363-2,808x10'
Лимфоциты (CD45b,1ght)
32 ±4%*
Т-клетки (CD3+,CD19-)
73 ± 12%
0,946-2,079x10"
Тхелперы(СОЗ+,С04+)
45 ±10%
0,576-1,336x10"
Т хелперы активированные/намяти
0,068-0,702x10°
15 ±10%
(CD3+, CD4+, CD45R0+, CD29")
Т хелперы наивные
0,272-1,123x10'
30 ±10%
(CD3+,CD4+,CD45RA+)
+
27 ± 8%
Т цитотоксические (CD3 ,CD8*)
0,372-0,974x10"
Т-клетки активированные (СШ+,
3 ± 3%
0,007-0,165x10"
HLA-DR+, CD25+, CD38~)
T
+
T-NK клетки (CD3 , CD 16", CD56 )
3 ± 3%
0,007-0,165x10"
В-клетки (CD3", CD19+, CD20+,
12 ±5%
0,111-0,376x10'
HLA-DR^
+
NK-клетки (LGL) (CD3", CD16 ,
13 ±5%
0,123-0,369x10"
CD56+,CD38±,CD8±)
+
+
Индекс соотношения CD4 /CD8
1,5-2,6
* Относительные и абсолютные количества лимфоцитов определяли от общего количества
лейкоцитов. Относительные и абсолютные количества субпопуляций Т-, В-, и NK-клеток
определяли от общего количества лимфоцитов.
Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Оптимизация настройки цитометров и подготовка протоколов для
анализа.
Иммунофенотипирование позволяет охарактеризовать клетки при помощи МА и да­
ет возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или
иного набора клеточных маркеров. Однако следует учитывать, что многие маркеры мо­
гут одновременно экспрессироваться на различных типах клеток и определять их начичие следует в режиме не менее чем двухцветного анализа, а типирование лейкозов же­
лательно проводить в четырех- и более цветном анализе (Nagata H., et al., 2001; Claude
L.,etal.,2005).
В настоящее время все большее количество клинико-диагностических лаборато­
рий используют метод проточной цитометрии для определения иммунного статуса
пациентов, диагностики лимфопролиферативных заболеваний и многих других важ­
ных параметров иммунной системы. Однако,отсутствиестандартных подходов к на­
стройке цитометров, созданию протоколов для исследования и подготовке образцов
для анализа по-прежнему делает метод проточной цитометрии достаточно субъектив­
ным и, в значительной степени, зависимым от опыта оператора.
9
В процессе цитометрического анализа могут быть допущены ошибки на разных
этапах. Во-первых, цитометр должен находиться в рабочем состоянии и проходить все
тесты проверки его работоспособности. Во-вторых, протоколы конкретного анализа
должны быть правильно настроены. Данная процедура не зависит от типа прибора,
поскольку процедуры подготовки инструментов для соответствующего аиатиза осу­
ществляются практически по одному и тому же алгоритму. В-третьих, на конечный
результат значительное влияние оказывает использование некачественных реагентов
или реагентов с истекшим сроком годности. И, наконец, в-четвертых, на результат
оказывают влияние ошибки, допущенные в ходе подготовки образца для анализа.
Одним из наиболее важных этапов при проведении стандартной процедуры анаоиза фенотипа клеток 1ПСЧ является правильность настройки протоколов для конкрет­
ных типов анализа.
Данный этап состоит в следующем: настройка дискриминатора, настройка пара­
метров светорассеяния, настройка параметров чувствительности фотоэлектронных
умножителей (ФЭУ) для флюоресценции, введение коэффициентов компенсации.
SS Lin
SS Lin
Рис. 1. Пример использования дискриминатора для удаления из зоны анализа
частиц, не соответствующих клеткам по параметрам светорассеяния. А - анализ
образца в отсутствии дискриминатора; Б - анализ образца при включенном дис­
криминаторе.
Оптимизация настройки дискриминатора. Современные цитометры обладают вы­
сокой чувствительностью по малоугловому светорассеянию, т.е. по размерам исследуе­
мых частиц (чувствительность достигает 0,1 мкм), поэтому они регистрируют множест­
во объектов, которые не являются клетками. Особенно это проявляется на образцах,
приготовленных по так называемой «безотмывочной» технологии. Наличие в образце
множества объектов, которые не являются лейкоцитами, приводит к тому, что цитометр
«захлебывается» от обилия данных и это приводит к получению недостоверных резуль­
татов. Чтобы избежать этого эффекта, необходимо ввести ограничения по отображае­
мым на гистограмме событиям, т.е. задать границы чувствительности цитометра. Для
этих целей служит дискриминатор. Необходимо ввести такие его значения, чтобы были
видны все основные популяции клеток анализируемого образца, а частицы, которые не
являются клетками (дебрис), не попадали в зону анализа. Как правило, это ограничение
ставится на канал малоуглового рассеяния света (рис. 1). Следует отметить, что слиш-
10
ком завышенные значения дискриминатора могут убрать из анализа часть интересую­
щей исследователя популяции клеток, поэтому к этому этапу настройки питометра не­
обходимо подходить со всей ответственностью.
Оптимизация настройки параметров светорассеяния, Как правило, современные
питометры используют два канала светорассеяния: регистрируется сигналы от мало­
углового светорассеяния и рассеяния света под углом 90°. Малоугловое светорассея­
ние (Forward Scatter, FS) представляет собой рассеяние света от поверхности клеток
под малыми углами (1-19°) и пропорционально диаметру исследуемого объекта. В
свою очередь, канал бокового светорассеяния или рассеяния света под углом 90° (Side
Scatter, SS) регистрирует весь свет, рассеянный как самой клеткой, так и ее оргаііеллами, т.е. характеризует структуру и гранулярность объекта. Таким образом, два вида
светорассеяния позволяют регистрировать два морфологических параметра клеток.
Рис. 2. Распределение клеток перифе­
рической крови при оптимальной на­
стройке каналов светорассеяния. FS малоугловое светорассеяние; SS - све­
торассеяние под углом 90°.
Гракул<щ*пы
о
*
'•
'
'
'
' ійз
SSLSn
Использование двух этих параметров позволяет в гетерогенной популяции клеток
локализовать все входящие в нее компоненты. Данная процедура производится за счет
использования «гейтирования». GATE (ворота) - логически ограниченная область кле­
ток с определенными характеристиками на гистограмме их распределения, позволяю­
щая анализировать события, заключенные исключительно в данную область. Гейтирование (от gating) - введение данных логических ограничений из одной гистограммы в
другие. Данная функция позволяет отображать и анализировать события, попадающие
исключительно в интересующую нас область.
Примером могут служить лейкоциты периферической крови, состоящие из лим­
фоцитов, моноцитов и гранулоцитов (рис. 2). При анализе периферической крови не­
обходимо соблюдать правило: все основные популяции клеток должны быть отобра­
жены на гистограмме распределения клеток по двум светорассеяниям, что облегчит
работу.
Использование морфологических параметров (FS и SS) для локализации лимфоци­
тов достаточно часто приводит к получению некорректных результатов. Это бывает
связано, как правило, с неполным лизисом эритроцитов, попаданием базофилов в зону
лимфоцитов и т.д. Для диагностики состояния иммунной системы и ее аномалий бо­
лее корректным представляется локализация лимфоцитов, опираясь на экспрессию
общего для лейкоцитов антигена (CD45) в многоцветном анализе (анализ больше трех
11
цветов) и многостадийное гейтирование. В последнее время все чаще используется
метод локализации лимфоцитов именно по наличию CD45.
as
^1
n
«J
32
V-a
s
Ю'-у
8
«••j
3
«j83
^'
So
33
3«
-
UI>
ш' '"%' ИГ^
io '
in! m'
lgG1-FlTC
lgG1-FITC
IgGI-FlTC
Рис. 3. Примеры настройки каналов флуоресценции. Правильная настройка негативные клетки находятся в середине первой декады логарифмической шка­
лы интенсивности флуоресценции (А). Б и В - примеры неправильной настройки
цитометра. Б - слишком высокое напряжение на ФЭУ. В - слишком низкое на­
пряжение на ФЭУ.
;
Оптимизация настройки параметров фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для
флюоресценции. После настройки каналов светорассеяния приступают к настройке
чувствительности каналов флюоресценции. Этот процесс начинают с анализа нега­
тивного контроля, который представляет собой клетки образца, окрашенные неспе­
цифическими антителами, мечеными теми же флуорохромами, с которыми предстоит
работать в дальнейшем (изотипический контроль). Негативные клетки должны попа­
дать в первую декаду на логарифмической шкале интенсивности флюоресценции по
всем задействованным каналам (рис. ЗА). Необходимо добиться того, чтобы клетки
контроля легли, по возможности, в центре первой декады. Следует сразу отметить, что
неспецифическое взаимодействие антител различных классов с поверхностью клеток
мишеней не одинаково. Исходя из этого, антитела для контрольного образца должны
быть того же изотипа и в той же концентрации, что и МА к CD маркерам, используе­
мые для анализа.
На рис. ЗБ и рис. ЗВ приведены гистограммы, полученные на цитометрах, настро­
енных некорректно. Если контрольные клетки попадают во вторую декаду, это, в ко­
нечном счете, может привести к ложно-позитивным результатам (рис. ЗБ), а низкая
чувствительность приводит к занижению реальных значений (рис. ЗВ). И то и другое
при клинико-диагностических исследованиях недопустимо.
Оптимизация введения коэффициентов компенсации. После настройки чувстви­
тельности прибора в случае многоцветного анализа возникают проблемы. Даже в слу­
чаях использования для анализа линейных маркеров, таких как CD19 и CD3, можно
увидеть дубль позитивные клетки, хотя они в природе не встречаются. Данный пара­
докс связан с тем, что спектры, испускаемые флуорохромами, не бывают точечными,
а имеют свое распределение в определенном диапазоне. Практически невозможно из­
бежать дополнительного вклада излучения во все ФЭУ, предназначенные для регист­
рации других флуорохромов, даже если использовать различные наборы барьерных
светофильтров. Таким образом, необходимо провести вычитание из общей интенсив-
12
ности флуоресценции на каждом ФЭУ дополнительного сигнала, генерируемого дру­
гими флуорохромами. Данное вычитание называется введением в программу анализа
коэффициентов компенсации.
ш
да
Рис. 4. Гистограмма распределения кле­
ток периферической крови иллюстри­
рующая первое правило введения коэф­
фициентов компенсации.
- Т Е П -Ег
•!
j
5 я; -і j
°щ
11
*g «• "ЕЗл...
1
2 rvf .
18-
MEAN X
ІіГ
CDJ-FITC
В процессе анализа регистрируется ряд статистических параметров, среди которых
есть такое значение как MEAN (рис 4). Этот параметр отражает среднестатистическое
положение максимума пика распределения частиц на гистограммах в выбранном ка­
нале флюоресценции или светорассеяния. Для процедуры введения коэффициентов
компенсации необходимо использовать клетки, окрашенные антителами, связанными
с разными флуорохромами, (например, CD3-F1TC и CD19-PE) и анализировать их в
двухпараметрическом режиме. Антитела для этой процедуры подбирают таким обра­
зом, чтобы они относились к двум непересекающимся CD маркерам. Гистограмму
разбивают на четыре квадранта, в которых определяют значение MEAN для каждого
типа флуоресценции. Первое правило введения коэффициентов компенсации гласит:
коэффициенты компенсации введены правильно, если MEAN квадранта 1 равен
MEAN квадранта 3 по оси X, a MEAN квадранта 4 равен MEAN квадранта 3 по оси У
(рис 4).
Второе правило оптимизации введения коэффициентов компенсации гласит: если
мысленно нарисовать линии из центров областей позитивных клеток, то они должны
быть приблизительно параллельны осям X и Y или должен образоваться прямоуголь­
ник (рис 5).
Рис. 5. Гистограмма распределения
клеток периферической крови иллю­
стрирующая второе правило введения
коэффициентов компенсации.
CD3-FITC
13
Всегда существует вероятность пере- или недокомпенсации. На рис. 6 представлены
оба этих случая. При недокомпенсации исследователь может получить завышенный ре­
зультат и ложно позитивные клетки (рис 6А). При перекомпенсации можно потерять
часть позитивных клеток и, как следствие этого, получить заниженный результат (рис
6Б).
10*
CD3-FITC
CD3-FITC
Рис. 6. Примеры неправильного использования коэффициентов компенсации.
При недокомпенсации (A): MEAN квадранта 4 больше, чем MEAN квадранта 3
по оси У, a MEAN квадранта 1 больше, чем MEAN квадранта 3 по оси X. При пе­
рекомпенсации (Б): MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 4 по оси
У, a MEAN квадранта 3 больше, чем MEAN квадранта 1 по оси X.
FITC
5
еі
t*1
Р£
it "IP
•
"
'
LTm-ш, і-пшц
nj
Рис. 7. Пример оптимизации двухпараметрического анализа FITC (FL1) против
РЕ (FL2) при изменении ч)тсствительности одного из каналов флуоресценции: А низкая чувствительность по FL2; Б - повышение чувствительности по каналу
флуоресценции FL2 за счет увеличения напряжения на ФЭУ; В - вычитание допол­
нительного вклада интенсивности флуоресценции FITC за счет увеличения коэф­
фициента компенсации.
Между напряжением на ФЭУ и коэффициентами компенсации существует взаимо­
связь. В некоторых случаях, когда используют МА от разных фирм производителей,
возникает необходимость изменить чувствительность по одному из каналов флюорес-
14
ценции. Эта процедура приводит к тому, что изменяется и отображение флюоресцен­
ции на двухпараметрических гистограммах. Повышая чувствительность по одному из
каналов, необходимо изменить и соответствующий этому каналу коэффициент компен­
сации. Например, в двухпараметрическом анализе FITC против РЕ задействованы два
канала флюоресценции (FL1 и FL2). Для повышения чувствительности по каналу
флюоресценции FL2 поднимают напряжение на ФЭУ. При этом наблюдается дополни­
тельный вклад интенсивности флуоресценции FITC в капал FL2, который необходимо
вычесть за счет увеличения коэффициента компенсации (рис. 7).
Таким образом, алгоритм настройки рабочего протокола выглядит следующим об­
разом: проверка работы цитометра; настройка дискриминатора; настройка каналов све­
торассеяния; настройка каналов флюоресценции; введение коэффициентов компенса­
ции.
Предложенный подход для настройки проточных цитометров и последующего
анализа окрашенных клеток применим к большинству производимых цитометров.
Стандартные настройки и создание протоколов позволяют более корректно прово­
дить анализ как в клинико-диагностических, так и научно-исследовательских целях. В
свою очередь, это позволяет использовать подготовленные протоколы для исследова­
ний и включать или исключать те или иные параметры в анализ в зависимости от це­
лей, поставленных перед врачом-лаборантом или научным работником.
Идентификация субпопуляций В-клеток.
При оценке относительного количества и характеристик клеток, участвующих в
иммунном ответе на антигены, очень важно иметь представление обо всех типах кле­
ток, участвующих в формировании специфического (адаптивного) иммунного ответа
организма на внедрение патогена. При формировании иммунной реакции одна из ве­
дущих ролей принадлежит клеткам тимического происхождения, получивших назва­
ние Т лимфоциты. В то же время эффекторные механизмы специфической иммунореактивности обеспечиваются либо эффекторными Т-клетками (Т-эффекторами ГЗТ,
цитотоксическими Т-клетками), либо специфическими гуморальными факторами,
секретируемые определенной субпопуляцией лейкоцитов. Специфический гумораль­
ный иммунный ответ обеспечивают хорошо всем известные антитела. Они обладают
способностью взаимодействовать с внедрившимися микроорганизмами, активировать
систему комплемента и стимулировать фагоцитарную активность клеток-фагоцитов,
взаимодействуя с их мембранными рецепторами.
Популяцией лимфоцитов, отвечающей за продукцию антител, являются В-клетки.
Каждый лимфоцит, относящийся к В-клеткам, запрограммирован на продукцию анти­
тел одной-единственной специфичности, и эти антитела присутствуют на его поверх­
ности в качестве рецептора для соответствующего антигена. Один В-лимфоцит несет
на своей поверхности примерно 105 идентичных молекул антител. Данные антитела
называют поверхностным или мембранными иммуноглобулинами (Робсон А., и др.,
2006).
15
Рис. 8 Гистограмма распределения CD3
и CD19 на лимфоцитах перифериче­
ской крови. CD3"CD19+ В-клетки
(квадрант Л ) , CD3+CD19" Т-клетки
(квадрант J4).
ш
а.
D
О
Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобулины
класса М (IgM). Они экспрессируются на мембране всех зрелых В-клеток, которые не
имели контакта с антигеном. Однако, на поверхности В-клеток, дифференцировка ко­
торых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса D (IgD). В процес­
се формирования иммунного ответа происходит переключение изотипов мембранных
иммуноглобулинов на IgG, IgA, IgE (Ярилин А.А., 1999).
Кроме мембранных иммуноглобулинов, В-клетки экспрессируют целый ряд мем­
бранных маркеров, которые необходимы для формирования В-клеточного рецептора
(BCR) и играют важную роль в передаче сигнала в процессе распознавания антигена,
а также являются маркерами линейной принадлежности В-клеток, что особенно по­
лезно при идентификации данной популяции лимфоцитов. К таким маркерам, прежде
всего, относятся CD 19 и CD21. Данные молекулы формируют ко-рецепторный ком­
плекс, в который вовлечен также и CD81 (Hultin L.E., et al, 1993).
CD19 антиген (также известный как В4) представляет собой мембранный гликопротеин, принимающий участие в регулирование развития В-лимфоцитов, их актива­
ции и дифференцировки. Эта молекула экспрессируется на всех нормальных Вклетках, включая про-В-лимфоциты, но исчезает у плазматических клеток в процессе
их созревания. Молекула CD 19 отсутствует на мембране нормальных Т-клеток, NKклетках, моноцитах и гранулоцитах (рис. 8). В связи с этим данный антиген рекомен­
дуется для количественной оценки общей популяции В-клеток (Hultin L.E., et al.,
1993).
C D 2 0
bright
CD5
«im
-ТГЯ:,
ш
о.
о
.••.<•:;••
s **•
о
4.7%lCD5 6risht
CD20
1С-
CD5-FITC
Рис. 9 Гистограмма распределения
CD20 и CD5 на лимфоцитах перифери­
ческой крови у пациента с ревматоид­
ным артритом.
16
Кроме перечисленных выше структур, в состав В-клеточного рецепторного ком­
плекса вовлечены и другие молекулы, например CD20 - интегральный не гликозилированный мембранный белок. Данная молекула является Са2+-каналом и участвует в акти­
вации и пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ио­
нов Са2". Молекула CD20 присутствует на всех нормальных В лимфоцитах перифери­
ческой крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но отсутст­
вует на плазматических клетках (Hultin L.E., et al., 1993).
Иногда для локализации В-клеток используют CD20, но данная молекула может
экспрессироваться в низкой плотности на других популяциях лимфоцитов. Хотя CD20
первоначально был описан как В-клеточный линейный маркер, оказалось, что не­
большая субпопуляция Т-клеток человека экспрессирует CD20. Причем, В-клетки
экспрессируют CD20 в высокой плотности (CD20br'8h'), а Т-клетки в низкой (CD20d,m)
и составляют 2.4 і7- 1.5 % от лимфоцитов периферической крови.
Хотя оценка экспрессии CD20 полезна при характеристике В-клеток, необходимо
достаточно осторожно подходить к интерпретации получаемых результатов (рис. 9).
Особенно это относится к случаям фенотипирования костного мозга. Сходная про­
блема может возникнуть при фенотипирования периферической крови у пациентов с
ревматоидным артритом.
В настоящее время среди В-клеток выделяют три основные субпопуляции, а именно:
В-1, В-2 и В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отводится мо­
лекуле CD5 (рис. 10). CD5 обнаружен на всех зрелых Т-лимфоцитах и на большинстве
тимоцитов. CD5 также присутствует на субноггуляциях В-лимфоцитов, но отсутствуег на
гранулоцитах и моноцитах. Молекула CD5 является лигандом для CD72 антигена, кото­
рый присутствует на В-лимфоцитах. Точная функциональная роль CD5 все еще до конца
не изучена, однако для этих молекул была показана физическая ассоциация с антигенспецифическим рецептерным комплексом как на Т-, так и на В-лимфоцитах и возмож­
ность модулировать передачу сигналов через этот комплекс. В последние годы было по­
казано, что CD5 может быть посредником негативной регуляции при передаче сигналов
для BCR.
!
%
S2
16.1%" 1.0%
1
и
"'?«•
S4-;
Рис. 10. Гистограмма распределения
CD5 и CD19 на лимфоцитах перифери­
ческой крови. Субпопуляции В-клеток:
CD19+CD5+
В-1
(квадрант
G2);
CD19+CD5" В-2 (квадрант G1).
ш
Ф; -, ~™,
CD5-FITC
Кроме роли, связанной с передачей сигналов при активации, молекула CD5 была
расценена как возможный маркер В-клеток, позволяющий различать их субпопуляции:
17
CD5" В-клетки (также называемые В-1 клетки) и CDS' В-клетки (или В-2 клетки) (рис.
10).
А
Б
ss;
-г"'
ЩП
Н2
65.4% (1.2%
20.7% [12.7%
Ш
О.
іА «'1
о
о
ЙЙІІЛ
*т
іо ,: ч
да
ШШ&'Ш
и1
ю*
ю3
10°
10'
102
10»
CD19-FITC
CD19-FITC
Рис. 11. Гистограммы распределения CD5 и CD19 на лимфоцитах перифери­
ческой крови. Субпопуляции В-1 лимфоцитов у пациента К. с аутоиммунным
тиреоидитом: А - до лечения; Б - в процессе лечения.
Анализ В-1 и В-2 клеток в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить сред­
нестатистическое количество этих субпопуляций. Было проанализировано 60 условно
здоровых лиц, и результаты представлены в таблице 2.
В-1 клетки вызывают значительный интерес за счет того, что их ассоциируют с
продукцией аутоантител, в том числе и при аутоиммунной патологии. Значительная
роль В-1 клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной вол­
чанке и синдроме Шегрена. Увеличение количества CD5 + В-клеток наблюдали у па­
циентов, страдающих миастенией, инсулин-зависимым диабетом и тиреоидитом Хашимото. Доля CD5" В-клеток может составлять треть и более от всех В-клеток (рис.
11).
Таблица 2. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-1 и В-2 лимфо­
цитов в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Содержание
Относительно
общих В-клеток
Субпопуляции
Относительно
лимфоцитов (%)
Общие В-клетки
В-1 клетки
12 ±5,0
1,3 + 0,8
10,8 ±6,7
0,022-0,115x10'
В-2 клетки
10,7 ±4,2
89,2 ±7,1
0,081-0,323x10'
(%)
Абсолютное ко­
личество (кл/л)
0,099-0,336x10'
Следующей субпопуляцией В-клеток, вызывающей значительный интерес у иссле­
дователей, являются В-клетки памяти. Идентификация CD27 как маркера В-клеток па­
мяти позволила надежно и эффективно идентифицировать в периферической крови на­
ивные В-клетки (IgM7CD27") и В-клетки памяти (CD27*) (рис. 12).
18
Рис. 12. Гистограмма распределения
CD27 и СШ9 на лимфоцитах перифе­
рической крови. Квадрант С2 - субпо­
пуляция В-клеток памяти.
' "іѵ' ' "ііг
" «*
"io?
CD19-FiTC
CD27 антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин. Он обнаружен
на медуллярных тимоцитах, периферических Т лимфоцитах, активированных В лим­
фоцитах и NK-клетках. Его лигандом является молекула CD70. Взаимодействие CD27
с его лигандом (CD70) на Т-клетках является одним из условий дифференцировки Вклеток в плазматические клетки. В свою очередь, существующие данные указывают на
то, что отсутствие IgD"CD27+ В-клеток памяти в значительной степени объясняет на­
рушение продукции иммуноглобулинов, несмотря на функциональную передачу сиг­
налов молекулой CD40 у пациентов с синдромом Х-связанного гипер-IgM.
Анализ В-клеток памяти в ПКЧ условно здоровых лиц позволил определить сред­
нестатистическое количество этой субпопуляции. Было проанализировано 60 условно
здоровых лиц, и результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Среднестатистическое содержание субпопуляций В-клеток памяти
в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Субпопуляции
Относительно
лимфоцитов (%)
Общие В-клетки
12 + 5,0
В-кдетки памяти
4,3 ± 2,5
Содержание
Относительно
общих В-клеток
(%)
Абсолютное коли­
чество (кл/л)
31,25 ±8,45
0,012-0,040 х 109
0,099-0,336 х Ю 9
Гуморальный иммунный ответ играет значимую роль в устранении как внутрикле­
точных, так и внеклеточных патогенов. Этот процесс проистекает за счет дифференци­
ровки зрелых В-клеток в плазматические клежи, которые секретируют большие количе­
ства антител. Однако большинство антигенов вызывают иммунную реакцию лишь при
наличии и участии Т лимфоцитов. Это относится к белковым и клеточным антигенам, а
также к вирусам, которые объединяют в понятие "Т-зависимые" антигены. Лишь не­
большое количество антигенов способно вызывать иммунный ответ без участия Тклеток. Некоторые бактериальные липополисахариды при достаточно высокой концен­
трации способны к поликлональной активации значительной части популяции В лимфо­
цитов, т.е. для такой стимуляции антигенная специфичность роли не играет. Линейные
антигены, медленно распадающиеся в организме и имеющие организованную опреде-
19
ленным образом и часто повторяющуюся детерминанту (полисахарид пневмококков, по­
лимеры D-аминокислот, поливинилпироллидон) также способны непосредственно сти­
мулировать В лимфоциты. Индуцируемый Т-независимыми антигенами иммунный ответ
практически не сопровождается формированием клеток памяти. При иммунном ответе на
Т-независимые антигены вырабатываются иммуноглобулины класса М и эффективность
Т-независимого ответа во много раз ниже. В свою очередь, Т-зависимые антигены в от­
сутствии Т-клеток лишены иммуногенности. При ответе на эти антигены требуется под­
ключение Т лимфоцитов. Т-зависимые антигены обеспечивают и определяют коопера­
тивное взаимодействие В- и Т-клеток. В результате такого взаимодействия происходит
переключение синтеза с IgM на IgG.
Основываясь на современных данных, различают два пути образования различных
репертуаров антител: Т-зависимый путь в терминальных центрах и Т-независимый
путь вне них. Точная функция второго пути и генерирование IgMfCD27* В-клеток в
настоящее время окончательно не выяснена. Однако, JglvTCD27T В-клетки играют
существенную роль в гуморальном ответе против Т-независимых патогенов, напри­
мер, инкапсулированных бактерий (Weller S., et al., 2004).
Активация зрелых В-клеток с Т-зависимым антигеном приводит к образованию
плазматических клеток двумя независимыми путями дифференцировки. Активиро­
ванные В-клетки могут войти в экстрафолликулярные пролиферативные центры, где
они быстро дифференцируются в короткоживущие плазматические клетки, секретирующие IgM. С другой стороны, активированные В-клетки могут попасть в терми­
нальный центр, где происходят различные молекулярные перестройки, такие, как со­
матические гипермутации, переключение изотипов Ig и отбор высокоафинных вари­
антов. Антиген-селективные В-клетки терминального центра являются предшествен­
никами двух типов клеток (высокоафинных В-клеток памяти и долгоживущих плаз­
матических клеток), которые являются ответственными за долгосрочную гумораль­
ную устойчивость (CalameK., 2001; Banchereau J., et al., 1992).
А
10»-г
3J1
Б
J2
U2
19.6%
18.1%
Ш
a.
ЗГ
p ю-
Ш
QD
О
10=,
J3;
и
10»
10*
102
CD3-FITC
Рис. 13 Гистограммы распределения CD3, HLA-DR и CD19 на лимфоцитах
периферической крови. CD3~CD19+ В-клетки (квадрант A-J1), CD3"HLA-DR+
клетки (квадрант Б - Л ) .
20
Помимо перечисленных выше молекул рецепторного и ко-рецепторного комплек­
са, на поверхности В-клеток экспрессируются антигены МНС класса II (HLA-DR),
Они принимают участие в представление антигенов, а В-клетки являются антигенпредставляющими клетками. Однако HLA-DR антигены также представлены на акти­
вированных Т- и NK-клетках. Этим объясняется несовпадение относительного коли­
чества CD3"CD19+В-клетки и CD3~HLA-DR+ клетки при некоторых патологиях (рис.
13).
Оценка относительного и абсолютного количества В-клеток является одним из
важных диагностических признаков. При воспалительньгх заболеваниях наблюдаются
колебания количества В-клеток в зависимости от типа и стадии иммунного ответа.
Все изложенное выше приводит к тому, что наиболее полную характеристику от­
носительного количества В-клеток и их субпопуляционного состава можно получить
при следующей комбинации MA: CD19/CD5/CD27/CD45.
В связи с тем, что молекула CD 19 представляет собой линейно специфический
маркер В-клеток и не встречается на других популяциях клеток периферической кро­
ви, данный антиген рекомендуется для количественной оценки общей популяции Вклеток. Однако, CD5 и CD27 также экспрессируются на поверхности Т-клеток. Гейтирование по зоне CD19 позитивных клеток, как показано на рис. 14, позволяет четко
локализовать как В-1 клетки (CD19TCD5^), так и В-клетки памяти (CD19"CD27T).
10 3 -
£1
ш
а,
й
Q
О
£2
10'
10°-
CD27-PC5
Рис. 14. Гистограммы распределения CD19, CDS и CD27 на лимфоцитах пе­
риферической крови. А - анализ по зоне CD19 позитивных клеток (зона D). Б распределение CD19 позитивных клеток находящихся в зоне D. Квадрант Е1 - В1 клетки (CD19+CDS+), квадрант Е4 - В-клетки памяти (CD19+CD27+).
Таким образом, в настоящее время оценка и характеристика В-клеточной популя­
ции лимфоцитов является не только важной задачей с точки зрения научных интере­
сов, но и позволяет врачу-клиницисту получить дополнительную информацию о воз­
можном наличии аутоиммунного процесса. Одновременно, что очень важно, совре­
менные подходы позволяют оценить эффективность уже сформировавшегося ответа
по наличию В-клеток памяти. Расширение потенциальных возможностей современ-
21
ной проточной цитомстрин значительно увеличивают точность оценки всех этих ди­
агностически-значимых моментов. Применение многоцветного окрашивания и много­
этапного гейтирования позволяют провести многопараметрический анализ клеток пе­
риферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе пациента.
Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов ана­
лиза и позволяет судить о функционировании В-клеточного звена иммунной системы
больных при разнообразных патологических состояниях.
Идентификация NK-клеток (натуральных киллеров).
Среди больших гранулярных лимфоцитов (LGL, Large Granular Lymphocytes) вы­
деляют отдельную популяцию клеток, получившую название натуральных киллеров
или NK-клеток (Natural Killer). NK-клетки являются важным компонентом врожден­
ной иммунной системы за счет наличия цитолитической активности против клетокмишеней и способности продуцировать цитокины. Первоначально они были описаны
на основании их функциональной способности уничтожать клетки некоторых опухо­
лей гемопоэтического происхождения без предшествующей стимуляции. Таким обра­
зом, одной из основных функций данной субпопуляции клеток иммуной системы яв­
ляется защита собственного организма от видоизмененного «своего».
Как уже было сказано выше, NK-клетки являются носителями двух основных
функций. Первая - это лизис опухолей и инфицированных вирусами клеток. Вторая регуляция врожденного и адаптивного иммунных ответов за счет секреции хемокинов
(CCL3, CCL4, CCL5 и XCL1) и цитокинов (GM-CSF, TNF-a, и IFN-y).
Способность NK-клеток взаимодействовать и убивать опухолевые, но не нормаль­
ные клетки была описана, а позже и объяснена рядом авторов. Этот эффект происхо­
дит за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих молекулы
МНС класса I, которые экспрессируются на нормальных клетках. Эти рецепторы
формируются на NK-клетках при ассоциации молекул CD94 с молекулами семейства
NKG2 (CD 159).
NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, наиболее чувствительной к фи­
зиологическим и психологическим стрессам. В настоящее время доказано выражен­
ное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки. Их цитолитическая ак­
тивность увеличивается при нарастании физической нагрузки и уменьшается после ее
окончания.
В периферической крови NK-клетки составляют от 5 до 20 % циркулирующих
лимфоцитов. По другим данным, среди лимфоидной популяции периферической кро­
ви человека NK-клетки составляет приблизительно 10-15%. Существует взаимосвязь
между изменением активности NK-клеток и их количеством с клиническими призна­
ками заболеваний у людей. Так, относительное количество NK-клеток и их активность
существенно изменяется не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции,
но и при гнойном воспалении, нарушении функций центральной нервной системы
(ЦНС), аутоиммунных заболеваниях и так далее (Whiteside T.L. et al., 1994).. Вероят-
22
но, что в результате применения более тонких и точных методов исследовании, таких
как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявлены и другие
изменения в субпопуляциях этих клеток при иных патологиях.
Рис. 15. Гистограмма распределе­
ния лимфоцитов периферической
крови с использованием моноклональных антител против CD3 и
CD16+CD56, меченых FITC и РЕ.
Квадранты: II- NK-клетки; 12 - ТNK-клетки; 13 - негативные по
CD3 и CD16+CD56 лимфоциты; 14 Т-клетки.
і'о°
ій>
ib'
іеС
CD3-F1TC
Для выявления NK-клеток среди других лимфоцитов используют МА, распознаю­
щие различные маркеры, экспрессируемые на их поверхности. Однако многие по­
верхностные молекулы NK-клеток представлены и на других субпопуляциях лимфо­
цитов, и это накладывает свои особенности на идентификацию натуральных килле­
ров. В связи с этим для их локализации среди других лимфоцитов используют уни­
кальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как, CD56 и CD 16 (рис. 15). С
другой стороны, NK-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как CD3,
CD14 и поверхностные Ig и это также используется при их локализации.
3.0%
Рис. 16. Гистограмма распределения лим­
фоцитов периферической крови с исполь­
зованием моноклональных антител против
CD3 и CD8, меченных FITC и РЕ. В зоне И
находятся CD8* NK-клетки.
>2
22.5%
ш
а.
о
О
10»-
'А
..ЗА,
•
29.Э%г 44,5%Jp;
•to»
' Л1' ' "iV то'
CD3-F1TC
Одним из основных маркеров, используемых для выявления NK-клеток, является
молекула CD 16. Антиген CD 16 представляет собой низко-аффинный рецептор для
IgG (FcyRIII). Данный антиген существует в двух различных формах, кодируемых
двумя различными генами: FcyRIIIA (или ІП-2) и FeyRIIIB (или Ш-1). Генетическая
разнородность CD 16 приводит к альтернативным путям ассоциации молекул с мем­
браной клеток. Первая трансмембранная форма (FcyRIIIA, 50-65 Ша) экспрессируется
на NK-клетках, моноцитах и макрофагах. Вторая форма (FeyRIIIB, 48 Ша), ассоции-
23
рованная с мембраной за счет гликозилфосфатидилинозитола (GPI), экспрсссируется
только на нейтрофилах.
Другим антигеном является молекула CD56. Данный антиген умеренно экспрессируется на отдельных субпопуляциях клеток периферической крови, таких как большие
гранулярные лимфоциты и все клетки с NK активностью. Молекула CD56 также экспрессируется отдельными субпопуляциями Т лимфоцитов (Dargent J.L., et al., 1998).
Циркулирующие зрелые NK-клетки имеют фенотип CD3"CD56+CD16+CD2d"" и от­
личаются от Т-клеток отсутствием Т-клеточного рецептора и CD3. В свою очередь,
отличие от В-клеток заключается в том, что NK-клетки никогда не экспрессируют
мембранные иммуноглобулины (Ig), однако, за счет экспрессии FcyRIII, они могут
быть позитивными при окрашивании антителами. Поверхностные маркеры, экспрессируемые активированными NK-клетками, включают целый ряд молекул, таких как
CD25, pi (CD29) и |32 (CD18) интегрины, различные активационные антигены, вклю­
чая HLA-DR, CD71 и CD69. В зависимости от степени активации NK-клеток поверх­
ностные рецепторы могут изменять свою экспрессию за счет повышения или пониже­
ния (Whiteside T.L., et a!., 1994; Rabinowich H., et ah, 1993).
Популяция NK-клеток обладает достаточной гетерогенностью по своему составу.
Исследователи выделяют несколько их субтипов, а именно npe-NK-клетки, зрелые
NK-клетки и активированные NK-клетки. Данная особенность связана с различной
экспрессией маркеров клеточной поверхности. Среди популяции циркулирующих
NK-клеток выделяют две основные субпопуляции. Первая экспрессирует CD 16 и низ­
кий уровень CD56 (CD164*" h,gh)CD56dim). Вторая экспрессирует CD56, однако, CD16
на них представлен в низкой плотности или полностью отсутствует (CD164w
low,
CD56bnghI). гт о с л е д н я я субпопуляция составляет приблизительно 10-20 % от общего
количества NK-клеток. Они секретируют IFN-y и другие цитокины, и имеют меньшую
цитолитическую активность. В свою очередь субпопуляция CD16h'EhCD56 ™ составля­
ет приблизительно 80-90% от NK-клеток периферической крови, они слабо
секретируют цитокины, но обладают высокой цитолитической активностью (Warren
H.S.,etal., 1991).
Перечень других маркеров, экспрессируемых на своей поверхности NK-клетками,
достаточно широк. Это - CD2, CD5, CD7, CD8, CD94, CD96, CD158, CD159 и многие
другие. В настоящее время для локализации и характеристики NK-клеток наиболее ши­
роко используют двухпараметрический анализ экспрессии CD16 и/или CD56 на CD3негативных клетках. Данная комбинация МА позволяет локализовать общую популя­
цию NK-клеток и количественно ее охарактеризовать (рис. 15), но не охарактеризовать
их субтипы.
Достаточно часто NK-клетки экспрессируют на своей поверхности а-цепь CD8
(рис. 16), но в более низкой плотности, чем цитотоксические Т-клетки. Функция CD8
у NK-клеток до последнего времени была неясна, однако было показано, что субпопу­
ляции NK-клеток человека, экспрессирующие аа гомодимер CD8, обладают большей
цитотоксичностью, чем CD8" NK-клетки, но механизмы этого оставались неизвестны­
ми. Позднее выяснилось, что соединение CD8a цепей в гомодимер индуцирует бы-
24
2
строе повышение внутриклеточного Са * и, инициированное этим, увеличение экс­
прессии CD69. Хотя секреция цитолитических ферментов инициирует апоптоз NKклеток, приток экзогенного кальция защищает CD8a+ NK-клетки от данного процесса.
Данная защита от апоптоза может быть снята преинкубацией NK клеток с антителами
против МНС класса I. Таким образом, данный механизм позволяет CD8cf NK-клсткам
сохранять жизнеспособность и принимать участие в многократном лизисе клетокмишеней.
В последние годы исследователи уделяют большое внимание экспрессии CD38 на
поверхности NK-клеток. Молекула CD38 - это мембранный гликопротеин, представ­
ляющий собой фермент, регулирующий концентрацию цитоплазматического кальция.
Кроме этого, данный фермент обладает целым рядом других активностей таких, как
аденозиндифосфат (ADP) рибозил циклазная, циклический аденозиндифосфат рибозил гидролазная и NAD гликогидролазная. Данная молекула также играет роль рецеп­
тора, модулируя межклеточные взаимодействия, и является переносчиком трансмем­
бранных сигналов. Молекула CD38 экспрессируется на активированных Т-, В-, NKклетках и некоторых других типах клеток.
В ряде работ приведены данные о том, что обработка CD38+ NK-клеток антителами
против CD38 приводит к активации их литической способности. Однако, это происхо­
дило только в тех случаях, когда было возможно взаимодействие CD38 со специализи­
рованными сигнальными молекулами. В случае NK-клеток роль такой молекулы играет
CD 16.
Представленные выше данные свидетельствуют в пользу того, что для наиболее
полной характеристики NK-клеток необходимо определить на СОЗ-негативных клет­
ках следующие поверхностные маркеры: CD16, CD56, CD38 и CD8. В свою очередь
следует отметить, что CD38 и CD8 позволяют оценить цитотоксическую активность
NK-клеток пациента и, как следствие этого, более корректно представлять картину,
происходящую на данном этапе развития иммунного ответа. Для этих целей рекомен­
дуется использовать следующие комбинации MA: CD3/CD16/CD56/CD45 и
CD3/CD8/CD38/CD45.
Как уже было сказано выше, применение двухцветного окрашивания лимфоцитов
с использованием комбинации антител CD3, CD56+CD16 позволяет локализовать NKклетки и оценить их абсолютное и относительное количество (рис. 15). Однако в этом
случае отсутствует возможность определить их субтипы.
Другим вариантом окрашивания лимфоцитов для выявления NK-клеток является
использование комбинации антител CD16 и CD56. На рис. 17А представлена двухпараметрическая гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови с ис­
пользованием МА против CD16 и CD56, меченных FITC и РЕ. Но в этом случае ре­
зультат получается несколько завышенным, поскольку дополнительный вклад вносят
Т-клетки, так как они могут экспрессировать на своей поверхности CD56 и CD 16. Это
особенно ярко проявляется при наличии различных патологий, когда резко возрастает
количество Т-клеток, экспрессирующих данные структуры.
25
Данную задачу позволяет решить применение многоцветного анализа и следую­
щей комбинации MA CD3/CD16/CD56/CD45. D данной комбинации CD3 позволяет
исключить из анализа Т-клстки (рис. 17Б).
С066ьгіЗм
ш
о.
10'-
ш
а.
• • • • & .
.-Ж
о
о
т
(О
ІЛ
о
о
.bright
10».
CD16-FITC
CD16-FITC
Рис. 17. Гистограммы распределения лимфоцитов периферической крови с
использованием моноклональных антител против CD16 и CDS6, меченных FITC
и РЕ. На гистограмме А отображены все CD45+ позитивные лимфоциты. На гис­
тограмме Б отображены только CD45+CD3" лимфоциты.
Ранее сообщалось, что СВ38~ЧЛЭ8*"МК-клетки обладают высокой цитолитической
активностью. Таким образом, знание о н&тичии данной субпопуляции, ее относитель­
ном и абсолютном количестве имеет важное диагностическое значение.
Для локализации CD38+CD8+NK-icneTOK возможно использовать двухпараметрический анализ (рис. 18), но более корректно применять трех- и четырехцветный ана­
лиз (CD3/CD8/CD38 и CD3/CD8/CD38/CD45).
Рис. 18. Гистограмма распределения лим­
фоцитов периферической крови с исполь­
зованием моноклональных антител против
CD8 и CD38, меченных FITC и РЕ. Область
Н содержит CD8+CD38+ NK-клетки.
CD8-FITC
В случае использования комбинации CD3/CD8/CD38 для выделения лимфоцитов
используют морфологические параметры, но в результате этого всегда существует ве­
роятность исключить из анализа часть больших гранулярных лимфоцитов, которые
могут просто не попасть в выделенную зону при гейтировании. Использование CD45
для локализации всей популяции лимфоцитов является более корректным.
26
Комбинация моиоклональных антител CD3/CD8/CD38/CD45 и многоэтапное по­
зитивное и негативное гейтирование позволяет четко выделить активированные NKклетки. На рис. 19А представлена двухпараметрическая гистограмма распределения
лимфоцитов периферической крови с использованием МА против CD3.
Дальнейший анализ проводят на отдельных гистограммах с использованием логи­
ческих ограничений в зонах позитивных и негативных по CD3. На гистограмме, полу­
ченной с использованием гейтирования по CD3*, в зоне второго квадранта находятся
активированные цитотоксические Т-клетки с фенотипом CD8br'8KCD38+ (рис. 19В).
Гейтирование по зоне CD3 негативных клеток, позволяет выявить активированные
NK-клетки с фенотипом СВв^СИЗв* (рис. 19Б). Данное утверждение правомерно,
поскольку CD8 экспрессируется не только на Т-клетках, но и на части популяции CD3
негативных клеток, а именно на NK-клетках.
"о
3
V)
і=
D
•to»
vfi
іо'
ііа!
CD8-FITC
»'
хю2
ю-
<g°
" ' lb'
10'
CD8-FITC
Рис. 19. Многоцветный анализ и последовательное гейтирование для локали­
зации активированных NK-клеток. А - гистограмма распределения лимфоцитов
периферической крови с использованием CD3 и светорассеяния под углом 90°.
Область D содержит Т-клетки, а область С - CD3 негативные лимфоциты. Б гистограмма распределения CD3" лимфоцитов периферической крови с исполь­
зованием CD8 и CD38. СВ8ШтСВ38+ активированные NK-клетки. В - гистограм­
ма распределения CD3+ лимфоцитов периферической крови с использованием
CD8 и CD38. CD8b"8heCD38+ активированные цитотоксические Т-клетки.
27
Таким образом, используя данную комбинацию МЛ, возможно в одном образце
определить активированные цитотоксичсские Т-клетки и активированные NK-клетки.
В последние годы становится весьма очевидной необходимость при тонировании
NK-клегок выявлять как общее количество, так и содержание отдельных их субпопуля­
ций. Это связано с большим количеством вновь полученного фактического материала и
несколькими направлениями развития современной иммунологии.
Результаты исследований показали, во-первых, ведущее значение NK-клеток и их цитотоксической ф>тікции при опухолевых и вирус-индуцированных процессах.
Во-вторых, наличие регуляторпой функции у отдельных субпопуляций NK-клеток
ставит вопрос об их клиническом и патогенетическом значении.
В-третьих, данные о наличии акгивационных рецепторов NK-клеток позволяют
по-новому оценить их функциональную активность, не ставя трудоемких и весьма за­
тратных экспериментов по киллингу клеток-мишеней.
В-четвертых, появилась возможность оценить степень воздействия лекарственной
терапии на собственно NK-клетки как в норме, так и патологии, как in vivo, так и in
vitro. Это позволяет значительно расширить возможности клинической фармакологии
по поиску средств, напрямую влияющих на данную группу клеток (химиотерапия
опухолей, антивирусная терапия и др.).
И, в-пятых, изучение субпопуляций NK-клеток и их функциональной активности
может повлиять на наши представления о природе патологических процессов. Эю
весьма важно как для известных патологий, где значение NK-клеток уже определено,
так и для других процессов, при которых значимость врожденных механизмов имму­
нитета недостаточно изучена. Как следствие этого, новые данные могут способство­
вать более корректной иммунотерапии различных патологических состояний с учетом
ее влияния на данные клетки.
Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии сф-TCR и yS-TCR.
Многие микроорганизмы являются внутриклеточными паразитами и, обитая внутри
клеток организма-хозяина, недоступны для антител. Облигатные внутриклеточные па­
разиты, в частности вирусы, способны размножаться только внутри клеток, используя
репликационную систему клеток хозяина. Факультативно внутриклеточные микроор­
ганизмы, такие как микобактерии и лейшмании, могут размножаться как в клетках,
главным образом в макрофагах, так и вне клеток, но внутриклеточный способ сущест­
вования для них более предпочтителен, поскольку обеспечивает защиту от факторов
иммунной системы. Против данных микроорганизмов действует особый механизм при­
обретенного иммунитета, а именно клеточный иммунитет. Он обеспечивается отдель­
ной субпопуляцией лимфоцитов, получившей название Т-клетки. В отличие от Вклеток, они дифференцируются в тимусе. Т лимфоциты специализируются на уничто­
жении клеток организма, которые инфицированы размножающимися внутриклеточно
возбудителями инфекции. Т лимфоциты играют важную роль в элиминации опухоле­
вых клеток, в реакциях трансплантат против хозяина и хозяин против трансплантата,
28
гиперчуствительности замедленного типа и других реакциях организма, направленных
на поддержание гомеостаза.
Оценка как относительного, так и абсолютного количества Т-клеток и их основных
субпопуляций получила широкое распространение в лабораторной практике. При фенотипировании лимфоцитов эти данные являются диагностически значимыми при раз­
личных патологических состояниях иммунной системы, включая первичные и вторич­
ные иммунодефициты. Динамика изменения субпопуляционного состава Т-клеток при
некоторых патологиях представляет собой значительную ценность для контроля эф­
фективности терапии, прогноза развития и течения заболевания (Hayball J.D., et al.,
2000; Mandy F.F., et al, 2003).
К маркерам, характеризующим Т-клетки, в первую очередь относят Т-клеточный
рецептор (T-Cell Receptor, TCR). Подобно В-лимфоцитам, Т лимфоциты несут на сво­
ей поверхности специфический рецептор для распознавания антигена. TCR является
гетеродимером, состоящим из двух цепей.
Существует два типа TCR, каждый из которых ассоциируется с разными типами Тлимфоцитов. TCR1, состоящий из у- и 5-цепей, появляется на ранних стадиях онтоге­
неза. TCR2 состоит из а- и Р-цепей (Davis М.М, et al, 1988; Autran В , et al, 1989; Jarry
A, et al, 1990;Van den Beemd R, et al, 2000).
Гены а- и р-цепей Т-клеточного рецептора организованы так же, как и гены иммуноглббулинов. Имеются также сегменты V, D и J и гены константных областей (С).
Формирование иммунокомпетентных Т-клеток сопровождается транслокацией фраг­
ментов V, D и 3 с образованием непрерывной последовательности VDJ. Как и при син­
тезе иммуноглобулинов, образование мРНК предусматривает удаление интронов меж­
ду VDJ и С.
CD3-PC5
CD3-PC5
Рис. 20. Гистограммы распределения Т-клеток экспрессирующих TCR-Vp.
Квадранты С2 содержат клетки с фенотипом СОЗ^ТСК-Ѵрі* и CD3+TCR-Vpi4+.
Следует отметить, что уже выявлена специфичность отдельных вариантов Vсегмента TCR. Так Ѵрі7 является мишенью для суперантигена микоплазмы (MAS) и
стафилококкового энтеротоксина В, а Ѵ|38 для стафилококкового энтеротоксина Е.
Описано, что при инфицировании вирусом Эпшейн-Бара наблюдалась быстрая клональная пролиферация CD8+ Т-клеток, экспрессирующих TCR Ѵрі4, хотя в норме
29
TCR V|314 Т-клетки составляют только 2-7% (рис. 20) (Haynes B.F., et al., 1995; Van
den Beemd R., et al., 2000; Kclscn J., et al., 2004; Wada Т., et al., 2007). He исключено,
что в будущем анализ наличия тех или иных Ѵр-субъедишщ TCR может быть исполь­
зован для персонифицированной терапии пациентов.
Примерно 87,2-98,4 % Т-клеток представляют собой вариант ap-TCR, и обознача­
ются эти клетки как ар-Т-клегки. Остальные 1.7-8.9 % Т-клеток несут на своей по­
верхности уб-TCR и обозначаются как у5-Т-клетки.
aP-Т-клетки подразделяются на две различные неперекрывающиеся субпопуля­
ции. Клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществле­
нии иммунного ответа или "индуцируют" его. Данная субпопуляция получила назва­
ние Т-хелперы. Т-клетки другой субпопуляции несут маркер CD8 и обладают пре­
имущественно цитотоксической активностью.
Небольшая часть ap-Т-клеток не экспрессируют ни CD4, ни CD8. С другой сторо­
ны, большинство у5-Т-клеток, циркулирующих в периферической крови, также "два­
жды отрицательны". Однако некоторые из ap-Т-клегок все же экспрессируют моле­
кулы CD8. Напротив, большая часть у5-Т-клеток в тканях экспрессируют CD8. Кроме
молекулы CD8 yS -Т-клетки на своей поверхности могут экспрессировать CD56,
CD94, CD161. Также было продемонстрировано, что цитостатическую активность убТ-клеток возможно стимулировать через CD 122 (Р-цепь рецептора IL-2) (Ichikawa Y.,
et al., 1991; Battistini L., et al., 1997; Fujimiya Y., et al., 1997).
у5-Т-клетки были изучены относительно недавно. Одной из особенностей у8-Тклеток в отличие от ар-Т-клеток является то, что они распознают непептидные анти­
гены, полученные из микробных патогенов, независимо от МНС. Данная субпопуля­
ция выполняет целый ряд важных функций, так они могут усиливать иммунный ответ,
производя большие количества интерферона-у (IFN-y), фактора некроза опухолей-а
(TNF-а) и хемокины. Кроме этого, у5-Т-клетки имеют эффекторную (цитотоксическую) активность. С эволюционной точки зрения, у5-Т-клетки занимают уникальное
место между высоко специфичными сф-Т-клетками и врожденной иммунной систе­
мой для выполнения защиты организма от патогенов. Экспериментальные данные по­
казали, что роль у5-Т-клеток была весьма существенна в устойчивости организма про­
тив целого ряда микроорганизмов. Так, функциональную значимость у5-Т-клеток от­
мечали в устойчивости к Mycobacterium, BoreUia, Francisella tularemis, Salmonella и
вирусам, включая вирус ВИЧ. Кроме того, yS-Т-клетки играют существенную роль и в
противоопухолевом ответе, в частности было описано значительное увеличение этих
клеток у пациентов с лимфомой. у5-Т-клетки также вовлечены в восстановление эпи­
телия и гомеостаз. С другой стороны, у5-Т-клетки могут быть вовлечены в патогенез
заболеваний с гиперактивацией иммунной системы, например, сахарного диабета, бо­
лезни Бехчета, а также бронхиальной астмы (Ichikawa Y., et al.,-1991; McClanahan J., et
al., 1999; Robak E., et al., 1999; Yin Z„ et al., 2000).
Содержание у5-Т-клеток в периферической крови варьирует, существуют половые
и возрастные различия. Их количество увеличивается с момента рождения до наступ­
ления полового созревания, а в дальнейшем постепенно снижается. У женщин коли-
30
чество у5-Т-клеток несколько выше, и этот уровень сохраняется значительно дольше,
чем у мужчин (Caccamo N., et al., 2006).
yS-Т-клетки обладают очень быстрой (начинающейся после 4-6 дней), высокой (в
200 раз) и длительной (>7 месяцев) пролиферативиой способностью в ответ на анти­
ген. Кроме того, в течение иммунного ответа антиген-специфические уб-Т-клетки мо­
гут составлять до 48-98 % от общего количества циркулирующих уб-Т-клеток. Таким
образом, обнаружение увеличенной циркулирующей субпопуляции у5-Т-клеток мо­
жет позволить сделать предположение о недавней или продолжающейся хронической
стимуляции, особенно на слизистых оболочках или участках кожи. Эта информация
позволяет клиницистам делать предположение о возможном медленно прогресси­
рующем инфекционном заболевании (Chen Z.W., et al., 2003).
На клеточной поверхности и а|3-, и у5-антигенраспознающие рецепторы Т-клеток
располагаются непосредственно рядом с полипептидным комплексом, имеющим
групповое название CD3. Это соседство и ассоциация с CD3 являются необходимым
условием для экспрессии всего рецепторного комплекса на поверхности клеток.
0.3%
п
ш
о.
22.3%
Ш
ti­
ro Ю'D
'чЙР
•ч- «гD
-
*2
* 1
1.5%
52.5%
о
о
10° •
10%•
fe
Щ:
U.M:
10»
10
1
CD3-FITC
10»
то*
55.7%і
10»
10'
10»
CD3-F1TC
Рис. 21. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, получен­
ные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови с
использованием комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45.
Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной
характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по такому ли­
нейно-специфическому маркеру как CD3, но и по наличию субпопуляций ар-Т-клеток
и yS-Т-клеток. Важность определения последних становится очевидной для целого
ряда заболеваний. В первую очередь к ним относятся такие заболевания как ВИЧинфекция, вторичные и первичные иммунодефицитные состояния, сопровождающие­
ся длительной персистенцией микроорганизмов в организме человека на фоне депрес­
сии Т-клеточного звена иммунной системы. И особенно важным становится опреде­
ление у5-Т-клеток при оценке общего количества Т-клеток в тех случаях, когда от их
количества зависит доза назначаемых препаратов (например, назначение антиретровирусной терапии ВИЧ-инфицированным пациентам).
Количественный анализ Т-клеток является наиболее востребованным исследова­
нием для иммунологического контроля состояний при синдроме приобретенного им-
31
мунодефицита (СПИД), мониторинга за пациентами как после трансплантации кост­
ного мозга, так и эффективности иммунодепрессивной терапии. Стандартные прото­
колы иммупофенотипирования, использующие четыре цвета, позволяют проводить
идентификацию субпопуляций Т лимфоцитов в одном образце (рис. 21). Этот анализ
предоставляет исследователю намного больше информации, но до последнего време­
ни она находилась вне зоны внимания клиницистов (Reimann K.A., ct al., 2000).
CD3-FITC
CD3-FITC
Рис. 22. Гистограммы распределения Т-клеток по плотности экслрессии CD3
на их поверхности. А - распределение CD3 позитивных Т-клеток у здорового до­
нора. Б - распределение CD3 позитивных Т-клеток у пациента с вирусом Эпштейна-Бара.
Так, при использовании комбинации MA CD3/CD4/CD8/CD45 при обычном ана­
лизе периферических Т-клеток достаточно часто наблюдается бимодальное распреде­
ление экспрессии CD3, которое предполагает наличие двух отличных субпопуляции
Т-клеток (рис. 22Б). Помимо молекул CD3 антиген-специфический Т-клеточный ре­
цептор является другом пан-Т-клеточным маркером, который необходимо использо­
вать при анализе пациентов с иммунологическими расстройствами. Как было описано
выше, существует два отличных типа TCR - <x(3-TCR и yo-TCR, которые различаются
по происхождению в онтогенезе и функциональным свойствам. В медицинской прак­
тике, как правило, внимание клиницистов сосредоточено, прежде всего, на сф-Ткдетках, которые составляют большую часть Т-лимфоцитов. Остающиеся около 5%
у5-Т-клсток, как правило, выпадают из зоны внимания клиницистов, и эти клетки рас­
сматривали исключительно при исследовании иммунитета слизистых оболочек и в
тимусе.
Данный этап необходим, так как большинство -уо-Т-клеток, циркулирующих в пе­
риферической крови "дважды отрицательны" по CD4 и CD8. Другая их особенность
заключается в том, что они имеют более высокую плотность экспрессии молекулы
CD3 на своей поверхности (CD3bnght). На рис. 22 изображено достаточно часто встре­
чающееся распределение CD3 положительных лимфоцитов при бактериальных и ви­
русных инфекциях, первичных и вторичных иммунодефицитах. Как видно из рис. 23,
клетки, находящиеся в зонах А, Б и В, экспрессируют высокий уровень CD3. В свою
очередь клетки в зоне А имеют фенотип CD3bn8h,CD4\ в зоне Б CD3br'sh,CD8dim и зоне
32
bnght
В CD3 CD8". Все эти признаки характерны для у8-Т-клеток. Чтобы выявить у5- и
сф-Т-клеток, как правило, используют следующую комбинацию MA ap-TCR/y5TCR/CD3/CD45.
21
0.3%
43.1%
4.2%
32
28Д%
Ю>.
10»-
ш
LU
О.
а.
о
и
S
•№>-
гззйк 104
22.3%'-
'.'4W-w и
:
1SP-
'Ша
д ib; И
1
CD3-FITC
i s . i % ; . 49.3%Т
4
да "
•ft"
10'
10*
CD3-FITC
Рис. 23. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полу­
ченные в результате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови
пациента с хроническим носительством вируса Эпштейна-Бара. В зонах А, Б и В
находятся CD3bri£h' Т-клетки.
На рис. 24 представлены гистограммы распределения Т-клеток, полученные в ре­
зультате многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хро­
ническим носительством вируса Эпштейна-Бара. На рис. 24А в квадранте F2 находят­
ся у5-Т-клетки, на рис. 24Б в квадранте Е2 - сф-Т-клетки.
'{*
10*
CD3-FITC
CD3-FITC
Рис. 24. Гистограммы распределения Т-клеток, полученные в результате
многоцветного анализа лимфоцитов периферической крови пациента с хрониче­
ским носительством вируса Эпштейна-Бара.
Все изложенное выше свидетельствует в пользу того, что для наиболее полной фенотипической характеристики Т-клеток необходимо проводить анализ не только ли­
нейно-специфичного маркера Т-клеток CD3, но и определять субпопуляционный со­
став Т-клеток по экспрессии Т-клеточного рецептора, а именно уб- и ap-TCR. Для
этих целей следует использовать многоцветный анализ и следующие комбинации
MA: CD3/CD4/CD8/CD45 и a.p-TCR/y5-TCR/CD3/CD45 (таблица 4).
33
Таким образом, более полная информация об экспрессии Т-клеточного рецептора в
клинической практике значительно расширяет возможности для анализа состояния Тклеточного звена иммунной системы не только с точки зрения адекватного выявления
его дефектов, но и для правильного назначения химиотерапевтических препаратов, на­
правленных на восстановление нормальною функционирования защитных систем ор­
ганизма.
Таблица 4. Среднестатистическое содержание у8-Т клеток и сф-Т клеюк в
периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Субпопуляции
Относительно
лимфоцитов (%)
Общие Т-клетки
73 + 12,0
Относительно об­
щих Т-клеток (%)
Абсолютное ко­
личество (кл/л)
0,946-2,079x10'
у5-Т клетки
4,6 ±2,8
5,3 ±3,6
0,022-0,115 х 10'
сф-Т клетки
70,5 ±9,7
92,8 ±5,6
0,924-1,964x10'
Идентификация регуляторных Т-клеток и Т-клеток памяти.
В крови человека присутствуют как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти, раз­
личающиеся между собой по функциональным и фенотипическим признакам. Жиз­
ненный цикл Т-клеток в организме делится на две фазы. Независимая от чужеродного
антигена стадия дифференцировки Т-клеток и стадия, связанная с присутствием чу­
жеродного антигена. Первая из них завершается появлением в русле крови зрелых на­
ивных Т лимфоцитов, каждый из которых способен отвечать только на «свой» анти­
ген. Стимулированные антигеном в ходе первичного ответа Т-клетки проходят даль­
нейшую дифференцировку (Sprent J., 1994).
Все Т-клетки памяти появляются в результате дифференцировки активированных
антигеном наивных предшественников в ходе норматьного развития первичного им­
мунного ответа in vivo. Экспрессия на клеточной поверхности различных изоформ
молекулы CD45 позволяет разделить CD4+ Т лимфоциты человека на наивные Тклетки и Т-клетки памяти. Принято относить субпопуляцию CD4+CD45RA~CD45R0+
Т лимфоцитов к Т-клеткам памяти и соответственно CD4+CD45RA CD45R0" — к на­
ивным Т-клеткам (рис. 25). Подобное разделение основано исключительно на способ­
ности CD4'"CD45RA~CD45R0+ Т-клеток, а не наивных Т лимфоцитов, интенсивно от­
вечать на повторный контакт с антигеном in vitro. В свою очередь, быстрый и усилен­
ный ответ Т-клеток памяти на специфический антиген является их важнейшим функ­
циональным отличием от наивных предшественников (Sanders M.E., et al, 1988;
Michie,C.A,etal., 1992).
Покоящиеся CD4* T лимфоциты памяти также отличаются от наивных предшест­
венников системой внутриклеточной сигнализации, приводящей к резистентности к
действию Са2+-ионофоров. Чувствительная к действию Са2+-ионофоров популяция
CD4+ Т-клеток человека составляет основную часть покоящихся наивных
CD4+CD45RA+CD45R0~ T лимфоцитов. В свою очередь, большинство резистентных к
34
2+
+
действию Са -ионофоров CD4 Т-клеток являются покоящимися CD4+CD45RA~
CD45R0* Т лимфоцитами памяти (Ishida Y., et al., 1988; Miller R.A., et al., 1991; Sigova
A.,etal„1999).
3n
;je2.s%
7.3%
33
CO45R0-ECD
•да
CD45R0-ECD
CD45R0-ECD
Рис. 25 Распределение лимфоцитов условно здорового лица (А и В) и пациен­
та в послеоперационный период (Б и Г). На гистограммах В и Г анализ лимфо­
цитов проводили только по CD45 позитивным клеткам. На гистограммах А и Б
анализировали клетки при помощи многоэтапного гейтирования по CD4S и
CD4.
Основная методическая сложность в исследованиях процесса дифференцировки
CD4+ T лимфоцитов в периферической крови здоровых лиц связана с тем, что активи­
рованные клетки составляют лишь незначительную часть. Как правило, в крови здо­
ровых лиц доля активированных CD4+ Т-клеток составляет менее 10% от общего чис­
ла CD4+ Т лимфоцитов (Reimann K.A., et al., 2000).
Однозначным фенотипическим признаком дифференцировки покоящихся наивных
CD4+CD45RA+CD45R0~T лимфоцитов человека в покоящиеся Т-клетки памяти приня­
то считать появление на поверхности клеток молекул CD45R0 взамен изоформы
CD45RA. Данная особенность позволяет выявить три субпоггуляции CD4+ T лимфоци­
тов человека: покоящиеся наивные CD45RA+CD45R0" Т-клетки, покоящиеся CD45RA"
CD45R0+ Т-клетки памяти и активированные - CD45RA+CD45R0+ Т-клетки (рис. 25).
Все активированные CD4+CD45RA+CD45R0+ T лимфоциты возникают в процессе сти­
муляции наивных Т-клеток антигеном in vivo (Sanders ME., et al., 1988; Michie, C.A., et
al., 1992).
Появление молекул CD69 считают основным фенотипическим признаком наибо­
лее ранней (первые часы) стадии активации наивных CD4+ Т лимфоцитов. Как прави-
35
ло, в крови здоровых лиц не удается обнаружить присутствие более чем 1-4%
CD4+CD69+ Т-клеток (Gerosa F., et al., 1991; Maschcr В., ct al., 1999; Pala P., et al., 2000).
CD95-FITC
+
+
Рис. 26 Алгоритм анализа субпопуляций CD4 CD25 T лимфоцитов человека:
CD4+CD25l"gh - зона Е, CD4+CD25|0,V - зона D, CD4+CD25" - зона С. В однопараметрических гистограммах представлено распределения молекул CD95+ на
CD4+CD25high, CD4+CD25|0W и CD4+CD25" T лимфоцитах. Распределения молекул
CD38, CD62L и HLA-DR на поверхности CD4+CD25high, CD4+CD25iow и CD4+CD25~
Т-клеток оценивалось аналогичным способом.
Определение относительного количества CD4+CD45RA+CD45R0" и CD4+CD45RA~
CD45R0* лимфоцитов может служить хорошим диагностическим признаком. Этот
эффект четко проявляется при развитии инфекции или при хирургическом вмеша­
тельстве, поскольку происходит накопление доли CD4+CD45RAXD45R0+ клеток и
снижение CD4+CD45RATCD45R0~. Как видно из рис. 25, определение относительного
количества CD45RA* и CD45R0+ клеток по всей популяции лимфоцитов мало инфор­
мативен и только анализ по зоне CD4 позитивных клеток позволяет четко увидеть это
различие.
Популяция CD4+CD25+ Т-клеток человека гетерогенна по функциональным свой­
ствам и фенотипическим признакам. Она включает в себя популяции пролиферирующих CD4+CD45RA+CD45R0+CD25low Т-клеток и «регуляторных» (T-reg - Т regulatory)
CD4TCD45R0+CD25hlgh T лимфоцитов. Идентификацию этих популяций клеток приня­
то проводить по совокупности количественных параметров экспрессии молекул
CD38, CD62L, CD95 и HLA-DR. В подобном случае правильный выбор областей ана-
36
лиза (рис. 26 и 28) в наибольшей степени определяет корректность описания субпопу­
ляций CD4 + CD25 + Т лимфоцитов человека. Согласно проведенному анализу, фенотипические признаки субпопуляции CDIS1"^, CD25 low и CD25" Т лимфоцитов полно­
стью отвечают существующим критериям для данных типов Т-клеток (Jonuleit Н., et
al., 2001; Baecher-Allan С , et al., 2001; Shevach E.M., 2002).
А
Б
ю 2 -.
о
<Ѵ
ю
гч
Q
о
^
Ж
сз%и1?} ? 4
; '/-'
" '&3
CD127-PE
" Г*.
$ -\
m1
i'o!' " w
CD4-PC7
Рис. 27. Многоэтапное гейтирование при анализе T-reg клеток в перифериче­
ской крови. А - гистограмма распределения CD127 и CD25 после одновременно­
го гейтирования по CD4 и CD45. В зоне Е находятся регуляторные клетки. Б гистограмма распределения CD4 и CD25 после гейтирования только по CD45.
Черные точки - T-reg клетки.
T-reg клетки имеют следующий фенотип CD3+CD4+CD25h,ghCD45R0+CD95+, однако
наиболее важным их маркером является FOXP3. Исследования показали, что FOXP3,
который кодирует фактор транскрипции скурфин (scurfm), является главным регули­
рующим геном для развития и функционирования CD4+CD25b'8h регуляторных Тклеток. Таким образом, самым точным маркером для идентификации T-reg клеток яв­
ляется как раз фактор транскрипции FOXP3. Однако он является внутриклеточным
маркером, что значительно затрудняет работу по идентификации T-reg (Schubert L.A., et
al.,2001).
Исследования последних лет показали, что экспрессия CD127 на T-reg клетках
снижена или отсутствует. В свою очередь, эксперементы in vitro выявили, что экс­
прессия CD 127 после активации Т-клеток резко снижается. CD 127 представляет из
себя сс-цепь гетеродимерного рецептора IL-7, который состоит из CD 127 и общей уцепи, которая представлена и у других рецепторов цитокинов (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL15R, и LL-21R). CD127 экспрессируется на тимоцитах, Т- и В-предшествинниках, зре­
лых Т-клетках, моноцитах, и некоторых других лимфоидных и миелоидных клетках.
Показано, что IL-7R играет важную роль в пролиферации и дифференцировке зрелых
Т-клеток (Ryan D.H., et al., 1997; Zaunders J.J., et al., 2006).
Таким образом, окончательный фенотип T-reg клеток будет выглядеть следующим
образом: CD3 + CD4 + CD25 b "*tD127 dm "" MKS FOXP3 + и для их детектирования можно
использовать данный фенотип T-reg, без выявления FOXP3. Для более точной локали-
37
зации T-rcg клеток предпочтительно использовать многоцветный анализ и многоэтап­
ное гейтирование с использованием следующего набора МА - CD45-FITC, CD4-PC7,
CD25-PC5 и CD127-PE (рис. 27). Среднестатистические результаты анализа T-reg кле­
ток взрослых условно здоровых лиц представлены в таблице 5.
Таблица 5. Среднестатистическое содержание субпопуляций регуляторных
Т-клеток в периферической крови взрослых условно здоровых лиц (N = 60).
Содержание
Субпопуляции
Общие Т хелперы
Рсгуляторныс Т-клстки (отно­
сительно Т хелперов)
45 ±10
Абсолютное коли­
чество (кл/л)
0,576-1,336x10"
3,7± 2,05
0,009-0,078 х 10"
Относительное (%)
Субпопуляции CD4+CD25+ Т-клеток проявляют неодинаковую чувствительность к
действию иономнцина. В иономицин резистентной фракции (ИР-фракции) значитель­
но возрастает доля CD4xCD25h;8h Т-клеток по сравнению с кровью того же донора, а
содержание CD4rCD25lmv T лимфоцитов уменьшается. Следовательно, большинство
CD4+CD25l"eh T лимфоцитов представлено резистентными к действию иономицнна
клетками. Полного исчезновения CD4+CD25l0"' T лимфоцитов в ИР-фракции никогда
не наблюдалось. Следовательно, и в составе CD4~CD25low T лимфоцитов присутству­
ют клетки, различающиеся по своей чувствительности к действию иономицина. Из­
менение содержания субпопуляций CD4+CD25* T лимфоцитов в ответ на действие
иономицина напрямую зависело от исходной доли Т-клеток с данным фенотипом в
крови. Однако обогащение ИР-фракции CD4+CD25h,gh Т-клетками и одновременное с
ним снижение доли CD4+CD25lmv T лимфоцитов наблюдалось наиболее часто.
В сравнении с CD4+CD25hIgh Т-лимфоцитами ПКЧ, ИР-популяция (рис. 28) всегда
обогащена клетками с высоким уровнем экспрессии молекул HLA-DR и CD95. Одно­
временно ИР CD4+CD25hleh Т лимфоциты характеризуются меньшей долей CD62I/
клеток (рис. 28) и заметным снижением уровня экспрессии этих молекул. По сравне­
нию с CD4+CD25low Т-клетками ПКЧ, ИР-фракция обогащена CD95" клетками с высо­
ким уровнем экспрессии этих молекул (рис. 28). При этом в ИР-фракции CD4 CD25 °w
Т лимфоцитов наблюдалось выраженное уменьшение доли CD62L+ клеток и снижение
уровня экспрессии этих молекул. Среди ИР CD4+CD25l0W T лимфоцитов уменьшение
доли CD38+ клеток (рис. 28) происходит за счет лимфоцитов с низким уровнем экспрес­
сии этого маркера.
Появление молекул HLA-DR на CD4+ T лимфоцитах считается признаком поздней
стадии активации этих клеток. Существование CD44CD25+HLA-DR+ Т-клеток в ПКЧ
не позволяет полностью разграничить данный этап активации Т лимфоцитов от пре­
дыдущего. Большинство CD4+HLA-DR+ Т-клеток ПКЧ имеют, как правило, фенотип
CD4+CD45RA~CD45R0+. Скорее всего, на поздних стадиях активации in vivo в ходе
нормального развития первичного иммунного ответа основная часть этих CD4T Т
38
лимфоцитов человека качественно изменяет свой характер регуляции внутриклеточ­
ного Са2+ и приобретает резистентность к действию низких доз иономицина.
CDJ52L
CD95
CD38
HLA-Dfi
C062L
CD95
CD38
Н1А-0Й
[•овевн I
« C D 2 5 (ІОЛІ
Рис. 28. Анализ субпопуляций CD4+ Т лимфоцитов человека до (а) и после (б)
инкубации клеток с иономицином, проведенный методом проточной цитофлуориметрии и разработанного алгоритма (см. рис. 26). По оси ординат приведены
значения долей клеток в составе соответствующей субпопуляции.
Маркер наиболее поздней стадии активации in vivo Т лимфоцитов человека - моле­
кулы CD29 (VLA - Very Late Antigen) - часто используется как дополнительный при­
знак покоящихся CD4"CD45RATD45R(T Т-клеток памяти. В составе ИР-фракции
CD4+CD45R0+CD29T Т-юіеток значительно больше, чем в исходной популяции того же
донора (рис. 29). Вместе с тем, на значительной доле (в среднем около половины)
CD4 T CD45RATD45R(f T лимфоцитов ИР-фракции этот антиген отсутствует. Никаких
экспериментальных данных в литературе о взаимосвязи молекул CD29 и CD45R0 до
настоящего
времени
не
описано.
Степень
обогащения
ИР-фракции
CD4+CD45R(TCD29~ Т-лимфоцитами зависит от исходной доли клеток с данным фено­
типом в составе лимфоцитов ПКЧ, но во всех исследованных случаях молекулы CD29
экспрессируются на меньшей доле ИР CD4 + CD45RATD45R(T Т-клеток. Как правило,
CD4+CD45RCTCD29" Т-клетки в ощутимых количествах встречаются только в крови
больных хроническими инфекциями. Сопоставимые результаты были получены для
лимфоцитов здоровых лиц. Вероятнее всего, на поздней стадии активации большая
часть CD4TCD45R(TCD29" T лимфоцитов состоит из резистентных к действию ионо­
мицина клеток, а, возможно, определенная часть CD4TCD45RCTCD29~ T лимфоцитов
является чувствительными к его действию клетками.
Появление CD4TCD26" T лимфоцитов также принято считать признаком специфи­
ческой активации Т-клеток, хотя до сих пор остается неясным, на какой стадии диффсренцировки появляется данный маркер. В норме, около четверти CD4^ Т-клеток ПКЧ
экслрессируют молекулы CD26. В ИР-фракции доля CD4*CD26" T лимфоцитов всегда
значительно выше, чем в ПКЧ того же донора, и составляет, как правило, более поло­
вины соответствующей популяции (рис. 29). Таким образом, значительная часть
39
CD4 CD26 CD45RA~CD45R0 T лимфоцитоз человека является резистентной к дейст­
вию иономицина.
г
б
£
" юг*;
ш
CD26-
IX w "i'.''S%-
20.3«
д*.
- ' Ф У Н ^ v"S5$s?4
Iff'
"ІяІ"'
«'
'•'"•I
га.7%
'' •-I
10"
' "•
1 » 10«
CD4-FITC
CD4-FITC
і
J5.2».
ш -а.
47 0".
D45R0
Ш
О.
Q
О
О іс^.
щ
"i£ty.
З.ѴЬ
№
ю1
да
CD29-FITC
to"
CD29-FITC
Рис. 29 Анализ состава CD4+ Т лимфоцитов человека до (а) и после (б) инку­
бации клеток с иономицином. Гистограммы показывают экспрессию CD45R0,
CD26 и CD29 молекул на поверхности CD4+ Т-клеток.
В целом возникновение резистентности к действию низких доз иономицина и из­
менение гомеостаза ионов кальция в CD4+ Т-клетках наиболее характерно для самых
поздних стадий дифференцировки активированных in vivo CD4^ T лимфоцитов чело­
века. В полной мере это свойство характерно для долгоживущих покоящихся
CD4+CD45RA"CD45R0+ T лимфоцитов памяти человека.
Как и следует ожидать от системы, работающей по принципу клональной селекции,
каждый антиген активирует лишь ничтожно малую часть всей популяции Т лимфоци­
тов. Дм выполнения своих функций наивным Т-лимфоцитам необходима пролифера­
ция (поскольку на антиген реагируют лишь немногие клоны, содержащие малое число
клеток, и для развития интенсивного ответа требуется их предварительное размноже­
ние). По этой причине подавляющее большинство работ по изучению закономерностей
активации Т лимфоцитов выполнены in vitro с использованием митогенных лектинов
(СооА. и ФГА), смеси ФМА с Са2+-ионофорами (иономицин), или МА к комплексу
CD3-TCR. Каждый этап специфической активации Т-клеток in vivo происходит в кон­
кретном микроокружении, полностью смоделировать которое в реальных условиях
эксперимента вряд ли представляется возможным.
40
Общепринятый фенотип наивных CD4+ Т-клеток человека может быть описан как
CD45RA+CD45R0"CD25 XD29TD62L + CD69~CD95 - HLA-DR~. Большинство покоя­
щихся наивных CD4+CD45RA+CD45R0" Т лимфоцитов, как и Т-клетки тимуса, явля­
ются чувствительными к действию Са2+-ионофоров. Многократное возрастание ионов
Са2+ всегда происходит наиболее резко в первые минуты стимуляции Т лимфоцитов и
достигает максимума в течение 5-10 мин. Следовательно, чувствительность к присут­
ствию ионов кальция в среде и к действию иономицина является необходимым усло­
вием для осуществления стадий индукции активации наивных Т лимфоцитов.
Чувствительность ранних этапов активации (от момента начала поликлональной
стимуляции и до появления на поверхности Т лимфоцитов молекул CD25) к присутст­
вию ионов кальция во внешней среде и их зависимость от амплитуды роста внутрикле­
точного Са2+ в ответ на стимул признается большинством исследователей. Данный этап
активации по продолжительности колеблется от 8 до 12 ч. Этот же временной интервал
принято характеризовать и по появлению молекул CD69. Экспрессия молекул CD69 в
активированных Т-клетках полностью подавляется EGTA. Среди лимфоцитов ИРфракции присутствие CD4+CD45R0~CD45RA+CD69+ Т-клеток никогда не наблюдается.
Скорее всего, большинство CD4+CD45RA+CD45R0,owCD69+ Т-лимфоцитов человека
представляют собой чувствительные к действию иономицина клетки. Возможно, до по­
явления молекул CD25 на активированных CD4+CD45R(TCD45RA+ Т-лимфоцитах эти
клетки и проходят несколько этапов начальной стадии активации, но все они не сопро­
вождаются качественными изменениями их чувствительности к действию иономицина.
Следовательно, для инициации процесса активации чувствительность Т-клеток к иономицину совпадает с их наиболее сильной зависимостью от присутствия Са2+ в среде.
Так как ионы кальция всегда присутствуют в организме, то резистентность к действию
иономицина просто не может появиться на данном этапе активации.
Одной из ключевых стадий процесса активации принято считать появление
CD4+CD25+ Т-клеток. Влияние удаления ионов кальция с помощью EGTA из среды на
экспрессию молекул CD25 Т-клетками сильно зависит от времени добавления хелатора.
Как правило, чем на более ранней стадии ионы кальция были удалены из среды инку­
бации клеток, тем большее влияние это оказывает на экспрессию молекул CD25. Ско­
рее всего, для индукции синтеза молекул CD25 de novo присутствие ионов кальция аб­
солютно необходимо. Экспрессия молекул CD25 на активированных Т-клетках, про­
шедших стадию индукции, значительно меньше зависит от EGTA. Для более поздних
стадий активации какого-либо эффекта EGTA на CD25 + Т-клетки отмечено не было.
Это свидетельствует о значительном снижении зависимости этой и, возможно, после­
дующих стадий активации Т-клеток от присутствия ионов кальция в среде.
Доля CD4+CD25+ Т-клеток в составе ИР-фракции лишь незначительно отличалась
от их содержания в крови того же донора. Это позволяет предположить появление ИР
Т-клеток, в которых произошла перестройка гомеостаза ионов кальция, именно на
данной стадии активации in vivo CD4* Т лимфоцитов. В популяции CD4 + CD25 i Тклеток ПКЧ присутствуют пролиферирующие и регуляторные CD4 + T лимфоциты.
Существуют ли взаимные переходы между CD4 + CD25 h ' eh и CD4+CD25low популяция-
41
ми, до сих пор остается неизвестным. Субпопуляции этих клеток проявляют неодина­
ковую чувствительность к Са2+-ионофору. Большинство CD4TCD25h'sh T лимфоцитов
представлено резистентными к действию иономицмна клетками. В сравнении с
CD4+CD25h'sh Т-лимфоцитами ПКЧ, ИР-фракция всегда обогащена HLA-DR* CD95*
и CD38+ клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул, но одновременно со­
держит меньше CD62L* клеток. В сравнении с CD4'CD25low Т-клетками ПКЧ, ИР по­
пуляция обогащена CD95* клетками с высоким уровнем экспрессии этих молекул.
При этом в ИР-фракции CD4+CD25low T лимфоцитов наблюдается выраженное
уменьшение доли CD62I/ клеток. Скорее всего, Т-клетки с измененным гомеостазом
ионов кальция появляются на стадии интенсивной пролиферации активированных
CD4+ Т лимфоцитов, но составляют меньшую долю этой популяции. В популяции регуляторных CD4'"CD25h'gh Т лимфоцитов доля ИР-клеток значительно выше. Какиелибо данные о зависимости этих популяций от присутствия ионов кальция в среде на
настоящий момент отсутствуют.
Появление молекул HLA-DR является общепринятым признаком поздней стадии
активации CD4+ T лимфоцитов. Специальных работ по изучению роли ионов кальция
в экспрессии молекул HLA-DR не проводилось, но отмечается минимальный вклад
кальмодулин-зависимых процессов (сАМР- или cGMP-зависимые протеинкиназы) в
осуществление экспрессии. Доля ИР CD4+HLA-DR+ Т-клеток всегда была значитель­
но выше, чем в крови того же донора. Скорее всего, на поздних стадиях активации т
vivo большая часть активированных CD4* Т-клеток качественно изменяет характер
внутриклеточной регуляции ионов кальция и приобретает резистентность к действию
иономицина.
Молекулы CD29 часто используются в качестве дополнительного признака по­
коящихся CD4+CD45RA"CD45R0+ Т-клеток памяти. Для этого маркера отсутствуют
четкие указания на зависимость его экспрессии от стадии активации CD4+ T лимфо­
цитов. Роль ионов кальция в индукции экспрессии этих молекул также до сих пор не­
известна. ИР-фракция значительно обогащена CD4+CD45R0fCD29+ Т-клетками по
сравнению с исходной популяцией в крови донора. Однако на значительной доле (в
среднем около половины) CD4+CD45RA"CD45R0+HP Т-клеток этот антиген отсутст­
вует. Скорее всего, на этой, достаточно поздней стадии активации CD4* Т лимфоци­
тов, происходит полная замена изоформы CD45RA на CD45R0. Вероятно, на этой
стадии активации большая часть CD4+CD29+ Т лимфоцитов состоит из резистентных
к действию иономицина клеток. Никаких работ по сравнительному анализу функцио­
нальных свойств CD45R0+CD29" и CD45R0+CD29+CD4" Т-клеток до настоящего вре­
мени не проводилось.
Дополнительным признаком покоящихся CD4+CD45RA~CD45R0+ T лимфоцитов
памяти человека принято считать присутствие в популяции CD28+ клеток. Действие
иономицина на лимфоциты ПКЧ сопровождается значительным обогащением попу­
ляции CD4+CD45RA~CD45R0+CD28+CD29+CD62LI<W Т-клетками. Неодинаковая чув­
ствительность к иономицину CD62Lhlgh и CD62L|0W T лимфоцитов хорошо совпадает с
общепринятым подразделением популяции CD4+ Т-клеток человека по путям мигра-
42
+
ции по организму. Для CD4 T лимфоцитов человека имеются указания на различную
чувствительность к апоптозу CD28~ и CD28" клеток - наиболее готовыми к апоитозу
клетками принято считать CD4,CD95h'8l'CD28~клетки. Согласно современной класси­
фикации, наиболее полно фенотип ИР CD4* Т-клеток человека совпадает с популяци­
ей «центрального ядра» Т-клеток памяти. В этой популяции CD4T T лимфоцитов па­
мяти представлены покоящиеся Т-клетки человека, полностью прошедшие зависимую
от антигена дифференшровку в ходе первичного иммунного ответа. Данные клетки
обладают ограниченной способностью к миграции по высоко-эндотелиальным венулам.
Дифференцировка CD4+ Т-лимфоцитов
Рис. 30. Диаграмма, иллюстрирующая возникновение резистентности к дей­
ствию иономицина, CD4+ T лимфоцитов памяти человека в ходе зависимой от
антигена дифференцировки из наивных предшественников как результат нор­
мального развития первичного иммунного ответа in vivo.
ИР Т-клетки были описаны ранее для селезенки и лимфатических узлов мыши.
Использование лабораторных животных дает редкую возможность проводить экс­
перименты методом адоптивного переноса: выделенные и охарактеризованные по­
пуляции иммунных клеток доноров (мышей) переносят наивным сингенным реци­
пиентам, в которых и проверяют in vivo функциональные свойства перенесенных
клеток. Только выделенные ИР Т-клетки из селезенок переболевших или вакцини­
рованных мышей-доноров оказались способны адоптивно переносить наивным ре-
43
ципиентам невосприимчивость к последующему заражению Mycobacterium
tuberculosis и Neisseria meningitidis в соответствующих моделях. Приведенные дан­
ные прямо свидетельствуют о способности ИР Т-клеток к выполнению основных
функций Т лимфоцитов памяти, связанных с распознаванием антигенов возбудите­
ля и быстрого и усиленного ответа на них in vivo, приводящего к эффективной за­
щите реципиентов от патогена. Большинство специфичных к антигену Т лимфоци­
тов селезенки и лимфатических узлов мыши также сосредоточено в ИР-фракции Тклеток.
ИР Т-клетки человека сохраняют способность отвечать на стимуляцию смесью
ФМА с иономицином. Для выделенных CD4TCD45R0+ Т-клеток памяти человека так­
же показана значительно меньшая зависимость пролиферации и продукции IL-2 от
концентрации ионов кальция в среде при стимуляции МА к CD3, по сравнению с на­
ивными CD4+ Т-клетками того же донора. Следовательно, резистентность к действию
иономицина Т-клеток памяти «не мешает» им осуществлять важнейшие функции Тклеток памяти in vivo и in vitro.
Полученные экспериментальные данные суммированы в виде схемы, приведенной
на рис. 30, иллюстрирующей изменение гомеостаза ионов кальция в CD4+ Тлимфоцитах в процессе их активации и дифференцировки in vivo. Данная схема носит
гипотетический характер, так как не все стадии активации и дифференцировки CD4+
Т-клеток in vivo описаны одинаково подробно.
Ионы кальция всегда присутствуют в организме. Они необходимы для протекания
множества биохимических реакций в клетках. При дифференцировке in vivo активиро­
ванных Т лимфоцитов роль ионов кальция постоянно меняется. Все покоящиеся наив­
ные CD4+CD45RA~CD45R(T Т-клетки чувствительны к действию низких доз иономи­
цина. Индукция активации наивных Т лимфоцитов всегда приводит к повышению Са"~
внутри клеток. На этой стадии активации Т-клетки сохраняют чувствительность к дей­
ствию иономицина. Более поздние стадии активации значительно меньше зависят от
присутствия ионов кальция, и часть активированных клеток приобретает резистент­
ность к действию иономицина. Покоящиеся CD4+CD45RA~CD45R0' Т-клетки памяти
вообще резистентны к действию иономицина, но это не препятствует осуществлению
ими своих физиологических функций, связанных с распознаванием антигенов возбуди­
теля и быстрого и усиленного ответа на них in vivo, приводящего к эффективной защите
организма от патогенов.
ВЫВОДЫ
1. Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов
цитометрического анализа для стандартизации исследований изучаемых парамет­
ров клеток иммунной системы применим для работы на большинстве проточных
цитометров ведущих фирм производителей.
2. Последовательное введение логически ограниченных зон при многоцветном ана­
лизе лимфоцитов выявляет наличие отдельных минорных субпопуляций, различие
44
в плотности экспрессии маркеров внутри изучаемой субпопуляции клеток, стадию
дифференцировки и степень их активации.
3. Результаты проведенных скрининговых исследований условно здоровых лиц в
различных регионах России с определением среднестатистическиих значений па­
раметров иммунного статуса сопоставимы со среднестатистическими значениями
параметров иммунного статуса человека опубликованными в литературе.
4. Методологический подход, включающий введение в первичную панель скринигового исследования иммунной системы антител для выявления аутореактивных
клонов В-клеток (В1, CD19+CD5+), улучшает диагностику и мониторинг за паци­
ентами с аутоиммунными заболеваниями (аутоиммунный тиреоидит).
5. В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный
цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возмож­
ность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный со­
став, так и ряд функциональных параметров иммунокомпетентных клеток при
уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечно­
го результата.
6. Предложена и внедрена в практическую работу четырехцветная панель моноклональных антител к различным кластерам дифференцировки лимфоцитов перифе­
рической крови учитывающая степень активации различных субпопуляций Тклеток, В-клеток и NK-клеток:
IgG/IgG/IgGCD45 - изотопический контроль;
CD19/CD5/CD27/CD45 - В1, В2, В-клетки памяти;
CD16/CD56/CD3/CD45 - субпопуляции NK-клеток;
CD8/CD4/CD3/CD45 - субпопуляции Т-клеток;
CD8/CD38/CD3/CD45 - активированные Т-цитотоксические и NK-клетки;
CD4/CD25/HLA-DR/CD45 - активированные Т хелперы;
CD45RA/CD45R0/CD4/CD45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти;
TCR-ap7TCR-y5/CD3/CD45 - сф- и у5-Т-клетки;
CD4/CD25/CD127/CD45 - Т-регуляторные клетки.
7. Разработанные критерии применения многоцветных параметров для иммунофенотипирования клеток, в том числе при использовании первичной панели для
скрининговых исследований и вторичной панели для более углубленного анализа
включают: а) анализ гистограмм на наличие клеток с измененной экспрессией ли­
нейных маркеров; б) сравнение полученных значений с референтными; в) анализ
плотности экспрессии значимых маркеров лимфоцитов; г) оценка степени актива­
ции иммунокомпетентных клеток.
8. Дифференцировка
Т
лимфоцитов
от
наивных
Т-хелперов
(CD4+CD7+CD45RA+CD45R0TD25TD29XD62L+CD69"CD95-HLA-DR1 к Тклеткам памяти (CD4+CD7"CD45RATD45R0+CD28+CD29+CD62Llow) сопровожда­
ется изменением рецепторного репертуара и перестройкой системы Са2+гомеостаза, что приводит к возникновению их резистентности к действию каль­
циевых ионофоров.
45
9. Обоснованное применение многоцветного цитометрического анализа значительно
расширяет возможности клинико-диагностических и научных исследований им­
мунной системы человека и биологических объектов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Коллективные монографии и главы в книгах.
1. Дозморов И.М., Багаева Л.В., Коваленко Е.И., Кузин И.И., Литвинов И.С, Луцан
Н.И., Луценко Г.В., Мо.тотковская И.М., Петров Р.В., Прохорова А.Л., Рысева
И.А., Хайдуков СВ., Сапожников A.M., Свирщевская Е.В. Альтернативность в
действии гликопептидов бактериальной стенки на иммунную систему и ее компаненты. // Синтетические иммуіюмодуляторы. Под ред. Р.В. Петрова, М.: Наука,
1991, с. 38-96.
2. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Sumaroka M.V., Litvinov I.S.,
Dorodnikh E.G., Valyakina T.I., Malakhov A., Brisken K. The molecular mechanism of
muramyl peptides' biological activity. // Hacmotology and Blood Transfusion, Modern
Trends in Human Leukemia IX, R. Neth et al. (Eds.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg,
1992, p. 290-293.
3. Vlasova E.V., Galanina O.E., Khaidukov S.V., Tuzikov A.B., Tzvetkov Y.E., Shashkov
A.S., Nifant'ev N.E., Bovin N.V. Specificity of Workshop mAb S071-S076 towards syn­
thetic selection receptors and cell lines A431 and HL-60. // Leucocyte Typing V. White
Cell Differentiation Antigens. S.F. Schlossman et al. (Eds.), Oxford University Press vol.
1,1995, p. 1534-1535.
4. Vlasova E.V., Kovalenlco E.I., Lukin S.V., Khaidukov S.V., Nifant'ev N.E., Piskarev
V.E., Bovin N.V. Myeloid Blind Panel biochemical analysis: Specificity of anticarbohydrate MA submitted to Myeloid cells section. // Leucocyte Typing VI. White Cell
Differentiation Antigens, Tadamitsu Kishimoto (Eds.), Garland Publishing, Inc. NY &
London, 1997, p. 1038-1040.
5. Избранные вопросы современной проточной цитометрии. // Под ред. Хайдукова
СВ., Зурочки А.В. Челябинск, Издательство "Челябинская государственная меди­
цинская академия", 2007, 85 с.
6. Сибиряк СВ., Хайдуков СВ., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в
иммунологических исследованиях: Краткое методическое руководство. // Ека­
теринбург, УрО РАН, 2008, 59 с.
7. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. // Под
ред. Хайдукова СВ., Зурочки А.В. Челябинск. Издательство "Челябинская госу­
дарственная медицинская академия". 2008,196 с.
Статьи в журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Рос­
сийской Федерации.
8. Юровский В.В., Сафонова Н.Г., Хайдуков СВ., Василов Р.Г., Демин В.В. Синтез и
иммунохимическое изучение антигенной детерминанты Н^-молекулы главного
комплекса гистосовместимости мыши. // Биоорганическая химия, 1986, 12 (1), с.
89-99
9. Гиляревский С.Д., Хайдуков СВ., Лунева Н.М., Несмеянов В.А. Фенотипирование
и функциональная характеристика линии клеток лимфосаркомы крысы. // Имму­
нология, 1987,2, с. 33-36.
Ю.Несмеянов В.А., Хайдуков СВ., Комалева Р.Л., Андронова Т.М., Иванов В.Т..
Влияние
N-ацетилглюкозамини л-(31 -4^-ацетилмурамои л-Е-аланил-D-
46
изоглутамина на экспрессию Іа-антигенов макрофагами мыши. // Биологические
мембраны, 1989, 6 (3), с. 245-249.
ll.Sumaroka M.V., Litvinov I.S., Khaidukov S.V., Golovina T.N., Kamraz M.V., Komal'eva R.L., Andronova T.M., Makarov E.A., Nesmeyanov V.A., Ivanov V.T. Muramyl
peptide-binding sites are located inside target cells. // FEBS Lett. 1991,295 (1-3), p. 4850.
12. Stratieva-Taneeva P.A., Khaidukov S.V., Kovalenko V.A., Nazimov I.V., Samochvalova
L.V., Nesmeyanov V.A. Bispecific monoclonal antibodies to human Interleikin 2 and
horseredish peroxidase. //Hybridoma, 1993,12 (3), p. 271-284.
13. Vlasova E.V., Byramova N.E., Tuzikov A.B., Zhegis L.S., Rapoport E.M., Khaidukov
S.V., Bovin N.V. Monoclonal antibodies directed to synthetic carbohydrate antigen Ley.
// Hybridoma, 1994,13 (4), p. 295-301.
14. Pukhalsky A., Toptygina A., Khaidukov S. Interleukin-2 receptor p chain as a possibile
target for low doses of mafosfamide. // Mediators of Inflammation, 1995, 4 (3), p. 175180.
15.Хайдуков СВ., Комалева Р.Л., Несмеянов В.А. Макрофаги - основная мишень дисахаридсодержащих мурамил-пептидов. // Иммунология, 1995, 3, с. 26-30.
16. Марквичева Е.А., Мареева Т.Ю., Хайдуков СВ., Бронин А.С, Несмеянов В.А., Зу­
бов В.П. Влияние иммобилизации в гранулы гидрогеля на структурнофункциональные особенности гибридных клеток в процессе культивирования. //
Биологические мембраны, 1995,12(2), с. 122-129.
17.Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Nesmeyanov V.A. N-acetylglucosamine-containing
muramyl peptides directly affect macrophages. // Int J Immunopharmacol. 1995, 17(11),
р.^ОЗ-ЭИ.
18. Шиян С.Д., Пухальский А.Л., Хайдуков СВ., Топтыгина А.П., Бовин Н.В. Взаимо­
действие лейкоцитов периферической крови с аі-кислым гликопрогеином, его уг­
леводными цепями и неогликоконъюгатами. // Гематалогия и трансфузиология,
1996,41 (2), с. 24-29.
19. Шебзухов Ю.В., Токсамбаева С.Ж., Хайдуков СВ., Мысякин Е.Б. Влияние факто­
ра активации тромбоцитов и его синтетических аналогов на экспрессию laантигенов перитонеальными макрофагами мыши. // Журнал Эпидемиологии, Мик­
робиологии и Иммунобиологии, 1996,3, с. 114-117.
20. Калашникова Е.А., Хайдуков СВ., Пухальский А.Л. Влияние разных доз дексаметазона и состава клеточной популяции на продукцию in vitro фактора некроза опу­
холей и иитерлейкина-6 мононуклеарами периферической крови человека. // Бюл­
летени Экспериментальной Биологии и Медицины, 1996,6, с. 667-672.
21. Еремеев В.В., Лядова И.В., Майоров К.Б., Хайдуков СВ., Мороз A.M., Апт А.С.
Получение и частичная характеристика специфических к антигенам микобактерий
клонов Т-клеток от мышей с генетически различной чувствительностью к туберку­
лезу. // Бюллетени Экспериментальной Биологии и Медицины, 1997, 123 (4), с.
431-434.
22. Хайдуков СВ., Бочарова И.В., Межлумова М.Б., Литвинов И.С, Яхин Р.Т., Нико­
ненко Б.В. Иммунологическая память, индуцированная Mycobacterium bovis (BCG)
у инбредных мышей. // Бюллетени Экспериментальной Биологии и Медицины,
1997,123 (11), с. 553-555.
23. Коваленко Е.И., Саблина М.А., Хирова Е.В., Хайдуков СВ., Бовин Н.В. Встраива­
ние неогликолипидов в мембрану клеток К562. Модель для изучения углеводзависимого лизиса клеток-мишеней естественными киллерами. // Биоорганическая хи­
мия, 1998,24 (3), с. 224-228.
47
24. Водовозова Е.Л., Хайдуков СВ., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.Н., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксических липосом
к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант. // Биоорганиче­
ская химия, 1998, 24 (10), с. 760-767.
25. Pichugin A.V., Khaidukov S.V., Moroz A.M., Apt A.S. Capacity of murine T cells to re­
tain long-term responsiveness to mycobacterial antigens is controlled by the H-2 com­
plex.//Clin. Exp. Immunol.. 1998, 111 (2),p. 316-324.
26. Lyadova I., Yeremeev V., Majorov K., Nikonenko В.. Khaidukov S., Kondratieva Т.,
Kobets N., Apt A. An ex vivo study of T lymphocytes recovered from the lungs of I/St
mice infected with and susceptible to Mycobacterium tuberculosis. // Infect. Irnrnun.
1998,66 (10), p. 4981-4988.
27. Рапопорт E.M., Некрасов M.B., Хайдуков СВ., Свирщевская Е.В., Жигис Л.С.,
Козлов Л.В., Баталова Т.Н., Зубов В.П., Бовин Н.В. Изучение клеточной локализа­
ции галактозосвязывающего лектина из сыворотки крови человека. // Биохимия,
2000, 65 (И),р. 1558-1563.
28. Lyadova I.V., Eruslanov E.B., Khaidukov S.V., Yeremeev V.V., Majorov K.B., Pichugin
A.V., Nikonenko B.V., Kondratieva Т.К., Apt A.S. Comparative analysis of T lympho­
cytes recovered from the lungs of mice genetically susceptible, resistant, and hyperresistant to Mycobacterium tuberculosis-triggered disease. // J Immunol. 2000, 165 (10), p.
5921-5931.
29. Kondratieva Т.К., Kobets N.V., Khaidukov S.V., Yeremeev V.V., Lyadova I.V., Apt
A.S., Tarn M.F., Stevenson M.M. Characterization of T cell clones derived from lymph
nodes and lungs of Pseudomonas aeraginosa-susceptible and resistant mice following
immunization with heat-kilied bacteria. // Clin Exp Immunol. 2000, 121 (2), p. 275-282.
30. Никоненко Б.В., Хайдуков СВ., Литвинов И.С, Бочарова И.В., Апт А.С. Иммуно­
логическая память у мышей линий СВА и CBA/N при вакцинации Mycobacterium
bovis (BCG). // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 131 (6),
2001, с. 649-651.
ЗІ.Сащенко Л.П., Козырь А.В., Лукьянова Т.И., Габибов А.Г., Сучков СВ., Бобик
Т.В., Хайдуков СВ., Алекберова З.С, Гнучев Н.В. Каспаззависимая цитотоксичность ДНК-аутоантител. // Доклады Академии Наук, 2001,380 (1), с. 117-119.
32. Lyadova I.V., Vordermeier H.M., Eruslanov E.B., Khaidukov S.V., Apt A.S., Hewinson
R.G. Intranasal BCG vaccination protects BALB/c mice against virulent Mycobacterium
bovis and accelerates production of IFN-gamma in their lungs. // Clin. Exp. Immunol.
2001,126 (2), p. 274-279.
33. Blishchenko E.Y., Kalinina O.A., Sazonova O.V., Khaidukov S.V., Egorova N.S., Surovoy A.Y., Philippova M.M., Vass A.A., Karelin A.A., Ivanov V.T. Endogenous fragment
of hemoglobin, neokyotorphin, as cell growth factor. // Peptides, 2001, 22 (12), p. 19992008.
34.Ночевный В.Т., Хайдуков СВ. Культура клеток кожи перепелиных эмбрионов. //
Аграрная наука, 2001, № 6, с. 22-24.
35. Петрова Е.Э., Валякина Т.И., Хайдуков СВ., Несмеянов В.А. Эндогенный фактор
некроза опухолей демаскирует на поверхности клеток меланомы центры связыва­
ния Ы-ацетилглкжозаминил-ф 1^)-№ацегилмурамоил-аланил-0-изоглутамина. //
Биоорганическая химия, 2001,27 (4), с. 249-256.
36. Гаенко ГЛ., Козлов A.M., Сапрыкина Н.С, Доротникова Е.Б., СВ. Хайдуков, Мо­
лотковский Ю.Г. Некоторые характеристики фенотипа клеток карциномы легкого
Льюис. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2002,134 (10), с.
443-446.
48
37. Хайдуков СВ., Холоденко И.В., Литвинов И.С Иономицин-резистентная субпо­
пуляция CD4* Т лимфоцитов периферической крови человека. Фенотипическая ха­
рактеристика. // Цитология, 2003,45 (3), с. 249-254.
38. Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Иономицин-резистентная субпопуляция CD4+ Т
лимфоцитов периферической крови человека. Функциональная характеристика. //
Биологические мембраны, 2003,20 (4), с. 333-340.
39. Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Фенотипическая характеристика CD4+ T лимфоци­
тов периферической крови человека, экспрессирующих белки множественной ле­
карственной устойчивости. // Биологические мембраны, 2003,20 (5), с. 381-385.
40. Rapoport Е., Khaidukov S., Baidina О., Bojenko V., Moiseeva E., Pasynina G., Karsten
U., Nifant'ev N., LePendue J., Bovin N. Involvement of the Galbetal - 3GalNAcbeta
structure in the recognition of apoptotic bodies by THP-1 cells. // Eur. J. Cell. Biol. 2003,
82 (6), p. 295-302.
41. Sashchenko L.P., Dukhanina E.A., Yashin D.V., Shatalov Y.V., Romanova E.A.,
Korobko E.V., Demin A.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Khaidukov S.V., Kiselev
S.L., Gabibov A.G., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. Peptidoglycan recognition protein
tag7 forms a cytotoxic complex with heat shock protein 70 in solution and in lympho­
cytes. //J. Biol. Chem. 2004, 279 (3), p. 2117-2124.
42. Коваленко Е.И., Хирова E.B., Молотковская И.М., Овчинникова Т.В., Саблина
М.А., Сапожников A.M., Хайдуков СВ., Бовин Н.В. Модификация поверхности
клеток с помощью липофильных гликоконъюгатов и взаимодействие модифици­
рованных клеток с натуральными киллерами // Биоорганическая химия, 2004, 30
(3), с. 281-292.
43.Гяенко Г.П., СВ. Хайдуков, Молотковский Ю.Г. Экспрессия коллагена IV типа
клетками карциномы легкого крысы. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и
Медицины, 2004,137 (1), с. 78-80.
44. Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Юрков С.Г., СВ. Хайдуков, Виолин Б.В. Про­
точная цитометрия для стандартизации линии клеток фибробластов и эмбрионов
кур. // Аграрная наука, 2004,3, с. 27-29.
45. Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Изменение гомеостаза ионов кальция в CD4+
Т_лимфоцитах периферической крови человека в процессе дифференцировки in
vivo. II Биохимия, 2005,70(6), с. 838 - 849.
46. Хайдуков СВ., Агафонова С.А., Литвинов И.С. Сравнительный анализ фенотипических характеристик наивных Т-клеток и Т-клеток памяти селезенки мышей ли­
нии СВА. // Биологические мембраны, 2005,22 (6), с. 482-491.
47. Кирилина Е.А., Суворов Н.И., Попова С.С, Хайдуков СВ., Рапопорт Е.М., Фонина
ЛА., Михайлов А.А. Индукция дифференцировки в лейкозных клеточных линиях
под влиянием миелопептида-4. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Меди­
цины, 2005,140 (11), с. 565-569.
48. Гурьянов С.А., Кирилина Е.А., Хайдуков СВ., Суворов Н.И., Молотковская И.М.,
Михайлова А.А. Специфическое связывание и проникновение внутрь клеткимишени флуоресцентно меченного миелопептида-4, обладающего дифференцировочной активностью. // Биоорганическая химия, 2006, 32 (6), с. 574-578.
49.Petrova E.E., Valyakina T.I., Simonova M.A., Komaleva R.L., Khaidukov S.V.,
Makarov E.A., Blokhin D.Y., Ivanov P.K., Andronova T.M., Nesmeyanov V.A. Muramyl peptides augment cytotoxic effect of tumor necrosis factor-alpha in combination with
cytotoxic drugs on tumor cells. // Int. Immunopharmacol. 2006, 6 (9), p. 1377-1386.
50. Ponomarenko N.A., Vorobiev I.I., Alexandrova E.S., Reshetnyak A.V., Telegin G.B.,
Khaidukov S.V., Avalle В., Karavanov A., Morse H.C 3rd, Thomas D., Friboulet A.,
Gabibov A.G. Induction of a protein-targeted catalytic response in autoimmune prone
49
mice: antibody-mediated cleavage of ЫІѴ-l glycoprotein GP120. // Biochemistry, 2006,
45(1), p. 324-330.
51.Хайдуков СВ., Зурочка А.В. Проточная цитомстрия как современный метод ана­
лиза в биологии и медицине. // Медицинская иммунология, 2007, 9 (4-5), с. 373378.
52.Хайдуков СВ. Подходы к стандартизации метода проточной цито.метрии для иммунофепотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для ана­
лиза. // Медицинская иммунология, 2007, 9 (6), с. 569-574.
53. Sashchenko L.P., Dukhanma E.A., Shatalov Y.V., Yashin D.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Romanova E.A., Khaidukov S.V., Galkin A.V., Gnuchev N.V., Georgiev
G.P. Cytotoxic T lymphocytes carrying a pattern recognition protein Tag7 can detect eva­
sive, HLA-negative but Hsp70-exposing tumor cells, thereby ensuring FasL/Fasmediated contact killing. // Blood. 2007, 110(6), p. 1997-2004.
54. Kovalenko E.I., Abakushina E., Telford W., Kapoor V., Korchagina E., Khaidukov S.,
Molotkovskaya I., Sapozhnikov A., Vlaskin P., Bovin N. Clustered carbohydrates as a
target for natural killer cells: a model system. // Histochem Cell. Biol., 2007, 127 (3), p.
313-326.
55.Хайдуков СВ., Зурочка А.В. Расширение возможностей метода проточной цито­
метрии для клинико-иммунологаческой практики. // Медицинская иммунология,
2008, 10(1), с. 5-13.
56. Blishchenko Е., Sazonova О., Surovoy A., Khaidukov S., Sheikine Y., Sokolov D.,
Freidlin I., Phihppova M., Vass A., Karelin A., Ivanov V. Antiproliferative action of
valorphin in cell cultures. // J Pept Sci. 2002, 8 (8), p. 438-452.
57. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Lukjanova T.I., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lukanidin E.M., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu. Timedependent changes of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cyto­
toxic proteins.//Immunol. Lett.,, 1993,37 (2-3), p. 153-157.
58. Ko2yr A.V., Sashchenko L.P., Kolesnikov A.V., Zelenova N.A., Khaidukov S.V., Ignatova A.N., Bobik T.V., Gabibov A.G., Alekberova Z.S., Sachkov S.V., Gnuchev NV.
Anti-DNA autoantibodies reveal toxicity to tumor cell lines. // Immunol. Lett., 2002, 80
0), p. 41-47.
59. Хайдуков СВ., Зурочка А.В. Многоцветный цитометрический анализ. Идентифи­
кация В-клеток. // Российский Иммунологический Журнал, 2007,1(10), 3-4, с. 220228.
60. Хайдуков СВ., Зурочка А.В. Многоцветный цитометрический анализ. Идентифи­
кация NK-клеток. // Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2 (11), 1, с. 2030.
61. Хайдуков СВ., Зурочка А.В., Чсрешнев В.А. Многоцветный цитометрический ана­
лиз. Идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии afS-TCR и у5TCR.//Медицинская иммунология, 2008,10 (2-3), с. 115-124.
62. Шипаева Е.В., Коваленко Л.П., Хайдуков СВ., Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Дур­
нев А.Д., Середенин СБ. Иммунокорригирующие свойства дипептида ГБ-115. /
Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2008 г., 145 (5), с. 548-551.
Публикации (тезисы докладов и статьи) в журналах по перечню ВАК Мини­
стерства образования и науки Российской Федерации.
63. Kovalenko E.I., Khaidukov S.V., Sablina M.A., Khirova E.V., Bovin N.V. The model
system for the study of carbohydrate-dependent NK cells-mediated cytotoxicity. // Im­
munology, Supplement 1, Abstracts 6th Annual Congress of the British Society for Im­
munology, Harrogate, UK, 1-4 December 1998,95, p. 105.
50
64. Хайдуков СВ., Литвинов И.С, Дедкова Е.Н., Агафонова СА. Зинченко В.П. Осо­
бенности Са2+-зависимой внутриклеточной сигнализации в Т-лимфоцитах памяти.
// Медицинская иммунология, Материалы III конференции "Дни иммунологии в
Санкт-Петербурге 99" 18-20 мая 1999,1 (3-4), с. 17.
65. Хирова Е.В., Коваленко Е.И., Саблина М.А., Хайдуков СВ., Бовин Н.В.Модельная
система для изучения роли углеводов поверхности клеток-мишеней на цитотоксическую активность естественных киллеров человека. // Медицинская иммунология,
Материалы III конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99" 18-20 мая
1999, 1 (3-4), с. 26-27.
66. Агафонова С.А., Котельникова О.В., Литвинов И.С, Хайдуков СВ., Несмеянов В.А
Клеточный иммунный ответ к возбудителю менингита группы В - Neisseria meningi­
tidis. фенотипический анализ "протективных" субпопуляций. // Медицинская имму­
нология, Материалы III конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99"
18-20 мая 1999,1 (3-4), с. 91.
67. Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Хайдуков СВ., Филиппова М.М., Калинина О.А.,
Сазонова О.В., Яцкин О.Н., Пивник А.В., Иванов В.Т. Компаненты тканеспецифических пептидных комплексов тканей: биологическая роль при норме и патологии.
// Медицинская иммунология, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в
Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000,2 (2), с. 122.
68. Коваленко Е.И., Хирова Е.В., Овчинникова Т.В., Хайдуков СВ., Бовин Н.В. Изу­
чение влияния углеводов на цитотоксическую активность NK-клеток человека с
использованием липофильных гликоконъюгатов. // Медицинская иммунология,
Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25
м*, 2000,2 (2), с. 130-131.
69. Коватенко Е.И., Хайдуков СВ., Хирова Е.В., Поклонский Д.Л., Литвинов И.С. NKклетки человека резистентны к низким дозам иономицина. // Медицинская иммуно­
логия, Материалы IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000"
23-25 мая, 2000,2 (2), с. 131.
70. Хайдуков СВ., Чудакова Д.А., Агафонова С.А., Литвинов И.С. Фенотипическая
характеристика Т-клеток памяти мышей. // Медицинская иммунология, Материалы
IV конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000, 2
(2), с. 141-142.
71.Тонеев В.В., Поклонский Д.Л., Хирова Е.В., Чудакова Д.Л., Хайдуков СВ., Литви­
нов И.С. Различная чувствительность субпопуляций Т-клеток человека к низким
дозам иономицина. // Медицинская иммунология, Материалы ГѴ конференции
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" 23-25 мая, 2000,2 (2), с. 141.
72. Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А., Сазонова О.В.,
Яцкин О.Н., Шейкин Ю.А., Соколов Д.И., Хайдуков СВ., Фрейдлин И.С, Иванов
В.Т. Компоненты тканеспецифических пептидных комплексов тканей: негативные
регуляторы пролиферации клеток. // Медицинская иммунология, Материалы V
конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2),
с. 120-121.
73. Сазонова О.В., Блищенко Е.Ю., Калинина О.А., Хайдуков СВ., Карелин А.А.,
Иванов В.Т. Пролиферативный эффект эндогенных фрагментов гемоглобина: роль
в тканевой регуляции. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 130-131.
74. Хирова Е.В., Хайдуков СВ., Коваленко Е.И., Овчинникова Т.В., Сапожников A.M.
Увеличение опосредованного натуральными киллерами лизиса клеток К562 и КАЛ,
модифицированных с помощью липофильных гликоконьюгатов, не связано с экс­
прессией белков теплового шока на поверхности клеток-мишеней. // Медицинская
51
иммунология, Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге
2001"21-24мая200],3(2),с. 133.
75. Поклонский Д.Л., Беляева Т., Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Изучение механизма
действия СА2т-ионофора - иономицина на субпопуляции Т-клеток перифериче­
ской крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы V конференции
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3 (2), с. 151.
76. Хайдуков СВ., Поклонский Д.Л., Литвинов И.С. Фенотипичсская характеристика
иономицин резистентных CD4* Т-клеток человека. // Медицинская иммунология,
Материалы V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая
2001, 3(2), с. 155.
77. Холоденко И.В., Хайдуков СВ., Ссферян К.Р., Литвинов И.С. Изучение взаимо­
действия конканавалина а и фитогемоглютинина фасоли с субпопуляциями Тклеток периферической крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы
V конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" 21-24 мая 2001, 3
(2), с. 156.
78. Хайдуков СВ., Хирова Е.В., Чудакова Д.А., Литвинов И.С. Фенотипическая ха­
рактеристика субпопуляций Т-клеток человека, различающихся но чувствительно­
сти к иономиципу в низких дозах. // Цитология, Материалы конференции, 2001,43
(4), с. 408.
79. Сазонова О.В., Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А.,
Яцкин О.Н., Шейкин Ю.А., Соколов Д.И., Хайдуков СВ., Фрейдлин И.С, Иванов
В.Т. Компоненты тканеспецифических пептидных комплексов: ингибиторы роста
тканей. // Медицинская иммунология, Материалы VI всероссийской научной кон­
ференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002", 20-23 мая 2002, 4 (2), с.
132-133.
80. Хайдуков СВ., Холоденко И.В., Литвинов И.С. Функциональная характеристика
резистентных к Са +-ионофору - иономиципу - CD4+ Т-клеток периферической
крови человека. // Медицинская иммунология, Материалы VI всероссийской науч­
ной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002," 20-23 мая 2002, 4
(2), с. 134-135.
81. Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Изменение систем поддержания гомесстаза ионов
Са2+ в процессе дифференцировки Т-клеток памяти ПКЧ из наивных предшествен­
ников в ходе первичного иммунного ответа. /7 Медицинская иммунология, Мате­
риалы VII всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в СанктПетербурге 2003", 23-26 июня 2003, 5 (3-4), с. 220.
82. Валякина Т.И., Петрова Е.Э., Симонова М.А., Ко\илева Р.Л., Хайдуков СВ., Не­
смеянов В.А. Комбинация ГМДП, цисплатина и TNF-a обладаетпротивоопухолевым действием и влияет на иммунный статус мышей опухоленносителей. // Меди­
цинская иммунология, Материалы VII всероссийского научного Форума "Дни им­
мунологии в Санкт-Петербурге 2004" 23-26 июня, 6 (3-5), с. 350-351.
83. Хайдуков СВ., Литвинов И.С Изменение гомеостаза ионов катьция в Трегуляторной популяции CD4' Т лимфоцитов периферической крови человека. //
Медицинская иммунология, Материалы VIII всероссийского научного Форума
"Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004" 23-26 сентября 2004,6 (3-5), с. 126.
84. Хайдуков СВ., Литвинов И.С. Различная чувствительность популяций CD4+ Т
лимфоцитов к концентрации внеклеточного [Са2+]. // Медицинская иммунология,
Материалы IX всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в СанктПетербурге 2005" 23-26 мая 2005, 7 (2-3), с. 125.
85. Васюнина Н.Ю., Ростовская М.С, Коржикова СВ., Чупикова Н.И., Шарифуллина
С.З., Тепляшин З.А., Тешіяшин А.С., Хайдуков СВ., Савченкова И.П. Влияние
52
различных условий культивирования на экспрессию поверхностных маркеров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. // Медицинская иммуноло­
гия, Материалы X всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в СанктПетербурге 2006" 29 мая -1 июня, 2006,2006, 8 (2-3), с. 416.
86. Хайдуков СВ. Иммунофенотипирование. Стандартизация метода проточной цитометрии. // Russian Jomal of Immunology. 2-я конференция "Иммунология репро­
дукции", Сочи, 15-18 мая, 2007,9, Supplement 4, с. 143-144.
87. Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Духанина Е.А., Шаталова Ю.В., Яшин Д.В., Рома­
нова Е.А., Хайдуков СВ., Гнучев Н.В., Сащенко Л.П. Лимфоциты человека узнают
и убивают HLA-опухолевые клетки: новая функция белка TAG7 (PGPP-S). // Ме­
дицинская иммунология, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни
иммунологии в Санкт-Петербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 141.
88. Хайдуков СВ. Иммунофенотипирование клеток периферической крови при по­
мощи проточной цитометрии. Стандартизация методов. // Медицинская иммуноло­
гия, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в СанктПетербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 342.
89. Зурочка А.В., Хайдуков СВ. Изменение представлений об оценке иммунного ста­
туса человека, новые проблемы и подходы к их решению. // Медицинская иммуно­
логия, Материалы XI всероссийского научного Форума "Дни иммунологии в
Санкт-Петербурге 2007" 28-31 мая, 2007,9 (2-3), с. 339-340.
Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность своим
научным консультантам академику РАН и РАМН, доктору медицинских наук, про­
фессору Черешневу Валерию Александровичу и доктору медицинских наук про­
фессору Зурочка Александру Владимировичу за интерес, проявленный к данной
работе, ценные замечания и предложения. Глубокую благодарность автор выража­
ет всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикаци­
ях.
Подписано в печать 17.11.2008 г.
Печать трафаретная
Заказ № 1115
Тираж: 120 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ»
ИНН 7726330900
115230, Москва, Варшавское ш.. 36
(499) 788-78-56
www.autoreferat.ru