Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Морозова Ксения Владимировна ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ, АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И РЕПАРАЦИИ ДНК В ГЕНЕЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.01. — «Акушерство и гинекология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: Д.м.н., проф. Макаров О.В. Д.б.н., Сальникова Л.Е. Москва – 2014 1 Список сокращений .............................................................................................. 4 Введение. ................................................................................................................. 5 Глава 1. Полиморфизм генов системы репарации ДНК, антиоксидантной системы и обмена катехоламинов в соматической патологии (обзор литературы). ......................................................................................................... 12 1.1 Невынашивание беременности как социальная проблема. .............. 12 1.2 Формы невынашивания беременности. ................................................ 13 1.3 Основные причины невынашивания беременности. ......................... 14 1.3.1 Эндокринные нарушения репродуктивной системы. ..................... 14 1.3.2 Анатомические причины НБ. ............................................................... 15 1.3.3 Иммунологические нарушения. ........................................................... 15 1.3.4 Инфекционные причины НБ................................................................ 16 1.3.5 Генетические причины НБ. .................................................................. 17 1.3.6. Аномалии кариотипа плода, как причина НБ. ................................ 18 1.3.7. Патология системы гемостаза, как фактор НБ. .............................. 19 1.4 Генный полиморфизм, как фактор невынашивания беременности. .............................................................................................................................. 19 1.5 Влияние оксидативного стресса на репродуктивную функцию человека. ............................................................................................................ 21 1.5.1 Оксидативный стресс. ............................................................................ 21 1.5.2 Роль транскрипционного фактора NRF2 в регуляции антиоксидантной системы организма. ........................................................ 23 1.5.3. Супероксиддисмутаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. ............................................................................. 25 1.5.4 Каталаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. .............................................................................................................. 26 1.5.5 Глутатионпероксидаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. ............................................................................. 28 1.5.6 Глутаматцистеин лигаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. ............................................................................. 30 2 1.6. Влияние системы детоксикации ксенобиотиков на репродуктивную систему человека. ............................................................................................ 31 1.6.1 Роль цитохром Р450 в процессах детоксикации ксенобиотиков. .. 33 1.7 Роль катехоламинов в организме человека. ........................................ 34 1.7.1 Роль катехол-О-метилтрансферазы (СОМТ) в метаболизме катехоламинов. ................................................................................................. 35 1.8 Механизмы репарации ДНК. ................................................................... 37 1.8.1Роль 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы в процессах эксцизионной репарации ДНК................................................................................................. 37 ГЛАВА 2. Методы исследования. .................................................................... 43 2.1. Материал и объект исследования. ............................................................ 43 2.2 Методы генотипирования. ..................................................................... 48 2.3 Определение активности катехол-о-метилтрансферазы. .................. 48 2.4. Статистическая обработка данных. ...................................................... 48 Глава 3. Клиническая характеристика пациенток обследованных групп. ................................................................................................................................. 50 Глава 4. Результаты проведенных исследований.......................................... 72 4.1 Роль полиморфизма гена обмена катехоламинов (СОМТ) в течении и прогнозе беременности. ............................................................................... 72 4.2 Роль полиморфизма гена фермента эксцизионной репарации ДНК (OGG1) в течении и прогнозе беременности. .............................................. 85 4.3 Частоты встречаемости аллелей генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 в генезе невынашивания первой половины беременности. ....................................................................................................... 93 Заключение ......................................................................................................... 104 Выводы. ............................................................................................................... 119 Практические рекомендации. ......................................................................... 119 Список используемой литературы................................................................. 121 3 Список сокращений НБ – невынашивание беременности АФК- активные формы кислорода ПОЛ – перекисное окисление липидов ХГЧ - хорионический гонадотропин человека АФС - антифосфолипидный синдром HLA- Human leycocyte antigens ГП - генный полиморфизм СР - свободные радикалы СОД - супероксиддисмутаза КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза ГП 4- глутатион пероксидаза 4 NRF2- ген транскрипционного фактора SOD2- ген супероксиддисмутазы 2 САТ- ген каталазы GCLC-ген глутатионцистеинлигазы GPX4-ген глутатион пероксидазы 4 CYP1A1-ген цитохром Р 450 СОМТ-ген катехол-о-метилтрансферазы OGG1-ген 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы SNPs-single nucleotide polymorphism- однонуклеотидный полиморфизм 4 Введение. Невынашивание беременности является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения и современного акушерства. На протяжении последних десятилетий отечественными и зарубежными учеными было проведено множество разносторонних исследований, касающихся самопроизвольных репродуктивных потерь, но невынашивание беременности по-прежнему является одной из наиболее распространенных и сложных проблем репродуктологии. Частота невынашивания первой половины беременности, по мнению разных авторов, составляет от 10% до 25%, причем в I триместре она достигает, по некоторым данным, 50% (43, 71). Этиология НБ крайне разнообразна. К основным причинам ранних репродуктивных потерь относятся генетические, иммунологические, нейроэндокринные, инфекционные факторы, а также экстрагенитальная патология, психологические, алиментарные, экологические причины, профессиональные и бытовые интоксикации, широко распространенные в условиях жизни в мегаполисе (16, 43). Несмотря на многообразие причин, этиология 26-66% случаев прервавшихся на ранних сроках беременностей остается невыясненной (71). Современные методы исследования, позволяющие изучить молекулярные механизмы многофакторных патологий, существенно расширили представление об их наследственной природе, что является актуальным и в контексте репродуктивного здоровья. Многочисленные исследования антиоксидантной системы показали, что нарушения в данной системе могут лежать в основе практически всех мультифакториальных заболеваний (34). Ферменты антиоксидантной системы в структуре своих генов имеют функционально неравноценные полиморфные аллели (35). Наличие подобного ДНК-полиморфизма определяет индивидуальную восприимчивость к повреждающему действию прооксидантов внешней среды и, как следствие, способно влиять на развитие патологических процессов (33, 35). В последнее время, с развитием геномики, стали изучать негативные влияния некоторых полиморфных 5 аллелей генов антиоксидантной системы на развитие заболеваний сердечнососудистой, опорно-двигательной, дыхательной, мочевыделительной систем, системы гемостаза, активность канцерогенеза (5, 12, 51, 70). В генезе ранних репродуктивных потерь система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной защиты, также играет немаловажную роль (35, 81). Активные формы кислорода, вырабатываемые в ходе ферментативных реакций в тканях организма, находясь в физиологических концентрациях, регулируют важнейшие биологические процессы в клетках, но как только концентрация активных форм кислорода начинает превышать физиологический уровень, их действие может приводить сопровождающихся к активации структурными разрушающих повреждениями процессов, молекулы ДНК и развитием генных мутаций (51, 83). Поэтому именно скоординированная работа ферментов антиоксидантной защиты, а также буферная емкость ее ферментативного компонента редокс-гомеостаза, определяют поддержание окислительных процессов на уровне, обеспечивающем нормальное течение многочисленных физиологических процессов (25, 51). За функционирование антиоксидантной системы в организме человека отвечают определенные гены, кодирующие активность ферментов антиоксидантной защиты. Учитывая вышеперечисленное, представляет практический интерес изучение полиморфизма генов, кодирующих выработку основных звеньев антиоксидантной защиты (17, 80). Помимо эндогенных свободных радикалов, существенный вклад в функционирование клеток организма вносит воздействие окружающей среды в виде чужеродных веществ -ксенобиотиков (44). В процессе метаболизма ксенобиотиков происходит накопление промежуточных веществ, обладающих токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (44). В норме элиминация ксенобиотиков осуществляется благодаря системе ферментативных реакций детоксикации, являющихся также генетически детерминированными. В случае структурных вариаций генов, 6 обуславливающих синтез ферментов со сниженной активностью, организм оказывается ослабленным перед постоянной атакой чужеродных экзогенных соединений (41, 84). Изучение корреляции исходной структуры гена и его вариантных аллелей с уровнем активности вырабатываемого фермента позволяет оценить степень уязвимости организма при носительстве вариабельных генов (16, 80). Широкое распространение в науке получило изучение носительства полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков в генезе многих соматических заболеваний, где существует доказанная и неоспоримая взаимосвязь (59). Исходя из вышеизложенного, изучение роли ферментов систем детоксикации ксенобиотиков в контексте невынашивания беременности является крайне необходимым. Известно, что в организме человека все внутриклеточные взаимодействия осуществляются благодаря нейромедиаторам, выполняющим роль переносчиков импульсов от нервной системы к органам, имеющим в клетках специфические рецепторы (49). Такими веществами являются катехоламины, регулирующие функции многих органов, особенно в условиях необходимой молниеносной мобилизации организма перед стрессовым фактором (49). Доказано, что за метаболизм катехоламинов ответственен ряд ферментов, поддерживающих их концентрации на физиологическом уровне (6, 29). Изменения структуры генов, отвечающих за выработку ферментов, неодинаково влияют на процессы метаболизма катехоламинов, что может сопровождаться различными негативными последствиями для организма, включающими, как предполагается, и нарушения нормального течения беременности (49). Научные исследования последних десятилетий доказали, что процессы перекисного окисления липидов и воздействие на организм ксенобиотиков оказывают мутагенное влияние на структурную основу молекулы ДНК, являющейся носителем генетической информации всего организма (17). В результате структурных модификаций в генах происходит изменение функциональных характеристик кодируемых веществ. Поддержание 7 исходного строения ДНК осуществляется благодаря ферментам защитных систем организма, в том числе, эксцизионной репарации ДНК, обеспечивающим «вырезание» дефектного основания из молекулы ДНК (24). В случае неполноценности ферментов репарации нарастает концентрация дефектов, что приводит к формированию большого числа мутаций, которые получают свое фенотипическое проявление в развитии патологии различных органов и систем (17, 24). Также описано влияние полиморфизма генов на активность процесса старения организма (34). По результатам этих исследований появляется возможность выявить группы риска по предрасположенности к тому или иному заболеванию, подобрать патогенетическую терапию, направленную на коррекцию негативного влияния оксидантного стресса с помощью препаратов, обладающих антиоксидантной активностью. Основываясь полиморфизма на генов данных исследований, антиоксидантной доказывающих системы, генов влияние детоксикации ксенобиотиков и генов репарации ДНК на развитие заболевания различных органов и систем, можно предположить, что в организме беременной женщины наличие аллелей определенных генов способно вносить вклад в формирование подверженности к такому мультифакторному состоянию, как невынашивание беременности. В связи с этим, важное значение может иметь комплексное молекулярногенетическое исследование генов, описанных выше функциональных защитных полиморфных кодирующих комплекс ферментов систем организма вариантов, для выявления определение активность соответствующих ферментов в зависимости от вариабельности аллелей, что позволит оценить степень влияния полиморфизма исследованных генов на формирование предрасположенности к невынашиванию первой половины беременности и обосновать патогенетическое лечение. 8 Цель исследования Определить влияние полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы, системы обмена катехоламинов и системы эксцизионной репарации ДНК на невынашивание беременности, с целью профилактики потерь последующих беременностей. Задачи исследования 1. Провести комплексное обследование пациенток с невынашиванием беременности. 2. Провести генотипирование с целью определения частоты встречаемости функциональных полиморфных вариантов генов: NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1, COMT, OGG1 у пациенток с невынашиванием беременности и у женщин с физиологически протекающей беременностью. 3. Установить степень риска возникновения НБ у женщин – носителей аллелей генов, ассоциированных с невынашиванием. 4. В случае исследуемых выявления генов с ассоциации риском полиморфного невынашивания варианта беременности определить влияние генотипа на активность соответствующего фермента. 5. В случае исследуемых выявления генов с ассоциации риском полиморфных невынашивания вариантов беременности провести анализ взаимосвязи генотипов с развитием соматической патологии, негативно влияющей на течение беременности. 9 Положения, выносимые на защиту: 1. Полиморфные варианты генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не являются фактором риска НБ. 2. Неблагоприятным для нормального течения беременности является наличие аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. 3. У женщин с аллелем А rs 4680 гена COMT и аллелем G rs1052133 гена OGG1, вероятность невынашивания беременности увеличивается в 1,61 и в 1,72 раза соответственно по сравнению с женщинами, имеющими альтернативные аллели. 4. Снижение активности фермента катехол-О-метилтрансферазы ассоциировано с невынашиванием беременности. Научная новизна: Установлено, что полиморфизм генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не ассоциирован с невынашиванием беременности. Впервые выявлена ассоциация между носительством аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 и невынашиванием беременности. Установлено, что носительство вышеуказанных аллелей повышает риск НБ в 1,62 и в 1,72 раза. Показано значение снижения активности фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с невынашиванием беременности. Практическая значимость работы: На основании проведенных исследований установлено, что носительство аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 является фактором риска НБ. Генотипирование женщин с невынашиванием беременности может быть рекомендовано, при исключении других причин НБ, как способ формирования групп риска, с целью проведения специфической терапии как в качестве предгравидарной подготовки, так и в I половине беременности. 10 Носителям аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности. 11 Глава 1. Полиморфизм генов системы репарации ДНК, антиоксидантной системы и обмена катехоламинов в соматической патологии (обзор литературы). 1.1 Невынашивание беременности как социальная проблема. Несмотря на современные подходы в лечении и диагностике, проблема невынашивания беременности (НБ) не потеряла своей актуальности, так как приводит не только к нарушениям в репродуктивной системе женщины, но и оказывает негативное влияние на рождаемость, перинатальную смертность и заболеваемость новорожденных. В последние годы, по данным литературы, частота самопроизвольных выкидышей составляет 15-20 % от общего числа всех клинически выявленных беременностей, что соответствует потере каждой пятой желанной беременности (16, 71). Примерно половину этого числа занимают преждевременные роды. В I триместре частота потери беременности достигает 50-70%, во II- 18-20%, в III-7-30 % (43, 71). Максимальное число самопроизвольных абортов (80%) приходится на I половину беременности, причем 38% из них происходит на сроке 7-8 недель (71). Ранний самопроизвольный аборт (на сроке 4-5 недель), на долю которого приходится 8 % всех прерванных беременностей, часто остается не диагностированным. У 12% беременных с привычным невынашиванием в анамнезе наблюдается задержка внутриутробного развития плода. последние десятилетия, несмотря на увеличение В спектра методов диагностики и лечения, процент неблагоприятных исходов беременности остается неизменным (71). По данным статистики в Российской Федерации ежегодно не рождается 180000 желанных детей. В условиях сложившейся в стране демографической ситуации охрана репродуктивного здоровья населения является важнейшей социальной задачей. 12 1.2 Формы невынашивания беременности. К ранним самопроизвольным выкидышам относят прерывание беременности на сроке до 12 недель, к поздним – с 12 до 22 недель, беременность, прервавшуюся на сроке более 22 недель, относят к преждевременным родам (71). По данным литературы, существенное значение имеет рубеж прерывания беременности до или после появления сердечной активности эмбриона. Другие ученые выделяют 3 формы НБ: доклиническое прерывание беременности (на сроке до 6 недель), прерывание в эмбриональный период (6-10 недель) и в плодовый период (10-20 недель гестации) (2, 32, 71). Особое место среди различных форм НБ занимает несостоявшийся выкидыш (missed abortion), т.е. гибель эмбриона или плода в раннем сроке гестации с длительной задержкой его в полости матки, которая занимает от 2-20% до 75% всех репродуктивных потерь (71). Длительное пребывание нежизнеспособного эмбриона в полости матки приводит к серьезным инфекционным и гемодинамическим осложнениям, что в свою очередь негативно сказывается на репродуктивной функции женского организма в последующем, предрасполагая к развитию привычного невынашивания и бесплодия (69). В настоящее время привычное невынашивание беременности (ПНБ) является одной из наиболее сложных медико-социальных проблем. Согласно определению ВОЗ, диагноз ПНБ ставится при наличии в анамнезе у женщины трех и более самопроизвольных прерываний беременности в сроке до 22 недель (69, 71). Частота привычного выкидыша в структуре НБ составляет до 25%, причем риск потери желанной беременности возрастает с увеличением числа неудач и достигает 38% после 2 предшествующих самопроизвольных прерываний (23, 72). Так как у обнаруживаются 60-80% эмбрионов хромосомные аномалии, самопроизвольный выкидыш 13 первого триместра эволюционного беременности рассматривается как механизм отбора, обеспечивающий элиминацию неполноценного потомства. Этим обусловлен отказ от сохранения беременности в сроке до 11-12 недель во многих Европейских странах (127, 130). Основываясь на опыте современной репродуктологии, проблему НБ относят к мультифакториальным заболеваниям (23, 69). Существует множество различных причин, приводящих к развитию данной патологии. Большую роль играет влияние факторов внешней среды (профессиональные вредности, загрязнение окружающей среды, стресс, интоксикация). Таким образом, данную проблему необходимо решать не только после наступления беременности, но и осуществлять комплексное обследование супругов для выявления нарушений в состоянии репродуктивной системы в комплексе предгравидарной подготовки. 1.3 Основные причины невынашивания беременности. 1.3.1 Эндокринные нарушения репродуктивной системы. Эндокринные факторы занимают ведущее место среди причин НБ при спорадических (случайных) выкидышах. В структуре ПНБ они составляют, по данным разных авторов, от 17 до 30% (23). Известно, что прерывание беременности в I триместре чаще всего обусловлено недостаточностью лютеиновой фазы, возникающей в связи с гиперсекрецией лютеинизирующего гормона (ЛГ), пониженной секрецией фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), гипоэстрогенией, гиперандрогенией, поражением рецепторов эндометрия (при хроническом эндометрите с высоким уровнем цитотоксичных клеток CD56+, CD16+ и вырабатываемых ими провоспалительных цитокинов, как правило, на фоне нормального уровня гормонов) (10, 64, 68). Нарушение прогестерону нормальной может быть функции обусловлено рецепторов механическим эндометрия к повреждением эндометрия при внутриматочных манипуляциях, хроническом эндометрите. 14 По мнению ряда авторов (27, 28, 78, 114, 145), нарушение рецепторного аппарата может быть связано с нарушением экспрессии гена рецепторов прогестерона. Патология репродуктивной функции женщины часто наблюдается при гиперандрогении, нарушении синтеза пролактина (61, 105). Заболевания щитовидной железы, в основном сопровождающиеся снижением ее функции также могут приводить к потере беременности (71). 1.3.2 Анатомические причины НБ. Большую роль в этиологии НБ играют пороки развития матки. Среди женщин с ПНБ аномалии развития матки встречаются в 10-15 % случаев по данным ряда авторов (23, 72). Наиболее значимыми пороками являются внутриматочные перегородки, двурогая, седловидная и однорогая матка (4). Прерывание беременности возможно при наличии миомы матки с субмукозным ростом узлов, полипов эндометрия, деформирующих полость матки, синехий в полости матки, как последствия внутриматочных манипуляций (3, 48). 1.3.3 Иммунологические нарушения. Иммунологические факторы занимают важное место среди причин НБ и выражаются в продукции организмом матери аутоантител против собственных тканей, в результате чего страдает ее собственный организм и плод (72, 78). Одним из основных иммунологических факторов прерывания беременности является антифосфолипидный синдром (30, 42, 53). Другим мощным фактором, предрасполагающим к неблагоприятному течению беременности, является несовместимость матери и отца по системе HLA (Human leycocyte antigens) (22, 72). Различные аллоиммунные процессы, такие как снижение продукции аллоантител к отцовским лейкоцитам, повышенное содержание 15 цитотоксических клеток в эндометрии, в децидуальной ткани и периферической крови матери, предрасполагают к невынашиванию первой половины беременности (22, 72). По данным ряда (39, 78, 87) авторов в случаях, когда этиология НБ остается не выясненной, причиной выкидыша может стать выработка материнским организмом аутоантител, играющих огромную роль нормальном в развитии беременности (к ХГЧ, эстрадиолу, прогестерону, гормонам роста, тиреоидным гормонам, к ткани яичника, к структурам клеточного ядра, молекулам ДНК). 1.3.4 Инфекционные причины НБ. Большую группу этиологических факторов составляют острые и хронические заболевания организма матери (31, 72). Наличие в организме женщины острой либо хронической вирусной (герпес, цитомегаловирусная и аденовирусная инфекции, краснуха, паротит, грипп, вирусы Коксаки А и В, некоторые другие энтеровирусы) и бактериальной инфекции, во время беременности при проникновении возбудителя в клетки хориона, приводит к гибели плодного яйца и прерыванию беременности (2, 19, 40, 65, 73, 79). По данным ряда авторов (52, 66), у 50 % женщин с угрозой прерывания беременности имеется цервицит в сочетании с кольпитом. Персистенция патогенной микрофлоры в полости матки приводит к нарушению рецепторного аппарата эндометрия, создает неблагоприятную среду для имплантации яйцеклетки и как следствие вызывает развитие привычного НБ (40). Так же при НБ определенную роль играют воспалительные заболевания миндалин, глотки, мочевыделительной системы и бессимптомное бактериальное носительство. За счет активизации цитокинов любая инфекция может оказывать прямой цитотоксический эффект, который способствует прерыванию беременности как в I, так и во II триместрах (16, 19, 71). 16 1.3.5 Генетические причины НБ. Хромосомные и другие генетические нарушения являются одной из основных причин репродуктивных потерь первой половины беременности. Однако, по мнению многих авторов, в 20-66% причины прерывания беременности остаются не известны (14, 72). Доказано, что большинство спорадических выкидышей обусловлено аномалиями кариотипа самого эмбриона, но для привычного невынашивания эта патология играет меньшую роль и занимает всего 7% от всех случаев потери беременности (18, 69). Известно, что частота хромосомных аберраций в абортивном материале напрямую коррелирует с гестационным сроком, на котором произошла гибель эмбриона. Так, в сроке 6-7 недель она составляет 60-75 %, 12-17 недель - 20-25%, и в сроке 17-28 недель- только 2-7 % (69). С дальнейшим ростом срока гестации этот процент снижается и вплоть до момента родов остается в пределах 0,5-0,9% (18, 21, 74, 121). Многие зарубежные научные школы относят прерывание беременности в I триместре к реализации процессов естественного отбора, как следствие, не считают целесообразным делать попытки пролонгирования беременности на сроке до 11-12 недель (127, 130, 133). Достижения современной медицины позволяют комплексно рассматривать проблему НБ, не только со стороны патологии самого эмбриона, но и изучать вклад материнского и отцовского генетического статуса в процесс наступления и развития беременности (16, 58). Несмотря на широкий спектр современных подходов к диагностике и лечению, проблема НБ десятилетия остается до сих пор нерешенной (43). За последние открыты важнейшие генетические причины многих мультифакториальных заболеваний, например, тромбофилии, дефектов фолатного обмена (7, 116). В свете исследований последних десятилетий 17 нарушения антиоксидантной защиты и системы детоксикации, также как и изученные ранее иммунологическая недостаточность, нарушение гормонального баланса и т.д., могут рассматриваться как ведущие причины тяжелой акушерской патологии, в том числе и НБ. По данным мировой практики, в настоящее время изучено более 40 генов, относящихся к генной сети НБ (41, 80). 1.3.6. Аномалии кариотипа плода, как причина НБ. Особая роль в этиологии НБ принадлежит хромосомным аберрациям эмбриона (18). На всех этапах внутриутробного онтогенеза хромосомные аномалии могут обеспечивать неправильное развитие эмбриона (имплантация, эмбриогенез, органогенез, рост и развитие плода) (37). Суммарный вклад хромосомных аномалий в гибель эмбриона (после имплантации) у человека составляет 45%. При этом, чем меньше срок прервавшейся беременности, тем больше вероятности, что причиной прерывания является патология кариотипа, вызванная хромосомным дисбалансом (14, 37, 106). Механизмы формирования основных видов хромосомных аномалий: 45-55% хромосомных аббераций у абортусов составляет трисомия (наличие трёх гомологичных хромосом вместо пары в норме), в 20-30% случаев наблюдается моносомия (наличие всего одной из пары гомологичных хромосом)(26). Другой вид патологии кариотипа носит название мозаицизм (наличие в организме человека двух или более генетически различных клеточных популяций, в результате нерасхождения хромосом на ранних этапах развития зиготы) (26). 15-20% аномалий приходится на триплоидию (нарушение мейотического расхождения всего набора хромосом в мейозе женских или мужских половых клеток). В 5% случаев наблюдается тетраплоидия (4 гомологичные хромосомы вместо пары в диплоидном наборе) и пентоплодия (5 вместо 2-х), которая развивается в случае, когда 18 первое митотическое деление привело к удвоению хромосом, но не разделению клетки (14, 16, 45, 106). 1.3.7. Патология системы гемостаза, как фактор НБ. Известно, что немаловажным фактором потери беременности могут являться генетические аномалии системы гемостаза. К наследственным тромбофилиям относятся дефицит антитромбина III ,протеина С, протеина S, мутация фактора V (лейденовская мутация), мутация гена протромбина и гена МТНFR (гипергомоцистеинемия). Наследственные тромбофилии являются причиной тромбоэмболических состояний и связаны с повышенным риском различных осложнений беременности (55, 69). 1.4 Генный полиморфизм, как фактор невынашивания беременности. Зачастую, причины невынашивания первой половины беременности остаются неизвестными при всех существующих методах обследования и при установленном задуматься о нормальном существовании кариотипе родителей и более широкого спектра плода. Стоит генетических взаимодействий, формирующих те или иные отклонения как в наступлении и течении беременности, формировании и развития эмбриона так и в жизнедеятельности взрослого организма в целом. Г. Винклер в 1920г. предложил термин "геном" для определения совокупности генов, заключенных в гаплоидном наборе хромосом организма одного биологического вида (26, 80). Гаплоидный геном человека состоит из 3 миллиардов пар (A , C, T и G) нуклеотидов и содержит 50000-100000 генов (26). Гены, представленные в популяции несколькими разновидностями (аллелями), обеспечивающими разнообразие признака внутри вида, являются полиморфными (26, 80). 19 Аллели, как мутации, эволюционно возникают в результате сбоя в передаче ДНК от родителей к детям. Различия между аллелями одного и того же гена выражаются в незначительных вариациях его "генетического" кода. Большинство известных вариантов полиморфизма выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК (7, 80). Почти все (99,9%) нуклеотиды ДНК индивидуумов идентичны друг другу, но геном человека содержит, по крайней мере, 1,42 миллиона отдельных полиморфных вариантов каждого нуклеотида (SNPs)-single nucleotide polymorphism. В зависимости от изменения нуклеотидной последовательности SNPs могут по-разному влиять на экспрессию кодируемого белка (80, 84). Считается, что у человека SNPs встречается с частотой 1-2 %, т.е. каждый человек отличается от других одним нуклеотидом на каждые 300 нуклеотидов (26, 80). Этот факт доказывает, что как не существует двух особей одного вида, абсолютно идентичных по своим фенотипическим признакам, так и химические процессы в разных организмах совпадают не полностью. Таким образом, генный полиморфизм определяет индивидуальность биохимического профиля и гомеостаза каждого отдельного организма (17, 80). Гены, имеющие в своем составе вариантные аллели, ассоциированные с различными мультифакторными заболеваниями и комплексными признаками, носят название «гены предрасположенности» (17, 18, 26). В ходе исследований генов предрасположенности было выявлено значительное различие в распределении частот аллелей и генотипов того или иного гена в различных популяционных и этнических группах, что может, в частности, отражать влияние условий проживания, питания и образа жизни населения в различных регионах мира (8). В зависимости от характера провоцирующего фактора их относят к генам внешней среды, либо к генам – триггерам, активирующим патологический процесс при сочетании нескольких неблагоприятных факторов (7, 8). Для возникновения 20 моногенных заболеваний достаточно только мутаций в соответствующем гене, в развитии же группы мультифакториальных болезней играет роль сочетание генетических и экзогенных факторов (17, 21, 41). Известно, что полиморфные гены ассоциированы и с изменениями в ферментативной системе организма (8). Наличие мутантных изоформ гена может значительно менять свойства кодируемого фермента, следствием чего являются повышение, снижение либо полная утрата его активности (41). Доказана неоспоримая роль генов предрасположенности в этиологии и патогенезе многих тяжелых хронических заболеваний, таких как сердечнососудистые, нейро-дегенеративные, онкологические и другие, также с уверенностью можно утверждать, что наличие ряда генетических вариантов приводит к расстройствам репродуктивной системы и может способствовать патологическому течению беременности (17, 41). В нашем исследовании проведено комплексное исследование влияния различных вариантов полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы, генов репарации ДНК и метаболизма катехоламинов формирование риска репродуктивных потерь первой на половины беременности. 1.5 Влияние оксидативного стресса на репродуктивную функцию человека. 1.5.1 Оксидативный стресс. Немаловажную роль в генезе ранних репродуктивных потерь играет система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной системы (АОС) (35). Активные формы кислорода (АФК), образующиеся в результате ферментативных реакций в тканях организма, в норме находясь в физиологических концентрациях, регулируют важнейшие биологические процессы в клетках, такие как: митогенная активность, генная экспрессия, индукция и реализация апоптоза, модуляция иммунного ответа, антибактериальная защита, воспалительные 21 реакции и клеточная адгезия (35). Однако, при повышении концентрации АФК, либо в условиях несостоятельности АОС происходит накопление свободных радикалов в органах и тканях. В результате этих процессов в организме развивается оксидантного окислительный (оксидантный) стресс. В условиях стресса происходит окислительная модификация и инактивация белков и ферментов, усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) с накоплением свободных радикалов, способных вызывать структурные повреждения молекулы ДНК и приводить к возникновению генных мутаций (35, 81). По данным литературы (20, 81), свободные радикалы в условиях нормальных концентраций жизнеобеспечения клеток играют важную роль в процессах различных биологических систем, участвуя в реакциях окислительного фосфорилирования, биосинтеза простагландинов и нуклеиновых кислот, в регуляции липидного обмена, в процессах митоза, а также метаболизма катехоламинов. Однако, роль свободных радикалов как реактогенных молекул в биологических системах изменчива, поскольку избыточное их образование может достаточно быстро привести к дезорганизации клеточных структур и нарушению функциональной активности клеток (11). Под действием свободных радикалов и активных форм кислорода в молекулах белков происходят структурные нарушения за счет окисления некоторых аминокислот, в результате чего между ними образуются ковалентные "сшивки", всё это активирует клеточные протеолитические ферменты, гидролизующие повреждённые белки. Особенно важно подчеркнуть, что происходит нарушение мембранных структур, изменение транспорта ионов Са2+, что угрожает жизнеспособности клетки. Активные формы кислорода легко нарушают и структуру ДНК (17, 41). Процессы ПОЛ в организме контролируются антиоксидантной системой. В случае первичной недостаточности антиоксидантной защиты происходит неполная инактивация продуктов ПОЛ, в результате чего даже 22 физиологические концентрации свободных радикалов оказывают токсическое воздействие на клетки организма. Повышенная активность перекисного окисления липидов может возникнуть в результате избыточного образования активных форм кислорода под воздействием стрессового фактора при нормальном функционировании антиоксидантной системы (51, 97). Другой причиной активации ПОЛ может являться генерализованная гипоксия, развивающаяся вследствие нарушений центральной и периферической гемодинамики (97). Все процессы образования свободных радикалов находятся под контролем системы антиоксидантной защиты (51). Во время беременности роль антиоксидантной защиты особенна актуальна. Взрыв оксидативного стресса возникает в плаценте в момент формирования маточно-плацентарного кровотока (10-12 неделя), когда наступает необходимость адаптации дочернего организма к среде материнской крови. Именно в этот момент особенное значение имеет слаженное функционирование ферментов антиоксидантной системы (91). Воздействие оксидативного стресса на эмбрион реализуется через нарушение мембранной стабильности клеток, процессов клеточного роста и апоптоза во время развития эмбриона, что в условиях недостаточности антиоксидантной системы может привести к потере беременности (113, 124). Предметом нашего исследования является полиморфизм генов, отвечающих за функционирование антиоксидантной системы, поэтому хотелось бы более подробно остановиться на каждом из них. 1.5.2 Роль транскрипционного фактора NRF2 в регуляции антиоксидантной системы организма. Функционирование и регуляция антиоксидантной защиты организма осуществляется благодаря многоступенчатому слаженному взаимодействию целого ряда белков и ферментов. Одним из регуляторных звеньев 23 антиоксидантной системы является транскрипционный белок, кодируемый геном NRF2. При возникновении оксидантного стресса активация транскрипционного белка приводит к запуску экспрессии антиоксидантных ферментов. В результате каскада реакций с участием ферментов антиоксидантной системы происходит нейтрализация свободных радикалов (29, 51). Ген NRF2 располагается на 2 хромосоме и является ответственным за экспрессию полноценно активного танскрипционного белка (80, 144). В случае изменения формирование структурных полиморфных характеристик вариантов, гена ведущих к происходит выработке недостаточного количества белка, что в условиях оксидантного стресса тормозит активацию защитных ферментов, ставя под угрозу полиморфизма гена NRF2, жизнедеятельность клеток органов и тканей (143). Известно несколько вариантов определяющих разный уровень выработки транскрипционного белка. По данным литературы (143), минорный аллель Т полиморфизма rs6721961, при котором происходит замена азотистого основания гуанина на тимин в 617 позиции, приводит к понижению выработки транскрипционного фактора, что ассоциировано с риском рака легких, особенно среди курильщиков. В исследовании (89) установлено, что генотип Т/Т повышает риск венозных тромбозов на фоне заместительной гормональной терапии эстрогенсодержащими препаратами у пациенток в постменопаузе. Существуют указания на ассоциированный с генотипом Т/Т повышенный риск развития олигоастенозооспермии (162). Также, по результатам некоторых исследований, носительство аллеля Т (генотип Т/Т) rs 6721961 и генотипа A/A rs2706110 повышает риск возникновения рака молочной железы (108). Согласно приведенным выше данным, носительство различных полиморфных вариантов гена NRF2 может сопровождаться повышенной уязвимостью организма, при недостаточности транскрипционного фактора. 24 Возникающий в результате дефект защитных систем приводит к нарастанию повреждающего воздействия чужеродных соединений. Принимая во внимание взаимосвязь полиморфизма гена NRF2 с повышенным риском развития различных заболеваний, можно предполагать и его значимость для процессов формирования и развития беременности в первой половине гестации, что и является предметом нашего исследования. 1.5.3. Супероксиддисмутаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. Одним из наиболее значимых звеньев антиоксидантной защиты организма является фермент супероксиддисмутаза (CОД). СОД представлена семейством металлоферментов, регулирующих уровень О2- в клетке путем катализации реакции дисмутации супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и воды. Супероксиддисмутаза находится во всех клетках, потребляющих кислород, и защищает мембраны клеток всех аэробных организмов от повреждающего действия свободных радикалов (34, 35, 86). В организме СОД представлена тремя изоформами, различающимися ионами металлов [Zn2+] , [Cu2+]и [Fe2+], входящими в состав их активных центров: СОД 1 [Cu,Zn- СОД], находится в цитоплазме, СОД 2 [Mn-СОД] в митохондриях, и СОД 3 [Fe-СОД]. - внеклеточная (экстраклеточная) форма находится преимущественно в плазме, лимфе, синовиальной жидкости (86, 128). Недостаток СОД приводит к снижению защитных функций организма и повреждению клеток свободными радикалами, однако слишком высокий уровень СОД может привести к переизбытку в организме перекиси водорода, и как следствие к токсическому повреждению клеток. Высокой активностью СОД отличаются эритроциты, что позволяет использовать кровь как источник для выделения и очистки фермента (35). Одним из основных генов, отвечающим за эффективность антиоксидантной защиты организма, является ген SOD2, расположенный на 6 25 хромосоме, изменчивость в структуре которого влияет на количество и активность вырабатываемой клетками супероксиддисмутазы 2 (35). Полиморфизм rs 4881 приводит к замене аминокислоты аланина на аминокислоту валин в 16 позиции, изменяет вторичную структуру белка и может влиять на перенос фермента из цитоплазмы в матрикс митохондрий. По данным разных авторов, такой вариант полиморфизма приводит в той или иной степени к дефициту кодируемого фермента (156). Активность СОД2 может отличаться до 56 раз у носителей разных аллельных вариантов. По данным литературы (137), у носителей Т/С и T/T вариантов активность фермента выше на 33% по сравнению с носителями C/C варианта. Наиболее исследован данный вариант полиморфизма SOD2 в генезе онкологических заболеваний, гипертонической болезни, нейродегенеративных состояний, обусловленных повреждающим действием на клетки оксидативного стресса. Носительство генотипа С/С увеличивает риск кардиогенного шока при дилатационной кардиомиопатии, также с данным генотипом ассоциирован повышенный риск заболеваемости раком желудка среди китайского населения (93, 161). Недавно изучена роль полиморфизма SOD2 в развитии ранних репродуктивных потерь (82). Установлено, что носительство супружеской парой аллельного варианта С/С ассоциировано с повышенным риском неразвивающейся беременности в I триместре. Существуют данные о более высокой вероятности возникновения беременности при проведении ЭКО у носителей генотипа Т/Т (131). 1.5.4 Каталаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. Каталаза - фермент антиоксидантной системы, является гемопротеином класса оксидоредуктаз, катализирующий реакцию обезвреживания пероксида водорода, образующегося в результате реакции дисмутации супероксидного радикала. Функция каталазы заключается в защите организма от активных 26 кислородсодержащих радикалов и пероксида водорода. Реализация функции каталазы происходит в большей степени при высоких концентрациях перекиси водорода, так как при низких концентрациях обезвреживание происходит преимущественно под действием пероксидазы (51). Каталаза весьма распространенный фермент, она присутствует почти во всех аэробно дышащих клетках и у некоторых факультативных анаэробов, преимущественно находится в пероксисомах, внеклеточно каталаза встречается в незначительных концентрациях (25). В условиях гипоксии усиление окислительных процессов способствует образованию большего количества перекисных соединений, что приводит к необходимости компенсаторного увеличения концентрации каталазы для защиты клеток от интоксикации (25). Ген САТ располагается на 11 хромосоме и отвечает за экспрессию фермента каталазы - важного звена антиоксидантной системы организма (26). По результатам проведенных исследований, была установлена связь носительства нескольких полиморфных вариантов гена САТ с развитием ряда мультифакториальных заболеваний. Генотипы G/G rs769214, А/А rs7943316 (=rs17880664) и Т/Т полиморфного варианта rs1049982 оказались ассоциированы с риском развития детского ожирения (85). Носительство генотипа А/А полиморфизма rs7943316 сопровождалось повышенным риском сердечнососудистых заболеваний у курящих и злоупотребляющих алкоголем мужчин, а генотипы А/Т и Т/Т, напротив, выполняли протективную функцию в отношении этих заболеваний в группе мужчин, ведущих здоровый образ жизни (151). При наличии полиморфного варианта rs1001179 (С262Т) гена CAT происходит замена цитозина на тимин в 262 позиции, что приводит к экспрессии неполноценной формы фермента, обладающей меньшей защитной активностью. По данным некоторых авторов (47, 94, 160) носительство генотипа Т/Т достоверно ассоциированно с повышенным 27 риском развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, бронхиальной астмы, с риском развития инсулиннезависимого сахарного диабета. Также существуют работы, по результатам которых сделан вывод о связи аллеля Т в гомо- и гетерозиготном состоянии с предрасположенностью к развитию язвенного колита, есть данные о повышении риска рака молочной железы у женщин с аллелем rs1001179–Т на фоне заместительной гормональной терапии в постменопаузе (112). Генотип Т/Т ассоциирован также с повышенным риском рака простаты у мужчин среди турецкого населения (147). Однако, присутствие минорного генотипа Т/Т, согласно данным некоторых исследований (129, 132) может играть не только отрицательную, но и положительною роль в структуре заболеваемости. Так, по данным литературы (129), аллель Т в гомозиготном состоянии rs1001179 обуславливает снижение риска развития невриномы слухового нерва и мужского бесплодия. На основании результатов перечисленных выше исследований можно сделать вывод о неоспоримой роли изменчивости гена САТ в возникновении предрасположенности к различным соматическим заболеваниям, на основании чего предполагается возможность наличия взаимосвязи полиморфизма данного гена с патологией репродуктивной системы. 1.5.5 Глутатионпероксидаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. Другим важнейшим элементом антиосидантной защиты является глутатионпероксидаза (ГП) – гомотетрамерный селенопротеин. ГП превращает перекись водорода и липидные пероксиды в безвредные молекулы до селензависимый того, как фермент, они образуют поэтому свободные активность радикалы. Это глутатионпероксидазы напрямую зависит от содержания селена в крови. Дефицит селена в 28 организме снижает активность ГП, а введение селена приводит к ее повышению (51). Фермент глутатионпероксидаза локализован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. Хотя роль каталазы и ГП для клетки при восстановлении H2O2 приблизительно одинакова, для организма в целом активность ГП значительно важнее (81). Известно несколько генов, кодирующих разные формы глутатионпероксидаз, отличающиеся по локализации в организме. ГП 1 (GPx1) является наиболее распространенной формой фермента, и обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих. ГП 2 (GPx2) экспрессируется в кишечнике и является внеклеточным ферментом, ГП 3 (GPx3) также является внеклеточным ферментом и в основном встречается в плазме. ГП 4 (GPx4) имеет большое значение в метаболизме пероксидов липидов и экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих на более низких уровнях (86). Предметом нашего исследования является полиморфизм гена GPx4, локализованый на 19 хромосоме, и контролирующий экспрессию селенсодержащего фермента ГП 4 (35). В литературе описано несколько аллельных вариантов гена GPX 4. Наибольшего внимания заслуживает однонуклеотидный полиморфизм rs713041 (С44Т) гена GPX4, при котором происходит замена цитозина на тимин в 44 сайте. Носительство генотипов С/Т и Т/Т приводит к экспрессии неполноценного по своей активности фермента глутатионпероксидазы 4, что может повышать уязвимость организма под воздействием свободных радикалов. По данным разных авторов (99, 122), носительство генотипа Т/Т ассоциировано с повышенным риском заболеваемости раком молочной железы, церебрального инсульта у больных эссенциальной гипертензией при носительстве генотипа Т/Т и С/Т (126). Генотип Т/Т обеспечивает повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний за счет ослабления функций клеток эндотелия (99). 29 По результатам исследований Bermano G,2007 (88) носительство аллеля С (генотип Т/С) rs713041 ассоциировано с риском развития колоректального рака. Гетерозиготный генотип С/Т ассоциирован с риском рака легких и гортани. По данным Villette S., 2002 (153) существует связь данного варианта полиморфизма с уровнем синтеза лейкотриенов и, как результат, участие в течении воспалительных процессов. Известно, что при носительстве генотипа С/С уровень вырабатываемых лейкотриенов выше, чем при генотипах С/Т и Т/Т (153). Недавно описан полиморфизм T2650C гена GPX4, при котором происходит замена тимина на цитозин в 2650 позиции. Наличие гомозиготного генотипа дикого типа T/T ассоциировано с пониженным риском развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у женщин и постоянной формой артериальной гипертензии у мужчин. Примечательно, что наличие у женщин гетерозиготного генотипа T/C гена снижает риск развития как язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, так и язвенной болезни желудка (75). Изученные полиморфные варианты гена GPX4 образуют гаплотип (rs757229-rs757230-rs4588110- rs3746165-rs3746166: C-G-G-T-A), по данным Liu SY,2011 (119) повышающий защиту от мужского бесплодия, связанного с астенозооспермией и олигоспермией. Существуют данные о связи гаплотипа (rs713041- rs4807542) гена GPX4 с риском развития местной остеоартропатии (Болезнь Кашин-Бекка ) среди китайского населения (103). Таким образом, основываясь на связи вариантных аллелей данного гена с формированием описанных выше мультифакториальных заболеваний можно предположить, что изменения в его структуре влияют и на течение беременности. 30 1.5.6 Глутаматцистеин лигаза, как один из основных факторов антиоксидантной защиты. Глутатион (GSH)- важнейший фактор поддержания редокс-статуса внутриклеточной среды. Являясь трипептидом с амино-группой цистеина и карбокси –группой глутамата, глутатион обеспечивает поддержание антиоксидантных процессов в организме (140). В процессе синтеза глутатиона принимают участие 2 субъединицы фермента глутаматцистеин лигазы (GCL): каталитической (GCLC) и регуляторной (GCLM) (100). Наиболее изученным и клинически значимым вариантом является полиморфизм rs17883901 (С129Т) гена GCLC, при котором происходит замена азотистого основания цитозина на тимин в 129 регионе. У носителей минорного генотипа Т/Т повышен риск развития сахарного диабета I типа (152). Аллель Т в гомозиготном состоянии по данным Zuo HP, 2007 (165), является маркером повышенного риска ишемической болезни сердца среди китайского населения. Однонуклеотидный полиморфизм rs761142 (G 151T) с заменой гуанина на тимин приводит к экспрессии фермента с пониженной активностью и по данным литературы генотип Т/Т ассоциирован с риском возникновения аллергии на сульфаметахосозол у больных СПИД (154). Объектом нашего исследования является полиморфный вариант rs17883901 (С129Т ), который исходя из вышеизложенного играет роль в формировании предрасположенности к некоторым системным заболеваниям, влияя в том числе и на течение беременности. 1.6. Влияние системы детоксикации ксенобиотиков на репродуктивную систему человека. Наряду с эндогенными источниками повреждающих агентов, существуют факторы внешней среды, проникающие в организм и провоцирующие усиление окислительного стресса, приводя тем самым к 31 нежелательным последствиям для здоровья женщины и течения беременности. К таким факторам относятся чужеродные для организма соединения – ксенобиотики (29). Все факторы внешней среды способны влиять на течение беременности на всех стадиях эмбриогенеза: начиная с гаметогенеза, при оплодотворении, в процессах имплантации и плацентации. В процессе метаболизма, как правило, активность ксенобиотиков снижается, происходит их дезактивация, либо в случае с токсическими веществами- детоксикация. Однако, зачастую в организме метаболиты ксенобиотиков, наоборот, приобретают большую активность и оказывают выраженный токсический эффект на организм, усугубляя окислительный стресс (36, 67). Таким образом, нарушение метаболизма ксенобиотиков играет огромную роль и в неблагоприятном течении беременности. В процессах метаболизма ксенобиотиков принимают участие порядка 30 различных ферментов. Процесс детоксикации объединяет 3 фазы: 1) в ходе I фазы происходят реакции гидролиза, восстановления и окисления субстрата, с образованием промежуточных активных метаболитов (67). 2) II фаза – фаза конъюгации – связывание токсических элементов, обезвреживание их при участии ферментов (гидролаз, трансферраз). В ходе 3 фазы происходит связывание ксенобиотиков и их метаболитов и элиминация их из организма (29, 67). Уровень активности ферментов детоксикации ксенобиотиков генетически детерминирован и индивидуален для каждого организма (80). Поскольку предметом нашего исследования являются варианты полиморфизма гена, кодирующего фермент семейства цитохром P 450 (СYP1А1), важно более подробно рассмотреть вторую фазу детоксикации ксенобиотиков, и непосредственной функции данного фермента. 32 1.6.1 Роль цитохром Р450 в процессах детоксикации ксенобиотиков. Ген СYP1А1 отвечает за экспрессию фермента цитохром Р 450 1А1 из семейства гемопротеинов, участвующего в процессах обмена стероидов (особенно эстрогенов), насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, детоксикации ксенобиотиков, метаболизме лекарственных средств (67, 101). В литературе описано несколько функциональных вариантов полиморфизма гена СYP1А1, в той или иной степени приводящих к изменению активности фермента (77). По данным литературы полиморфный вариант rs1048943 (Ile462Val) гена CYP1А1, в основе которого лежит замена аденина на гуанин в 2455 позиции, сопровождается заменой аминокислоты изолейцина на валин (62, 77). При этом экспрессируется фермент цитохром Р450 1А1 с повышенной активностью, в результате чего происходит накопление промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков и активно нарастает мутагенное воздействие на организм с развитием соматических заболеваний (109). По данным Salnikova L,2012, ассоциирован с повышением генных минорный аллель G rs1048943 соматических мутаций в условиях радиационного облучения (134). Носительство генотипа G/G в 1,5 раза увеличивает риск заболеваемости раком легких, плоскоклеточной карциномы кожи среди курильщиков (158). Согласно проведенным ранее исследованиям аллель G в гомозиготном состоянии достоверно чаще обнаруживается у пациентов с онкологическими заболеваниями желудка и толстого кишечника (123). Полиморфизм в rs4646903 (Т3801С) гена CYP1A1 не приводит к изменению аминокислотной последовательности, однако у носителей гомозиготы С/С и гетерозиготы Т/С индуцибельность фермента несколько выше. Согласно последним исследованиям, носительство аллеля С ассоциировано с повышенным риском развития синдрома поликистозных яичников (136). 33 Полиморфный вариант rs2606345 (-27+606G>T) гена CYP1A1 не влияет на активность фермента, однако носительство минорного аллеля G ассоциировано с риском рака легких и гормоно- зависимых опухолевых процессов (135). Повышенный риск развития опухолей головного мозга у детей женского пола был выявлен у носителей минорного аллеля G полиморфного варианта rs2606345, также выявлена роль гаплотипа rs2606345-rs1048943rs4646903 в генезе данной патологии (135). Существует корреляция между носительством гаплотипа 4889 G/-27+606G>T и повышенным уровнем TCR мутантных лимфоцитов в условиях радиационного облучения (135). Поскольку именно в первой половине гестации эмбрион подвержен наибольшему влиянию со стороны негативных агентов окружающей среды, уровень активности ферментов системы детоксикации ксенобиотиков может вносить вклад в формирование ранних генных мутаций. По результатам проведенного исследования Носковой И.Н., 2008 (54), носительство генотипов Т/Т и С/Т полиморфного варианта С 264Т повышает риск репродуктивных потерь I триместра беременности. Объектом нашего исследования являются полиморфные варианты rs4646903 (Т3801С) предрасположенности и rs1048943 (A4889G) гена CYP1А1, и их роль в к репродуктивным потерям первой половины беременности среди женщин, проживающих на территории Москвы и Московской области. 1.7 Роль катехоламинов в организме человека. В ЦНС человека существуют вещества, молекулы которых являются химическими посредниками в регуляции межклеточных взаимодействий. К этой группе веществ относятся производные пирокатехина - катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин). Катехоламины выполняют 34 двойственную функцию нейромедиаторов и нейрогормонов, синтезируясь в мозговом веществе надпочечников, являются основными трансмиттерами симпатоадреналовой нервной системы (49). Основным звеном в процессах метаболизма катехоламинов является фермент катехол-О-метилтрансфераза, нарушение активности которого сопровождается нарушением процессов распада и элиминации катехоламинов (49). 1.7.1 Роль катехол-О-метилтрансферазы (СОМТ) в метаболизме катехоламинов. Ген СОМТ, кодирующий экспрессию фермента катехол-О- метилтрансферазы располагается на 22 хромосоме (46, 50, 159). При нормальной структуре гена СОМТ происходит выработка полноценно активного фермента, осуществляющего процесс распада катехоламинов, что поддерживает их концентрацию на физиологическом уровне. В случае возникновения изменений в структуре гена СОМТ с формированием вариантных аллелей в различных сайтах, может изменяться стабильность экспрессируемого фермента, вплоть до полной утраты ферментативной активности (49). Одним из наиболее изученных полиморфных вариантов является rs4680 (G472А) с заменой в локусе 472 азотистого основания гуанина на аденин, что приводит к замене валина на метионин в аминокислотной последовательности сопровождается белка. выработкой Такое изменение фермента в структуре белка катехол-О-метилтансферазы со сниженной активностью. При этом доказано, что у носителей генотипа G/G наблюдается экспрессия полноценного фермента, гетерозиготы G/A отличает некоторое снижение активности СОМТ, у гомозигот по минорному аллелю А (генотип A/A) наблюдается 3-4 кратное снижение активности фермента, по сравнению с генотипом дикого типа (150). 35 По данным ряда авторов (98, 102, 110, 155, 157) , носители генотипа А/А rs4680 значительно чаще страдают психическими заболеваниями, такими как шизофрения, биполярное и паническое расстройство, депрессия. Выявлен повышенный риск развития болезни Альцгеймера среди азиатского населения при наличии генотипа А/А (98, 115). Также известно, что аллель А rs4680 ассоциирован с относительно низким уровнем инактивации допамина, что предрасположенностью к алкогольной зависимости. сопровождается (150) Существуют данные о повышении риска развития миомы матки также у гомозигот по мутантному аллелю А (104). Согласно данным китайских ученых, носительство аллеля А повышает риск развития преэклампсии (117). Согласно исследованиям китайских ученых (149), у носителей генотипа А/А rs4680 существует повышенный риск онкологических заболеваний. По результатам проведенного в 2013 году метанализа, выявлен повышенный риск развития рака эндометрия в постменопаузе у носителей генотипа G/G (118). По данным Gothelf D, 2013 (107), описаны также аллели rs165599 и аллель Т полиморфизма rs74745580-G и rs74745580-T, приводящие к экспрессии фермента со сниженной активностью; показано влияние данного гаплотипа на риск развития психоза и депрессивных состояний (107). Согласно приведенным выше данным ясно, что наибольшую научную значимость получило изучение полиморфизма гена СОМТ в структуре психиатрических заболеваний. Однако, принимая во внимание связь выработки малоактивного фермента с недостаточным распадом катехоламинов, можно предположить негативное их воздействие не только на нервную систему, но и на органы- мишени, содержащие специфические рецепторы. Нам представляется интересным рассмотреть носительство наиболее изученного полиморфизма гена СОМТ rs4680 (G472А) с анализом вклада различных генотипов данного полиморфизма в риск развития патологии первой половины гестации. 36 1.8 Механизмы репарации ДНК. В основе всех живых организмов лежит молекула ДНК, регулирующая их жизнедеятельность посредством реализации генетической программы. ДНК обеспечивает хранение и передачу генетической информации от одного поколения к другому, поддерживая тем самым индивидуальные характеристики каждого вида (76, 80). По структуре молекула ДНК представляет собой полимерную молекулу, состоящую из повторяющейся последовательности нуклеотидов (белков), нуклеотиды в свою очередь образованы комплексом из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы, последние два вещества формируют связи между азотистыми основаниями в нуклеотиде (80). В метаболизме молекулы ДНК выделяют три ведущих процесса: репликация, рекомбинация и репарация (76, 80, 84). За период жизненного цикла в каждой клетке под действием эндогенных и экзогенных факторов происходит от 105 до 1010 мутаций в молекуле ДНК, которые несут как положительное значение, являясь основой эволюции, так и, при недостаточности репаративной системы, могут приводить к развитию целого ряда заболеваний (76, 123). Одним из наиболее сложных механизмов репарации ДНК является эксцизионная репарация, осуществляющая удаление дефектного основания из молекулы ДНК. В результате генетически детерминированной недостаточной работы ферментов эксцизионной репарации ДНК, происходит накопление мутаций в генах с фенотипическим проявлением в виде развития заболеваний разных органов и систем (8, 76). 1.8.1 Роль 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы в процессах эксцизионной репарации ДНК. Основным ферментом, обеспечивающим протекание процессов эксцизионной репарации ДНК, является 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза. 37 Осуществляя свою функцию посредством вырезания из молекулы ДНК мутантного основания 8-oxoG, фермент ОGG1 поддерживает нормальную структуру ДНК, снижая риск мутагенеза (76, 120). Функциональная активность фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы напрямую зависит от структурной основы кодирующего гена (76, 80, 125). При сохранении исходной конфигурации гена ОGG1 в организме вырабатывается максимально активный фермент эксцизионной репарации. Пи наличии ряда полиморфных вариантов в ОGG1 гене происходит изменение функциональных характеристик экспрессируемого фермента (8). По данным разных авторов некоторые полиморфные варианты приводят к выработке менее активного фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы, а в некоторых случаях возможна полная утрата его активности (146). Такие патологические перестройки ведут к нарушению процессов восстановления ДНК на всех уровнях и провоцируют накопление канцерогеных и мутагенных повреждений ДНК, что, в свою очередь, негативно отражается на гомеостазе макроорганизма (8, 76). Наиболее изученным полиморфным вариантом является rs1052155 (С977G) гена ОGG1, при котором происходит замена цитозина на гуанин в 977 локусе, с заменой аминокислоты серина на цистеин. По данным литературы, минорный аллель G является маркером опухолей радиационного происхождения (134). Генотип G/G также ассоциирован с риском рака ободочной и прямой кишки, плоскоклеточного рака пищевода (141, 164). По данным авторов (95, 96, 142) установлено, что носительство аллеля G в гомозиготном состоянии повышает риск развития хронических заболеваний почек, сахарного диабета 2 типа, эпителиального рака яичников и рака молочной железы у пациенток в постменопаузе среди китайского населения. Также существуют указания на связь минорного аллеля G rs1052155 с ухудшением прогноза выживаемости при печеночно-клеточном раке на фоне 38 вирусного гепатита В (111). Установлена связь генотипа G/G с повышенным риском онкологических заболеваний головы и шеи среди польского населения и рака желчного пузыря у северо-индийской популяции (138, 139). Помимо негативного влияния, аллель rs1052155-G гена ОGG1 может оказывать и протективный эффект: например, китайскими учеными установлено снижение риска рака предстательной железы при носительстве данного аллеля (163). Относительно роли других полиморфных вариантов гена ОGG1 в генезе развития заболеваний информация в литературе крайне скудная и противоречивая. Таким образом, наибольший интерес представляет дальнейшее изучение полиморфизма rs1052155 (С977G) гена ОGG1. Столь часто демонстрируемая роль минорного аллеля G в связи с повышенным риском к развитию онкологических заболеваний подтверждает вероятность его вклада в канцеро- и мутагенез. Исходя из вышеперечисленного, можно предположить, что носительство различных генотипов ОGG1 неодинаково влияет и на течение беременности, с возможным повышением числа патогенных мутаций у женщин с аллелем rs1052155-G, поэтому объектом нашего исследования мы выбрали именно полиморфизм С977G. Основываясь на приведенных выше данных связи изменчивости в структуре генов ферментов антиоксидантной системы, системы детоксикации ксенобиотиков и генов эксцизионной репарации ДНК с повышенной воздействия уязвимостью организма повреждающих предрасположенностью к в условиях факторов развитию многих и, неблагоприятного как следствие, мультифакториальных заболеваний, можно с уверенностью утверждать, что дальнейшее изучение данных групп генов в контексте выявления риска НБ крайне актуально для современной медицины. 39 На основании приведенных выше данных мы провели анализ роли изучаемых полиморфных вариантов в возникновении различной соматической патологии, результаты приведены в Таблице №1. Таблица 1. Ассоциация полиморфных вариантов генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1, COMT, OGG1 с соматическими заболеваниями. Ген Сайт NRF2 rs 67211961 Т (генотип Т/Т ) Риск рака легких среди курильщиков, (89, 108, риск развития олигоастенозооспермии,143, 162) венозных тромбозов при ЗГТ в постменопаузе, рака молочной железы rs 2706110 А (генотип А/А) Риск рака молочной железы (108) rs 4881 С (генотип Т/С и С/С) Риск онкологические заболевания, гипертоническая болезнь, нейродегенеративные состояния, дилатационная кардиомиопатия, неразвивающаяся беременность (93, 161) Т (генотип Т/Т и С/Т ) Риск заболевания сердечно-сосудистой (47, 94) системы, бронхиальной астма, (112, 148, неинсулинзависимого сахарного 160) диабета, язвенного колита, рака молочной железы на фоне ЗГТ в постменопаузе, рака простаты Т (генотип Т/Т) Протективная роль в отношении риска развития невриномы слухового нерва и мужского бесплодия. (129) G ( генотип G/G) Риск развития детского ожирения (85) Риск сердечно-сосудистых заболеваний (151) SOD2 САТ rs 1001179 rs 769214 Аллель/генотип Соматическое заболевание Ссылка (82, 131) rs А (генотип А/А) 7943316= rs 17880664 rs 1049982 Т (генотип Т/Т ) rs 7943316 А (генотип А/А) 40 у курящих и злоупотребляющих алкоголем мужчин GPx4 rs 713041 Гаплотип rs757229rs757230rs4588110rs3746165rs3746166 GCLC Т (генотипы Т/А Т/Т) Протективный эффект в отношении развития сердечно-сосудистых заболеваний у мужчин, ведущих здоровый образ жизни Т (генотипы С/Т и Т/Т) Риск рака молочной железы, риск (99, 122, церебрального инсульта у больных 126) (103) эссенциальной артериальной гипертензией ,риск развития местной остеоартропатии (Болезнь Кашин-Бекка ) среди китайского населения С (генотип Т/С ) Риск развития колоректального рака (88) С (генотип С/С) Повышенный уровень выработки лейкотриенов (153) C-G-G-T-A Протективный эффект по отношению к мужскому бесплодию, связанному с астенозооспермией и олигоспермией (119) Риск развития сахарного диабета I типа (152) rs17883901 Т (генотип Т/Т ) (151) Риска ишемической болезни сердца (165) среди китайского населения. rs761142 Т (генотип Т/Т ) Риск возникновения аллергии на (154) сульфаметахосозол у больных СПИД CYP1А1 rs1048943 G ( генотип G/G) Повышением генных соматических (134) мутаций в условиях радиационного облучения Риск заболеваемости плоскоклеточной раком легких, (125, 158) карциномы кожи среди курильщиков rs4646903 С (генотипы Риск развития синдрома поликистозных (136) (54) 41 С/С и Т/С) яичников, риск репродуктивных потерь I триместра беременности rs2606345 G ( генотип G/G) rs4680 опухолевых процессов Риск Гаплотип rs2606345rs1048943rs4646903 СОМТ Риск рака легких и гормонозависимых (135) развития опухолей головного мозга у детей женского пола А (генотип А/А) Риск психических заболеваний (98, 102) (шизофрения, биполярное расстройство, паническое расстройство, (110, 155) депрессия),преэклампсия, риск болезни (149, 157) Альцгеймера, онкологических заболеваний, риск миомы матки, рака эндометрия постменопаузе, (104, 150) в алкогольной зависимости. ОGG1 (115, 118) (117) Гаплотип rs165599rs74745580 G -Т Риск психоза и депрессивных состояний (107) rs1052155 G (генотип G/G) Риск рака ободочной и прямой кишки, (141, 164) плоскоклеточного хронических рака пищевода, заболеваний сахарного диабета 2 почек, (95, 96) типа, (111, 142) эпителиального рака яичников и рака молочной железы постменопаузе у (138, 139, в 163) китайского пациенток среди населения, онкологических заболеваний головы и шеи среди польского населения и рака желчного пузыря у северо-индийской популяции. 42 Протективный эффект в отношении рака простаты. ГЛАВА 2. Методы исследования. 2.1. Материал и объект исследования. Клиническое обследование пациенток, включенных в наше исследование, осуществляли на базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой - заслуженный врач России, д.м.н., профессор О.В. Макаров). Пациенток в основную группу отбирали среди женщин с 2 и более репродуктивными потерями в анамнезе. Диагноз прерванной беременности был установлен при госпитализации на основе сбора анамнеза, оценки жалоб, а также с применением дополнительных клинико-лабораторных методов обследования, УЗИ органов малого таза. В наше исследование были включены пациентки с установленным диагнозом неполного самопроизвольного выкидыша, самопроизвольного аборта в ходу, либо неразвивающейся беременности на сроке более 7 недель гестации. Пациенткам с нарушенной беременностью было произведено инструментальное удаление остатков или измененного плодного яйца, в послеоперационном периоде всем без исключения была назначена утеротоническая и антибактериальная терапия. С целью исключения патологии кариотипа эмбриона как причины потери беременности, в основную группу вошли пациентки со сроком гестации на момент гибели плода более 7 недель по размеру плодного яйца, всем отобранным абортусов. Для пациенткам исключения было произведено спорадических кариотипирование выкидышей критерием включения в группу являлось наличие в анамнезе 2 и более эпизодов 43 невынашивания первой половины беременности. Случаи таких исходно грубых аномалий кариотипа, как анэмбриония были исключены из исследования. В группу не вошли также пациентки с потерей беременности, наступившей в результате ЭКО. Критерием включения пациенток в контрольную группу являлось наличие у женщин 2 или более беременностей, протекавших без угрозы прерывания и закончившихся нормальными срочными родами. Из исследования были исключены пациентки с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе. Случаи серьезных угроз невынашивания беременности, с наличием кровяных выделений во время беременности также не входили в контрольную группу. Исходя из задач нашего исследования основную группу составили пациентки с 2 и более репродуктивными потерями первой половины беременности, контрольную группу - женщины с 2 и более родами в анамнезе. На каждую пациентку нами была заведена индивидуальная карта, куда были занесены данные анамнеза, включающие антропометрические данные, уровень социально-экономического перенесенные гинекологические и и профессионального экстрагенитальные статуса, заболевания, характеристику репродуктивного здоровья, течение и исход беременностей, а также результат проводимого нами генотипирования. Вся информация была объединена в специальную базу данных для проведения статистического анализа полученных результатов. Пациенткам обеих групп было выполнено полное клинико- лабораторное обследование согласно современным медико-экономическим стандартам. 1. При поступлении в стационар или родильный дом всем пациенткам проводили тщательный сбор анамнеза, который включал данные о: - материальном, социальном и профессиональном статусе - вредных привычках (прием алкоголя, табакокурение) 44 - воздействию вредных профессиональных факторов (работа с компьютером, контакт с химическими веществами) - перенесенных соматических заболеваниях, наличию хронической экстрагенитальной патологии, генетически детерминированных заболеваний. - перенесенных вирусных и бактериальных инфекциях - менструальной функции (возраст наступления менархе, продолжительность и регулярность менструального цикла, характер и объем менструальных выделений). -половой жизни (возраст начала половой жизни, количество половых партнеров, способ контрацепции) -гинекологических заболеваниях (время возникновения, длительность течения и исход) - репродуктивной функции (количество, течение, исход беременностей). 2. После сбора анамнеза проводили общее обследование пациенток. В ходе объективного осмотра были отмечены антропометрические данные, степень выраженности подкожно-жировой клетчатки, состояние кожных покровов и видимых слизистых, определение характера оволосения. С целью дообследования была проведена оценка функции дыхательной и сердечно-сосудистой систем, измерение артериального давления, частоты пульса и дыхания, поверхностная и глубокая пальпация живота, наличие или отсутствие перитонеальных симптомов, перкуссия живота, выявление симптома Пастернацкого, выявление периферических отеков, изменений по ходу сосудистых пучков. 3. Проведение специального гинекологического обследование включало в себя: осмотр наружных половых органов, оценку характера и степени оволосения; осмотр шейки матки и стенок влагалища с помощью зеркал с целью оценки состояния слизистой и характера выделений из цервикального канала; двуручное влагалищное исследование для 45 определения размера, положения и консистенции тела матки, состояния придатков матки. 4. В перечень дополнительных методов исследования, проводимых нашим пациенткам, были включены: 1. Клинический анализ крови 2. Общий анализ мочи 3. Определение группы крови и резус фактора 4. Биохимический анализ крови 5. Коагулограмма 6. Определение гормонального профиля. 7. Анализ крови на определение инфекций RW,ВИЧ, HBS, HCV 8. ЭКГ 9. Бактериоскопия отделяемого влагалища и цервикального канала 10.Посев из цервикального канала на микрофлору и определение чувствительности к антибиотикам. 11.Исследование отделяемого цервикального канала и влагалища с помощтю ПЦР - диагностики на ИППП. 12.Ультразвуковое исследование органов малого таза При проведении УЗИ органов малого таза был использован аппарат Voluson E8 фирмы GE с применением мультичастотного микроконвексного внутриполостного ректо-вагинального датчика с частотой (4.0 - 11.0 МГц). Во время исследования нами была проведена оценка состояния органов малого таза, измерение размеров матки, определение ее консистенции и формы, оценивали состояние эндометрия, структуру яичников и маточных труб, оценивали наличие свободной жидкости в полости малого таза. При подтверждении факта беременности проводили измерение размера плодного яйца, КТР (копчико-теменной размер) эмбриона, расположение и состояние хориона. При проведении УЗИ во II-III триместрах определяли размеры 46 плода, тип положения и предлежания, оценивали состояние и количество околоплодных вод, определяли степень зрелости плаценты. 5. Проведено генотипирование пациенток полиморфизма с целью выявления следующих генов: генов антиоксидантной системы CAT, GPX4, GCLC, SOD2, NRF2, системы детоксикации ксенобиотиков CYP1A1, гена, отвечающего за обмен катехоламинов COMT, генов репарации ДНК OGG1. Специальные генетические методы исследования выполняли на базе Учреждения Российской Академии Н.И.Вавилова, лаборатории Наук Института общей генетики им экологической генетики (заведующий лабораторией д.б.н. Рубанович А.В.). Таблица. 2 Таблица 2. Специальные методы исследования Генотипирование Вид исследования (ПЦР-реакция) Количество исследований rs6721961 (G617T) гена NRF2 196 rs 17880664 (Т21С) гена CAT 188 rs713041 (С44Т) гена GPX4 176 rs4880 (Т47С) гена SOD 2 196 rs17883901 (С129Т) гена GCLC 196 rs1048943 (А4889G) гена CYP1A1 174 rs4646903 (Т3801С) гена CYP1A1 196 rs 4680 (G1947А) гена COMT 174 rs1052133 (С977G) гена OGG1 190 Определение активности фермента СОМТ 274 Кариотипирование 151 Всего 2113 47 2.2 Методы генотипирования. Генотипирование было проведено 274 пациенткам путем постановки реакции на основе взятых анализов периферической крови. У каждой пациентки осуществляли забор венозной крови в стерильную одноразовую пробирку объемом 5 мл, содержащую консервант – раствор К3EDTA, в соотношении 1:10. Хранение образцов осуществляли при температуре -20˚-80˚C вплоть до постановки реакции. В ходе исследования выделяли ДНК из образцов крови с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, страна производитель Россия). Постановку реакции осуществляли согласно методу, заявленному производителем. Для проведения готовые наборы ПЦР реакции использовали Master Mix (Фирма лиофилизированные Изоген). Постановку реакции осуществляли согласно протоколу, заявленному производителем. 2.3 Определение активности катехол-о-метилтрансферазы. Определение активности фермента катехол-о-метилтрансферазы осуществляли согласно методике, описанной Zurcher.G., 1982г (166). 2.4. Статистическая обработка данных. В работе анализировали выборку объемом 274 наблюдений. Каждое наблюдение содержало 89 переменных, из которых 78 признаков являлись дискретными, качественными, а 11 признаков - непрерывными, количественными. Доля пропущенных значений составила менее 1% . Для статистического анализа были использованы следующие методы: 1) Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html) 2) Для оценки критерия значимости в двух независимых группах, представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали 48 критерий χ2 (Хи- квадрат) и критерий Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). 3) Для групп, представленных параметрическими величинами, использовали t-тест Стьюдента 5) В ряде случаев для оценки достоверности различий частот бинарных показателей использовали также трендовый тест Армитажа (адрес свободного доступа http://www.biomedcentral.com/1753-6561/3/S7/S37). 6) Вклады различных генотипов в заболеваемость определяли с помощью традиционного для таких исследований показателя «odds ratio» (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html). (OR – мера коррелятивной связи), равного OR Pбол (1 Pздор ) Pздор (1 P бол ) , где Pбол - частота генотипа среди больных, Pздор - частота генотипа среди здоровых. При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1. При OR>1 говорят о повышенном риске заболевания при данном генотипе. 7) Все обследованные популяции были проверены на соответствие критерию Харди-Вайнберга. 8) Оценку корреляционной зависимости для непараметрических ранговых величин проводили по методу Спирмена (R). Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах и рисунках, имеют следующие обозначения: М - среднее, s - стандартное (среднеквадратичное) отклонение, m - ошибка среднего, n - объем анализируемой подгруппы, р достигнутый уровень значимости. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% . 49 Глава 3. Клиническая характеристика пациенток обследованных групп. Материалы диссертационной работы получены в результате комплексного клинико-лабораторного обследования 274 женщин. Основную группу составила 151 пациентка с 2 и более потерями беременности в анамнезе на сроке более 7 недель. Критериями исключения из группы являлись случаи тяжелых аномалий кариотипа (анэмбриония), а также беременности, наступившие в результате ЭКО. Всем пациенткам, включенным в основную группу было проведено кариотипирование абортусов, с целью исключения грубых аномалий кариотипа, как причины потери беременности. Для контрольной группы было отобрано 123 женщины с 2 и более беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися срочными самопроизвольными родами. Из группы исключались пациентки с кровяными выделениями во время беременности, а также с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе. Сбор материала осуществлялся на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой заслуженный врач России, д.м.н., профессор О.В. Макаров). Для исключения конфаунд-факторов в исследование были включены пациентки идентичной национальности (славянской), одной географической зоне и общем проживающие климатическом в поясе, преимущественно на территории города Москвы и Московской области. Все исследования были проведены с письменного согласия испытуемых женщин. На каждую пациентку была заведена индивидуальная карта, включающая данные анамнеза жизни, характер менструальной функции, наличие гинекологической и экстрагенитальной патологии, перенесенные вирусные и инфекционные заболевания, также подробно выяснялось 50 количество и характер течения беременностей с указанием проводимой во время беременности медикаментозной терапии. Тщательный сбор анамнеза позволил охарактеризовать условия материального и социального статуса, неблагоприятных внешних жизни пациенток: уровень наличие вредных привычек и факторов воздействия, а также представилась возможность сравнить уровень неблагоприятного влияния стресса на течение беременности у пациенток обеих групп. В ходе исследования показателей мы провели сравнение росто-весовых для оценки конституциональных характеристик организма пациенток обеих групп. Таблица 3. Средний возраст. Вес и рост обследованных женщин (M±m). Основная группа n=151 Контрольная группа n=123 (M±m) (M±m) Возраст женщин 31,840,46 30,67 0,46 Вес женщин 65,041,02 65,11 1,05 Рост женщин 165,40,49 165,580,56 Индекс массы тела 23,90,15 23,930,43 В таблице №3 приведены данные о среднем возрасте включенных в исследование пациенток. Достоверного различия по этим показателям выявлено не было. Таким образом, основываясь на сравнении приведенных выше данных по возрасту и росто- весовым показателям можно сделать заключение о том, что обе группы пациенток были практически однородными. Нарушение жирового обмена у пациенток основной группы было выявлено достоверно чаще, по сравнению с контрольной. В основной группе количество женщин с ожирением составило 39,07 % (n=59) , в контрольной 51 группе этот показатель оказался значительно ниже и составил 19,51% (n= 24), χ²=12,5; р=0,0005. (Рис.1) * 40% 30% Основная группа 20% Контрольная группа 10% 0% Нарушение жирового обмена *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 1. Нарушения жирового обмена у обследованных пациенток. В нашем исследовании проведена оценка социально-экономического статуса обследуемых женщин. Поскольку уровень материального положения определяет качество жизни, можно говорить о его влиянии и на НБ. В основной группе практически все пациентки - 96,6% (n=146) оценили свое материальное положение как среднее, 2 пациентки указали на высокое материальное положение 1,32% (n= 2) и 3 женщины 1,98% (n =3) оказались с низким достатком. В контрольной группе все 100% обследованных пациенток расценили свое материальное положение как среднее. При сравнении приведенных выше данных достоверной статистической разницы не было. Важными показателями социального статуса являются уровень образования и профессия. Известно, что уровень образования напрямую коррелирует с величиной умственной нагрузки, что может являться фактором стрессового воздействия на организм. В основной группе обследованных нами женщин 76,80% (n=116) имели высшее образование, 23,17% (n= 35) пациенток получили 52 только среднее специальное образование. В контрольной группе количество пациенток с высшим образованием составил 74,70 % (n=92) , тогда как женщин со средним образованием было 25,20 % (n=31). При сравнении достоверной разницы между группами выявлено не было. В нашем исследовании мы провели изучение трудовой занятости женщин, как фактора повышенного стрессового воздействия на организм, особенно во время беременности. В основной группе около 68,10 % (n=103) оказались служащими, 17,22% (n=26) пациенток имели рабочую профессию, 12, 58% (n =19) не работали, а 5,29% (n =8) являлись студентками высших учебных заведений. В контрольной группе к служащим относились 64,22% (n=79) женщин, количество рабочих оказалось несколько ниже и составило 13% (n=16), домохозяек - 17,07% (n=21) женщин и 3 пациентки являлись учащимися 2,43% (n=3). Статистически достоверной разницы между группами не наблюдалось. Среди факторов, негативно влияющих на организм женщины и на прогноз вынашивания беременности, мы выделили профессиональные вредности: контакт с химическими веществами и подверженность излучению при работе с компьютером, а также вредные привычки, такие как табакокурение и злоупотреблением алкоголем (43). Большинство пациенток в обеих группах имели профессию, связанную с повышенным электромагнитным излучением в связи с частой работой за компьютером. В основной и контрольной группах этот фактор встречался примерно с одинаковой частотой и составил 68,21% (n=103) и 73,17% (n=90) соответственно. Контакт с химическими веществами на рабочем месте установлен у 6 женщин основной группы 3,97% и у 4 пациенток контрольной группы, что составило 3,25 %. Количество курящих пациенток в основной группе составило 23,84% (n=36) , в контрольной же группе пристрастие к табакокурению наблюдалось в два раза реже, что соответствовало 13% (n= 16) обследованных женщин, эти показатели достоверно отличались χ²=5,7; р=0,022 (Рис.2). 53 В ходе исследования было установлено, что пациентки основной группы значительно чаще, чем контрольной группы употребляли алкоголь. Так, в основной группе этот показатель составил 17,21 % (n =26), тогда как в контрольной на потребление алкоголя указало всего 3 пациентки, что составило 2,43%. При сравнении групп по данному параметру также выявлена статистически достоверная разница χ² =15,65; р=0,0001(Рис.2). 25% * * 20% Основная группа 15% 10% Контрольная группа 5% 0% Курение Алкоголь *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 2. Частота встречаемости вредных привычек у обследованных пациенток. В условиях современного мегаполиса, активной трудовой деятельности с максимальной занятостью на работе, требующей высокого умственного и эмоционального напряжения, современные женщины находятся под постоянным влиянием стресса. В нашем исследовании для оценки уровня стресса мы рассматривали продолжительность ночного сна и уровень тревожного состояния пациенток. Являясь мощным дестабилизирующим фактором для здоровья организма, хроническое воздействие стресса несомненно оказывает и негативное влияние на течение беременности (1, 72). В нашем исследовании мы провели анализ частоты наличия этого неблагоприятного фактора в жизни пациенток. При оценке продолжительности ночного сна, как одного из основных протективных факторов в условиях стресса, статистической разницы между группами выявлено не было. На продолжительность сна менее 5 часов в сутки указало 9,27 % (n=14) пациенток основной группы и 15,44 % (n =19) контрольной группы соответственно. 54 Наличие хронического тревожного состояния выявлено у пациенток основной группы в 62,25 % (n=94) наблюдений, в контрольной группе этот показатель оказался в два раза ниже и составил 32,52% (n=40). При сравнении выявлена высоко достоверная статистическая разница χ² =23; р=0,0001(Рис 3). Среди пациенток основной группы 62,9 % (n=95) указали на высокий уровень тревожности, что было достоверно чаще, чем у пациенток контрольной группы 36,58% (n=45) соответственно, χ² =18,80; р=0,001(Рис 3). * 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% * Основная группа Контрольная группа Сон менее 5 часов Тревога Стресс *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 3. Частота тревоги и хронического стресса у обследованных пациенток. На основании приведенных выше данных можно сделать вывод, что пациентки основной группы почти в два раза чаще подвергались воздействию стресса, что могло являться одним из факторов, предрасполагающих к возникновению репродуктивных потерь. Наличие экстрагенитальной патологии может оказывать мощное негативное влияние на течение и исход беременности, поэтому при сборе анамнеза мы уделяли большое значение выявлению заболеваний различных органов и систем (23). В условиях жизни в мегаполисе под воздействием хронического стресса возрастает риск развития гипертонической болезни. Известно, что наличие артериальной гипертензии у беременной женщины негативно влияет 55 на течение гестации (48). В результате изменения морфологической и функциональной структуры сосудов происходит нарушение микроциркуляции и возникает гипоксия в различных органах, в том числе и в матке. Ангиопатия и гипоксия приводят к неполноценной инвазии трофобласта и нарушениям структуры ложа хориона, что способствует развитию в нем первичной недостаточности, в результате которой нарушается нормальное развитие эмбриона (71). К усугублению гипоксии при первичной инвазии трофобласта и нарушению развития ворсин хориона с последующей гипоплазией плаценты приводит также снижение гемоглобина (71). Эти два фактора значительно увеличивают риск возникновения угрозы прерывания и потери беременности. В нашем исследовании пациентки основной группы оказались достоверно более склонны к повышению АД. Артериальная гипертензия выявлена в основной группе в 22,51 % (n=34) наблюдениях, в контрольной группе данная патология выявлена всего у 5 пациенток - 4,06 %, что было достоверно ниже χ² 18,9; р=,0001. Анемия во время беременности выявлена в основной группе в 47,01 % (n=71), а в контрольной группе у 28,45% (n=35) пациенток, χ² 9,85; р=0,001 (Рис 4). Пролапс митрального клапана встречался с одинаковой частотой обеих группах и составил в 12,58 % (n=19) в основной и 8,77% (n= 10) в контрольной группе соответственно (Рис 4). У обследованных нами женщин диффузное увеличение щитовидной железы выявлено чаще в основной группе - у 17,88 % (n= 27) пациенток, в контрольной группе оно составило 9,75% (n= 12) наблюдений, однако, достоверной разницы выявлено не было (Рис.4). 56 Хр. панкреатит * ДЖВП * Язвенная болезнь желудка и 12ти перстной кишки Хр. гастрит * Контрольная группа Эутиреоидный зоб Основная группа ПМК Анемия * Артериальная гипертензия * 0% 10% 20% 30% 40% 50% *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис.4. Частота экстрагенитальной патологии у обследованных пациенток. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта, у пациенток в нашем исследовании чаще встречался хронический гастрит. В основной группе он выявлен у 43,70 % (n=66) пациенток, тогда как в контрольной группе этот показатель оказался в два раза ниже и составил 21,13% (n=26) всех наблюдений. При сравнении двух групп по данному признаку выявлена достоверная разница: χ² 15,48; р=0,0001 (Рис .4). Язвенная болезнь желудка встречалась редко и выявлена только у двух пациенток, как в основной группе, так и в контрольной (Рис .4). На втором месте среди заболеваний ЖКТ оказалась дискинезия желчевыводящих путей. У пациенток основной группы частота встречаемости составила 13,90 % (n= 21), в контрольной группе эта патология наблюдалась достоверно реже, у двух пациенток, и составила 1,62% : χ² 15,6; р=0,0001(Рис .4). Заболевания поджелудочной железы встречались чаще у женщин основной группы в 11,25% (n=17) , в контрольной группе выявлены в 1,62% (n=2) , что также оказалось достоверно: χ² 9,7; р=0,0001 (Рис .4). 57 Наличие в организме очагов хронической инфекции во время беременности может привести к внутриутробному инфицированию плода с последующим формированием пороков развития и прерыванием беременности, особенно в первом триместре (65). В нашем исследовании наиболее часто среди хронических заболеваний ЛОР органов был выявлен хронический тонзиллит. У пациенток основной группы он встречался достоверно чаще: в 41,05% (n=62) наблюдений, в контрольной группе - у 26,01% (n =32)пациенток: χ² 6,8; р=0,009 (Рис 5). Количество различным пациенток с хроническим бронхитом также было при сравнении двух групп. У женщин основной группы эта патология выявлена в 9,27% (n=14) наблюдений, в контрольной группе хроническим бронхитом страдали всего 3 пациентки (2,43%). Коэффициент достоверности составил χ² 5,1; р=0,01. Это может быть связано с тем, что в основной группе было большее количество курящих женщин (Рис 3). 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% * * * Основная группа Контрольная группа *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис.5. Хронические воспалительные заболевания дыхательной и мочевыделительной системы у обследованных пациенток. Обращает на себя внимание частая встречаемость воспалительных заболеваний мочевыделительной системы у обследованных нами пациенток. На наличие хронического цистита указали 38,41 % (n=58) женщин основной группы, по сравнению с пациентками контрольной группы, где хроническое воспаление мочевого пузыря выявлено в 10,56% (n=13) 58 наблюдений, установлена высокая достоверная разница между группами: χ² 27; р=0,0002 (Рис 5). С одинаковой частотой у пациенток обеих групп встречался хронический пиелонефрит, он составил 15,89% (n=24) в основной и 13% (n=16) в контрольной группе соответственно (Рис. 5). Анализируя приведенные выше данные, можно утверждать, что пациентки основной группы достоверно чаще пациенток контрольной группы оказались подвержены различной экстрагенитальной патологии. Другим значимым условием нормального течения беременности является репродуктивное здоровье женщины. Нормальный гормональный фон женщины является основой для формирования и развития беременности. В случае нарушения соотношения гормонов в организме, увеличения синтеза эстрогенов возникают многие гормонозависимые заболевания (68, 72). Дисфункция яичников выявлена у пациенток основной группы в 9,56% (n=14) случаев, в контрольной группе этот показатель соответствовал 7,37% (n=9), достоверной разницы не было. Одинаково редко в обеих группах имели место случаи поликистоза и апоплексии яичников. Миома матки у пациенток основной группы выявлена в большем проценте - 22,51 % (n= 34), чем в контрольной группе 7,31 % (n=9), что было статистически достоверным: χ² 11,8; р=0,0006 (Рис.6). Что касается наружного эндометриоза, то в основной группе на его наличие указали всего две пациентки, тогда как в контрольной группе эта патология не наблюдалась вовсе. Возможно, отсутствие данного заболевания в группах объясняется тем, что для наружного эндометриоза наиболее характерным симптомом является бесплодие, а проблем с фертильностью у женщин в нашем исследовании выявлено не было (Рис.6). 59 Дисфункция яичников Поликистоз яичников Апоплексия яичника * Миома матки Наружный эндометриоз Контрольная группа Аденомиоз * Мастопатия, фиброаденома Основная группа * Гиперпластические процессы эндометрия Эктопия шейки матки Рубцовая деформация шейки матки 0% 10% 20% 30% 40% *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 6. Частота заболеваний женских половых органов и молочных желез у обследованных пациенток. Количество пациенток с аденомиозом в основной группе значительно превышало таковое в контрольной группе и составило 21,19 % (n=32) и 4,06% (n=5) соответственно, при проверке критерия значимости были выявлены достоверные различия: χ² 17,2; р=0,0001 (Рис.6). Такая патология молочных желез, как мастопатия и фиброаденома, также выявлена у пациенток обеих групп. В нашем исследовании превалировала тенденция к повышенному показателю этих заболеваний в основной группе, что составило 19,86 % (n=30), в контрольной же группе заболевания молочных желез встречались достоверно реже - у 8,94% (n=11 ) обследованных женщин: χ² 6,3; р=0,01 (Рис.6). В единичных случаях выявлены перенесенные ранее гиперпластические процессы эндометрия, в основной группе на них указали 60 6 женщин (3,97%), в контрольной группе показатель оказался еще ниже и составил 1,62 % (n=2), статистического различия не наблюдалось (Рис.6). По частоте встречаемости эктопии шейки матки в процентном соотношении также не выявлено различий между двумя группами, что составило в основной группе 30,73% (n=46) пациенток и контрольной- 28,94% (n=36) соответственно (Рис.6). Наличие рубцовой деформации шейки матки в результате разрывов в родах выявлено у 19 пациенток основной группы -12,58% , в контрольной группе этот показатель был ниже и составил 5,69 % (n=7), однако достоверной разницы при сравнении двух групп нами не установлено (Рис.6). Принимая во внимание, что у пациенток основной группы значительно чаще, чем в контрольной, имели место такие заболевания как миома матки, аденомиоз, патология молочных желез, можно предположить наличие взаимосвязи между неблагоприятными исходами беременностей у женщин в основной группе с отягощенным гинекологическим анамнезом. Другим важным критерием оценки репродуктивного здоровья является наличие хронических воспалительных заболеваний органов малого таза. Известно, что персистирующие инфекционные процессы половых органов ставят под угрозу нормальное течение беременности (65). Так, при наличии хронического цервицита возникает риск восходящего инфицирования плода. При эндометрите происходит повреждение эндометрия, что приводит к нарушению имплантации плодного яйца, возникновению антигенной агрессии материнского организма против клеток эмбриона, как чужеродных (22,27). Наличие хронического очага инфекции в придатках матки может привести к неполноценности формирующегося желтого тела, что повышает риск потери беременности (68). 61 В нашем исследовании у пациенток основной группы хронический цервицит был выявлен в 4 раза чаще, чем в контрольной группе: в 22,51% (n=34) и 5,69% (n=7) наблюдений соответственно. Достоверная разница составила χ² 15; р=0,0001 (Рис. 7). 30% 25% * * 20% * 15% Основная группа Контрольная группа 10% 5% 0% Хронический цервицит Эндометрит Хронический сальпингоофорит *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 7. Частота воспалительных заболеваний органов малого таза у обследованных пациенток. В нашем исследовании пациентки основной группы были чаще подвержены хроническим воспалительным заболеваниям придатков матки , по сравнению с контрольной. Процентное соотношение составило 29,13 % (n=44) и 17,88 % (n=22) соответственно. При сравнении двух групп разница была достоверна: χ² 4,69; р=0,03 (Рис. 7). Согласно приведенным выше данным, очевидно, что обследованные нами женщины в основной группе страдали хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза достоверно чаще пациенток контрольной группы. Это говорит о разнице в репродуктивном здоровье между рассматриваемыми группами женщин и объясняется включением в основную группу пациенток с заведомо отягощенным гинекологическим анамнезом. При проведении комплексной оценки репродуктивного здоровья женщины немаловажную роль играет выявление нарушений микрофлоры влагалища и наличие инфекций, передающихся половым путем. 62 Одним из распространенных нарушений нормального микробиоценоза влагалища является бактериальный вагиноз (2). У пациенток в нашем исследовании он встречался значительно чаще в основной группе, в 38,41 % (n=58) наблюдений, а женщины контрольной группы были почти в четыре раза реже подвержены этой патологии – 8,13% (n=10), с достоверной разницей: χ² 33; Бактериальный вагиноз р=0,0001 (Рис. 8). * Кандидоз * ВПГ * ВПЧ Контрольная группа Основная группа * ЦМВ Хламидиоз 0% 20% 40% 60% 80% 100% *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис.8. Частота нарушений микробиоценоза влагалища и инфекций, передающихся половым путем у обследованных пациенток. Как результат дисбиотических процессов наружных половых органов у женщин в нашем исследовании наиболее часто имел место кандидоз. У пациенток основной группы выявлено превалирование данной патологии, что составило 86,09 % (n=130) наблюдений, а в контрольной группе этот показатель был достоверно ниже и составил около 52% (n=64). Коэффициент достоверности соответствовал χ² 38; р=0,000001 (Рис. 8). Инфекции, передающихся половым путем, также могут в разной степени негативно влиять на течение беременности. В частности, вирусное поражение зачастую приводит к внутриутробному инфицированию и в результате повышает риск НБ (71). 63 На первом месте по частоте инфицирования у обследованных нами женщин находился вирус простого герпеса. В основной группе на его носительство указало почти в два раза больше пациенток, чем в контрольной, что составило 69,53% (n=105) и 39,02% (n=48) соответственно. Статистическая разница была достоверна χ² 25; р=0,00001 (Рис.8). У пациенток основной группы также достоверно чаще было выявлено носительство вируса папилломы человека различных типов. У женщин в основной группе носительство ВПЧ отмечено у 23,84 % (n= 36), в контрольной группе - всего у 13,82 % (n=17). При сравнении двух групп разница оказалась достоверной χ² 4; р=0,03 (Рис.8) Носительство цитомегаловирусной инфекции в основной группе составило 13,90 % (n= 21), в контрольной группе этот показатель был ниже 10,56% (n=13), однако достоверной разницы выявлено не было (Рис.8). Среди инфекций, передающихся половым путем, пациентки нашего исследования указали на перенесенный в анамнезе хламидиоз. Несмотря на частоту встречаемости в основной группе в 21,19 % (n=32) наблюдений, а в контрольной группе - почти в два раза реже – у 12,19 % (n=15) наблюдений, при сравнении достоверной статистической разницы установлено не было (Рис.8). Исходя из вышеперечисленного, ясно, что группы у пациенток основной в анамнезе значительно чаще имели место бактериальные инфекции гениталий. Эти результаты вирусные и объясняются включением в основную группу пациенток с заведомо неблагополучным акушерско-гинекологическим анамнезом. При оценке количества перенесенных гинекологических операций было установлено, что коагуляция шейки матки по поводу эктопии шейки матки была проведена 39,73 % (n=60) пациенткам основной группы, против 31,70% (n=39) в контрольной группе, в результате сравнения двух групп достоверной разницы не выявлено. 64 Также несколько пациенток в обеих группах в анамнезе перенесли раздельное диагностическое выскабливание слизистой матки по поводу патологии эндометрия. Оперативное лечение по поводу апоплексии яичника в объеме резекции яичника было выполнено всего двум пациенткам в основной и двум в контрольной группах. Таким образом, по анамнезу перенесенных гинекологических операций обе группы статистически не различались. В нашем исследовании мы провели сравнение частоты приема оральных контрацептивов пациентками обеих групп с целью контрацепции и лечения гинекологических заболеваний до беременности. По полученным результатам установлено, что больше половины женщин основной группы использовали гормональные контрацептивы, на их прием указали 68,87% (n=104). В контрольной же группе пациентки достоверно реже принимали оральные контрацептивы, их количество составило 41,46% (n=51). Выявлена достоверная разница: χ² 20,7; р=0,00001 (Рис. 9). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% * * * * * Основная группа Контрольная группа *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 9. Частота приема препаратов обследованными пациентками до и вовремя беременности. 65 Для уточнения характера течения беременностей у пациенток основной и контрольной групп мы посчитали необходимым сравнить частоту приема различных препаратов во время гестации. Препараты из класса гестагенов в составе терапии, направленной на пролонгирование беременности, были назначены большинству пациенток в основной группе, их количество соответствовало 56,94% (n=88), в контрольной группе этот показатель составил 14,63% (n=18) наблюдений, при сравнении выявлена высокая достоверная разница: χ² 51,5; р=0,000001 (Рис. 9). В группах обследованных нами женщин отличалась частота приема препаратов, содержащих магний. В основной группе подавляющее большинство пациенток - 74,17 % (n=112) во время беременности принимали препараты магния, в контрольной группе также достаточно часто выявлено употребление этих препаратов – 55,28 % (n=55), коэффициент достоверности при сравнении групп составил: χ² 10,7; р=0,001 (Рис. 9). Витамин Е во время беременности принимали женщин 92,71 % (n= 140) основной группы, в контрольной группе также большинство пациенток указали на прием этого препарата 78,15% ( n=93), χ² 12; р=0,0006 (Рис.9). Наибольшая разница между исследованными группами установлена в приеме антиагрегантов. В основной группе эти препараты принимали 68, 87% (n=104) беременных пациенток, тогда как в контрольной группе на прием антиагрегантов во время беременности указали всего 2 женщины, что соответствовало 1,62%, достоверная разница составила: χ² 129,2; р=0,0000001 (Рис. 9). Все перечисленные лекарственные средства применяются в акушерстве и гинекологии с целью лечения угрозы прерывания беременности и пролонгирования гестации (71). Основную группу в нашем исследовании составили женщины с одним или несколькими эпизодами потерь беременности в анамнезе. Очевидно, что столь высокая разница в приеме 66 этих препаратов, в сравнении с контрольной группой, обусловлена заведомо неблагоприятным течением гестации у этих пациенток. Назначение же этих препаратов пациенткам в контрольной группе при незначительных тянущих болях внизу живота и при отсутствии эпизодов кровяных выделений может объясняться современным подходом к ведению беременности - назначение не всегда оправданного количества лекарств с профилактической целью. Немаловажным критерием здоровья женщины и перспективы вынашивания беременности является репродуктивный анамнез. Среди обследованных нами пациенток было незначительное количество женщин, прошедших лечение от бесплодия. В основной группе бесплодием страдали 4,63% пациенток (n=7), в группе контроля эта патология диагностирована только у 2 женщин, что соответствовало 1,62%, достоверной разницы выявлено не было. Основную патологию беременности в нашем исследовании составило привычное невынашивание. У пациенток основной группы привычное невынашивание наблюдалось в 53,64% (n=81) случаев. Для контрольной группы наличие эпизодов репродуктивных потерь в целом и привычного невынашивания в частности являлось критерием исключения. В ходе сбора анамнеза выявлено различие между пациентками обеих групп по общему числу беременностей. В основной группе среднее количество беременностей составило 3,480,27, тогда как в контрольной группе оно составило 2,710,1 с достоверной разницей: t=4,05;p=0,000067 (Рис. 10). Количество беременностей, закончившихся родами, также отличалось между группами. Для основной группы средний показатель составил 0,800,06. В контрольной группе наблюдалось значительно большее количество благополучных беременностей, среднее количество родов 67 колебалось в пределах 2,230,06, что было статистически достоверным: t=15, 44;p=0,0000001 (Рис.10). 4 * 3,5 3 * 2,5 * 2 Основная группа 1,5 Контрольная группа 1 0,5 0 Количество беременностей Количество родов Количество прервавшихся беременностей Количество абортов *Различия статистически достоверны, р<0,05 Рис. 10. Характеристика репродуктивной функции обследованных пациенток. В анамнезе у пациенток, включенных в исследование, присутствовали аборты. Количество беременностей, прерванных по желанию пациентки в обеих группах статистически не отличалось. Для основной группы этот показатель составил 0,550,09, в контрольной группе он оказался чуть меньше и составил около 0,450,08 (Рис.10). В ходе анализа реализованности репродуктивной функции обследованных нами женщин было установлено статистически значимое превалирование количества беременностей у пациенток основной группы. Все пациентки в основной группе имели в анамнезе как минимум 2 эпизода потери беременности, при отсутствии таковых в контрольной группе. Однако количество родов в основной группе оказалось в разы ниже, чем в контрольной, в которой превалировало число благополучно доношенных беременностей. Это также обусловлено критериями включения пациенток в группы. Отдельно мы считали необходимым провести характеристику прервавшихся беременностей у пациенток основной группы по сроку гестации на момент поступления в стационар и размеру плодного яйца. 68 Принимая во внимание, что в гестационном сроке до 7 недель основной причиной потери беременности являются аномалии кариотипа плода, с целью сведения к минимуму вероятности наличия этой патологии, критерием отбора женщин в основную группу оказался срок на момент гибели плодного яйца более 7 недель. В исследование также не были включены случаи анэмбрионии и беременности, наступившие в результате ЭКО. Таким образом, срок беременности у пациенток основной группы составил в среднем 11,550,27 недели, при этом размер плодного яйца, установленный при УЗИ исследовании, колебался в пределах 9,730,27 недель. Подводя итог анализу клинической характеристики обследованных пациенток нужно отметить, что такие вредные привычки , как табакокурение и частое употребление алкоголя, повышают риск развития многих заболеваний различных органов и систем. склонность В случае, когда к ним имеет беременная женщина, под угрозу ставится как нормальное развитие эмбриона, так и течение самой беременности. Курение во время беременности вызывает гипоксию в тканях, повышает риск формирования различных пороков развития и невынашивания беременности (71). Алкоголь в высоких дозах оказывает токсическое воздействие на весь организм и может нарушить нормальное течение беременности (43). Достоверно чаще пациентки основной группы в нашем исследовании имели склонность к перечисленным вредным привычкам, что может обуславливать большую их предрасположенность к соматическим заболеваниям и оказать косвенное влияние на неблагоприятный исход беременности. Сильным дестабилизирующим фактором для организма является стресс (1). В условиях жизни в мегаполисе, высокого уровня психоэмоционального напряжения современные хронического защитных женщины часто находятся в условиях эмоционального стресса, что приводит к истощению ресурсов организма. Все это доказано способствует 69 формированию психосоматических и органических нарушений в организме. Необходимо отметить, что одним из разрушающих механизмов воздействия стресса является увеличение свободнорадикального окисления и накопления активных форм кислорода (1). Таким образом, стресс неблагоприятно влияет и на течение беременности, и женщины именно основной группы нашего исследования указали на чрезмерное присутствие стресса в их жизни, включая период гестации. Что касается экстрагенитальной патологии, то общее соматическое здоровье женщин в основной группе оказалось хуже, чем в контрольной. Заболевания различных органов и систем также приводят к осложненному течению беременности. Нарушение жирового обмена, артериальная гипертензия, эутиреоидный зоб, заболевания желудочно-кишечного тракта, чаще наблюдались у пациенток основной группы. Персистенция очагов хронического воспаления экстрагенитальной локализации может также неблагоприятно влиять на развитие беременности, приводя к системной интоксикации в результате обострения, либо к внутриутробному инфицированию (71). В нашем исследовании у пациенток основной группы чаще, чем в контрольной, встречался хронических бронхит, что может быть обусловлено большим процентом курящих женщин в этой группе. Воспалительные заболевания мочевыделительной системы также чаще наблюдались в основной группе, что коррелирует и с большим процентом инфекций половых органов у этих пациенток. Другим критерием характеристики репродуктивного здоровья является гинекологический анамнез. Что касается гинекологической патологии, то такие заболевания, как миома матки, аденомиоз, фиброзно-кистозная мастопатия, в основной группе выявлены у большего числа пациенток. Отдельно стоит отметить наличие у пациенток заболеваний половых органов, обусловленных инфекционным фактором. Так, инфекции, передающиеся половым путем, персистирующие в организме во время беременности, могут приводить к дефектам имплантации плодного яйца, к 70 внутриутробному инфицированию и, как следствие, к различных пороков развития исследовании пациентки и потери основной формированию беременности (72). В нашем группы указывали на наличие хронических воспалительных заболеваний внутренних и наружных половых органов значительно чаще, чем пациентки контрольной группы. Также среди инфекций, передающихся половым путем, в основной группе в анамнезе наблюдался чаще хламидиоз. При сравнении фертильности у пациенток обеих групп установлено, что в основной группе наблюдалось превалирование числа беременностей, однако количество родов было значительно ниже. Также в основной группе превалировало число прервавшихся беременностей и случаев привычного невынашивания, что группу. обусловлено критериями включения пациенток в В контрольной же группе наоборот количество родов было приближено к числу беременностей, при полном отсутствии репродуктивных потерь, что также объясняется критериями отбора. Терапия, направленная на пролонгирование беременности чаще назначалась пациенткам в основной группе, это связано с отягощенным течением беременности у женщин этой группы. Препараты для сохранения беременности с меньшей частотой, но назначались и пациенткам контрольной группы, что может объясняться современными подходами к ведению беременности врачами женских консультаций и назначением данной терапии даже в случае незначительных тянущих болей внизу живота при полном отсутствии симптомов угрозы прерывания беременности. Подводя итог, можно утверждать, что по уровню заболеваемости группы оказались неоднородными. В нашем исследовании мы не ставили задачу установить конкретную причину репродуктивных потерь у пациенток основной группы, нашей целью было выявить генетические факторы предрасположенности к невынашиванию беременности, которые могут являться одновременно и факторами развития различной соматической патологии. 71 Глава 4. Результаты проведенных исследований. 4.1 Роль полиморфизма гена обмена катехоламинов (СОМТ) в течении и прогнозе беременности. Стресс является эволюционно заложенным механизмом ответа организма на неблагоприятное воздействие извне (50). По данным современной литературы стресс возникает как при экстремальном, так и при обычном воздействии экзогенных и эндогенных факторов (50). Экстремальное воздействие на организм может протекать по двум временным критериям: кратковременный стресс и длительный стресс. Стресс является важнейшим приспособительным механизмом, однако в условиях хронического длительного воздействия даже слабого дестабилизирующего фактора развивается истощение защитных ресурсов организма с нарушением функций всех органов и систем (13). Среди агентов, вызывающих стресс, выделяют физиологические и психологических стрессоры (13, 50). В 1936 году Г. Селье впервые описал три стадии развития стресса: стадия тревоги, стадия резистентности и стадия истощения. При первой стадии в процесс вовлекается триада стресса: иммунная система, надпочечники и желудочно-кишечный тракт, происходит мобилизация защитных систем организма, и в зависимости от силы стрессового фактора организм либо справляется с возникшей угрозой, либо может погибнуть. Вторая стадия характеризуется адаптацией к стрессору, повышению всех защитных резервов стабилизацией организма, что способствует эффективной борьбе с негативным воздействием без значительного вреда для него (63). В случае развития третьей стадии, именуемой истощением, в условиях длительного воздействия стресса, несмотря на повышенный уровень адаптивных процессов происходит постепенное истощение защитных резервов, с постепенным нарушением функций организма вплоть до гибели (50, 63). 72 Основными активными веществами, отвечающими за адаптацию во время стресса, являются катехоламины. Они проявляют двойственные функции, являются гормонами, регулирующими все звенья обмена веществ в организме, а также играют роль нейромедиаторов в передаче сигнала между клетками (49). Являясь биогенным моноаминами, катехоламины осуществляют химическую регуляция межклеточных взаимодействий, активируя систему гипоталамус-гипофиз-надпочечники, обеспечивая протекание адаптивных реакций. К катехоламинам относятся адреналин, норадреналин и дофамин, синтез которых происходит преимущественно в мозговом веществе надпочечников по следующей схеме: норадреналин – адреналин. (13). тирозин - ДОФА - дофамин - Выработка катехоламинов является неспецифической приспособительной реакцией на изменение внутренней и окружающей среды. В условиях стресса эти вещества выбрасываются в кровь, что позволяет повысить выносливость и мобилизовать резервы организма путем изменения функционального состояния органов и повышения метаболизма в тканях (13). Физиологическая активность катехоламинов обусловлена способностью связываться со специфическими восприимчивыми структурами в эффекторной клетке- адренорецепторами, потенцируя ответ в органах - мишенях (50). Существует 2 подвида рецепторов: α- и β- адренорецепторы. В зависимости от степени сродства катехоламинов к адренорецепторам разных типов различается и характер их биологической активности (50). Адреналин «гормон тревоги» взаимодействует с обоими видами рецепторов и вызывает сужение сосудов кожи и слизистых оболочек, скелетной мускулатуры, органов брюшной полости, однако на сосуды головного мозга действует как вазодилататор, менее выраженный прессорный эффект связан с возбуждением не только α1 и α2 -рецепторов, но и β2- адренорецепторов сосудистой стенки. При взаимодействии с β2- адренорецепторами также происходит расслабление скелетной мускулатуры, бронхов и кишечника. Напротив, норадреналин 73 обладает значительно большим прессорным и сосудосуживающим воздействием, приводя к повышению артериального давления. Среди функций катехоламинов следует выделить их способность связываться с тромбоцитами и белками плазмы, приводя к гиперкоагуляции, что в сочетании с сосудосуживающим эффектом при чрезмерном содержании катехоламинов в крови может сопровождаться нарушением трофики тканей и органов (13, 50). Учитывая тесную физиологических взаимосвязь процессов с течения механизмами всех биохимических наступления и и течения беременности, следует отметить влияние катехоламинов на функциональное состояние миометрия (9). Иннервация матки осуществляется путем взаимодействия симпатических и парасимпатических нервных волокон, оказывающих неодинаковое влияние на функциональное состояние миометрия, однако совместно реализующих главную задачу: Функционирование сохранение обеих либо подсистем прерывание подчиняется беременности. нервным центрам гипоталамуса и спинного мозга, располагающимся вблизи центра регуляции психосоматической функции, что объясняет их взаимное влияние друг на друга (15). Так, чрезмерное возбуждение психосоматического центра в результате психологическое напряжения, тревоги, хронического стресса, могут привести к дисбалансу между симпатической и парасимпатической нервной системой (13, 63). Основными нейромедиаторами, отвечающими за передачу нервных импульсов в синапсах нервных волокон миометрия, являются катехоламины (9, 15). Характер воздействия определяется типом выделяемого медиатора, плотностью и типом расположения рецепторов в мышечных клетках миометрия. Норадреналин преимущественно воздействует на α- адренорецепторы, вызывая тем самым повышение возбудимости миометрия, усиление тонуса и сократительной активности матки (15). Наоборот, возбуждение β- адренорецепторов сопровождается токолизом, снижением 74 возбудимости миомерия, приводящего к расслаблению матки. Поскольку адреналин способен связываться с α- и с β- адренорецепторами, он может оказывать разнонаправленное воздействие на тонус матки (15). Сосудосуживающая функция катехоламинов может приводить к спазму сосудов матки, а в гиперкатехоламинемии комплексе может с гиперкоагуляцией сопровождаться в условиях нарушениями трофики, приводящей в конечном итоге к неполноценности инвазии трофобласта. Чрезмерный спазм сосудов матки приводит к нарушению инвазии спиральных артерий, что обуславливает формирование плацентарной недостаточности и в условиях дисбаланса вазоконстрикторов и вазодилататоров сопровождается развитием многих осложнений беременности вплоть до ее потери (9, 38). В условиях современной окружающей среды организм беременной женщины находится под постоянным воздействием стрессоров различного происхождения. активность Чрезмерная женщин, психоэмоциональная связанная с и напряженной интелектуальная профессиональной деятельностью во время беременности, обуславливает формирование стойкого хронического стрессового фона (63). Социальные и экономические проблемы, неблагополучная обстановка в семье - все это приводит к хронизации стресса и реализации связанных с ним повреждающих действий на организм матери и плода (71, 72). В организме функцию распада и элиминации катехоломинов выполняет моноаминоксидаза (МАО) и цитозольный метилтрансфераза (СОМТ) (49). КОМТ катехоламинов с аденозилметионина присоединением (80). Ген к СОМТ, фермент катехол-О- принимает участие в реакции ним метильной кодирующий группы от S- катехол-О- метилтрансферазу, располагается на 22 хромосоме (80). 75 Стресс Кора головного мозга Полиморфизм гена СОМТ, Гипоталамус экспрессия сниженной активности катехол-Ометилтрансферазы Нормальная структура гена СОМТ Полноценный фермент катехол-Ометилтрансфераза Мозговое вещество надпочечников фермента катохол-ометилтрансферазы надпочечников Катехоламины (дофамин, норадреналин, адреналин) Катализация катехоламинов, баланс уровня катехоламинов в организме Накопление катехоламинов, нарушение их распада и элиминации α- адренорецепторы β- адренорецепторы Вазоспазм, ухудшение перфузии тканей, повышение тонуса матки Гиперкоагуляция Вазодилатация, Снижение тонуса матки Нарушение инвазии трофобласта, плацентарная недостаточность Рис.11. Влияние стресса на течение беременности в зависимости от активности фермента катехол-о-метилтрансферазы Фермент дикого типа СОМТ обеспечивает адекватную катализацию катехоламинов, концентрации в результате нейромедиаторов чего в поддерживаются организме. физиологические Вариантные аллели, контролирующие синтез менее активного/стабильного фермента, могут быть сопряжены с дисбалансом уровня катехоламинов, особенно в условиях их гиперпродукции (98, 102, 107) . 76 Нами выведена патогенетическая схема взаимосвязи биохимических перестроек организма под влиянием стресса, связанных с накоплением катехоламинов, с развитием патологии беременности (Рис.11). Одним из полиморфных вариантов гена COMT, наиболее изученных и описанных в литературе является rs 4680 (G1947А), при котором происходит замена гуанина на аденин в 1947 положении, с заменой аминокислоты валина на метионин в структуре белка. Известно, что аллель G ассоциирован с более высокой активностью фермента катехол-О-метилтрансферазы, по сравнению с аллелем А (107). При проведении исследования одной из основных задач, стоящих перед нами, являлось изучение описанного выше полиморфизма гена СОМТ, как фактора неполноценной биохимической защиты организма беременной женщины при чрезмерной выработке катехоламинов. Согласно полученным данным, минорный аллель А в гомозиготном состоянии встречался у пациенток основной группы в 25 % случаев (n=37), в контрольной группе этот показатель оказался идентичным и составил 24,5 % (n=28), что не является статистически различным и приближено к общепопуляционным значениям для европеоидов- около 30%. Что касается гетерозиготного генотипа G/А, то в нашем исследовании он оказался наиболее часто встречающимся, что соответствует распределению в популяции - до 45%. Здесь также не было выявлено статистически значимой разницы между группами, среди пациенток с НБ гетерозиготы выявлены в 57,04 % (n= 85), против здоровых женщин, у которых этот показатель составил 42,47 % (n=48) (Рис. 12). Наиболее интересные данные получены нами при сравнении частот встречаемости гомозиготного генотипа G/G, отвечающего за экспрессию фермента катехол-О-метилтрансферразы с полноценной активностью, что позволяет рассматривать данный генотип, как благоприятный (Рис. 12). 77 60% 50% * 40% Основная группа 30% Контрольная группа 20% 10% 0% СОМТ G/G СОМТ G/А СОМТ A/A *Различия статистически достоверны, при р< 0,05. Рис.12. Распределение генотипов rs 4680 (G1947А) гена COMT у пациенток основной и контрольной групп. Так, в группе пациенток с репродуктивными потерями гомозигота G/G выявлена всего в 18 % случаев (n= 27), что оказалось почти в два раза ниже по сравнению со здоровыми женщинами, где аллель G в гомозиготном состоянии достигал 33% (n=37). Данная разница между группами была статистически достоверна: χ² =7,4, р=0,006 ( Рис. 12). Таким образом, можно утверждать, что среди здоровых женщин благоприятный генотип G/G встречается достоверно чаще и может играть протективную роль, защищая организм в условиях гиперпродукции катехоламинов, поддерживая их концентрацию на физиологическом уровне. Аллель А в гомозиготном состоянии можно соответственно рассматривать как рисковый аллель (доминантная модель). При проведении статистического анализа распределения генотипов полиморфизма в зависимости от сроков беременности по некоторым исследуемым генам, нами был выявлен рубеж 10 недель, до и после которого происходило изменение частот встречаемости генотипов, что указывало на изменчивость влияния того или иного аллеля на течение беременности на разных сроках гестации. Поэтому, нам представлялось интересным поделить 78 основную группу на 2 подгруппы: с потерей беременности до 10 недель и после 10 недель гестации и провести сравнение выделенных подгрупп с общим контролем для интересующего нас полиморфного варианта. В нашем исследовании мы провели сравнение пациенток с невынашиванием беременности с целью двух подгрупп установления изменения распределения генотипов относительно сроков гестации. Выявлено, что среди пациенток с репродуктивными потерями на сроке до 10 недель генотип А/А встречался в 24,05 % (n=19) наблюдений, что совпадало с распределением в группе контроля - 24,4 % (n=28). По частоте гетерозигот G/А также не наблюдалось существенной разницы, данный генотип выявлен у пациенток с потерей беременности до 10 недель в 55,7 % (n=44) случаев, в группе контроля этот показатель составил 42,47 % (n= 48), что достоверно не различалось. Также разницы не выявлено и по аллелю G в гомозиготном состоянии, данный генотип наблюдался у 20,2% (n=19) пациенток с потерей беременности на сроке менее 10 недель, в контрольной группе показатель составил 33 % (n= 37). Изменение частоты встречаемости генотипов на более ранних сроках беременности, по сравнению с общей основной группой пациенток с невынашиванием, может быть обусловлено тем, что на сроках гестации до 10 недель реализуются механизмы потери беременности, обусловленные грубыми генными мутациями самого плода. Данные анализа частоты распределения генотипов в подгруппе пациенток с потерей беременности после 10 недель гестации приведены на (Рис.13). На основании полученных результатов установлено, что гомозиготный генотип А/А в этой подгруппе встречался в 29% (n=26), что оказалось несколько выше, чем в группе общего контроля 24,4 % (n=28), и незначительно превышает результат по основной группе в целом, однако разница не являлась достоверной (Рис.13) 79 * 60% 50% 40% Основная группа 30% 20% Контрольная группа * 10% 0% СОМТ G/G СОМТ G/A СОМТ А/А *Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.13 Распределение генотипов rs 4680 (А1947G) гена СОМТ у пациенток при потере беременности на сроке более 10 недель. Гетерозиготный генотип G/А выявлен более чем у половины женщин с потерями беременности на сроке свыше 10 недель и составил 80% (n=52), у группы здоровых женщин этот показатель оказался на уровне 42,47 % (n= 48), однако показатели достоверно не отличались (Рис.13). Разница между пациентками с невынашиванием на сроке более 10 недель и здоровыми женщинами по частоте распределения генотипа G/G является статистически значимой. В основной подгруппе этот показатель составил 13 % (n=12), тогда как в группе контроля генотип G/G наблюдался значительно чаще – у 33% (n=37) здоровых испытуемых, установлена достоверная разница: χ² =10,31, р=0,0013 (Рис. 21). Превалирование гомозигот G/G в группе здоровых женщин подтверждает протективную функцию носительства данного генотипа в сравнении с группой пациенток с репродуктивными потерями, где фенотипически благоприятный генотип встречался более чем в два раза реже. Снижение частоты носительства протективного аллеля G с увеличением срока беременности в группе с НБ может объясняться более значимой ролью фермента СОМТ для течения беременности после 10 недель гестации. 80 С целью выяснения характера проявления наследуемого признака, нами был проведен аддитивный тест Кохрана-Армитажа. По результатам было установлено, что у пациенток основной группы имеется доминантная модель наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/А являются рисковыми по развитию невынашивания беременности у данных пациенток: χ² =5,47, р=0,02. Также нами установлено, что у пациенток носителей аллеля А в 1,61 раза выше шанс потери беременности в первой половине гестации, по сравнению с носителями аллеля G. (OR=1,61, р=0,02, 95% df= 1,06-2,43). По данным литературы (60, 98, 150) у носителей аллелей А rs 4680 гена СОМТ снижена активность фермента катехол-О-метилтрансферазы, который несет ключевую роль в процессе распада катехоламинов. Учитывая тот факт, что в нашей работе мы выявили ассоциацию полиморфизма rs 4680 с невынашиванием первой половины беременности, нам представляется интересным оценить экспрессию гена СОМТ. По вышеописанной методике нами была определена активность фермента катехол-О-метилтрансферазы у обследованных женщин. Установлено, что у носителей минорного аллеля А в гомозиготном состоянии наблюдалась самая низкая активность фермента 226,52 ± 79,18 мкмоль/мг; у женщин с гетерозиготным генотипом G/А активность фермента была достоверно выше и составила 335,88 ± 82,74 мкмоль /мг; а у носителей дикого генотипа G/G активность фермента была самой высокой 564,67 ± 156,77 мкмоль/мг. Полученные нами данные совпадают с популяционными значениями и соответствуют данным литературы (98, 150). При анализе полученных результатов мы установили, что у женщин контрольной группы с аллелем А в гомозиготном состоянии уровень активности фермента достоверно выше, чем у основной группы - 256,02 ± 65,12 и 204,19 ± 82,32 мкмоль /мг соответственно (t=-2,74, p=0,008). Полностью аналогичная ситуация выявлена и у носителей гетерозигот G/А 318,19 ± 72,3 мкмоль/мг в основной группе и 367,34 ± 91,05 мкмоль /мг в 81 контрольной; данные показатели так же достоверно отличались (t=-3,42, p=0,0008). мкмоль гвоякола/мг 800 * 700 600 500 * 400 * 300 200 100 0 СОМТ А/А Основная группа СОМТ A/G СОМТ G/G Контрольная группа * Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.14. Средняя активность катехол-О-метилтрансферазы у женщин основной и контрольной групп в зависимости от генотипа rs 4680 (А1947G) гена СОМТ. При сравнении активности фермента у пациенток с гомозиготным генотипом по аллелю G оказалось, что у женщин с невынашиванием беременности средняя активность фермента составила 474,47 ± 95,64 мкмоль /мг, что было достоверно меньше, чем у здоровых женщин 630,49 ± 160,78 мкмоль /мг (t=-4,49, p=0,00009) ( Рис.14). Для оценки взаимосвязи активности фермента катехол-О-метилтрансферазы и невынашивания беременности, мы сравнили среднюю активность у женщин основной и контрольной групп (Рис.15). В нашем исследовании средняя активность фермента катехол-Ометилтрансферазы у женщин, страдающих привычным невынашиванием беременности, оказалась достоверно ниже, чем у женщин контрольной группы (t=-5,68, p=0,0000). 82 600 мкмоль гвоякола/мг 500 * 400 300 200 100 0 Основная группа Контрольная группа * Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.15. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин основной и контрольной групп. На основании приведенных выше данных можно сделать вывод о взаимосвязи пониженной активности фермента катехол-о-метилтрансферазы с риском невынашивания первой половины беременности. Для обеих изученных групп показано также наличие генетически обусловленного изменения активности фермента: наименьшая активность выявлена у носителей генотипа А/А, наибольшая активность – у носителей генотипа G/G. Нам было интересно также проследить частоту встречаемости эстроген зависимых гинекологических заболеваний у обследованных пациенток в зависимости от генотипа rs 4680 гена СОМТ. Выявлено, что миома матки достоверно чаще наблюдалась у группы пациенток носителей аллеля А (в гомозиготном и гетерозиготном состоянии), χ² =13,35, р=0,0003, также достоверно ассоциированного с невынашиванием в данной группе пациенток. 83 100% * * * 80% 60% А/А +G/А 40% G/G 20% 0% Миома матки Аденомиоз ФКМ * Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.16. Распределение частоты встречаемости эстрогензависимых заболеваний в зависимости от генотипа rs 4680 гена СОМТ. Что касается аденомиоза, то у пациенток с генотипом А/А и G/А также наблюдалось значительное превалирование данного заболевания, по сравнению со здоровыми женщинами, χ² =12,78, р=0,0004. Фибрознокистозная мастопатия выявлена в подавляющем большинстве (более 90%) у носителей гомозиготы А/А и гетерозиготы G/А, тогда как среди группы контроля практически не встречалась, χ² =28,71, р< 0,0001 (Рис.16). Вышеперечисленные данные подтверждают наличие у пациенток основной группы склонности к гиперэстрогении, что может косвенно являться предрасполагающим фактором для развития невынашивания беременности. В ходе нашего исследования мы также изучили ассоциацию носительства аллелей rs 4680 гена СОМТ с риском развития экстрагенитальной патологии у обследованных пациенток. Установлено, что в группе пациенток с нормальным гемоглобином генотип G/G выявлен в 32,69 % (n=51) наблюдений, а у пациенток с анемией- всего у 12,22 % (n=13) пациенток, χ² =5,04, р=0,03 (Рис.17). Гетерозиготный генотип G/A примерно в равном проценте наблюдался в обеих группах, как с наличием анемии, так и при нормальном гемоглобине – у 47,43% (n=74) и 55,66 % (n=59), разница не была достоверна (Рис.17). 84 * 60% 50% * 40% Группа пациенток с анемией 30% Группа пациенток с нормальным гемоглобином 20% 10% 0% СОМТ G/G СОМТ G/A СОМТ A/A Рис.17. Распределение генотипов rs 4680 (А1947G) гена COMT у пациенток с анемией во время беременности Что касается минорного генотипа А/А, то среди пациенток с анемией он выявлен в 32,07% (n=34), тогда как среди пациенток с нормальным гемоглобином наблюдался в 19,87% ( n=31) наблюдений, что было достоверно различно: χ² =14,27, р=0,002 (Рис.17). С целью выяснения характера проявления наследуемого признака, нами был проведен аддитивный тест Кохрана-Армитажа. Было установлено, что у пациенток с анемией наблюдается доминантная модель наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/А являются рисковыми по возникновению анемии во время беременности: χ² =13,65, р=0,002. При оценке рисков установлено, что у носителей аллеля А в 1,93 раза выше шанс развития анемии во время беременности, по сравнению с носителями аллеля G. (OR=1,93, р=0,02, 95% df= 1,34-2,8). 4.2 Роль полиморфизма гена фермента эксцизионной репарации ДНК (OGG1) в течении и прогнозе беременности. Поскольку все процессы, структурой молекулы происходящие в клетке, связаны со ДНК, поддержание ее целостности играет крайне важную роль в обеспечении гомеостаза организма (57). 85 Система репарации, то есть восстановление повреждений в молекуле ДНК, функционирует благодаря множеству механизмов от простых (фотореактивация, деалкилирование) до многоэтапных, функция которых осуществляется под контролем множества генов (57, 80). Одним из наиболее сложных путей репарации, реализующимся по аналогии с оперативным вмешательством в молекулу ДНК, является каскад реакций эксцизионной репарации (base excision repair, BER). Мишенью для системы BER являются алкилированные, неправильно спаренные и другие основания, внутриклеточные радикалы кислорода и другие генотоксические соединения. В процессе репарации первым звеном является распознавание дефектных оснований высоко специфическими ферментами гликозидазами (57). Основным ферментом эксцизионной репарации ДНК является 8оксогуанин-ДНК-гликозилаза (OGG1), осуществляющая элиминацию из молекулы ДНК окисленных оснований, которые, как известно, образуются под действием активных форм кислорода (8). Его функция реализуется благодаря вырезанию из молекулы ДНК мутантного окисленного основания 8-oxoG, активно участвующего в развитии многих патологических процессов, включая канцерогенез (24). Фермент OGG1 обладает двумя функциями, с одной стороны проявляя себя как гликозилаза, с другойапуриновая/апиримидиновая (регион АР) лиаза. Процесс репарации ДНК под действием OGG1 происходит в два этапа: первый- гидролиз гликозидной связи 8-oxoG , на втором этапе происходит расщепление связи в регионе АР (80). Таким образом, при участии фермента OGG1 реализуются важнейшие процессы поддержания первозданной структуры молекулы ДНК, благодаря чему организм защищается от мутагенного воздействия со стороны генотоксических веществ (7). Однако, в условиях недостаточности системы репарации в клетке накапливаются мутации, приводящие к развитию многих соматических заболеваний (141, 164). Ген OGG1, кодирующий фермент 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазу, располагается на 3 хромосоме (24). Изменения в структуре гена с 86 формированием полиморфного варианта могут сопровождаться экспрессией неполноценного фермента, что приводит к снижению защитной системы репарации ДНК и уязвимости организма перед возникающими мутагенами. Полиморфизм гена OGG1 ассоциирован с риском развития онкологических заболеваний различной локализации (95, 96, 164). Проблема мутагенеза особенно актуальна для организма во время беременности, так как в условиях нарушения механизмов репарации под удар ставится как материнский организм, так и формирующиеся клетки и ткани нового дочернего организма, однако взаимосвязь невынашивания беременности с носительством полиморфных вариантов гена OGG1 в литературе не описана. Объектом нашего исследования как раз являлось изучение влияния полиморфизма гена OGG1 на течение беременности I и II триместра. Наиболее изученным является однонуклеотидный полиморфизм rs1052133 (С977G) гена OGG1, приводящий к замене цитозина на гуанин, что сопровождается изменением в строении белка с заменой аминокислоты серина на цистеин (163). По данным литературы, носительство аллеля С ассоциировано со снижением активности фермента 8-оксогуанин-ДНК- гликозилазы (90). Нам представляется интересным изучение распределений генотипов данного полиморфизма у женщин с невынашиванием первой половины беременности в сравнении со здоровыми фертильными пациентками. Мы провели генотипирование пациенток основной и контрольной групп; полученные результаты представлены на (Рис. 18). 87 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Основная группа * Контрольная группа * OGG1C/C OGG1C/G OGG1 G/G *Различия статистически достоверны, р< 0,05. Рис.18. Распределение генотипов rs1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток основной и контрольной групп. Согласно результатам проведенного нами генотипирования, гомозиготный генотип С/С в основной группе встречался в подавляющем большинстве случаев- 63% (n=94), в группе контроля данный генотип также являлся самым распространенным и составил 72% (n= 87) наблюдений, что, однако, не являлось достоверно различным. В популяции европеоидов этот генотип также выявлен более чем у 60% (Рис. 18) Гетерозиготы С/G выявлены у 30,80 % (n=46) среди женщин с невынашиванием беременности, а в контрольной группе этот показатель составил 27,2% (n=33), что также не различалось и находилось на уровне общепопуляционных 30% европеоидов (Рис. 18). Интересные результаты получены нами при сравнении частот распределения гомозиготного генотипа G/G. Среди пациенток с потерей беременности в I и II триместрах этот генотип выявлен у 6,04 % (n= 9), при этом в группе контроля всего одна пациентка оказалась носителем генотипа G/G – 0,8 %, что оказалось статистически достоверным χ² =5,09, р=0,02. В европейской популяции, согласно данным литературы, данный генотип также встречается крайне редко. Учитывая достоверно более частое носительство генотипа G/G у пациенток основной группы с невынашиванием беременности, можно утверждать, что носительство аллеля 88 G оказывает неблагоприятное влияние на течение первой половины беременности (Рис. 18). При проведении аддитивного теста нами было установлена доминантная модель наследования аллеля G в гетерозиготном состоянии над аллелем С (χ² =4,29, р=0,03), что может оказывать неблагоприятное влияние на течение беременности. Учитывая наличие аддитивного эффекта, мы рассчитали отношение рисков носительства аллелей исследуемого полиморфизма. По результатам проведенного сравнения носительство аллеля G полиморфизма rs1052133 гена OGG1 превалировало у женщин с невынашиванием беременности, по сравнению с аллелем С (OR=1,62, р=0,04, 95%, df= 0,38-0,99). На основании приведенных выше данных можно утверждать, что у пациенток - носителей аллеля G вероятность невынашивания беременности в 1,62 раза выше, чем у носителей аллеля С. Для уточнения распределения генотипов относительно сроков прерывания беременности нами проведено сравнение двух подгрупп пациенток с репродуктивными потерями. 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Основная группа Контрольная группа * OGG1C/C OGG1C/G OGG1 G/G *Разница статистически достоверна, р< 0,05. Рис. 19. Распределение аллелей rs1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток при потере беременности на сроке 7-10 недель. По результатам проведенного сравнения установлено, что гомозигота С/С выявлена у пациенток с репродуктивными потерями на сроке менее 10 недель в 68% (n=53) наблюдений, что не являлось существенно отличным от общей группы контроля, где этот показатель составил 72 % (n=87) (Рис. 19). 89 Достоверной разницы также не получено при анализе частот встречаемости генотипа С/G, он выявлен у 24,3 % (n=19) женщин с потерей беременности на сроке до 10 недель и у 27,2% (n= 33) здоровых женщин (Рис. 19). Относительно гомозиготного генотипа G/G получены значения, совпадающие с результатами сравнения общей основной группы и группы контроля. Так, у пациенток с невынашиванием на сроках беременности менее 10 недель этот показатель составил 7,60 % (n=6) против 1 пациентки контрольной группы (χ² =6,59, р=0,01). Таким образом, генотип G/G достоверно превалировал в группе пациенток с репродуктивными потерями (Рис. 27). Результаты, полученные в группе с потерей беременности в относительно ранние сроки беременности (до 10 недель), могут объясняться большей вероятностью реализации промутагенных повреждений 8-охоG в грубые генные и хромосомные аномалии плода при генетически обусловленной сниженной активности фермента OGG1, особенно в условиях оксидативного стресса, сопутствующего протеканию беременности I триместра. Более интересные результаты получены при изучении подгруппы пациенток с потерей беременности в сроках 10 недель и более. Среди пациенток с репродуктивными потерями на сроках 10 недель и более гомозиготный генотип С/С выявлен в 59% (n=54) случаев, тогда как в группе контроля этот показатель оказался несколько выше и составил 72 % (n=87), однако достоверной разницы выявлено не было (Рис.20). Гетерозигота C/G в обеих группах наблюдалась примерно в равном проценте случаев, у пациенток с невынашиванием на сроках более 10 недель генотип C/G выявлен в 36,3% (n=33), что достоверно не отличалось от группы контроля, где этот показатель оказался равен 27,2% (n=33) (Рис.20). 90 80% 70% 60% * 50% Основная группа 40% Контрольная группа 30% 20% * 10% 0% OGG1C/C OGG1C/G OGG1 G/G *Разница статистически достоверна, р< 0,05. Рис.20. Распределение генотипов rs 1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток при потере беременности на сроке 10 недель. Генотип G/G наблюдался у 4,39% (n=4) женщин с НБ на сроках 10 недель и более, тогда как среди здоровых женщин выявлен всего у одной пациентки (χ² =4,1, р=0,04). Установленная разница оказалась статистически достоверной, что позволяет рассматривать генотип G/G как неблагоприятный (Рис.20). При сравнении подгруппы пациенток с репродуктивными потерями на сроке более 10 недель и группы здоровых женщин выявлен аддитивный эффект: χ² =4,9, р=0,02. Таким образом, аллель G оказывает негативное влияние на вынашивание беременности и у носителей гетерозиготного генотипа. При оценке рисков установлено, что носительство аллеля G, по сравнению с аллелем С, в 1,72 раза повышает шанс потери беременности на сроках более 10 недель (OR=1,72, р=0,04, 95%, df= 0,34 – 0,99). Что касается экстрагенитальной патологии, то нами также выявлена ассоциация носительства аллелей rs 1052133 (С977G) гена OGG1 с развитием анемии во время беременности. В обеих группах пациенток, как с анемией, так и с нормальным гемоглобином дикий аллель С в гомозиготном состоянии наблюдался с 91 одинаковой частотой 60,57% (n=63) и 71,08% (n=118) соответственно, разница не являлась достоверной (Рис.21). Что касается гетерозиготного генотипа С/G, тут также не выявлено достоверной разницы по частоте встречаемости среди пациенток с анемией 32,69 % (n=34) и у здоровых женщин -27,11 % (n=45) (Рис.21). 80% 70% 60% 50% Группа пациенток с анемией во время беременности * 40% Группа пациенток с нормальные гемоглобином 30% 20% * 10% 0% OGG1C/C OGG1C/G OGG1 G/G *Разница статистически достоверна, р< 0,05. Рис.21. Распределение генотипов rs 1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток с анемией во время беременности. Минорный аллель G в гомозиготном состоянии выявлен у 6,73% (n=7) пациенток с анемией и всего у 1,08% (n=3) здоровых женщин, что было статистически достоверным: χ² =4,35, р=0,03(Рис.21). При сравнении групп выявлен аддитивный эффект, то есть, оба генотипа С/G и G/G являются рисковыми по развитию анемии во время беременности. Также установлено, что носители аллеля G имеют повышенный шанс развития анемии во время беременности в 1,65 раз (OR=1,65, р=0,04, 95%, df= 0,38 – 0,96). 92 4.3 Частоты встречаемости аллелей генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 в генезе невынашивания первой половины беременности. В организме человека постоянно происходит образование и накопление активных форм кислорода (АФК), как побочных продуктов многих внутриклеточных химических реакция. При нормальной концентрации АФК участвуют в регуляции важнейших функций клетки, таких как процессы митоза, метаболизм молекулы ДНК (35). Однако, в условиях чрезмерной продукции АФК либо при недостаточности нейтрализующей их системы происходит развитие окислительного стресса (35). Известно, что сопровождающийся процесс перекисного окисления липидов, образованием свободных радикалов, усиливается в условиях окислительного стресса (25, 81). Неконтролируемое накопление АКФ и свободных радикалов влечет за собой дисбаланс молекулярнохимических систем организма и может приводить к структурным повреждениям в молекуле ДНК, индуцируя мутагенез (25). Другим мощным негативным фактором, нарушающим нормальный клеточный состав, является воздействие ксенобиотиков (29). В условиях современного мегаполиса с повышенной концентрацией в окружающей среде различных чужеродных химических веществ организм находится под постоянным воздействием вредных соединений, особенно при неполноценности эндогенных защитных систем (44). Клетки органов и тканей человека обладают высокой чувствительностью к изменению своего гомеостаза и способны быстро реагировать на попадание в ее внутриклеточное пространство чужеродных соединений (свободные радикалы, ксенобиотики), с последующей их нейтрализацией (44). Попавшие в клетку гидрофобные соединения 93 нуждаются в предварительном превращении их в водорастворимую форму, на этом этапе работают ферменты первой фазы детоксикации, однако, если вредоносное вещество исходно водорастворимо, в реакцию сразу вступают ферменты второй фазы системы детоксикации (33). В ходе третьей фазы происходит элиминация из клетки чужеродных агентов. Основным регулятором второй фазы ответа клетки на окислительный стресс является транскрипционный белок NRF2 (34). Вне опасности количество NRF2 находится на низком уровне и преимущественно локализуется в цитозоле, а не в ядре клетки, однако в условиях нарастания оксидантного стресса количество NRF2 резко увеличивается. NRF2 обуславливает активную транскрипцию генов антиоксидантной системы и синтез ферментов, осуществляющих нейтрализацию и элиминацию чужеродного соединения (35). Во время беременности происходит значительная перестройка многих химических и метаболических процессов, увеличивается количество ненасыщенных жирных кислот, являющихся основным субстратом для перекисного окисления липидов (36). В случае дисбаланса в антиоксидантной системе происходит избыточное накопление свободных радикалов и АФК, что может пагубно влиять на функциональное состояние матери и плода. Неполноценная элиминация ксенобиотиков также приводит к нарастанию нагрузки на клетки организма, что может сопровождаться нарушением их структуры и функций (34). В литературе существуют упоминания о полиморфных вариантах гена NRF2, носительство аллелей которых приводит к нарушению транскрипции защитных ферментов, что сопровождается повышенной уязвимостью организма в условиях оксидантного стресса и высоких концентраций ксенобиотиков (89, 108, 162). Объектом нашего исследования выбран ранее не изученный в контексте НБ однонуклеотидный полиморфизм rs 6721961 гена NRF2, при 94 котором происходит замена гуанина на тимин в 617 позиции, что сопровождается выработкой недостаточного количества транскрипционного фактора с последующим дефектом экспрессии необходимых защитных генов ферментов антиоксидантной системы. Относительно общепопуляционных показателей среди европеоидов известно, что аллель G встречается в 89% наблюдений, остальные 10% приходились на аллель Т (108). Нами проведено генотипирование пациенток с потерей беременности и здоровых женщин с выполненной репродуктивной функцией. Наиболее часто встречающимся являлся аллель G в гомозиготном состоянии, в основной группе он выявлен у 69,50% (n=105) испытуемых, в контрольной группе этот показатель был несколько выше и составил 73,77 % (n= 90), что достоверно не отличалось. На втором месте по распространенности оказался гетерозиготный генотип G/T, который выявлен примерно с равной частотой как в основной группе - 29,1% (n=44), так и в контрольной - 23,77% (n=29), достоверная разница между группами также не была установлена. Самым редким оказался аллель Т rs 6721961 в гомозиготном состоянии. В обеих группах он встречался крайне редко и среди женщин с невынашиванием беременности составил всего 1% (n=2), в контрольной группе генотип Т/Т выявлен также всего у 3 пациенток – в 2% наблюдений. Согласно корреляции результатам между нашего репродуктивными исследования, потерями не установлено первой половины беременности и носительством вариантных аллелей гена NRF2. Антиоксидантная защита организма осуществляется благодаря многоступенчатому взаимодействию многих ферментов и химических соединений (25, 35). Среди основных звеньев антиоксидантной защиты можно выделить митохондриальный фермент каталазу (CAT), выработка которого обеспечивает нормальное течение окислительно-восстановительных реакций в организме. Являясь хромопротеидом из группы гидропероксидаз, каталаза 95 расщепляет образующуюся в результате окислительных реакций токсическую перекись водорода до молекулы кислорода и воды (34, 35). Однако, в условиях низкой концентрации перекиси водорода каталаза проявляет также и пероксидазную активность, окисляя полифенолы и низшие спирты. Ген CAT располагается на 11 хромосоме и отвечает за САТ за счет экспрессию фермента, структурные изменения в гене вариантных аллелей могут по-разному влиять на активность вырабатываемого фермента (80). В случае ослабления защитной функции каталазы могут происходить нарушения в редокс- системе всего организма, что особенно неблагоприятно отражается на течении беременности (36). В нашем исследовании объектом изучения был выбран мало изученный однонуклеотидный полиморфизм в промоторе гена САТ rs 17880664 (Т21А), при котором происходит замена азотистого основания тимина на аденин в 21 позиции (7). Аллель Т в гомозиготном состоянии встречался у 37% (n=56) пациенток основной группы, среди пациенток контрольной группы он выявлен у 40% (n=48) обследованных, что достоверно не отличалось. Наши результаты примерно соответствовали значениям для популяции европеоидов в целом - около 50 %. Вклад гетерозиготы Т/А составил в основной группе 52,3% (n=78), в контрольной этот показатель оказался несколько ниже и составил 45% (n=54), однако достоверных различий также выявлено не было. Частота встречаемости данного генотипа в популяции европеоидов так же находится на уровне 40% . Самым редким по распространенности среди обследованных нами пациенток был гомозиготный генотип А/А, крайне редко встречающийся и в популяции в целом. У пациенток с невынашиванием беременности он наблюдался в 10 % (n=15) случаев, тогда как в контрольной группе аллель А в гомозиготном состоянии выявлен у 15 % (n=18), разница не была статистически достоверна. 96 Таким образом, по результатам проведенного исследования мы не обнаружили взаимосвязи между носительством аллелей rs 17880664 гена САТ и риском невынашивания первой половины беременности. Другим важным звеном антиоксидантной защиты организма в условиях оксидантного стресса является фермент глутатионпероксидаза (ГП). Основными ее локализациями являются цитозоль клетки и митохондрии. Глутатионпероксидаза препятствует образованию свободных радикалов посредством восстановления перекиси водорода до воды, а также восстановления органических гидропероксидов до гидроксипроизводных. Поскольку глутатионпероксидаза является гомотетрамерным селенопротеином, активность фермента напрямую зависит от концентрации селена в организме. В условиях современной жизни в мегаполисе с неблагоприятной экологией и нерациональным питанием с редким употреблением в пищу морепродуктов, возникает дефицит поступления в организм селена, что само по себе снижает активность глутатионпероксидазы. В литературе описано несколько изоформ фермента, кодирующихся разными генами. Ферменты различаются в зависимости от места расположения в клетке и от субстратной специфичности. Наиболее изученным является глутатионпероксидаза 4, играющая основную роль в пероксидации липидов в организме. Ген глутатионпероксидазы 4 (GPx4) располагается на 19 хромосоме. Известно, что полиморфные варианты гена могут обуславливать синтез белка с измененной антиоксидантной активностью. Объектом нашего исследования был выбран наиболее изученный полиморфный вариант rs 713041 (С44Т) гена GPx4, при котором возникает замена цитозина на тимин в 44 сайте, что сопровождается экспрессией фермента глутатионпероксидазы 4 с пониженной активностью. По данным литературы, данный вариантный аллель гена ассоциирован с повышенным риском развития некоторых соматических заболеваний (99, 122). 97 Нам представлялось интересным проследить взаимосвязь между носительством данного полиморфизма и риском репродуктивных потерь первой половины беременности. В популяции европеоидов генотипы rs 713041 распределились следующим образом: гомозиготный генотип С/С встречался у 31,9 %, гетерозиготы С/Т наблюдались у 45% и гомозиготный вариант Т/Т выявлен всего у 23% населения. В результате генотипирования пациенток обеих групп установлено, что у женщин с невынашиванием беременности аллель С в гомозиготном состоянии встречался в 46,4 % (n=66) наблюдений, в контрольной группе данный генотип выявлен у 38,01% (n=46), что достоверно не различалось. По распространенности гетерозиготы С/Т между пациентками основной и контрольной групп также не выявлено достоверной разницы, данный генотип выявлен у 38,70% (n=55) и у 51,23% (n=62) соответственно. Что касается гомозиготного генотипа Т/Т, то у пациенток с репродуктивными потерями он встречался в 15 % (n=21), тогда как среди здоровых женщин выявлен всего у 11% (n=13), однако достоверной разницы не наблюдалось. Таким образом, достоверных различий по частоте встречаемости аллелей rs 713041 (Т21А) гена GPX4 у пациенток основной и контрольной групп в нашем исследовании установлено не было, и показатели совпали с общепопуляционными. На основании полученных нами результатов можно сделать вывод об отсутствии взаимосвязи между носительством аллелей rs 713041 и риском репродуктивных потерь. Другой группой наиболее активных ферментов антиоксидантной системы являются ферменты семейства супероксиддисмутаз (СОД) (25). Основной функцией этих металлоферментов является регуляция уровня О2 в клетке посредством реакции дисмутации супероксидных радикалов, в результате которой происходит образование перекиси водорода и воды. Супероксиддисмутаза является чрезвычайно распространенным ферментом, 98 находящимся в клетках всех аэробных организмов (20). В организме СОД представлена тремя изоформами, различающимися по входящему в состав иону металла и располагающимися в различных частях клетки организма, а также во внеклеточной жидкости (35). Наиболее активной изоформой супероксиддисмутаз является СОД 2, имеющая в своем составе молекулу марганца Mn в активном центре и располагающаяся преимущественно в митохондриях. СОД2 осуществляет защиту организма от активных форм кислорода, постоянно образующихся в результате процессов перекисного окисления липидов (35). Ген SOD2, кодирующий супероксиддисмутазу, локализуется на 6 хромосоме и обеспечивает экспрессию полноценно функционирующего фермента (80). Ряд вариантных аллелей гена SOD2 может быть ассоциирован с изменением количества/активности/стабильности соответствующего фермента. В нашем исследовании мы провели изучение наиболее описанного однонуклеотидного полиморфизма гена SOD2 - rs 4880 (Т47С). Данный полиморфный вариант характеризуется заменой тимина на цитозин в 47 сайте, который приводит к изменению в первичной структуре белка с заменой аминокислоты аланина на валин со снижением, в той или иной степени, активности кодируемого фермента (93, 161). Данный полиморфный вариант наиболее изучен и рассматривается как предиктор развития многих мультифакториальных заболеваний (62, 82, 161). Носительство минорного генотипа С/С сопровождается экспрессией фермента с уменьшенной антиоксидантной активностью (82). По результатам проведенного нами генопитирования установлено, что у пациенток основной группы аллель Т в гомозиготном состоянии представлен в 25% (n=37) наблюдений, в контрольной группе этот показатель составил 20% (n=24), что достоверно не отличалось. В популяции гомозигота Т/Т выявлена у 35 % европеоидов. По данным разных авторов (82, 93, 161), данный генотип рассматривается как благоприятный, поскольку обеспечивает экспрессию активной формы фермента СОД 2. 99 Частота гетерозиготы C/Т у женщин с невынашивание беременности составила 53,6 % (n=81), что оказалось идентичным контрольной группе - 56 % (n=69). В нашем исследовании генотип С/Т выявлен с той же частотой, что и в целом в популяции – около 50%. Изменения активности фермента для гетерозиготы С/Т, по сравнению с гомозиготой Т/Т, по литературным данным не зарегистрировано. Последний, наименее распространенный генотип С/С в популяции европеоидов встречается у 15 %. По мнению ряда авторов (82, 156, 161), данный генотип расценивается как неблагоприятный и ассоциирован с продукцией фермента со сниженной антиоксидантной активностью. Однако, по результатам нашего исследования частота встречаемости аллеля С в гомозиготном состоянии у пациенток с невынашиванием беременности составила 21,9 % (n=33), что достоверно не отличалось от группы контроля 23,6% (n= 29). Таким образом, можно утверждать, что носительство аллелей rs 4880 гена SOD 2 не повышает риск потери первой половины беременности. Еще одним из важнейших звеньев АОС является восстановленный глутатион (низкомолекулярный тиол), при участии которого происходит восстановление и изомеризация дисульфидных связей, а также изменение активности ферментов и других белков (35). Глутатион является кофактором фермента глутатионпероксидазы, а также при его участии происходит синтез лейкотриенов в организме. Синтез глутатиона происходит под воздействием фермента глутаматцистеинлигазы (GCL), состоящей из двух субъединицрегуляторной субъединицы (GCLM) и обеспечивающей каталитическую активность фермента (GCLC) (34, 35). В нашем исследовании мы провели изучение полиморфного варианта промоторного rs17883901 ( С129Т) гена GCLC, при котором происходит замена цитозина на тимин в 129 позиции (100). По результатам генотипирования пациенток выявлено превалирование аллеля С в гомозиготном состоянии в обеих группах. В основной группе 100 частота данного генотипа составила 86, 80% (n=131), среди здоровых женщин этот показатель также встречался в подавляющем большинстве и составил 86,20 % (n =106), что не различалось между собой и совпало с показателем по популяции в целом – 88% . Согласно общепопуляционным показателям процент гетерозигот среди европеоидов находится около 12 %. Близкие значения для генотипа С/Т получены и в нашем исследовании, он выявлен у женщин с потерей беременности в 13,2 % (n=20), а в группе контроля наблюдался у 10,6% (n=13) пациенток, без достоверной разницы между группами. Наименее распространенным являлся генотип Т/Т, который встречался всего у 3 здоровых женщин, тогда как в основной группе данный вариант не наблюдался вовсе. В популяции процент встречаемости гомозиготы Т/Т также крайне мал и по данным разных авторов, стремится к 0. Согласно полученным результатам, носительство аллелей rs 17883901 (C129Т) гена GCLC не повышает риск репродуктивных потерь и не может рассматриваться как предиктор невынашивания первой половины беременности. В организме процессы детоксикации ксенобиотиков происходят в 3 этапа и находятся под контролем целого ряда ферментов. Механизмы первой фазы регулируются в основном ферментами семейства цитохром P 450 (СYP), отвечающими за метаболизм чужеродных веществ. Под воздействием CYP1A1 происходит активация полициклических ароматических углеводородов с образованием проканцерогенов (44). Нами были исследованы два наиболее изученных полиморфных варианта гена экспрессируемого CYP1A1, по-разному фермента, влияющих следовательно, на имеющих активность разное фенотипическое проявление (59, 77). Объектом нашего исследования был выбран однонуклеотидный полиморфизм rs1048943 (А4889G) гена CYP1A1, при котором происходит замена аденина на гуанин в 4889 позиции, что приводит к изменению 101 структуры белка с заменой аминокислоты изолейцина на валин (Ile462Val) (62). По данным проведенных ранее исследований (109, 156), носительство разных генотипов данного полиморфизма обуславливает неодинаковую активность кодируемого фермента. Так, у носителей гомозиготы G\G активность фермента значительно выше, по сравнению с другими генотипами, что обуславливает чрезмерное накопление промежуточных рактивных метаболитов в процессе метаболизма ксенобиотиков (77, 109, 136). В основной группе пациенток нашего исследования генотип А/А присутствовал в подавляющем большинстве наблюдений –у 91,3 % (n=138) пациенток, в контрольной группе этот показатель составил 87,7 % (n=107), что не отличалось между собой и совпало с показателем по популяции европеоидов – более 90%. Частота гетерозиготы А/G также приближена к общепопуляционным показателям, около 7 %, и для основной группы составила 8,6% (n=13), в группе контроля значения достигали 12,2% (n=15), что достоверно не различалось. Гомозиготный генотип G/G в нашем исследовании не выявлен ни у одной пациентки, как в основной, так и в контрольной группах, что соответствует общепопуляционным значениям – менее 1 %. При проведении сравнительного анализа частоты распределения аллелей rs1048943 у пациенток нами не установлено достоверной разницы. Согласно нашим данным, вариантный аллель rs1048943 (А4889G) гена CYP1A1 не оказывает неблагоприятного влияния на течение и исход беременности в первой половине гестации. В нашем исследовании мы провели генотипирование пациенток и для другого полиморфного варианта гена CYP1A1. При полиморфизме rs4646903 гена CYP1A1 происходит замена тимина на цитозин в позиции 3801. Известно, что у носителей гомозиготного генотипа С/С и гетерозиготного варианта Т/С активность фермента выше, по сравнению с гомозиготой Т/Т. 102 В основной группе нашего исследования 83 % (n=124) пациенток являлись носителями гомозиготного генотипа Т/Т, в контрольной группе это значение соответствовало 75% (n=85), что достоверно не отличалось. Согласно статистике гомозигота Т/Т выявляется более чем у 60% популяции европеоидов. Второе место по распространенности занимает гетерозиготный генотип Т/С, который у пациенток с невынашиванием представлен в 16,7 % (n=25) случаев, тогда как среди здоровых женщин он встречался в 24,7% (n=28), что совпадало с общепопуляционными значениями - около 30 %. Достоверной разницы между группами выявлено не было. Минорный аллель С в гомозиготном состоянии крайне редок в популяции европеоидов и в обеих группах нашего исследования его частота оказалась равна 0% . На основании приведенных выше данных можно сделать важный вывод об отсутствии связи между изученными полиморфными вариантами гена CYP1A1 и потерей первой половины беременности. 103 Заключение Несмотря на развитие современной науки и медицины исключить проблему невынашивания беременности из жизни человечества до сих пор не удалось. Множество факторов, обособленных и связанных провоцируют эту патологию, приводя к трудностям естественного воспроизводства и снижая уровень прироста населения планеты. В свете современной науки и медицины получены новые ответы на вопросы, связанные с причинами невынашивания беременности. С целью преконцепционной подготовки женщины широко распространены скрининговые методы для установления инфекционных, гормональных, иммунологических, физиологических и анатомических причин возможного неблагоприятного течения беременности (71). Благодаря разработкам в области расшифровки генетического кода человека возможным выявление некоторых генетических стало предикторов невынашивания, например таких как патология гемостаза (72). Отдельный пласт занимают аномалии кариотипа эмбриона, обуславливающие потерю беременности в I триместре, что отражает реализацию эволюционной программы естественного отбора (14, 21). Однако, такие мутации часто носят спорадический характер, не увеличивая риск потери последующих беременностей (23). В случае нормального кариотипа эмбриона и отсутствия явных причин невынашивания со стороны организма матери, встает вопрос: какие процессы в таком случае провоцируют прерывание беременности? Для ответа на этот вопрос множество современных исследователей обращает свое внимание на глубинные генетические аспекты функционирования организма. Давно известен тот факт, что в результате многих эндогенных процессов в организме происходит накопление СР и АФК (35). Также очевидно, что в условиях современной загрязненной среды возросла нагрузка токсических и канцерогенных веществ на организм человека (29). Многие негативные факторы, которые вне беременности компенсируются за счет резервов организма, могут оказать пагубное влияние на развивающийся 104 эмбрион (71). Элиминация всех вредоносных агентов происходит под контролем многоступенчатой генетически детерминированной, защитной системы (33, 44). Поскольку все процессы жизнедеятельности реализуются строго следуя заложенной в ДНК информации, изменение ее структуры с заменой одного единственного нуклеотида может привести к неполноценности кодируемого вещества (белка, фермента) с нарушением внутриклеточных биохимических взаимодействий (57, 80). За последнее десятилетие проведено много исследований, направленных на изучение генетической основы систем, обеспечивающих поддержание гомеостаза организма (86). Наиболее важными в этом отношении оказались антиоксидантная система и система детоксикации ксенобиотиков (51, 86). Существуют единичные исследования, отражающие роль этих систем в процессах наступления и течения беременности, по некоторым генам даже установлена статистически значимая ассоциация, однако большинство таких исследований проводилось на небольших популяционных выборках. В нашем исследовании мы решили провести анализ влияния генетических повреждений защитных ферментативных систем организма на течение первой половины беременности при более широких выборках пациенток. Известно, что чужеродные вещества ксенобиотики и свободные радикалы обладают мутагенными свойствами в отношении молекулы ДНК, провоцируя накопление генных, хромосомных и геномных мутаций, что отражается также и на генах защитных антиоксидантной и детоксикационной систем (8, 44, 112). Гены репарации предотвращают накопление ошибок в структуре ДНК (8). Учитывая значимость генов репарации как важного звена в процессе детоксикации/репарации/элиминации повреждений ДНК, нам представлялось интересным проследить влияние изменчивости в их структуре на столь уязвимую и подверженную мутагенным влияниям систему как мать - эмбрион на ранней стадии своего развития (7, 80). 105 В исследование были включены 274 пациентки, из которых 151 имела 2 и более эпизодов невынашивания в анамнезе и 123 женщины с реализованной репродуктивной функцией при 2 и более нормальных родах в анамнезе. В момент поступления пациенток в стационар (роддом) был проведен стандартный сбор анамнеза, включающий развернутые вопросы для уточнения характера менструальной и репродуктивной функций и с целью выявления перенесенной гинекологической и экстрагенитальной патологии. Всем пациенткам было выполнено полное клинико-лабораторное обследование, включая УЗИ органов малого таза. Всем пациенткам с потерей беременности было произведено кариотипирование плода. В рамках нашего исследования для выявления частот встречаемости полиморфных вариантов изучаемых генов было проведено генотипирование всех пациенток при помощи постановки реакции амплификации с последующей визуализацией результатов с применением 2% агарозного геля. Также была выполнена постановка биохимических реакций для определения активности ряда ферментов. Все обследованные нами женщины для чистоты сравнения были отобраны с учетом идентичности среды и условий проживания, климатического пояса, принадлежности к славянской национальности. Группы были практически однородны по антропометрическим показателям, социально-экономическому и профессиональному статусу. Давно известно и неоспоримо, что приверженность к таким вредным привычкам, как употребление алкоголя и табакокурение, наносит урон не только организму женщины, провоцируя всевозможные соматические патологии, но и вызывает грубые пороки развития эмбриона, вплоть до потери беременности (71, 72). Перечисленные вредные привычки повышают нагрузку на организм со стороны канцерогенного, тератогенного и мутагенного воздействия токсических продуктов, которое должно компенсироваться активностью защитных детоксикационных систем (44). В основной группе превалировал процент женщин, имеющих вредные 106 привычки, что могло опосредованно повышать риск неблагоприятного исхода беременности. Однако, наличие вредных привычек отражает лишь формирование неблагоприятного фона для течения беременности, не являясь прямой и единственной причиной репродуктивных потерь. Необходимо отметить, что среди экзогенных факторов особое место занимают условия психоэмоционального характера окружающей обстановки (63). Учитывая все возрастающий уровень напряжения, связанного с жизнью в мегаполисе, такое понятие, как хронический стресс выходит на ведущее место среди факторов, нарушающих баланс организма женщины (23). В последние годы все больше женщин стремятся к активной профессиональной деятельности, зачастую сопряженной с огромными эмоциональными затратами, что в сочетании с нестабильностью семейного микроклимата, нарушением естественных биоритмов, приводит к развитию стойкого хронического стрессового фона (23). Механизму воздействия стресса на организм современная наука уделяет все больший интерес (63). Доказано, что стрессоры способны усиливать каскад ПОЛ с накоплением свободных радикалов, повышать уровень образования катехоламинов, активируя симпато- адреналовую систему, что способствует в итоге ослаблению защитных сил организма и повышает уязвимость перед другими факторами внешней среды. Очевидной является патогенетическая связь высокого уровня стресса с формированием не только соматических заболеваний, но и патологического течения беременности, что подтверждается результатами нашего исследования. Так, пациентки основной группы значительно чаще отмечали у себя признаки хронического стресса по сравнению с женщинами контрольной группы, проживающими в более благоприятных психоэмоциональных условиях (63, 84). На течение беременности прямое влияние оказывает общее соматическое здоровье матери (48, 71). Связь пониженного уровня здоровья с неблагоприятным течением беременности исследовании. По результатам сравнений имела место и в нашем в группе пациенток с 107 невынашиванием чаще наблюдались такие мультифакториальные патологии, как нарушение жирового обмена, артериальная гипертензия, эутиреоидный зоб, заболевания желудочно-кишечного тракта. Следует уточнить, что нарушение жирового обмена у пациенток основной группы не носило выраженный характер и не сопровождалось развитием метаболического синдрома, поэтому также не может в значительной степени нарушать нормальные процессы гестации. Наличие у пациенток основной группы высокого процента заболеваемости эутиреоидным зобом может объясняться эндемичностью данного заболевания для проживающих на территории Москвы и Московской области, однако при отсутствии дисбаланса гормонов щитовидной железы эта патология так же не является прямой причиной патологического течения беременности репродуктивным потерям и у обследованных не могла нами приводить пациенток. к Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта у пациенток основной группы наблюдались не осложненные компенсированный характер течения нозологии, имеющие хронический в стойкой стадии ремиссии, таким образом, их наличие отражает уровень общего соматического здоровья, но не играет ведущую роль в формировании репродуктивных потерь первой половины беременности у данных пациенток. Таким образом, рассматривая изолированно экстрагенитальную патологию, нам не удалось установить ведущей причины повторяющихся эпизодов потери беременности у пациенток основной группы. Немаловажную роль в характеристике здоровья организма играет персистенция очагов хронической инфекции экстрагенитальной локализации (72). При обследовании пациенток было установлено, что женщины основной группы чаще страдали воспалительными заболеваниями органов, бронхолегочной системы и мочевыделительной Лор системы (хронический цистит), чем группа контроля. Следует отметить, что все диагностированные воспалительные заболевания у обследованных нами пациенток находились в стадии стойкой ремиссии и являлись результатом 108 перенесенных в анамнезе острых состояний. Больший процент встречаемости хронического бронхита в основной группе может быть связан с приверженностью этих пациенток к табакокурению, которое, как известно, является прямым предиктором заболеваний легких. Развитие хронического тонзиллита также может быть опосредованно связано с курением, за счет снижения местного иммунитета. Персистенция хронического цистита в основной группе может объясняться большей частотой встречаемости инфекционной патологии половой сферы у этих пациенток, что предполагает восходящий путь инфицирования. Следует отметить, что все диагностированные воспалительные заболевания у обследованных нами пациенток находились в стадии стойкой ремиссии и являлись результатом перенесенных в анамнезе острых состояний. Таким образом, воспалительные заболевания экстрагенитальной локализации в стадии ремиссии, являлись не более чем фоновыми и не могли изолированно от других причин вызвать тяжелые осложнения беременности, а особенно приводить к невынашиванию. Среди основополагающих характеристик репродуктивного здоровья женщины следует выделить уровень фертильности. Поскольку целью нашего исследования являлась попытка установления причин репродуктивных потерь, в основную группу были отобраны женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, характеризующимся наличием более 2 случаев невынашивания в анамнезе. Статистически большее число беременностей в данной группе связано с наличием в анамнезе у пациенток не только самопроизвольных выкидышей, но и абортов, при этом число родов оказалось намного ниже. Напротив, контрольная группа была сформирована из здоровых женщин с низким числом абортов, при большом количестве самопроизвольных нормальных родов и исключением эпизодов невынашивания. Таким образом, статистически значимая разница по числу беременностей объясняется заведомо более отягощенным репродуктивным 109 анамнезом, которой как раз являлся основным критерием включения пациенток в основную группу. Что касается гинекологической патологии, то распространенные заболевания как миома матки, аденомиоз в такие основной группе наблюдались значительно чаще, что может свидетельствовать о повышенном содержании эстрогенов в организме у пациенток данной группы. В пользу гиперэстрогении говорит и превалирующее количество фиброзно-кистозной мастопатии (более 90 %) среди женщин с невынашиванием беременности в нашем исследовании. Дисфункция яичников носит чаще приходящий характер и затрудняет само наступление беременности, существенно не отражаясь при этом на течении гестации (5), в нашем исследовании данная патология наблюдалась достаточно редко и с одинаковой частотой у пациенток обеих групп. По-другому складывается ситуация с персистенцией в организме женщины воспалительных поражений органов репродуктивной системы. По результатам проведенного сравнения такие заболевания, как цервицит, эндометрит и сальпингоофорит, в анамнезе у пациенток основной группы встречались значительно чаще. Безусловно, инфекционные процессы в органах малого таза могут опосредованно влиять на прогноз вынашивания беременности, однако, согласно анамнестическим данным, у группы пациенток с невынашиванием в нашем исследовании наблюдались лишь хронические формы течения, с редкими и отдаленными по времени от момента беременности эпизодами обострения. Больший процент данных заболеваний в основной группе может объясняться неоднократными случаями потери беременности у этих пациенток, сопровождающимися инструментальными внутриматочными вмешательствами, что само по себе является фоном для развития латентного воспалительного процесса. Этот же фактор мог быть причиной более частого указания пациенток на дисбиотические нарушения микрофлоры влагалища и кандидоза в анамнезе, 110 возникающих еще и по причине профилактического приема антибактериальных препаратов в период после прервавшейся беременности. В ходе проведенного дообследования в отношении носительства специфических возбудителей заболеваний, передающихся половым путем, существенных статистических различий между группами не наблюдалось. В основной группе выявлено некоторое превалирование инфицирования вирусом простого герпеса, без эпизодов обострения во время гестации, а также вируса папилломы человека, не оказывающего прямого негативного влияния на прогноз течения беременности. Таким образом, инфекционный фактор у пациенток нельзя рассматривать как ведущую причину потери беременности. Реализованность репродуктивной функции оценивали по соотношению беременностей и родов у пациенток. Так в основной группе нашего исследования наблюдалось большее число беременностей, однако количество родов было значительно ниже, чем в группе здоровых женщин. Это объясняется большим процентом привычного невынашивания в основной группе. Среди здоровых женщин превалировало число благополучно доношенных беременностей, без эпизодов репродуктивных потерь, поэтому в этой группе число беременностей примерно соответствовало количеству родов. Терапия, направленная на пролонгирование беременности, значительно чаще была назначена пациенткам основной группы, что связано с отягощенным течением беременности. Однако, и пациентки контрольной группы значительно реже, но все же принимали данный вид препаратов во время беременности, что может объясняться современными подходами к ведению беременности врачами женских консультаций и назначением терапии даже в случае незначительных тянущих болей внизу живота. После обработки анамнестических данных и результатов общеклинического обследования каждой пациентке нами было произведено 111 генотипирование для выявления частот встречаемости полиморфных вариантов исследуемых генов - кандидатов. Известно, что многие эндогенные процессы в организме протекают с образование АФК и свободных радикалов, в норме инактивируемых ферментами антиоксидантнй системы (34, 35). При неэффективности защитных функций в организме происходит чрезмерное накопление вредоносных агентов, в результате чего под их воздействием оказываются все органы и системы, что особенно актуально во время беременности (36). Чужеродные вещества, попадающие в организм из загрязненной окружающей среды, именуются ксенобиотиками (44). Для их нейтрализации также активно функционирует система детоксикации, благодаря слаженному взаимодействию ряда ферментов (44). Так же как и от антиоксидантной системы, от системы детоксикации зависит поддержание нормального гомеостаза организма, неполноценной что защитной становится функции невозможным (36). Учитывая в условиях генетическую детерменированность данных процессов, связь изменений в структуре генов с предрасположенностью к различным заболеваниям, а также отсутствие данных об изучении их в контексте невынашивания беременности, нам представлялось интересным проследить влияние носительства аллелей полиморфных вариантов генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC и CYP1A1 на риск невынашивания беременности. Транскрипционный белок NRF2 является основным регулятором второй фазы ответа клетки на окислительный стресс; он запускает каскад ферментативных реакций, направленных на ликвидацию АФК и свободных радикалов (35). Объектом нашего исследования являлся однонуклеотидный полиморфизм G617T (rs 6721961) гена NRF2, ассоциированный с некоторыми мультифакториальными заболеваниями (108). По результатам проведенного нами генотипирования, достоверных статистических различий по распределению аллелей между основной и контрольной группами выявлено не было. На основании этих результатов очевидно, что 112 рассматриваемый полиморфный вариант гена NRF2 не ассоциирован с невынашиванием беременности в первые 20 недель гестации. Далее мы изучили распределение вариантных аллелей генов основных ферментов антиоксидантной системы. Так однонуклеотидный полиморфизм Т21С (rs 17880664) гена САТ, отвечающего за выработку фермента каталазы, по результатам нашего исследования не ассоциирован с невынашиванием беременности, так как различий между группами по распределению аллелей установлено не было. Аналогичные данные получены нами и в отношении полиморфных вариантов rs 713041 (С44Т) гена GPX4 (фермент глутатионпероксидаза 4) и rs17883901 (С129Т) гена GCLC (фермент глутаматцистеинлигаза, каталитическая субъединица). Между основной и контрольной группами пациенток не выявлено различий в распределении вариантных аллелей данных генов, что свидетельствует об отсутствии взаимосвязи вышеперечисленных полиморфных вариантов с риском репродуктивных потерь первой половины беременности. Что касается другого немаловажного звена антиоксидантной защиты, фермента супероксиддисмутазы 2 (SOD 2), объектом нашего исследования являлся однонуклеотидный полиморфизм rs 4880 (Т 47 С) гена SOD 2, который ассоциирован со сниженной активностью для носителя гомозиготного генотипа С/С (131, 161). При сравнении обеих групп в нашем исследовании не было установлено статистически значимой разницы по распределению аллелей данного полиморфизма. Следующей группой исследованных нами генов являлись гены системы детоксикации ксенобиотиков. Поскольку наиболее изученным в контексте соматических заболеваний являются ферменты семейства цитохром Р 450, объектом нашего исследования являлись полиморфные варианты rs1048943 (А4889G) и rs4646903 (Т3801С) гена CYP1A1. Проведя анализ частот распределения аллелей, мы не выявили значимой разницы между основной и контрольной группами. По полученным результатам ясно, что, несмотря на их роль в развитии различных соматических заболеваний, 113 полиморфные варианты rs1048943 и rs4646903 CYP1A1 гена не ассоциированы с повышенным риском невынашивания первой половины беременности и не могут рассматриваться как предикторы репродуктивных потерь. На основании однонуклеотидных результатов полиморфных изучения вариантов выбранных генов нами ферментов антиоксидантной системы и системы детоксикации ксенобиотиков мы пришли к выводу, что наличие рассмотренных однонуклеотидных замен в генах NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC и CYP1A1 не ассоциировано с риском потери беременности в первые 20 недель гестации. Более интересные данные получены нами при изучении полиморфного варианта rs 4680 гена COMT, обеспечивающего синтез фермента катехол-ометилтрансферазы (49). Хорошо известно, что необходимым условием для поддержания на физиологическом уровне концентрации катехоламинов является выработка данного фермента с нормальной активностью (57). Резко возрастающая под воздействием стресса концентрация вырабатываемых катехоламинов может крайне негативно влиять на организм беременной женщины, особенно при недостаточности процессов их обмена и элиминации (49). Пациенток основной группы нашего исследования как раз отличает повышенный уровень тревожности и стресса. Именно в гестационный период накопление катехоламинов особенно негативно, поскольку оказывает прямое и опосредованное влияние на все органы-мишени, включая матку, за счет повышения ее тонуса и ухудшения маточно-плацентарного кровотока ставит под угрозу нормальное течение беременности. Ранее было показано, что носительство вариантных аллелей rs 4680 гена COMT сопряжено с выработкой фермента с разным уровнем активности (104, 118). Так, наличие аллеля G полноценного в гомозиготном фермента состоянии сопровождается катехол-о-метилтрансферазы, тогда секрецией как в гетерозиготном состоянии (генотип G/А) приводит к снижению активности 114 фермента вдвое, а в случае гомозиготы по аллелю А происходит 3-4 кратное снижение активности (104). По результатам проведенного нами генотипирования наиболее интересные данные получены при сравнении пациенток с невынашивнием беременности на сроке более 10 недель с группой контроля. Здесь наблюдалось значительное превалирование дикого аллеля G в гомозиготом состоянии у здоровых пациенток (χ² =10,31, р=0,0013), что говорит о протективной роли данного аллеля G, благодаря продукции фермента катехол-о-метилтрансферазы. С целью выяснения характера проявления наследуемого признака нами был проведен аддитивный тест КохранаАрмитажа. По результатам было установлено, что у пациенток основной группы имеется доминантная модель наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/А являются рисковыми по развитию невынашивания беременности у данных пациенток (χ² =5,47, р=0,02). Также нами установлено, что у пациенток-носителей аллеля А имеется повышенный шанс потери беременности в первой половине гестации (OR=1,61, р=0,02, 95% df= 1,06-2,43). Также нам представлялось интересным проследить изменение активности фермента катехол-о-метилтрансферазы у носителей генотипов полиморфного варианта rs 4680 гена COMT. Оказалось что у носителей минорного генотипа А/А наблюдалась самая низкая активность фермента 226,52 ± 79,18 мкмоль /мг; у женщин с гетерозиготным генотипом активность фермента была достоверно выше и составила 335,88 ± 82,74 мкмоль /мг; а у носителей генотипа G/G активность фермента была самой высокой 564,67 ± 156,77 мкмоль /мг, что достоверно отличалось от носителей аллеля А. Таким образом, установлена статистически достоверная ассоциация носительства аллеля А rs 4680 гена COMТ со снижением активности фермента катехол-о-метилтрансферазы и невынашиванием беременности у обследованных нами пациенток. После обработки полученных результатов 115 перед нами встал вопрос: как патогенетически объяснить нарушение нормального развития беременности при неполноценной функции катехоло-метилтрансферазы? Какие процессы могут приводить в итоге к потере беременности в условиях избыточного количества катехоламинов? Один из механизмов, описанных ранее, связан с прямым воздействием катехоламинов на рецепторы миометрия и стенку маточных сосудов, приводящих к повышению тонуса матки и нарушению маточно- плацентарного кровотока, что, как известно, сопровождается недостаточной трофикой и создает условия для прерывания беременности (15). В ходе проводимых исследований нас заинтересовала теория эстрогенозависимой генотоксичности (92). Не секрет, что во время беременности, особенно на ранних ее сроках, в организме женщины резко возрастает количество эстрогенов, что является необходимым условием для полноценных процессов имплантации яйцеклетки, так в комплекс создания искусственного гормонального фона для поддержания беременности после ЭКО в комплекс терапии добавляют не только гестагены, но и эстрогены (23). В процессах распада эстрогенов, результатом их гидроксилирования является образование катехолэстрогенов, семихинонов и хинонов. Катехолэстрогены обладают высокой эстрогенной активностью и являются основой для образования хинонов, несущих мощное прямое мутагенное и генотоксическое воздействие на ДНК. Процессы инактивации катехолэстрогенов протекают при обязательном участии метилтрансферазы, однако катехоламины катехол-о- сами по себе угнетают активность СОМТ, что влечет за собой недостаточную инактивацию 4гидроксиэстрогенов с чрезвычайно высокой генотоксичностью (92). Таким образом, наличие катехол-о-метилтрансферазы с заведомо сниженной активностью, обусловленной носительством вариантных аллелей гена СОМТ, запускает каскад цепных реакций, на выходе активирующих мощные процессы генотоксического повреждения ДНК (92). Мы предполагаем, что этот механизм может отражаться на всех этапах гестации 116 от момента имплантации и эмбриогенеза. Возникающая в таких условиях генотоксическая нагрузка, вероятно, вносит немалый вклад в прерывание беременности. Данная гипотеза подтверждается большей предрасположенностью пациенток с невынашиванием беременности в нашем исследовании при наличии аллеля А rs 4680 гена COMT к таким эстрогенозависимым заболеваниям, как миома матки, аденомиоз и фиброзно-кистозная мастопатия. В ходе нашего исследования мы выявили взаимосвязь риска развития анемии во время беременности с носительством аллелей rs 4680 гена COMT. Установлено, что у носителей аллеля А (генотип G/A и А/А) шанс возникновения анемии в 1,93 раза выше, по сравнению с аллелем G, (OR=1,93, р=0,02, 95% df= 1,34-2,8). Полученный результат может объясняться возможным снижением уровня эритропоэза у данных пациенток в связи с наличием у них гиперэстрогении, что также подтверждено нашим исследованием (56). Принимая во внимание тот факт, что и катехолэстрогены, и множество других эндогенных и экзогенных метаболитов оказывают мощное генотоксическое влияние на молекулу ДНК, крайне важным механизмом поддержания ее нормальной структуры являются восстановительные процессы репарации. Одним из основных звеньев является система эксцизионной репарации, гены которой и являются предметом нашего исследования (80). Под контролем гена OGG1 происходит синтез фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы, обеспечивающего вырезание окисленных оснований из молекулы ДНК, однако у вариантных аллелей гена может иметь место ослабление ферментативной активности, а, следовательно, и уменьшение эффективности процессов репарации с накоплением структурных повреждений. Давно известно, что особенно в ранние сроки беременности, в период эмбрио- и органогенеза процессы мутагенеза приобретают особенную значимость. Нам представляется интересным 117 ответить на вопрос: ассоциировано ли предполагаемое накопление мутаций в молекуле ДНК при недостаточности одного из звеньев репаративной системы с риском потери беременности? По результатам проведенного нами генотипирования на предмет распределения аллелей rs1052133 OGG1 гена установлено, что неблагоприятный аллель G в гомозиготном состоянии, по данным ранее проведенных исследований ассоциированный с выработкой менее активного фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы в основной группе наших пациенток наблюдался значительно чаще: χ² =5,09, р=0,02. Также у обследованных пациенток установлена доминантная модель наследования минорного аллеля G, на основании чего можно утверждать, что и гомозиготный генотип G/G и гетерозиготный С/G являются рисковым по невынашиванию беременности: χ²=4,29, р=0,03. Что касается распределения шансов, то аллель G в 1,61 раза повышает риск потери беременности в первой половине гестации (OR=1,62, р=0,04, 95%, df= 0,38-0,99). То есть, носительство аллеля G ассоциировано с повышенным риском потери беременности у наших пациенток. Так же в ходе нашего исследования мы выявили ассоциацию носительства минорного аллеля G с риском развития анемии во время беременности, (OR=1,65, р=0,04, 95%, df= 0,38 – 0,96). Полученные результаты свидетельствуют о наличии множества опосредованных механизмов, способных нарушить нормальное течение гестации, и дальнейшее их изучение позволит в большой степени снизить их пагубное проявление. Что касается практического применения полученных нами результатов, то на их основе возможно сформировать группы повышенного риска невынашивания беременности. Также назначение седативных препаратов с целью имеет смысл снижения выработки катехоламинов пациенткам-носителям аллеля А rs 4680 гена COMT (особенно в гомозиготном состоянии). Также следует с осторожностью назначать эстрогенсодержащие препараты пациенткам, имеющим аллель А rs 4680 гена COMT и аллель G rs1052133 гена OGG1. 118 Нам представляется, что дальнейшее изучение процессов возникновения и компенсации генотоксического воздействия на ДНК как одного из повреждающих механизмов позволит пролить свет на столь малоизученные причины невынашивания, что позволит разработать как профилактические, так и лечебные меры, направленные на устранение данного осложнения. Выводы. 1. Шанс НБ I половины беременности при наличии аллеля А rs 4680 гена COMT у женщин в 1,61 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля G rs 4680 гена COMT в сроке более 10 недель гестации. 2. Риск НБ I половины беременности при наличии аллеля G rs1052133 гена OGG1 на течение беременности у женщин в 1,72 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля С rs1052133 гена OGG1 вне зависимости от срока гестации. 3. Полиморфные варианты генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не являются фактором риска НБ. 4. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с НБ на 25% ниже, чем у женщин, не имеющих репродуктивных потерь. 5. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы отличается у носителей различных генотипов соответствующего гена; она минимальна у носителей генотипа А/А rs 4680 гена COMT, имеет промежуточное значение у носителей генотипа G/A и максимальна – у носителей генотипа G/G. 6. Аллель А rs 4680 гена COMT ассоциирован не только с риском невынашивания беременности, но и с развитием анемии, миомы матки, фиброзно- кистозной мастопатии и аденомиоза. 119 Практические рекомендации. 1. У женщин с НБ в анамнезе необходимо включить в комплексное обследование генотипирование для выявления наличия неблагоприятных аллелей rs1052133 гена OGG1 и rs 4680 гена COMT с целью прогнозирования возможного риска НБ. 2. У женщин, имеющих аллель А rs 4680 гена COMT, особенно в гомозиготном состоянии, показано профилактическое назначение седативных препаратов с целью снижения выработки естественных катехоламинов. 3. Носителям аллеля А rs 4680 гена COMT и аллеля G rs1052133 гена OGG1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности. 4. С целью предгравидарной подготовки и во время беременности женщинам, имеющим аллель G rs1052133 гена OGG1 проводить курсы антиоксидантной терапии для снижения генотоксического эффекта. 120 Список используемой литературы 1. Абрамченко В.В. Психосоматическое акушерство / В.В.Абрамченко. -СПб.: «Сотис», 2001. 311 с. 2. Агаджанова А.А. Современные методы терапии больных с привычным невынашиванием беременности // РМЖ. 2003. - Том 11, № 1. - С. 17-20. . 3. Адамян Л.B., Кулаков В.И., Хашукоева А.З. Пороки развития гениталий.-М., 1999. 4. Адамян Л.В. и др. Л.В.Адамян,В.И.Кулаков,А.З.Хашукоева / "Пороки развития матки и влагалища"//Москва, 1998 год,320с. 5. Адамян Л.В., Спицын В.А., Андреева Е.Н. Генетические аспекты гинекологических заболеваний. М.: Медицина, 1999. — 216 с. 6. Акмаев И.Г. Структурные основы механизмов гипоталамической регуляции эндокринных функций. -М.: Наука. -1979. -227с. 7. Аксенович Т.И. Статистические методы генетического анализа признаков человека: Учебное пособие.- Новосибирск: Новосиб.гос. ун-т, 2001. - 128 с. 8. Алтухов Ю.П. и Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 38. № 9. - С. 1173-1195. . 9. Андреев C.B., Кобкова ИД. Роль катехоламинов в здоровом и больном организме. M Медицина, 1970.-296 с. 10. Арутюнян Н.А., Савченко О.Н. Активность 17-В-гидроксисте-роиддегидрогеназы, креатинфосфокиназы, содержание половых стероидов иих рецепторов в матке у больных с фибромиомой или эндокринным бесплодием //Акуш. и гин.-1990.-Мб.-с. 16-19. 11. Аульченко Ю.С., Аксенович Т.П. Методологические подходы и стратегии картирования генов, контролирующих комплексные признаки человека // Вестник ВОГиС. 2006. - Т. 10. - № 1. - С. 189202. 12. Аульченко Ю.С., Аксенович Т.П. Методологические подходы и стратегии картирования генов, контролирующих комплексные признаки человека // Вестник ВОГиС. 2006. - Т. 10. - № 1. - С. 189202. 13. Баклаваджян О.Г. Вегетативные механизмы гипоталамуса // Физиология вегетативной нервной системы. Л : Наука, 1981. - С. 398-474. 14. Бакулина Е.Г. Хромосомные нарушения у пациентов, страдающих первичным бесплодием / Е.Г. Бакулина, Л.Л. Мельникова // Второй (четвертый) Российский съезд медицинских генетиков, г. Курск, 17-19 мая 2000 г. Тезисы докладов. Ч. 2. Курск, 2000. - С. 116. 15. Бакшеев Н.С., Орлов P.C." «Сократительная функция матки», Киев, Здоровье, 1976, 184 С. . 16. Баранов B.C., Айламазян Э.К. Экологические и генетические причины нарушения репродуктивного здоровья и их профилактика // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. — Т. LVI. - вып. 1. — С. 3-10. 17. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Е., Асеев М.В. Геном человека и «гены предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) .- СПб.: Интермедика, 2000.- 272 с. 18. Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека : Научнопрактические аспекты.- СПб.: Издательство Н-Л, 2007.- 640 с. 19. Бахарева И.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В., Ганковская Л.В., Козлов П.В., Долгина Е.Н. Исследование особенностей окислительного метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией. //Материалы V Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии» - М., 2122 ноября 2006). Вопросы практической педиатрии. – 2006. - Том 1, №4. - С. 10-11. 20. Беловский, Ю.Ю. Изменение ПОЛ и антиоксидантной системы в условиях дополнительного респираторного сопротивления Текст. / Ю.Ю. Беловский, В.Н. Морозов. // Физиология человека. 1999. Т. 25. № 5. - С. 127-129. 21. Беспалова О.Н. Генетика невынашивания беременности // Журнал акушерства и женских болезней. 2007. - Т. LVI. - вып. 1. - С. 81-95. 121 22. Беспалова О.Н. и др./Особенности аллельного полиморфизма генов HLA П класса (DRB1, DQA1, DQB1) у супругов в парах с невынашиванием беременности / // Ж. акуш. и жен. болезн. — 2006. — Т. LV, №3. — С. 5-11. 23. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Под ред. И.В. Кулакова.-М.: ГЕОТАР-Медиа, 2005.- 616 с. 24. Василенко Н.Л., Невинский Г.А. (2003) Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. Биохимия, 68, р. 165183. 25. Величковский, Б.Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации организма к факторам окружающей среды / Б.Т. Величковский // Веста. РАМН. 2001. № в. - С. 45-52. 26. Гинтер Е.К.Медицинская генетика.- М.: Медицина, 2003.- 445 с. 27. Гладкова К.А., Менжинская И.В., Сухих Г.Т. и др. Роль сенсибилизации к прогестерону в клинике привычного невынашивания беременности // Проблемы репродукции. 2007. - № 6. - С. 95-98. 28. Глуховец Б. И., Глуховец Н. Г., Тарасов В.Н. Патогенетические основы гормональной гипотрофии эндометрия при ранних самопроизвольных выкидышах. Архив патологии том 64, № 5, 2002 год, стр. 28-31. 29. Гуляева Л.Ф. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе /Л.Ф. Гуляева, В.А. Вавилин, В.В. Ляхович. - Новосибирск, 2000. - 84 с. 30. Джвебянова Г.Г. и др. Иммунологические показатели при привычной невынашиваемости беременности //Акушерство и гинекология. 1996. - № 1. - С.41-43. . 31. Доброхотова Ю. Э., Сухих Г. Т., Озерова Р. И. Неразвивающаяся беременность аспекты этиологии. Возможности цитокинотерапии в программе реабилитации в раннем послеабортном периоде // Журнал «Медиа Сфера». 2006. - Вып. 2. . 32. Доброхотова Ю.Э. Актуальные вопросы невынашивания беременности // Москва, 2007. . 33. Жолдакова, З.И. Механизмы процессов биоактивации чужеродных химических веществ под действием ферментных систем организма Текст. / З.И. Жолдакова, Н.В. Харчевникова // Вестник РАМН.-2002 № 8. - С. 44-49. 34. Зборовская, И.А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме. Клинические аспекты / И.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестн. РАМН.- 1995. № 6.- С.53-60. 35. Зенков Н.К. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты /Н.К. Зенков, В.З. Лапкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука /Интерпериодика, 2001. - 343с. 36. Золотухин П. В. /Окислительный стресс и беременность // Валеология . -2010.- N2. - С. 2218-2268. 37. Золотухина Т.В., Шилова Н.В. Клетки плода в крови матери : новый неинвазивный подход к пренатальной диагностике хромосомных болезней // Пренатальная диагностика.- 2002. -№1.-С. 17-22. . 38. Кириченко В.Н. Вегетативная регуляция системного и маточного кровообращения в конце нормально протекающей беременности: Автореф. дис.канд. мед. наук. М., 1995. -24с. . 39. Кирющенков П.А., Особенности ведения женщин с аутосенсибилизацией к хорионическому гонадотропину человека //Гинекология.-2003.- Т.5 , №5.- С. 222-224. 40. Коллектив авторов (О.В.Макаров, В.А.Алешкин, Т.Н.Савченко, С.С.Афанасьев, Е.А.Воропаева, Л.В.Ганковская, А.З.Хашукоева, И.В.Бахарева, С.И.Каюкова, Л.О.Протопопова, М.С.Афанасьев, Е.И.Гиммельфарб, Л.И.Новикова). Под редакцией Макарова О.В., Алешкина В.А, Савченко Т.Н. Инфекции в акушерстве и гинекологии (руководство для врачей). // Москва, «МЕДпресс-информ», 2009г. 41. Колчанов H.A., АнанькоЕ.А., КолпаковФ.А. и др./ Генные сети // Молекулярная биология. 2000. - Т.34, №4. - С.533-544. 42. Крысова Л.А., Лесняк О.М., Путилова Н.В., Ремизова И.И Антифосфолипидный синдром у женщин с привьшным прерыванием беременности //Клиническая медицина.- 1999. Т.77. - №7. С.43-46. 43. Кулаков, В. И. Репродуктивное здоровье населения России / Кулаков В. И. //Акуш. и гин. 2002. - № 2. - С. 4- 7. 122 44. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков// Соросовский Образовательный журнал.1999.- №1-С. 8-12. 45. Левина Л .Я. Микроанеусомии: их выявление и связь с нарушениями развития / Л .Я. Левина, Л.И. Барановская, В.Г. Антоненко, В.И. Иванов // Медицинская генетика. 2006. - №10. - С. 3-7. 46. Луцик Е.А. Эфферентные и афферентные связи нейросекреторных центров гипоталамуса. Афферентные связи // Нейроэндокринология, СПб. -1993. кн. Вторая, ч. Первая - С. 270-299. 47. Майкова Е.В., Нгуен Ф.Н., Подольская А.А., Алимова Ф.К., Кравцова О.А. РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦАЖурнал "Современные проблемы науки и образования"№1, 2012 год. 48. Макаров О.В. Гинекология. Клинические лекции. "ГЭОТАР- Медиа"2010 , 352с. 49. Матлина Э. Ш., Меньшиков В.В. Клиническая биохимия катехоламинов. М. Медицина. 1967. С 125. 50. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-реакций, основные стадии процесса / Ф.З. Меерсон // Физиология адаптационных процессов. М., 1986. - С. 77-119. 51. Меньшикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меныцикова, Н.К. Зенков // Успехи современ. биологии.- 1993. Т.113, вып.4,- С.442-455. 52. Мещерякова А.В., Демидова Е.М., Старостина Т.А. Иммуноморфологические изменения в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности и сопутствующей урогенитальной инфекции // Акушерство и гинекология. - 2001.-№3. – С. 22-24. 53. Назаренко С.А., Яковлева Ю.С. Цитогенетика человека и хромосомные болезни // Томск: SST . -2001.- 83 с. 54. Носкова И.Н., НВ Артымук, Я.Л. Масенко.«Медицинские и социальные аспекты неблагоприятного исхода беременности у женщин сельской месности. Медицина в Кусбассе . 2008 №1, стр 65-67. 55. Озолиня Л.А., Патрушев Л.И., Шполянская Н.Ю. и др. Распространенность мутаций в генах фактора V (G1691A, Leiden), протромбина (G20210A) и метилен-тетрагидрофол итредуктазы среди беременных московской популяции (С677Т) и их связь с патогенезом. Тромбоз, гемостаз и реология, 2001, 5(5), 47-53. 56. Папаян А. В., Жукова Л. Ю.. Анемии у детей, 2001. 57. Патрушев, Л.И. Экспрессия генов Текст. / Л.И. Патрушев. М.: Наука, 2000. - 830 с. 58. Подзолкова Н.М., Истратов В.Г., Золотухина Т.В. и др. Клинические и патогенетические аспекты неразвивающейся беременности // Рос. вестн. акуш.-гинекол.- 2003.-№2.- С. 40–44. 59. Проданчук, Н.Г. Токсическое воздействие ксенобиотиков на стволовые клетки как фактор риска развития общесоматической и онкологической патологии Текст. / Н.Г. Проданчук, Г.М. Балан // Современные проблемы токсикологии. 2010. - № 1. - С. 17-41. 60. Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейерс, В. Родуэлл. Биохимия человека: В двух томах. Пер. с англ.: – М.: Мир, 1993. 61. Раисова А.Т., Орлова В.Г. Значение некоторых функциональных проб для дифференциальной диагностики различных форм гиперандрогении // Методы оценки эндокринной функции репродуктивной системы. Сборник научных трудов. - М, 1999. 62. Сальникова Л.Е.,Замулаева И.А. Белопольская О.Б., Иванова Т.И., Кузнецова Г.И., «Встречаемость TCR- мутантных лимфацитов у человека в зависимости от генотипов по локусан детоксикации ксенобиотиков.» Экологическая генетика человека, том 8,№ 2 ., 2010 18-23. 63. Селье Г. /Стресс без дистресса//, 1992г, 109с. 64. Сенчук А.Я., Венцковский Б.М., Мельничук В.Д. и соавт. /Оценка клинической и лабораторной эффективности трансвагинально введенного микронизированного прогестерона при угрозе самопроизвольного выкидыша// Практикующий врач. 2004. - №3. - С.35. . 65. Серов В.Н., Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. /Современные принципы терапии воспалительных заболеваний женских половых органов: Mетодическое пособие для врачей акушеров–гинекологов.–М., 2003 .– 19 с. 123 66. Серова О.Ф., Милованов А.П./ Основные патоморфологические причины неразвивающейся беременности и обоснование предгравидарной терапии женщин // Акушерство и гинекология.- 2001.- № 3.- С. 19-23. 67. Сибиряк C.B., Черешнев В.А., Симбирцев A.C., Сибиряк Д.С., Гаврилова Т.В. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных соединений. Екатеринбург, «Центр Академического обслуживания» УрО РАН, 2006. - 160 с. 68. Сидельникова В.М. Неполноценная лютеиновая фаза (НЛФ) –тактика ведения женщин с привычной потерей беременности // Привычная потеря беременности- новый взгляд на роль половых гормонов. Тезисы Всероссийского форума «Мать и дитя».- М., 2002.- С. 907-908. 69. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности / В.М. Сидельникова. М.: Триада - X, 2002. - 304 С. 70. Сидельникова В.М., Антонов А.Г./ Гемолитическая болезнь плода и новорожденного//.Москва: Изд-во «Триада-Х», 2004.-192 с. 71. Сидельникова В.М./ Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием.// Методические пособия и клинические протоколы.- М.:- МЕДпресс-информ, 2010. -219 с. 72. Сидельниковой В. М. Актуальные проблемы невынашивания беременности (Цикл клинических лекций) М. 2001; 170. 73. Сидорова И.С., Черниенко И.Н. Внутриутробные инфекции: хламидиоз, микоплазмоз, герпес, цитомегалия //Российский вестник периноталогии и педиатрии. 1998. - №3. - С.7-13. 74. Смирнова А.Ю., ХамошинаМ.Б. , МихайловаИ.Е. и др. Анализ результатов инвазивной пренатальной диагностики хромосомных аномалий в Приморском крае / // Материалы IX всероссийского научного форума «Мать и дитя»: тезисы докладов. М., 2007. - С. 238-239. . 75. Солодилова, М.А. Некоторые вопросы этиологии язвенной болезни /М.А.Солодилова, А.В.Полоников // Российская научная конференция смеждународным участием «Медикобиологические аспекты мультифакториальнойпатологии».- Курск.- 2006.- Т.1.- с.367-369. 76. Спивак И. М.«Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие»Эко-Вектор, 2006, 220 с. 77. СпицынВ.А. ,Макаров C.B. , Пай Г.В., Бычковская Л.C./ Полиморфизм в генах человека, ассоциирующихся с биотрансформацией ксенобиотиков // Информационный вестник ВОГиС. 2006. - Т. 10, № 1.-С. 97-105. 78. Сухих, Г. Т. Иммунология беременности Текст. / Г. Т. Сухих, Л. В. Ванько. М.: Издательство РАМН, 2003. - 400 с. - Библиогр.: с. 339 - 392. 79. Тареева Т.Г., Федорова М.В., Шумина А.В. и др./ Особенности течения цитомегаловирусной инфекции у беременных с урогенитальными забо-леваниями//Вестн. Росс. асе. акуш.-гин.-1998.-№3.-С. 15-18. 80. Фогель Ф. Генетика человека: в 3 т. : пер. с англ. / Ф. Фогель, А. Мотульски. М.: Мир, 1990. . 81. Фридович, И. Свободные радикалы в биологии / И. Фридович. М.: Мир, 1979.-С. 1,272- 308. 82. Ходжаева Д.А., Лунина С.Н., Луценко H.H. Роль полиморфизма гена SOD2 у женщин в генезе неразвивающейся беременности //Вестник РГМУ-2011- специальный выпуск №2-134-136. 83. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н.Источники образования свободных радикалов и их значение в биологических системах в условиях нормы // Современные наукоемкие технологии. – 2006. – № 6 – С. 28-34. 84. Шилов, В.Н. Молекулярные механизмы структурного гомеостаза / В.Н. Шилов. М.: Интерсигнал, 2006. - 288 с. 85. Azahara I. Rupérez, Josune Olza, Mercedes Gil-Campos, Rosaura Leis,María D. Mesa, Rafael Tojo, Ramón Cañete, Ángel Gil, and Concepción M. Aguilera1 A re Catalase −844A/G Polymorphism and Activity Associated with Childhood Obesity? Antioxid Redox Signal. 2013 December 1; 19(16): 1970– 1975. doi: 10.1089/ars.2013.5386 86. Bast A., Haenen G. Oxidants and antioxidants: State of the Art. Symposium on oxidants and antioxidants. // The Am. J. of Med., Vol.91, №3, p. 10. 87. Beer AE, Kwak JYH. Reproductive medicine program. Finch University of Health Science. Chicago Medical School, 1999.- P. 96. 124 88. Bermano G, Pagmantidis V, Holloway N, Kadri S, Mowat NA, Shiel RS, Arthur JR, Mathers JC, Daly AK,Broom J, Hesketh JE.Evidence that a polymorphism within the 3'UTR of glutathione peroxidase 4 is functional and is associated with susceptibility to colorectal cancer.School of Life Sciences, The Robert Gordon University, Aberdeen, AB25 1HG, UK. Genes Nutr. 2007 Nov;2(2):225-32. 89. Bouligand J, Cabaret O, Canonico M, Verstuyft C, Dubert L, Becquemont L, Guiochon-Mantel A, Scarabin PY Effect of NFE2L2 genetic polymorphism on the association between oral estrogen therapy and the risk of venous thromboembolism in postmenopausal women.; Estrogen and Thromboembolism Risk (ESTHER) Study Group.Clin Pharmacol Ther. 2011 Jan;89(1):60-4. . 90. Bravard A, Vacher M, Moritz E, Vaslin L, Hall J, Epe B, Radicella JP.Oxidation status of human OGG1-S326C polymorphic variant determines cellular DNA repair capacity. Cancer Res. 2009 Apr 15;69(8):3642-9. 91. Burton GJ, Jauniaux E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2011 Jun;25(3):28799. 92. Cavalieri E., K.Frenkel, J. G. Liehr et al Estrogens as endogenous genotoxic agents: DNA adducts and mutations. // JNCI Monograph 27. - 2008 : estrogens as endogenous carcinogens in the breast and prostate. - P. 75-93, . 93. Charniot JC, Sutton A, Bonnefont-Rousselot D, Cosson C, Khani-Bittar R, Giral P, Charnaux N, Albertini JP. Manganese superoxide dismutase dimorphism relationship with severity and prognosis in cardiogenic shock due to dilated cardiomyopathy.Free Radic Res. 2011 Apr;45(4):379-88. doi: 10.3109/10715762.2010.532792. Epub 2010 Nov 10. 94. Chen H, Yu M, Li M, Zhao R, Zhu Q, Zhou W, Lu M, Lu Y, Zheng T, Jiang J, Zhao W, Xiang K, Jia W, Liu L.Polymorphic variations in manganese superoxide dismutase (MnSOD), glutathione peroxidase-1 (GPX1), and catalase (CAT) contribute to elevated plasma triglyceride levels in Chinese patients with type 2 diabetes or diabetic cardiovascular disease.Mol Cell Biochem. 2012 Apr;363(1-2):85-91. Epub 2011 Dec 14. 95. Chen X, Liu X, Wang J, Guo W, Sun C, Cai Z, Wu Q, Xu X, Wang Y. Functional polymorphisms of the hOGG1 gene confer risk to type 2 epithelial ovarian cancer in Chinese. Int J Gynecol Cancer. 2011 Nov;21(8):1407-13. . 96. Chen X, Wang J, Guo W, Liu X, Sun C, Cai Z, Fan Y, Wang Y.Two functional variations in 5'-UTR of hoGG1 gene associated with the risk of breast cancer in Chinese. Breast Cancer Res Treat. 2011 Jun;127(3):795-803. 97. Cindrova-Davies T., Hong-Wa Y. et al Oxidative stress, gene expression and protein changes induced in the human placenta during labor // Am. J. Pathol. – 2007. – Vol. 171, № 4. – P. 1117–1168. 98. Corvol, J.-C., Bonnet, C., Charbonnier-Beaupel, F., Bonnet, A.-M., Fievet, M.-H., Bellanger, A., Roze, E., Meliksetyan, G., Ben Djebara, M., Hartmann, A., Lacomblez, L., Vrignaud, C., Zahr, N., Agid, Y., Costentin, J., Hulot, J.-S., Vidailhet, M.The COMT Val158Met polymorphism affects the response to entacapone in Parkinson's disease: a randomized crossover clinical trial.Ann. Neurol. 69: 111-118, 2011. 99. Crosley LK, Bashir S, Nicol F, Arthur JR, Hesketh JE, Sneddon AA. The single-nucleotide polymorphism (GPX4c718t) in the glutathione peroxidase 4 gene influences endothelial cell function: interaction with selenium and fatty acids.Mol Nutr Food Res. 2013 Dec;57(12):2185-94. . 100. Dalton, TP (2000). «Knockout of the Mouse Glutamate Cysteine Ligase Catalytic Subunit (Gclc) Gene: Embryonic Lethal When Homozygous, and Proposed Model for Moderate Glutathione Deficiency When Heterozygous». Biochem Biophys Res Commun. 279 (2): 324. 101. Daly, A.K. Recent advances in understanding the molecular basis of polymorphisms in genes encoding cytochrome P450 enzymes Text. / A.K. Daly, K.S. Fairbrother, J. Smart // Toxicology Letters. 1998. Vol. 102-103. - P. 143147. 102. Domschke K, Tidow N, Schrempf M, Schwarte K, Klauke B, Reif A, Kersting A, Arolt V, Zwanzger P,J.Prog Deckert Epigenetic signature of panic disorder: a role of glutamate decarboxylase 1 (GAD1) DNA hypomethylation?Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2013 Oct 1;46:189-96. doi: 10.1016/j.pnpbp.2013.07.014. Epub 2013 Jul 29.PMID:23906988. 103. Du XH, Dai XX, Xia Song R, Zou XZ, Yan Sun W, Mo XY, Lu Bai G, Xiong YM. SNP and mRNA expression for glutathione peroxidase 4 in Kashin-Beck disease. Br J Nutr. 2012 Jan;107(2):164-9. doi: 10.1017/S0007114511002704. Epub 2011 Jun 23. PubMed PMID: 21733339. 125 104. Feng Y, Zhao X, Zhou C, Yang L, Liu Y, Bian C, Gou J, Lin X, Wang Z, Zhao X The associations between the Val158Met in the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene and the risk of uterine leiomyoma (ULM)..Gene. 2013 Oct 25;529(2):296-9. doi: 10.1016/j.gene.2013.07.019. Epub 2013 Aug 9.PMID:23939469. 105. Florio P., Luisi S., Galleri L. et al. The official journal of the international society of gynecology endocrinology //Gynecological endocrinology.-v.22 suppl.-№1. - Books of abstracts.- Florence.- Marech 2-5.-2006.-P.62. 106. Gardner R.J. Chromosome abnormalities and genetic counseling. Third edition / Gardner R.J., Sutherland G.R. // Oxford monographs on medical genetics, №46,- Oxford: Oxford University Press, 2004, 557 p. 107. Gothelf D, Law AJ, Frisch A, Chen J, Zarchi O, Michaelovsky E, Ren-Patterson R, Lipska BK, Carmel M, Kolachana B, Weizman A, Weinberger DR Biological Effects of COMT Haplotypes and Psychosis Risk in 22q11.2 Deletion Syndrome..Biol Psychiatry. 2013 Aug 27. pii: S0006-3223(13)00675-6. doi: 10.1016/j.biopsych.2013.07.021. PMID:23992923 108. Hartikainen JM, Tengström M, Kosma VM, Kinnula VL, Mannermaa A, Soini Y Genetic polymorphisms and protein expression of NRF2 and Sulfiredoxin predict survival outcomes in breast cancer..Cancer Res. 2012 Nov 1;72(21):5537-46. . 109. Hayashi S.I., Watanabe J., Nakachi K., Kawajiri K. PCR detection of an A/G polymorphism within exon 7 of the CYP1A1 gene //Nucleic Acids Res. - 1991. - V.19, № 17. - P.4797. 110. Houston JP, Kohler J, Ostbye KM, Heinloth A, Perlis RH Association of catechol-Omethyltransferase variants with duloxetine response in major depressive disorder..Psychiatry Res. 2011 Oct 30;189(3):475-7. doi: 10.1016/j.psychres.2011.07.002. Epub 2011 Jul 24.PMID:21788083. 111. Jung SW, Park NH, Shin JW, Park BR, Kim CJ, Lee JE, Shin ES, Kim JA, Chung YH.Polymorphisms of DNA repair genes in Korean hepatocellular carcinoma patients with chronic hepatitis B: possible implications on survival.J Hepatol. 2012 Sep;57(3):621-7. doi: 10.1016/j.jhep.2012.04.039. Epub 2012 May 29.PMID:22659345 112. Khodayari S, Salehi Z, Fakhrieh Asl S, Aminian K, Mirzaei Gisomi N, Torabi Dalivandan S. Catalase gene C-262T polymorphism: importance in ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol. 2013 May;28(5):819-22. doi: 10.1111/jgh.12141. PubMed PMID: 23425094 113. Knott L, Hartridge T, Brown NL, Mansell JP, Sandy JR: Homocysteine oxidation and apoptosis: a potential cause of cleft palate. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2003, 39:98-105. 114. Lascarin G., Tokmadzic VS, Strbo N. Progesterone induced blocking factor (PIBF) mediates progesterone induced suppression of decidual lymphocyte cytotoxicity // Am.J. Reprod Immunol.-2002.Oct.v 48, № 4.-Р. 201-9. 115. Lee YH, Song GG COMT Val158Met and PPARγ Pro12Ala polymorphisms and susceptibility to Alzheimer's disease: a meta-analysis..Neurol Sci. 2014 Jan 30. PMID:24477323 116. Lensen R, Rosendaal F, Vandenbroucke J, Bertina R. Factor V Leiden: the venousthrombotic risk in thrombophilic families. Br J Haematol. 2000 Sep;110(4):939-45.PubMed PMID: 11054086. 117. Liang S, Liu X, Fan P, Liu R, Zhang J, He G, Liu Y, Bai H. Association betweenVal158Met functional polymorphism in the COMT gene and risk of preeclampsia in a Chinese population. Arch Med Res. 2012 Feb;43(2):154-8. doi:10.1016/j.arcmed.2012.03.002. Epub 2012 Apr 1. PubMed PMID: 22475780. 118. Lin G, Zhao J, Wu J, Andreevich O R, Zhang WH, Zhang Y, Yu L.Contribution of catechol-Omethyltransferase Val158Met polymorphism to endometrial cancer risk in postmenopausal women: a meta-analysis.Genet Mol Res. 2013 Dec 10;12(4):6442-53. doi: 10.4238/2013.December.10.5.PMID:24390993. 119. Liu SY, Zhang CJ, Si XM, Yao YF, Shi L, Ke JK, Yu L, Shi L, Yang ZQ, Huang XQ, Sun H, Chu JY.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi Association between single nucleotide polymorphisms of 5'untranslated region of GPx4 gene and male infertility].. 2011 Jun;28(3):270-4. Chinese. 120. Maga G., Villani G., Crespan E., Wimmer U., Ferrari E., Bertocci B., Hiibscher U. (2007) 8-oxoguanine bypass by human DNA polymerases in the presence of auxiliary proteins. Nature, 447, p. 606608. 126 121. McGillivray G, Rosenfeld JA, McKinlay Gardner RJ, Gillam LH. Genetic counselling and ethical issues with chromosome microarray analysis in prenatal testing. Prenat Diagn. 2012 Apr;32(4):389-95. doi: 10.1002/pd.3849. PubMed PMID: 22467169. 122. Méplan C, Dragsted LO, Ravn-Haren G, Tjønneland A, Vogel U, Hesketh J.Association between polymorphisms in glutathione peroxidase and selenoprotein P genes, glutathione peroxidase activity, HRT use and breast cancer risk. PLoS One. 2013 Sep 10;8(9):e73316. doi: 10.1371/journal.pone.0073316. eCollection 2013. 123. Miller H., Grollman A.P. (1997) Kinetics of DNA polymerase I (Klenow fragment exo~) activity on damaged DNA templates: Effect of proximal and distal template damage on DNA synthesis. Biochemistry, 36, p. 15336-15342. 124. Myatt L, Cui X: Oxidative stress in the placenta. Histochem Cell Biol 2004, 122:369-382. 125. Plum GE, Grollman AP, Johnson F, Breslauer KJ. Influence of the oxidatively damaged adduct 8oxodeoxyguanosine on the conformation, energetics, and thermodynamic stability of a DNA duplex. Biochemistry. 1995 Dec 12;34(49):16148-60. PubMed PMID: 8519772. 126. Polonikov AV, Vialykh EK, Churnosov MI, Illig T, Freidin MB, Vasil'eva OV, Bushueva OY, Ryzhaeva VN, Bulgakova IV, Solodilova MA.The C718T polymorphism in the 3'-untranslated region of glutathione peroxidase-4 gene is a predictor of cerebral stroke in patients with essential hypertension.Hypertens Res. 2011 Dec 8. doi: 10.1038/hr.2011.213. 127. Qiao J, Wang ZB, Feng HL, Miao YL, Wang Q, Yu Y, Wei YC, Yan J, Wang WH, Shen W, Sun SC, Schatten H, Sun QY.The root of reduced fertility in aged women and possible therapentic options: Current status and future perspects. Mol Aspects Med. 2013 Jun 21. pii: S0098-2997(13)00041-1. . 128. Rabinowitch H.L. Superoxide radicals, superoxide dismutases and oxygen toxycity in plants / H.L. Rabinowitch, I. Fridovich // Photo-chem. Photobiol. 1983. - V. 37- № 6. - P. 679-690. 129. Rajaraman P, Hutchinson A, Rothman N, Black PM, Fine HA, Loeffler JS, Selker RG, Shapiro WR, Linet MS, Inskip PD. Oxidative response gene polymorphisms and risk of adult brain tumors. Neuro Oncol. 2008 Oct;10(5):709-15. doi: 10.1215/15228517-2008-037. Epub 2008 Aug 5. PubMed PMID: 18682580; PubMed Central PMCID: PMC2666247. 130. Reindollar RH.Contemporary issues for spontaneous abortion. Does recurrent abortion exist? Obstet Gynecol Clin North Am. 2000 Sep;27(3):541-54. . 131. Ruiz-Sanz JI, Aurrekoetxea I, Matorras R, Ruiz-Larrea MB. Ala16Val SOD2 polymorphism is associated with higher pregnancy rates in in vitro fertilization cycles. Fertil Steril. 2011 Apr;95(5):1601-5. doi:10.1016/j.fertnstert.2010.11.022. Epub 2010 Dec 3. PubMed PMID: 21130430. 132. Sabouhi S, Salehi Z, Bahadori MH, Mahdavi M. Human catalase gene polymorphism (CAT C-262T) and risk of male infertility. Andrologia. 2014 Jan 23. doi:10.1111/and.12228. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 24456074 133. Salker M, Teklenburg G, Molokhia M, Lavery S, Trew G, Aojanepong T, Mardon HJ, Lokugamage AU, Rai R, Landles C, Roelen BA, Quenby S, Kuijk EW, Kavelaars A, Heijnen CJ, Regan L, Macklon NS, Brosens JJ. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 2010 Apr 21;5(4):e10287. 134. Salnikova L, Chumachenko A, Belopolskaya O, Rubanovich A. Correlations between DNA polymorphism and frequencies of gamma-radiation induced and spontaneous cytogenetic damage. Health Phys. 2012 Jul;103(1):37-41. doi:10.1097/HP.0b013e3182231a9d. PubMed PMID: 22647910. 135. Salnikova LE, Belopolskaya OB, Zelinskaya NI, Rubanovich AV. The potential effect of gender in CYP1A1 and GSTM1 genotype-specific associations with pediatric brain tumor. Tumour Biol. 2013 Oct;34(5):2709-19. doi: 10.1007/s13277-013-0823-y. Epub 2013 May 10. PubMed PMID: 23661361 136. Shen W, Li T, Hu Y, Liu H, Song M. Common polymorphisms in the CYP1A1 and CYP11A1 genes and polycystic ovary syndrome risk: a meta-analysis and meta-regression. Arch Gynecol Obstet. 2014 Jan;289(1):107-18. doi: 10.1007/s00404-013-2939-0. Epub 2013 Jul 13. PubMed PMID: 23852617. 137. Shimoda-Maёtsubayashi S., Matsumine H., Kobayashi T. Structural dimorphism in the mitochondrial targeting sequence in human manganese superoxide dismutase gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 226. P. 561-565. 138. Sliwinski T, Przybylowska K, Markiewicz L, Rusin P, Pietruszewska W,Zelinska-Blizniewska H, Olszewski J, Morawiec-Sztandera A, Mlynarski W, Majsterek I. MUTYH Tyr165Cys, OGG1 Ser326Cys and 127 XPD Lys751Gln polymorphisms and head neck cancer susceptibility: a case control study. Mol Biol Rep. 2011Feb;38(2):1251-61. doi: 10.1007/s11033-010-0224-x. Epub 2010 Jun 23. PubMed PMID:20571908. 139. Srivastava A, Srivastava K, Pandey SN, Choudhuri G, Mittal B. Single-nucleotide polymorphisms of DNA repair genes OGG1 and XRCC1: association with gallbladder cancer in North Indian population. Ann Surg Oncol. 2009 Jun;16(6):1695-703. doi: 10.1245/s10434-009-0354-3. Epub 2009 Mar 6.PMID:19266243. 140. Struznka L, Chalimoniuk M, Sulkowski G. (September 2005). «The role of astroglia in Pb-exposed adult rat brain with respect to glutamate toxicity». Toxicology 212 (2-3): 185-194. PMID 15955607. . 141. Su Y, Xu A, Zhu J.The effect of oxoguanine glycosylase 1 rs1052133 polymorphism on colorectal cancer risk in Caucasian population. Tumour Biol. 2014 Jan;35(1):513-7. doi: 10.1007/s13277-013-10729. Epub 2013 Aug 23.PMID:23975367 142. Sun C, Liu X, Zhang H, Guo W, Cai Z, Chen H, Zhang K, Zhu D, Wang Y.Functional polymorphism of hOGG1 gene is associated with type 2 diabetes mellitus in Chinese population. Mol Cell Endocrinol. 2010 Aug 30;325(1-2):128-34 143. Suzuki T, Shibata T, Takaya K, Shiraishi K, Kohno T, Kunitoh H, Tsuta K, Furuta K, Goto K, Hosoda F, Sakamoto H, Motohashi H, Yamamoto M.Regulatory nexus of synthesis and degradation deciphers cellular Nrf2 expression levels.Mol Cell Biol. 2013 Jun;33(12):2402-12. doi: 10.1128/MCB.00065-13. Epub 2013 Apr 9.PMID:23572560. 144. Suzuki T, Shibata T, Takaya K, Shiraishi K, Kohno T, Kunitoh H, Tsuta K, Furuta K, Goto K, Hosoda F, Sakamoto H, Motohashi H, Yamamoto M/Regulatory nexus of synthesis and degradation deciphers cellular Nrf2 expression levels.Mol Cell Biol. 2013 Jun;33(12):2402-12. doi: 10.1128/MCB.00065-13. Epub 2013 Apr 9.PMID:23572560. 145. Szekeres- Bartho J., Progesterone receptor- mediated immunomodulation and antiabortive effects: The role of PIBF // Gynecologycal Endocrynology.-2001-15(55)-Р. 43. 146. Tanaka K. (2007) RNA polymerase II bypasses 8-oxoguanine in the presence of transcription elongation factor TFIIS. DNA Repair, 6, p. 841-851. 147. Tefik T, Kucukgergin C, Sanli O, Oktar T, Seckin S, Ozsoy C. Manganese superoxide dismutase Ile58Thr, catalase C-262T and myeloperoxidase G-463A gene polymorphisms in patients with prostate cancer: relation to advanced and metastatic disease. BJU Int. 2013 Aug;112(4):E406-14. 148. Tefik T, Kucukgergin C, Sanli O, Oktar T, Seckin S, Ozsoy C. Manganese superoxide dismutase Ile58Thr, catalase C-262T and myeloperoxidase G-463A gene polymorphisms in patients with prostate cancer: relation to advanced and metastatic disease..BJU Int. 2013 Aug;112(4). 149. Tian C, Liu L, Yang X, Wu H, Ouyang Q.The Val158Met polymorphism in the COMT gene is associated with increased cancer risks in Chinese population. Tumour Biol. 2013 Dec 5.PMID:24307619. 150. Tiihonen, J., Hallikainen, T., Lachman, H., Saito, T., Volavka, J., Kauhanen, J., Salonen, J. T., Ryynanen, O.-P., Koulu, M., Karvonen, M. K., Pohjalainen, T., Syvalahti, E., Hietala, J.Association between the functional variant of the catechol-O-methyltransferase (COMT) gene and type 1 alcoholism.Molec. Psychiat. 4: 286-289, 1999. 151. Vialykh EK, Solidolova MA, Bushueva OIu, Bulgakova IV, Polonikov AV. Catalase gene polymorphism is associated with increased risk of cerebral stroke in hypertensive patients. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 2012;112(8 Pt 2):3-7. Russian. PubMed PMID: 23390647. 152. Vieira SM, Monteiro MB, Marques T, Luna AM, Fortes MA, Nery M, Queiroz M, Dib SA, Vendramini MF, Azevedo MJ, Canani LH, Parisi MC, Pavin EJ, Giannella-Neto D, Corrêa-Giannella ML.Association of genetic variants in the promoter region of genes encoding p22phox (CYBA) and glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) and renal disease in patients with type 1 diabetes mellitus. BMC Med Genet. 2011 Sep 30;12:129. 153. Villette S, Kyle JA, Brown KM, Pickard K, Milne JS, Nicol F, Arthur JR, Hesketh JE .A novel single nucleotide polymorphism in the 3' untranslated region of human glutathione peroxidase 4 influences lipoxygenase metabolism..Blood Cells Mol Dis. 2002 Sep-Oct;29(2):174-8. 154. Wang D, Curtis A, Papp AC, Koletar SL, Para MF Polymorphism in glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) is associated with sulfamethoxazole-induced hypersensitivity in HIV/AIDS patients.BMC Med Genomics. 2012 Jul 23;5:32. doi: 10.1186/1755-8794-5-32.PMID:22824134. 128 155. Wang X, Wang Z, Wu Y, Yuan Y, Hou Z, Hou G.Association analysis of the catechol-Omethyltransferase /methylenetetrahydrofolate reductase genes and cognition in late-onset depression. Psychiatry Clin Neurosci. 2013 Dec 25. doi: 10.1111/pcn.12133. PMID:24373005. 156. Wen S.Y., Wang H., Sun O.J., Wang S.Q. Rapid detection of the known SNPs of CYP2D9 using oligonucleotide microarray // World J. Gastroenterol. -2003. -V.9. P. 1342-1346. . 157. Woo, J.-M., Yoon, K.-S., Yu, B.-H.Catechol O-methyltransferase genetic polymorphism in panic disorder.Am. J. Psychiat. 159: 1785-1787, 2002.[PubMed:12359690. 158. Xu CH, Wang Q, Qian Q, Zhan P, Yu LK. CYP1A1 exon7 polymorphism is associated with lung cancer risk among the female population and among smokers: a meta-analysis. Tumour Biol. 2013 Dec;34(6):3901-11. doi: 10.1007/s13277-013-0978-6. Epub 2013 Jul 7. PubMed PMID: 23832578. 159. Yamashita Т., Liu X., Опака Т., Honda K., Saito Т., Yagi K. Vasopressin differentially modulates noradrenaline release in the rat supraoptic nucleus // Neuroreport. 2001. -V. 12. - P. 3509-3511. . 160. Yang LL, Huang MS, Huang CC, Wang TH, Lin MC, Wu CC, Wang CC, Lu SH, Yuan TY, Liao YH, Ko YC, Wang TN.The association between adult asthma and superoxide dismutase and catalase gene activity.Int Arch Allergy Immunol. 2011;156(4):373-80. Epub 2011 Aug 9. 161. Yi JF, Li YM, Liu T, He WT, Li X, Zhou WC, Kang SL, Zeng XT, Zhang JQ. Mn-SOD and CuZn-SOD polymorphisms and interactions with risk factors in gastric cancer. World J Gastroenterol. 2010 Oct 7;16(37):4738-46. 162. Yu B, Lin H, Yang L, Chen K, Luo H, Liu J, Gao X, Xia X, Huang Z.J Genetic variation in the Nrf2 promoter associates with defective spermatogenesis in humans.Mol Med (Berl). 2012 Nov;90(11):133342. 163. Zhang H, Xu Y, Zhang Z, Li L The hOGG1 Ser326Cys polymorphism and prostate cancer risk: a meta-analysis of 2584 cases and 3234 controls..BMC Cancer. 2011 Sep 13;11:391. doi: 10.1186/14712407-11-391.PMID:21914193. 164. Zhang J, Zhou J, Zhang P, Wang W, Tao S, Wang A meta-analysis of the association between the hOGG1 Ser326Cys polymorphism and the risk of esophageal squamous cell carcinoma. M.PLoS One. 2013 Jun 6;8(6):e65742. doi: 10.1371/journal.pone.0065742. Print 2013.PMID:23762419. 165. Zuo HP, Xu WJ, Luo M, Zhu ZZ, Zhu GS.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi The glutamatecysteine ligase catalytic subunit gene C-129T and modifier subunit gene G-23T polymorphisms and risk for coronary diseases].. 2007 Jul;35(7):637-40. . 166. Zurcher, G. Rapid and sensitive single-step radiochemical assay for catechol-Omethyltransferase / G. Zurcher, M. Da Prada // J. Neurochemistry. - 1982, -Vol.38.-P. 191-195. 129
