Масс-спектрометр
advertisement
Опыт использования метода масс-спектрометрии в санитарной и клинической бактериологии ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора С.н.с., к.б.н. Точилина А.Г., в.н.с., к.м.н.Белова, д.б.н. Соловьева Масс-спектрометрия – аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества (молекулярные весы) Масс-спектрометр – это инструмент, способный в условиях вакуума разделять находящиеся в газовой фазе заряженные частицы вещества согласно отношению их массы к заряду (m/z ratio). С 2011 года методика идентификации микроорганизмов с помощью Biotyper была внесена в реестр медицинских технологий. Масс-спектрометры серии Flex имеют регистрационные удостоверения о внесении прибора в государственный реестр изделий медицинской техники и Сертификаты Госстандарта России об утверждении средств измерений MALDI Biotyper имеет европейский сертификат IVD Directive 98/79/EC. Прямое масс-спектрометрическое белковое профилирование для видовой идентификации микроорганизмов (бактерии, грибы) Biotyper a.i. 1400 1200 1000 800 600 400 200 4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z Прямое нанесение с питательной среды Снятие единичной колонии Перенесение на мишень Нанесение матрицы Экстракция Этанолом/муравьиной кислотой + 300 μl ddH2O +900 μl C2H5OH (96%) Удаление супернатанта+50 μl HCOOH (70%) +50 μl CH3CN 1 μl супернатанта переносится на мишень MALDI Biotyper RTC Задать проект Запустить прибор Получить результат Указать поз. образцов Идентификация с помощью MALDI Biotyper 3.0 1. Снять спектры, сохранить 4. Загрузить базу данных 2. Запустить MALDI Biotyper 3.0 3. Загрузить спектры 5. Запустить идентификацию, получить результат ribosomal Protein RL36 RS32 RL34 RL33meth. RL32 RL30 RL35 RL29 RL31 RS21 Escherichia coli 6254.64 5380.64 5000 4364.06 3000 6410.90 7157.65 7273.87 6315.49 4000 5096.01 2000 1000 8368.99 7870.62 Intens. [a.u.] Результаты идентификации 0 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 m/z m/z 4364,33 5095,82 5380,39 6255,39 6315,19 6410,60 7157,74 7273,45 7871,06 8368,76 Таблица результатов Представление результатов идентификации, выполненной в «ручном режиме» Candida utilis Candida utilis DSM 342 Другие типы материала. Моча. Жидкая культура 1мл : центрифуг./отмывка /центрифуг. Экстракция бактериального осадка, нанесение на мишень •Не более 2-х микроорганизмов •Концентрация > клеток 106клеток Добавление матрицы Идентификация гемокультуры с помощью MALDI Biotyper Пробоподготовка • • • • • Лизис эритроцитов Осаждение гемоглобина Отмывка от гемоглобина Очистка от солей Белковая экстракция • Получение результата в течение 20-30 минут • Идентификация > 80 % случаев • Отсутствие ложноположительных результатов • Работа с флаконами без угля/с углем • Идентификация не более 1 микроорганизма Идентификация сальмонелл в кале Образец кала Инокуляция Инкубация ночь при 37°C 150 µl супернатанта Центрифугирова ние, отмывка Лизис Селективная среда (e.g. selenite) Приготовление мишени Идентификация MALDI Biotyper Получение масс-спектров MALDI-TOF MS Результат в течение одного дня! Salmonella bongori S. cholerasuis S. enterica S. enteritidis S. tiphimurium S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica S.enterica st. st. st. st. st. st. st. st. st. st. st. anatum arizonae diarizonae dublin enterica gallinarum hadar houtenae indica salamae stanley Масс-спектрометрическая идентификация резистентности по деградации антибиотиков Сarbapenem-sensitive K. pneumoniae strain (A, D, and G), Сarbapenem-resistant K. pneumoniae strain (B, E, and H), Сarbapenem-resistant strain in the presence of the Sparbier K et al. J. Clin. Microbiol. carbapenemase inhibitor APBA (C, F, and I). 2012;50:927-937 Положения и типы аминокислотных замен в гене β-лактамазы типа ТЕМ-1, приводящих к образованию ферментов с «расширенным» спектром действия (БЛРС) Мутации в гене β-лактамазы типа ТЕМ, обуславливающие устойчивость к ингибиторам MALDI-ToF минисеквенирование forward праймер SNP ДНК ПЦР праймер + ddA reverse праймер dNT P ампликоны + праймер SAP ампликоны dNT P + минисеквенирование 5’ 3’ + праймер CT 3’ GAXGCT (TC) ddA; ddC dG 5’ MALDI-ToF праймер +dG+ddC Анализ полученных данных, программа FlexAnalisys: Схема проведения идентификации белка по его пептидному фингерпринту Вырезание отдельных белковых пятен (>20 г/мм2) Трипсинолиз белков в фрагментах геля Получение масс-спектра Идентификация по базам данных Заключение • MALDI TOF масс-спектрометр позволяет на одном приборе: ▫ Провести идентификацию чистой культуры микроорганизмов в течение 1-2 минут ▫ Повысить точность (специфичность) исследования ▫ Объективизировать интерпретацию результатов ▫ Расширить спектр идентифицируемых бактерий ▫ Охарактеризовать исследуемые штаммы по наличию антибиотикорезистентности (как по фенотипу -деградация антибиотика, так и по генотипу-минисеквенирование) ▫ Найти метку штамма (особенности протеома) ▫ Провести эпид анализ и выявить источник инфекции Лаборатория микробиома человека и средств его коррекции ФБУН ННИИЭМ им. И.Н.Блохиной • 432-81-86 • 432-87-93 Спасибо за внимание!
