Масс-спектрометр
advertisement
Новый протеогеномный метод идентификации микроорганизмов Челябинск, 2010 • Масс-спектрометрия – аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества - • Масс-спектрометр – инструмент, способный в условиях вакуума разделять заряженные частицы вещества, находящиеся в газовой фазе, по отношению их массы к заряду (m/z) 1й этап масс-спектрометрического анализа Мягкая ионизация - MALDI Матрично-Активированная Лазерная Десорбция/Ионизация МАТРИЦА: УФ лазер - Поглощает энергию _лазерного излучения Ионы аналита Нобелевский лауреат 2002 Измерение ионы матрицы - “вскипая”, увлекает _ в газовую фазу _ молекулы _аналита - способствует _ ионизации аналита – Циано-4-гидроксикоричная кислота Сокристаллизованное с матрицей вещество NC ОН O OH 2й этап масс-спектрометрического анализа Сортировка ионов по массам по времени пролѐта (TOF) Ускорение Образцы погруженного в матрикс аналита на планшете Свободный дрейф ионов + + + + + Электроды + Детектор Интенсивность Лазерная десорбция/ионизация Определение времени пролѐта (TOF) t ~ m/z ионов до детектора Масса t пролѐта m/z 1 Да 100 Да 1000 Да 10 000 Да 5 х 10 50 х 10 150 х 10 500 х 10 -7 -7 -7 -7 U=20-7кВ, расстояние -1 м сек сек сек сек Схема исследования MALDI – ToF-MS Пробоподготовка Идентификация Biotyper a.i. 500 Пробоподготовка 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 m/z Колония первичного посева клинического материала Прямое бактериальное белковое профилирование для видовой идентификации и штаммового типирования Характеристики исследования: • Быстрая и простая пробоподготовка: 5 минут/образец • Предел измерения 104-105 клеток • Скорость измерения: ~ 1 мин / образец • Возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования Подготовка образца Колония первичного посева 70% этанол Осадок в 70% муравьиную к-ту и 50% ацетонитрил Повторное центрифугирование Стальной планшет AnchorChip – это стальная планшета, содержащая гидрофильные пятна для образцов точно заданного размера (600 или 400 мкм), окруженные гидрофобным покрытием. Такое устройство планшет позволяет готовить объемов (0.3 - 1мкл). образцы из очень малых Незначительное влияние состава питательных сред на белковый профиль Рост Pseudomonas oleovorans на различных средах Psdm. oleovorans B396_Medium 360 1000 0 Psdm. oleovorans B396_Medium 464 1000 Воспроизводимость вне зависимости отPsdm. источника oleovorans B396_Medium 53 выделения, типа инструмента, лаборатории 0 1000 0 Psdm. oleovorans B396_Medium 65 1000 0 Psdm. oleovorans B396_Medium 98 1000 500 0 Psdm. oleovorans B396_MRS10 2000 1000 0 Psdm. oleovorans B396_YPD 2000 1000 0 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Bruker Daltonics 4364.06 Рибосомальный белок ribosomal Protein RL36 RS32 RL34 RL33meth. RL32 RL30 RL35 RL29 RL31 RS21 6254.64 5380.64 5000 7157.65 7273.87 3000 6410.90 5096.01 6315.49 4000 7870.62 2000 1000 8368.99 Intens. [a.u.] Чрезвычайно высокая воспроизводимость обусловлена измерением мажорных рибосомальных белков 0 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 m/z m/z m/z 4364,33 5095,82 5380,39 6255,39 6315,19 6410,60 7157,74 7273,45 7871,06 8368,76 Intens. [a.u.] Прямое белковое профилирование x10 5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 m/z Программное обеспечение BioTyper База данных BioTyper 3476 штаммов Идентификация c ПО “BioTyper” 1 Суммарный спектр Аналитическое ПО и открытая пополняемая база данных на 3476 штаммов Идентификация пиков по индексу совпадения спектров 2 Исследуемый образец Идеально совпавшие с базой 3 Совпавшие в более широком диапазоне отклонений Несовпавшие 4 Показатель достоверности: >2,0 – достоверная видовая идентификация База Biotyper 1,7-2,0 - вероятная идентификация до рода <1,7 – не идентифицирован Neisseria N.meningitidis N.gonorrhoeae E.N.Ilina et al J Mol Diagn 2009,11 (1): 75-86 Лабораторная апробация совместно с сотрудниками межклинической бактериологической лаборатории ММА им. И.М.Сеченова • Проанализирован 831 посев. Идентификация проведена для 822 (99%). _В 9 случаях скудный рост • Расхождение с бактериологическими данными в 37 случаях (4,5%) совпадение данных расхождение данных В 35 случаях идентификация МС (BioTyper) подтверждена секвенированием 16S RNA. В 2х случаях секвенирование подтвердило бактериологическую идентификацию. Прямая идентификация из биологических образцов Прямая идентификация возбудителей из мочи: • Проанализировано 200 образцов • Идентификация проведена для 188 образцов (94%) • Совпадение результатов _ с бактериологической идентификацией в 179 случаях (95,2%) • Расхождение данных в 9 случаях (4,8%): - в 4х случаях МС-идентификация подтверждена секвенированием _ - в 5 случаях проведена МС-идентификация и скудный рост при бактериологическом тестировании Данные представлены на 19 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, 16-19 мая 2009 Прямое белковое профилирование a.i. 1400 1200 1000 800 600 400 200 4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z Масс-спектрометрия – надежный метод идентификации микроорганизмов с минимальными трудовыми и финансовыми затратами на пробоподготовку и анализ Генетически-детерминированная лекарственная устойчивость Дикий тип Препарат ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ УСТОЙЧИВЫЕ НАРУШЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ОПРЕДЕЛЕННЫХ УЧАСТКАХ БАКТЕРИАЛЬНОГО ГЕНОМА, СВЯЗАННЫЕ С ФОРМИРОВАНИЕМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТОМУ ИЛИ ИНОМУ ПРОТИВОМИКРОНБОМУ ПРЕПАРАТУ Мутантный тип Изониазид Мутации в генах katG, inhA, ahpC, oxyR, furA Рифампицин Мутации в гене rpoB Пиразинамид Мутации в гене pncA Этамбутол Мутации в гене embB Стрептомицин Мутации в гене rpsL, rrs Фторхинолоны Мутации в генах gyrA, gyrB Канамицин/ амикацин Мутации в гене rrs (16S pРНК) Исследуемый материал: мокрота, биологические жидкости, культура микроорганизма, т.д. ПЦР (для накопления гена, несущего маркерную мутацию) Реакция минисиквенирования MALDI-ToF масс-спектрометрия продуктов реакции минисиквенирования Получение масс-профилей Анализ масс-спектра и вывод о наличии мутации, приводящей к лекарственной УСТОЙЧИВОСТИ микроорганизма Устойчивость к рифампицину 531 Ser Мутация в 531 кодоне гена rpoB -субъединицы РНК-полимеразы Дикий тип CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG CCC GGC GGT CTG Ser531Leu ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... Праймер 19 звеньев Праймер 19 звеньев TC Достроенный праймер 20 звеньев ТС +ddC 273,1898 + ДНК-полимераза + ddTTP +ddCTP ТТ Достроенный праймер 20 звеньев ТТ +ddT 288,2015 Практическое применение Разработан набор для выявления маркеров устойчивости к рифампицину, изониазиду и этамбутолу у M. tuberculosis • Шесть (6) систем праймеров для амплификации фрагментов генов: rpoB субъединицы РНК-полимеразы, katG - каталазы - пероксидазы, inhA - eнол-АСР-редуктазы, embB – арабинозилтрансферазы и gyrA - субъединицы А ДНК-гиразы • Двадцать один (21) зонд для выявления мутаций минисеквенированияем с последующей MALDI-ToF масс-спектрометрией • В работе: – системы праймеров для амплификации rrs генов – Праймеры (зонды) для анализа мутаций, ассоциированных с устойчивостью и канамицину/амикацину Исследованы 1003 штамма Mycobacterium tuberculosis Центральный регион РФ - 410 Уральский регион РФ - 310 Сибирский (западносибирский) - 283 Сибирский Центральный ЦНИИ туберкулеза, Москва НИИ фтизиопульмонологии Екатеринбург НИИ туберкулеза , Новосибирск Уральский Эффективность методики: 96 % для RIF-резистентных штаммов 94% для INH-резистентных штаммов microflex (Bruker Daltonics) Чувствительность: 200 бактериальных клеток в образце Воспроизводимость результатов исследования – 100% Разработана высокоинформативная система генетического скрининга лекарственной устойчивочти M.tuberculosis При наличии в КДЛ баклаборатории и ПЦР-лаборатории достаточно подключить только масс-спектрометр Сравнение методов идентификации микроорганизмов для рутинной клинической практики Все 1660 проанализированных изолята получены из образцов крови, СМЖ, гноя, биопсий, ран, фекалий, отделяемого дыхательного тракта Метод Затраченное время Уровень подготовки персонала Цены дек. 2008 Ручной Окраска по Граму Стоимость, € 6 мин 0,6 От среднего до высокого Система идентификации API (bioMerieux) 18 - 48 ч 4,6 - 6,0 Средний Определение устойчивости к антибиотикам 18 - 48 ч 6,6 - 7,4 Средний Phoenix - система идентификации и опрeделения чувствительности к _ антибиотикам (BD Diagnostics) 5 - 20 ч 12,65 Средний 5-8ч 5,9 - 8,23 Система Vitek (bioMerieux) идентификация Средний идентификация и определенние чувствительности к антибиотикам MALDI-TOF 5-8ч 10,38 -12,71 6 - 8,5 мин 1,43 P.Seng et. al. (France), Clinical Infectious Diseases 2009; 49:543-51 От низкого до среднего MALDI-TOF масс-спектрометрия – быстрый, недорогой и точный метод для клинической бактериологии ДОСТУПНЫЙ !
