Автореферат Чжан Лицзюань - Институт биоорганической химии
advertisement
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН на правах рукописи ЧЖАН ЛИЦЗЮАНЬ НАПРАВЛЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ КАК ИНСТРУМЕНТ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ специальность 03.01.03 — Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Научный руководитель: член-корреспондент РАН доктор биологических наук Сергей Анатольевич Лукьянов Официальные оппоненты: Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН Савицкий Александр Павлович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физической биохимии института биохимии им. А.Н. Баха РАН Ведущая организация: Институт биологии гена РАН Защита состоится 7 апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д.16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан 5 марта 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А. Олейников 2 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Зеленый флуоресцентный белок GFP и его варианты и гомологи представляют собой уникальное семейство белков, способных к образованию хромофорной группы за счет автокаталитической посттрансляционной модификации собственных аминокислотных остатков, происходящей без привлечения внешних кофакторов и ферментов. Благодаря этому свойству, GFP-подобные белки широко используются в современной молекулярной и клеточной биологии в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для прижизненного мечения белков, органелл и клеток. Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФ-белки) составляют особую группу GFP-подобных белков, способных к многократному увеличению яркости флуоресценции в ответ на облучение светом определенной длины волны и интенсивности. ФАФ-белки являются мощным инструментом для точного оптического мечения и последующего слежения за перемещением выбранного объекта (отдельных клеток, внутриклеточных органелл и белков). В последнее время ФАФ-белки успешно применяются в новых методах получения изображений со сверхвысоким разрешением. Создание новых ФАФ-белков, особенно с эмиссией в красной области видимого спектра, а также новых методов их использования представляется высоко актуальной задачей, позволяющей расширить область применения GFPподобных белков. Цели и задачи работы. Целью работы было разработать новые методы анализа деградации и взаимодействий целевых белков на уровне единичных живых клеток с использованием ФАФ-белков. В рамках этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать метод мониторинга деградации целевых белков с использованием необратимо фотоактивируемого белка Dendra2. 2. Создать мономерный обратимо фотоактивируемый красный флуоресцентный белок и применить его для изучения взаимодействия целевых белков между собой. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показана возможность использования ФАФ-белков для определения скорости деградации целевых белков в режиме реального времени на уровне отдельных живых клеток. Получены и охарактеризованы обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP; выявлены аминокислотные позиции, имеющие определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости мутантов белка TagRFP. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с 3 использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом. Разработанные методы могут быть широко использованы в молекулярной и клеточной биологии для изучения функционирование белков в живой клетке. Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 11 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 144 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 5 таблицы. Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной летней школе Molecular Imaging (Гейдельберг, Германия, 2006), V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008) и Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МОНИТОРИНГА ДЕГРАДАЦИИ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕОБРАТИМО ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ 1.1. Описание предлагаемого метода. Протеолиз является одним из существенных регуляторных механизмов в жизнедеятельности клетке. Протеолитическая регуляция встречается практически во всех клеточных процессах (рост, дифференцировка, апоптоз, MHCI презентация, передача сигналов, стрессовый ответ, регуляция клеточного цикла, ДНК репарация, транскрипция). Время полужизни клеточных белков варьирует от нескольких минут до нескольких дней. К тому же, время жизни многих клеточных белков может существенно меняться в зависимости от клеточного цикла или в ответ на внешний стимул. Нарушение регуляции протеолиза в клетке может привести к различным патологиям. Получив данные о времени полужизни целевого белка in vivo, можно оценить, насколько его функция регулируется протеолизом в данных условиях. Классические методы определения времени полужизни белка в клетке основаны либо на кратковременном включении радиоактивно-меченых аминокислот, либо на общем ингибировании синтеза белка с последующим количественным определением постепенного уменьшения количества целевого белка во времени с помощью специфических антител. К недостаткам этих 4 методов следует отнести их трудоемкость, необходимость работы с радиоактивной меткой, а также, в случае применения ингибиторов белкового синтеза, серьезное нарушение метаболизма клетки, которое может повлиять на полученный результат. Очевидно также, что классические подходы неприменимы для анализа отдельных клеток в режиме реального времени. С появлением GFP было показано, что его флуоресценция позволяет проводить оценку времени полужизни целевых белков, слитых с GFP, в индивидуальных клетках в реальном времени с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитофлуориметрии. Однако, поскольку яркость флуоресценции GFP зависит как от синтеза и созревания нового белка, так и от его последующей деградации, данный подход требует применения ингибиторов белкового синтеза, Рис. 1. Схема предлагаемого метода слежения очевидно нарушающих нормальную за деградацией целевого белка с помощью жизнедеятельность клетки. ФАФ-белка. Клетки экспрессируют В данной работе мы предлагаем конструкцию, кодирующую целевой белкок, мониторинга деградации слитый с ФАФ-белком. Стационарная метод концентрация химерного белка и целевых белков с использованием соответствующий флуоресцентный сигнал мономерных фотоактивируемых (например, зеленый) зависит от уровня синтеза белка и скорости его деградации, а флуоресцентных белков, способных к также скорости созревания ФАФ-белка. После необратимому изменению спектров фотопереключения ФАФ-белка в клетке и эмиссии после появляется новый сигнал (например, возбуждения светом определенной красный), уровень которого не зависит от облучения синтеза и созревания новых молекул ФАФ- длины волны. белков, а зависит только от скорости Метод основан на экспрессии в деградации данного белка. Соответственно, слежение за интенсивностью флуоресценции клетках конструкции, кодирующих фотоактивированной формы ФАФ-белка целевой белок, слитый с ФАФ-белком позволяет оценить скорость деградации 1). После фотоактивации целевого белка в режиме реального времени (Рис. образуется спектрально различимый на уровне одной клетки. пул ФАФ-белка, количество которого не зависит от синтеза нового белка, а 5 зависит только от его деградации в клетке (следует учитывать обесцвечивание флуоресценции при ее регистрации). Это позволяет количественно оценивать скорость распада белка по исчезновению флуоресцентного сигнала. Предложенный подход был опробован на примере белка Dendra2 в качестве ФАФ-белка. Dendra2 - это мономерный зеленый флуоресцентный белок (максимум возбуждения и эмиссии при 490 и 507 нм, соответственно), который необратимо фотоактивируется, то есть приобретает красную флуоресценцию (максимум возбуждения и эмиссии при 553 и 573 нм, соответственно) в ответ на облучение ближним УФ (360-410 нм) или синим (450-490 нм) светом. Время полусозревания хромофора Dendra2 составляет 90 мин при 37°С. В данной работе мы показали возможность использования белка Dendra2 для определения времени полужизни целевых белков in vivo. 1.2. Подбор условий для визуализации, фотопереключения и наблюдения за белком Dendra2 в клетках млекопитающих В качестве модельного объекта мы использовали культуры клеток человека (линии HeLa, HEK293 и РС12), временно трансфецированные плазмидами, кодирующими белок Dendra2 и белки слияния. Для визуализации клеток использовали лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica DMIRE2 SP2, имеющий 100 мВт аргоновый лазер с линией при 488 нм, 1 мВт гелийнеоновый лазер с линией при 543 нм, 150 Вт ртутную лампу, 63х объектив и термостатируемую камеру. Для визуализации зеленой флуоресценции Dendra2 применяли сканирование 2-10% 488 нм лазером. Важно отметить, что при таком режиме сканирования фотопереключения Dendra2 в красную форму не происходит, что дает возможность оценивать интенсивность зеленой флуоресценции в клетке, не вызывая нежелательной фотоконверсии. Также было обнаружено, что такое многократное сканирование практически не приводило к обесцвечиванию зеленой формы Dendra2. Для фотопереключения Dendra2 клетки подвергали облучению в течение 15 секунд синим светом от ртутной лампы (450490 нм). Для визуализации красной флуоресценции белка в конфокальном режиме сканирования использовали 25% 543 нм лазер. В данных условиях практически не наблюдалось обесцвечивания красной флуоресценции Dendra2 после 20-30 сканирований, что достаточно для построения графика падения интенсивности красной флуоресценции вследствие деградации белка в клетке. При трансфекции клеток линии HeLa и HEK293 плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность Dendra2, была обнаружена зеленая флуоресценция, интенсивность которой при добавлении циклогексимида к клеткам не уменьшалась в течение нескольких часов. При фотоактивации синим светом наблюдали уменьшение зеленой флуоресценции и возрастание красной. 6 Далее следили за красной флуоресценцией клеток при 37°С на конфокальном микроскопе. Оказалось, что интенсивность красного сигнала в течение нескольких часов практически не падала (Рис. 2а), что показывает стабильность белка Dendra2 в живых клетках. 1.3. Влияние PEST-мотивов и убиквитина на время жизни белка Dendra2 в клетке Далее мы проверили, возможно ли направить белок Dendra2 на путь протеосомной деградации с помощью известных деградационных мотивов. Из литературы известно, что белки с периодом полураспада менее 2 часов часто содержат фрагменты, обогащенные пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином (так называемые PEST-сигналы). Делеция фрагмента, содержащего PEST-сигнал, значительно увеличивает период полураспада белка, а перенос этого фрагмента на стабильную молекулу приводит к быстрому гидролизу последней. Для проверки способности белка Dendra2 деградировать в клетке были получены следующие химерные конструкции: pDendra2-PEST(ODC) и pDendra2PEST(NPDC), где PEST(ODC) – PEST-последовательность орнитиндекарбокислазы (ODC, ornithine decarboxilase) и PEST(NPDC) – PEST-последовательность белка фактора нейтральной дифференцировки 1 (NPDC-1, neural proliferation and differentiation control protein-1). Деградационный мотив PEST белка ODC. Ранее было показано, что ЕGFP, слитый с мотивом PESTODC, имеет время полужизни от 2 до 9.8 часов в зависимости от конкретной химерной конструкции и клеточной линии. В натоящей работе, клетки HEK293, трансфецированные плазмидой рDendra2PEST(ODC), после фотоактивации показали быстрое падение красной флуоресценции со временем полужизни 2-3 часа (Рис. 2а). Деградационный мотив PEST белка NPDC-1. При экспрессии химерной конструкции pDendra2-PEST(NPDC) в клетках PC12 наблюдали очень слабую зеленую флуоресценцию. При добавлении циклогексимида (100 мкг/мл) зеленая флуоресценция исчезала очень быстро; время полужизни белка составило 15 мин (Рис. 3). При инкубации трансфецированных клеток с необратимым ингибитором протеасомы эпоксомицином (0,5 мкМ) в течение шести и более часов наблюдалось существенное увеличение интенсивности зеленой флуоресценции. Короткоживущий белок Dendra2 с N-концевым неотщепляемым убиквитином. Была создана химерная конструкция pUb(G75A/G76V)-Dendra2, которая содержит последовательность кДНК убиквитина, несущего замены G75A и G76V, и последовательность Dendra2. Известно, что при наличии этих мутаций не происходит отщепления убиквитина от белка слияния, что приводит к дестабилизации белка. При экспрессии химерной конструкции pUb(G75A/G76V)Dendra2 в клетках HEK293 зеленая флуоресценция не наблюдалась. При 7 инкубации трансфецированных клеток с ингибитором протеасомы эпоксомицином (0.5 мкМ) в течение шести и более часов появлялась зеленая флуоресценция. Вместе, эти результаты четко показывают, что белок Dendra2, как и GFP, является стабильным белком, но может быть направлен в убиквитинпротеасомную систему в составе химерных белков, несущих быстро деградируемые последовательности. 8 1.4. Определение времени полужизни белка IBα при помощи Dendra2 В качестве модельного белка для определения времени полужизни по изменению красной флуоресценции Dendra2 был выбран ингибитор NFB (IBα). IBα относится к семейству белков IB, которые Рис. 3. Репрезентативные графики изменения связываются с зеленой флуоресценции Dendra2-PEST(NPDC) в фактором клетках PС12 в присутствии циклогексимида (100 транскрипционным мкг/мл). Представленные графики соответствуют NF-B в цитоплазме, интенсивности флуоресценции отдельных клеток. препятствуя его транслокации в ядро. При воздействии на клетки TNFα (Tumor Necrosis Factor-α), IL-1 (Interleukin-1) или форболовым эфиром (PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate) происходит активация IB киназных комплексов IKK (1 и/или 2), которые фосфорилируют IBα по остаткам Ser32 и Ser36. Это приводит к быстрому распаду IBα и активации NF-B. Рис. 2. Измерение скорости деградации белков с использованием Dendra2 в трансфецированных клетках HEK293. В приведенных графиках каждая линия соответствует уровню интенсивности флуоресценции отдельной клетки (для каждого эксперимента было подсчитано по 10–15 клеток и представлено по 1-2 репрезентативных графика). (а) Изменение красной флуоресценции клеток, трансфецированных рDendra2 (пустые квадраты) или рDendra2PESTODC (черные круги и треугольники). (б) Изменение красной флуоресценции клеток, экспрессирующих рIκBα-Dendra2. Вставка показывает пример конфокального изображения клеток в зеленом канале (возбуждение при 488 нм, регистрация при 500–530 нм). (в) Изменение красной флуоресценции клеток на той же культуральной чашке, что и в (б), но после добавления 0.5 мкM ингибитора протеосомы MG132. (г) Изменение красной (пустые квадраты) и зеленой (черные круги) флуоресценции МIBα-Dendra2 в клетке HEK293. (д, е) Изменение красной флуоресценции IκBα-Dendra2 (клетки, не подвергавшиеся воздействию – открытые символы; клетки, инкубированные с 0.1 мкг/мл PMA (стрелкой показан момент добавления) – заполненные символы) в линейной (д) и полулогарифмической (е) шкалах. 9 Для белка IBα показана деградация по убиквитин-зависимому протеасомному пути. Было показано, что деградация IBα и последующая активация NF-B происходит в клетках и без стимулирующих воздействий со средней скоростью, варьирующей от 1.5 до 5 часов в зависимости от клеточной линии. Клетки HEK293, трансфецированные конструкцией pIBα-Dendra2, визуализировали под микроскопом. В клетках со средним уровнем экспрессии наблюдалась ожидаемая преимущественно цитоплазматическая локализация зеленой флуоресценции (Рис. 2б). После фотоактивации Dendra2 интенсивность возникшего красного сигнала быстро падала. Время полужизни белка IBαDendra2, измеренное по падению интенсивности красной флуоресценции, составило 1.5-2 часов (Рис. 2б). После инкубации этих клеток с ингибитором протеасомы MG132 мы наблюдали прекращение падения красной флуоресценции (Рис. 2в). Это свидетельствует о том, что падение красной флуоресценции обусловлено протеасомной деградацией белка pIBα-Dendra2. Полученные нами результаты совпадают с ранее опубликованными результатами о времени полужизни химерного белка IBα-GFP и внутриклеточного IBα. В качестве контроля мы определили время полужизни химерного белка IBα-Dendra2 классическим методом инкубации клеток с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом и последующим вестерн-блот анализом с помощью поликлональных антител против Dendra2; время полужизни IBα-Dendra2, Рис. 4. Скорость деградации IκBα-Dendra2, измеренная с измеренное таким образом, помощью инкубации клеток с циклогексимидом. Вставка составило 2 часа (Рис. 4). показывает вестерн-блот анализ (антитела против В качестве Dendra2) суммарного белка из IκBα-Dendra2трансфецированных клеток, инкубированных с дополнительного контроля циклогексимидом в течение 0, 1, 3 и 5 часов. Полоса был получен мутант IBα с соответствует ожидаемой массе 60 кДа, других полос на аминокислотными пленке не обнаружилось. График построен на основе заменами S32A и S36A данных, полученных из иммуноблота. (МIBα). Из литературных 10 данных известно, что эти мутации приводят к повышению стабильности белка IBα. Полученную химерную конструкцию pМIBα-Dendra2 экспрессировали в клетках линии HEK293. Как и ожидалось, после фотоактивации наблюдалось постепенное возрастание зеленой флуоресценции, а уровень красной флуоресценции оставался практически постоянным (Рис. 2г). Из литературных данных известно, что активация клеток форболовым эфиром (PMA) уменьшает время полужизни IBα. Действительно, мы наблюдали значительное ускорение падения красной флуоресценции после инкубирования клеток, трансфецированных рIBα-Dendra2, с форболовым эфиром (Рис. 2д,е). Время полужизни IκBα составило 20 мин, что хорошо согласуется с ранее описанным значением, равным 15 мин. Отметим, что нам удалось зарегистрировать изменения в скорости деградации белка в одной и той же клетке до и после добавления форболового эфира. В целом, полученные нами результаты относительно скорости деградации IκBα-Dendra2 хорошо согласуются с литературными данными по деградации эндогенного IκBα, а также с данными по белку слияния IκBα-EGFP. К недостаткам предлагаемого метода можно отнести: 1. Необходимость работать с экзогенными генно-инженерными конструкциями, обычно обеспечивающими повышенный уровень экспрессии целевого гена для четкой регистрации флуоресцентного сигнала. 2. Возможное влияние ФАФ-белка на деградацию целевого белка 3. Невозможность регистрации белков с очень короткими временами жизни, так как хромофор ФАФ-белка требует времени для своего созревания. Следует отметить, что все эти недостатки также можно отнести к мечению белков с помощью ЕGFP и других флуоресцентных белков, но несмотря на это, этот подход широко применяется в современной клеточной биологии. Предложенный нами метод дает уникальную возможность регистрации деградации целевого белка в режиме реального времени на уровне одной клетки без добавления ингибитора белкового синтеза, позволяет следить за изменениями скорости деградации белка при внешних воздействиях на клетку, выявить возможную связь деградации целевого белка с особенностями отдельных клеток (размер, форма, стадия клеточного цикла и пр.). 11 2. ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОМЕРНЫХ ОБРАТИМО ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ TagRFP является на сегодняшний день самым ярким мономерным красным флуоресцентным белком. Это делает TagRFP перспективной основой для получения обратимо фотопереключаемых красных флуоресцентных белков. 2.1. Получение мономерного обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка KFP-HC Мы провели мутагенез TagRFP методом случайного мутагенеза по ключевым позициям, 148 и 165 (здесь и далее нумерация по GFP, рис. 5), которые согласно литературным данным по другим флуоресцентным белкам должны в большой степени определять возможность цис-транс-изомеризации хромофора. Была получена библиотека мутантных вариантов, несущих 20 возможных аминокислотных остатков в положениях 148 и 165 в различных сочетаниях (всего 400 возможных сочетаний), экспрессирующихся в E. coli. Визуальный скрининг около 5000 колоний этой библиотеки показал наличие красных флуоресцентных белков различной яркости, однако вариантов с ярко выраженными свойствами фотоактивации найдено не было. Мы предположили, что некоторые аминокислотные остатки в окружении хромофора TagRFP мешают проявлению свойств фотоконверсии. Для преодоления этой проблемы был проведен мутагенез по положениям 148 и 165 белка-предшественника TagRFP, называемого NRM14 и обладающего мономерной структурой, но имеющего более низкую, чем у TagRFP, яркость флуоресценции. Анализ аминокислотных позиций, различающих белки TagRFP и NRM14, показывает, что только для трех из них (позиции 69, 179 и 181) боковые цепи погружены внутрь белковой глобулы (рис. 5) и, следовательно, могут напрямую влиять на способность к обратимой фотоконверсии. Мы предположили, что в случае TagRFP более объемные остатки Arg69 и Phe181 (Lys69 и Leu181 в NRM14) могут мешать цис-транс-изомеризации хромофора, которая должна происходить при фотоконверсии. Интересно, что в фотоконвертируемом белке KFP1 в соответствующих позициях 69 и 181 стоят именно Lys и Leu. При мутагенезе NRM14 было обнаружено два мутантных варианта, обладающих способностью к обратимой фотоконверсии. Один из них содержал замену S148C и проявлял фотоконверсию, аналогичную обратимой фотоактивации KFP1: интенсивность красной флуоресценции возрастала в 3–4 раза под воздействием зеленого света (530–560 нм) и затем возвращалась к исходному уровню при облучении синим светом (450–490 нм) или после инкубации в темноте. Второй мутантный белок, названный KFP-HC, содержал замены N148H и S165C (рис. 5) и проявлял свойства, обратные свойствам белка 12 KFP1: исходно относительно высокая интенсивность красной флуоресценции падала в 10 раз под воздействием зеленого света (530–560 нм) и затем возвращалась к исходному уровню при облучении синим светом (450–490 нм) или после инкубации в темноте. Так как мутант KFP-HC проявлял большую яркость флуоресценции и больший динамический диапазон фотоконверсии, мы охарактеризовали его более подробно. Рис. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей флуоресцентных белков. Нумерация остатков соответствует последовательности GFP. Разрывы, внесенные для выравнивания последовательностей, обозначены прочерками. Аминокислотные остатки, боковые цепи которых погружены в белковую глобулу, показаны на сером фоне. Аминокислотные остатки в положениях 65–67, образующие хромофорную группу, выделены прямоугольником. Замены в NMR14, отличающие его от TagRFP, подчеркнуты. Замены, характерные для KFP-HC и rsTagRFP, выделены жирным шрифтом и подчеркиванием. 13 2.2. Спектральные свойства KFP-HC Выделенный белок KFP-HC обладал флуоресценцией в красной области спектра с максимумами возбуждения и эмиссии при 585 и 615 нм, соответственно (рис. 6а). После облучения интенсивным зеленым светом интенсивность флуоресценции падала в 8–10 раз (рис. 6а). Кроме изменения интенсивности флуоресценции, происходило также некоторое изменение формы спектров возбуждения и эмиссии, что хорошо заметно при сравнении нормализованных спектров (рис. 6б). В ―потушенном‖ состоянии основной пик возбуждения немного сдвигается в синюю область (максимум при 575 нм), а также появляется новый пик при 480 нм. Последний, вероятно, соответствует протонированному состоянию хромофора и определяет восстановление ―потушенного‖ синим светом белка KFPHC. Максимум эмиссии также претерпевает гипсохромный сдвиг на 13 нм (602 нм). Измерение спектров поглощения показало, что при тушении KFP-HC зеленым светом происходит сдвиг максимума с 575 до 565 нм с некоторым увеличением коэффициента молярного поглощения (рис. 6в). Поскольку яркость флуоресценции пропорциональна произведению коэффициента молярного поглощения и квантового выхода, то очевидно, что тушение KFP-HC объясняется уменьшением квантового выхода флуоресценции. В активированном состоянии KFP-HC обладал квантовым Рис. 6. Спектральные свойства белка KFPфлуоресценции 0.08 и HC. (а) Спектры возбуждения (штриховые выходом линии) и эмиссии (сплошные линии) KFP- коэффициентом молярного поглощения HC в исходном (черные линии) и 72000 М-1 см-1. После тушения KFP-HC потушенном (серые линии) состояниях. (б) Спектры из панели а, зеленым светом, в темновых условиях, нормализованные на максимальное белок медленно возвращался к исходному значение флуоресценции для каждой (флуоресцентному) состоянию с кривой. (в) Спектры поглощения KFP-HC в исходном (черная линия) и потушенном временем полувосстановления около 30 (серая линия) состояниях. мин. 14 2.3. Фотоконверсия KFP-HC в культуре клеток млекопитающих Для демонстрации возможности использования KFP-HC для прижизненного мечения кодирующая последовательность KFP-HC была клонирована в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих. Была проведена временная трансфекция клеток линии Phoenix Eco (модификация широко используемой линии клеток эмбриональной почки человека HEK293). Флуоресцентная микроскопия показала наличие трансфецированных клеток с флуоресценцией в красной области спектра (рис. 7а). Интенсивность флуоресценции была низкой, но четко детектируемой. При наблюдении под флуоресцентным микроскопом интенсивность флуоресценции быстро падала, поскольку возбуждающий зеленый свет вызывал затухание флуоресценции белка KFP-HC. После кратковременного облучения синим светом (набор фильтров для визуализации GFP) происходило восстановление красного сигнала. Путем варьирования яркости и продолжительности облучения зеленым и синим светом удалось подобрать условия для проведения многократных циклов тушения активации белка KFP-HC без заметного необратимого фотообесцвечивания (рис. 7б). В ходе этих экспериментов выяснилось, что избыточное облучение именно синим, а не зеленым светом оказывает основное влияние на скорость необратимого фотообесцвечивания белка KFP-HC. Таким образом, белок KFP-HC может быть применен для флуоресцентного мечения в культуре клеток млекопитающих. Свойства обратимой фотоконверсии потенциально могут быть использованы для локального оптического мечения, а также для микроскопии сверхвысокого разрешения. Выявленная взаимосвязь между структурой (аминокислотной последовательностью) и способностью к обратимой фотоконверсии у различных вариантов красного флуоресцентного белка TagRFP может позволить в будущем разработать более яркие фотоконвертируемые красные флуоресцентные белки. 15 Рис. 7. Фотоконверсия KFP-HC в живых клетках млекопитающих. (а) Микрофотографии двух клеток линии Phoenix Eco, содержащих KFP-HC, полученные с использованием наборов фильтров TX2 для визуализации флуоресценции в красной области спектра. Фотографии получены последовательно в указанном порядке, каждое нечетное изображение соответствует KFP-HC в активированном состоянии, каждое четное – в потушенном состоянии. Тушение KFP-HC осуществлялось облучением зеленым светом (набор фильтров TX2), активация – облучением синим светом (набор фильтров GFP). (б) Изменение интенсивности флуоресценции KFP-HC в клетках, показанных на панели (а). Серые и черные прямоугольники над графиком обозначают интервалы облучения зеленым и синим светом, соответственно. Цифры соответствуют изображениям на панели (а). 2.4. Получение обратимо флуоресцентного белка rsTagRFP фотопереключаемого красного В сотрудничестве с лабораторией В. В. Верхуши (Медицинский колледж А. Эйнштейна, Бронкс, США) путем направленного и случайного мутагенеза красного флуоресцентного белка TagRFP был получен его вариант, имеющий обратимо фотопереключаемый спектр поглощения. Для этого был проведен направленный мутагенез по позициям 148, 165 и 203 с помощью «вырожденных» праймеров, в сочетании с случайным мутагенезом. Отбор целевых клонов производился с использованием проточного флуориметрического сортера клеток (эта работа выполнялась в лаборатории В.В. Верхуши). Изменение спектра 16 поглощения дополнительно детектировали визуально по изменению окраски бактериальных колоний (при дневном освещении) из розового в желтый после фотопереключения. В результате был получен вариант TagRFP/Phe84Trp/Ile125Leu/Asn148Ala/Ser165Gly/Phe181Leu/Lys189Asn/Tyr200Phe, который был назван rsTagRFP (reversibly switchable TagRFP). Вероятно, ключевыми заменами, обеспечивающими фотопереключаемость rsTagRFP, являются Asn148Ala и Ser165Gly, т.к. остатки Ala148 и Gly165 не могут образовать водородные связи с хромофор-образующим Tyr66, что облегчает цистранс-изомеризацию хромофора, а также мутация Phe181Leu, характерная и для KFP-HC. Разные максимумы поглощения при фотопереключении rsTagRFP, очевидно, являются следствием протонирования хромофора в «потушенном» состоянии. Схожий механизм фотопереключения был описан у других ФАФбелков, например, Dronpa и mTFP0.7. 2.5. Характеристика выделенного rsTagRFP в растворе Облучение светом при 445/25 нм переключает rsTagRFP во флуоресцентное состояние с максимумами поглощения при 567 нм и эмиссии при 585 нм (Рис. 8 и Табл. 1). Облучение светом при 570/30 нм переключает rsTagRFP в низкофлуоресцентное состояние; при этом пик поглощения при 567 нм почти исчезает, и вместо него появляется новый пик поглощения при 440 нм. Изменения в поглощении при фотоконверсии rsTagRFP, рассчитанные как изменение интегрального поглощения в диапазоне ±50 нм от максимумов при 567 нм и 440 нм составили 22 и 3.4 раза, соответственно. Соотношение яркости флуоресценции флуоресцентной и низкофлуоресцентной форм составило около 20, что совпадает с соотношением для полосы поглощения при 567 нм. Квантовый выход красной флуоресценции не изменялся при фотоконверсии и составлял 0.11. (Табл. 1). Рис. 8. Спектры поглощения, эмиссии и возбуждения rsTagRFP. Здесь НФ – нефлуоресцентная форма, Ф – флуоресцентная форма. Интересно отметить, что при титровании рН к кислую область интенсивность пика поглощения при 567 нм постепенно уменьшается и появляется пик при 440 нм. Эти два пика, очевидно, относятся к анионной и нейтральной формам гидроксифенильной группы хромофора. 17 Таблица1. Спектральные характеристики rsTagRFP по сравнению с TagRFP. rsTagRFP Белок Ф НФ Максимум поглощения, нм 567 440 Изменение поглощения в диапазоне 22 3.4 ±50 нм от максимума (соотношение) Коэффициент экстинкции, 36800 15300 M-1см-1 Максимум эмиссии, нм 585 585 Квантовый выход 0.11 0.11 Относительная яркость, % 12 0.6 pKa 6.6 TagRFP 555 69900 584 0.48 100 3.9 Ф – флуоресцентное состояние, НФ – нефлуоресцентное состояние. pKa – рН, при котором флуоресценция падает в 2 раза при титровании белка из нейтральной в кислую область. 2.6. Применение rsTagRFP взаимодействий в живой клетке для изучения белок-белковых Для изучения взаимодействия целевых белков в клетке часто используют метод резонансного переноса энергии (Fluorescence or Forster Resonance Energy Transfer, FRET) между двумя флуоресцентными белками. Один флуоресцентный белок выступает в качестве донора, другой, чей спектр поглощения хорошо перекрывается со спектром эмиссии донора, - в качестве акцептора. При сближении молекул донора и акцептора на расстояние менее 10 нм при возбуждении донора происходит нерадиационный перенос энергии на молекулу акцептора, что выражается в уменьшении яркости (и времени жизни) флуоресценции донора и увеличении яркости флуоресценции акцептора. Для детекции взаимодействия между двумя изучаемыми белками, в клетке экспрессируют конструкции, кодирующие белки слияния целевых белков с флуоресцентными белками, между которыми может происходить эффективный FRET. При взаимодействии целевых белков, флуоресцентные белки сближаются, что можно детектировать по возникновению FRET. Недавно была предложена стратегия фотохромного нерадиационного переноса энергии (photochromic FRET, pcFRET), основанного на измерении изменений яркости и/или времени жизни флуоресценции донора при обратимом «включении» и «выключении» акцептора за счет фотоиндуцируемого изменения его спектра поглощения. Это позволяет 18 упростить и повысить чувствительность детекции FRET, а также проводить многократные измерения на одной клетке. Однако, ни один из ранее описанных обратимо фотоактивируемых белков не обладал фотопереключаемым спектром поглощения, поэтому pcFRET был продемонстрирован только на синтетических красителях. Поскольку фотоконверсия rsTagRFP сопровождается резким изменением формы спектра поглощения (в частности, 20-кратным изменением амплитуды пика при 567 нм), этот белок, возможно, является подходящим акцептором для метода pcFRET. Для проверки этой возможности, в качестве донора был выбран желтый флуоресцентный белок EYFP, так как имеется значительное перекрывание между спектрами эмиссии EYFP и поглощения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии (Рис. 9а); также ожидается минимальное изменение флуоресценции rsTagRFP при воздействии возбуждающего света на EYFP. В химерном белке rsTagRFP-EYFP мы ожидали увидеть модуляцию интенсивности флуоресценции EYFP в ответ на фотоконверсию rsTagRFP (Рис. 9б). Действительно, мы регистрировали многократное обратимое усиление флуоресценции EYFP как результат тушения rsTagRFP на выделенных белках слияния rsTagRFP-EYFP (Рис. 9в) и бактериальных колониях, синтезирующих белок слияния. Обратимое увеличение яркости флуоресценции EYFP составляло 19-20%. Рис. 9. Характеристика выделенных в растворе белков слияния EYFP-rsTagRFP. (а) Наложение спектра поглощения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии и в нефлуоресцентном состоянии на спектр эмиссии EYFP. (б) Схематическое изображение фотохромного FRET, где донор – EYFP, а акцептор – rsTagRFP во флуоресцентном (rsTagRFP окрашен в красный цвет) или нефлуоресцентном состоянии (rsTagRFP окрашен в синий цвет). (в) Циклы фотопереключения белков слияния EYFP-rsTagRFP при облучении светом при 436/20 нм (16 мВт/см2 , 0.6 с) и 570/30 нм (82 мВт/см2 , 0.5 с). Интенсивность флуоресценции EYFP нормализовали на интенсивность в первом цикле переключения rsTagRFP во флуоресцентном состоянии. 19 Рис. 10. Взаимодействие между EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в живых клетках HeLa, визуализированное при помощи метода pcFRET. (а) Эпифлуоресцентные изображения клеток одного поля в фильтре YFP (левая) и TX2 (правая) до и после добавления EGF. (б) Модуляция интенсивности красной флуоресценции в клетке во время циклов фотопереключения акцептора Grb2-rsTagRFP. (в, г) Изменение флуоресценции EGFR-EYFP в ответ на переключение Grb2-rsTagRFP. (в) На графике показано относительное возрастание интенсивности флуоресценции EGFR-EYFP в ответ на переключение Grb2-rsTagRFP в нефлуоресцентное состояние в различное время до и после стимуляции EGF. Для расчета этих значений сравнивали интенсивность флуоресценции EGFR-EYFP за вычетом фона в избранных областях клеточной мембраны (время -2, 2 и 4 мин) или эндосом (время >4 мин) для пар изображений, полученных, когда rsTagRFP находился во флуоресцентном и нефлуоресцентном состоянии. (г) Псевдоцветные изображения флуоресценции EGFR-EYFP (верхний ряд: Grb2-rsTagRFP во флуоресцентном состоянии; нижний ряд: Grb2-rsTagRFP в нефлуоресцентном состоянии) до и после стимуляции EGF в нулевой момент времени. 20 Чтобы показать возможность применения pcFRET с rsTagRFP для детекции белок-белковых взаимодействий, мы использовали хорошо описанную в литературе модельную систему, в которой рецептор эпидермального ростового фактора EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) взаимодействует с белком, связывающим рецептор фактора роста Grb2 (Growth factor receptor-binding protein 2), при стимуляции клеток эпидермальным фактором роста EGF. В многочисленных экспериментах, в том числе и с применением FRET между флуоресцентными белками, ранее было показано, что после добавления в клеточную среду белка EGF активированный EGFR взаимодействует с Grb2 на плазматической мембране, а затем этот сигнальный комплекс подвергается эндоцитозу. Мы экспрессировали химерные конструкты EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в клетках линии HeLa. Внутриклеточная локализация белков слияния в нестимулированных клетках была различной. В то время как сигнал EGFR-EYFP в основном был локализован на плазматической мембране, флуоресценция Grb2rsTagRFP была распределена по всей клетке с некоторым накоплением в ядре (Рис. 10а). Добавление 100 нг/мл EGF в культуральную среду привело к быстрой (1-2 мин) транслокации Grb2-rsTagRFP и накоплению этого белка на плазматической мембране. Затем в течение 15-30 мин происходил эндоцитоз, EGFR-EYFP и Grb2rsTagRFP оказались колокализованы на эндосомах. Эти наблюдения были полностью аналогичны тем, которые описаны для белков слияния EGFR и Grb2 с другими флуоресцентными белками, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния rsTagRFP на функционирование белка Grb2. Для визуализации pcFRET между EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP были подобраны такие условия облучения, при которых не происходит заметного необратимого выцветания rsTagRFP во время циклов фотопереключения (Рис. 10б). Как и предполагалось, фотопереключение Grb2-rsTagRFP не влияло на эмиссию EGFR-EYFP в отсутствие EGF (Рис. 10в,г), что подтверждает отсутствие взаимодействий между EGFR и Grb2 в нестимулированных клетках. После добавления EGF, фотопереключение Grb2-rsTagRFP привело к примерно 20% обратимому изменению флуоресценции EGFR-EYFP и на плазматической мембране, и на эндосомах, очевидно, вследствие взаимодействия EGFR и Grb2. Следует отметить, что использованные для фотоконверсии и детекции интенсивности синего и зеленого света оказались нетоксичными для живых клеток. Таким образом, с помощью метода pcFRET нам удалось регистрировать взаимодействие EGFR и Grb2 в одной и той же клетке, до и после стимуляции. Не было обнаружено достоверной разницы между эффективностью pcFRET на плазматической мембране и эндосомах (Рис. 10в). Также мы обнаружили, что 21 добавление EGF привело к максимальному значению эффективности FRET меньше чем за 2 минуты, и в течение последующих 30 минут существенные изменения эффективности отсутствовали (Рис. 10в,г). Наши данные свидетельствуют, что комплекс EGFR-Grb2 формируется на плазматической мембране в течение нескольких десятков секунд после стимуляции EGFR и далее сохраняется неизменным при эндоцитозе в течение последующих 30 мин. Предложенный в данной работе метод pcFRET с желтым флуоресцентным белком EYFP в качестве донора и обратимо фотоактивируемым красным флуоресцентным белком rsTagRFP в качестве фотопереключаемого акцептора дает возможность простой и чувствительной детекции белок-белковых взаимодействий в живых клетках с использованием стандартных флуоресцентных или лазерных сканирующих конфокальных микроскопов. Метод позволяет измерять FRET много раз, что повышает точность детекции и позволяет проводить продолжительное наблюдение за индивидуальными клетками. ВЫВОДЫ Разработан метод мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в режиме реального времени, основанный на использовании необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков. 2. Получены обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP с различными механизмами фотоконверсии: изменением квантового выхода флуоресценции в случае белка KFP-HC, и изменением спектра поглощения при неизменном квантовом выходе флуоресценции в случае белка rsTagRFP. Показано, что аминокислотные позиции 148, 165 и 181 (нумерация относительно зеленого флуоресцентного белка GFP) играют определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка rsTagRFP в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом. 1. 22 Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Zhang L., Gurskaya N.G., Merzlyak E.M., Staroverov D.B., Mudrik N.N., Samarkina O.N., Vinokurov L.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Method for realtime monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques, 2007, 42, 446-450. 2. Чжан Л., Гурская Н.Г., Копанцева Е.Е., Мудрик Н.Н., Вагнер Л.Л., Лукьянов К.А., Чудаков Д.М.. Выявление аминокислотных остатков, ответственных за способность к обратимой фотоконверсии мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP. Биоорган. химия, 2010, 36, 187-192. Тезисы докладов на конференциях 1. Gurskaya N., Zhang L., Lukyanov K. A method for real-time monitoring protein degradation at single cell level. EMBL Heidelberg, September 4-8 2006, c 80. 2. Zhang L. Gurskaya N.G., Kopanceva E.E. Lukyanov K.A. Reversibly photoconvertible monomeric red fluorescent protein. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящѐнная 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009) стр. 276. 23
