РОЛЬ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССОВОГО

Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 55–57.
И. В. Грязева, О. К. Давыдова
РОЛЬ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ
В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА БАКТЕРИЙ
Исследовано влияние пяти гомологов ауторегуляторных молекул из группы алкилоксибензолов
(АОБ) на стрессовый ответ бактериальных клеток, оценённый на основе люминесцентного отклика
биосенсоров: ibpA при температурном воздействии, recA при УФ-облучении и soxS при окислительном стрессе. Показана зависимость эффектов от структуры и концентрации использованных гомологов АОБ.
Ключевые слова: алкилоксибензолы, Escherichia coli, ген-репортер, lux-биосенсор, стресс, белки
теплового шока, SOS-система, окислитель.
Введение. Существование микроорганизмов
происходит на фоне постоянных стрессовых воздействий, определяемых крайней изменчивостью
условий окружения. Длительная эволюция мик­
роорганизмов в природе способствовала формированию ряда защитных реакций, включающих
индукцию транскрипции стрессовых белков, таких как белки теплового шока, функционирование систем репарации ДНК, работу ферментов
антиоксидантной защиты [1].
Наряду с этим в последние годы в вопросе об
адаптации бактерий к стрессу всё большее внимание уделяется низкомолекулярным, видонеспецифичным молекулам — ауторегуляторам,
представленным у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ) [2]. Индуцируя переход
микробной популяции в гипометаболическое покоящееся состояние [3], АОБ обеспечивают формирование устойчивости составляющих её клеток к широкому спектру стрессовых факторов [4].
Механизм данных защитных эффектов, с одной
стороны, связывают с прямой протекцией бактериальных клеток ауторегуляторами от повреждающего воздействия [5], с другой стороны, объясняют функционированием АОБ в качестве сигналов тревоги, опосредованным через контроль
экспрессии стрессовых регулонов [6]. Сказанное
определило интерес к выяснению целостной картины взаимоотношений между указанными системами антистрессовой защиты клетки с уточнением роли в данном процессе АОБ.
Цель. Изучение влияния широкого ряда гомологов АОБ на стрессовый ответ бактериальных
клеток при тепловом шоке, УФ-облучении и воздействии окислителей.
Материалы и методы. При проведении исследований использовали химически синтезированные аналоги ауторегуляторных факторов бактерий, представленные коммерчески доступными
препаратами С7-АОБ, С11-АОБ и С12-АОБ (Sigma,
США), а также вновь синтезированными С9-АОБ
и С18-АОБ (Enamine, Украина).
В качестве основного объекта использовали любезно предоставленные И. В. Мануховым
(ГосНИИгенетика, Россия), сконструированные
генно-инженерными методами специфические
lux-биосенсоры Escherichia coli, позволяющие с
высокой чувствительностью и специфичностью
проводить количественную оценку функционирования стрессовых регулонов [7]. Данные штаммы характеризуются наличием клонированной
полной кассеты lux-генов Photorhabdus luminescence, промоторы которых обеспечивают дифференцированную индукцию свечения при воздействиях стрессоров определённой специфичности. Используемые штаммы выращивали в течение 16–18 ч при 37 °C на LB-бульоне (Sigma,
США) в присутствии 20 мкг/мл антибиотика ампициллина, являющегося селективным фактором
плазмиды, несущей lux-гены. Перед постановкой
эксперимента культуру дополнительно разводили той же свежей питательной средой и инкубировали ещё 3–5 ч до достижения ОП = 0,2 ед.
при 640 нм. Полученную биомассу смешивали
с АОБ до конечных концентраций 10 –6, 10 –5, 10 –4
и 10 –3 М, а также с использованной для их разведения дистиллированной водой (контроль) и выдерживали в течение 60 мин.
Температурное воздействие осуществляли путём инкубации аликвот суспензий по 300 мкл
в твёрдотельном термостате «Термит» («ДНКТехнология», Россия) при 55 °С в течение 5 мин.
УФ-облучение клеток в объёме 1 мл осуществлялось с использованием широкополосной ртутнокварцевой лампы (Osram, Германия) с расстояния
10 см через интерференционный светофильтр с
максимумом пропускания в области 254 нм, обес­
печивающей преимущественное ­повреждение
56
И. В. Грязева, О. К. Давыдова
ДНК бактериальных клеток. Окисление осуществлялось путём инкубации аликвот суспензий по
300 мкл в присутствии индуктора окислительного стресса параквата (Sigma Chemical Co, США)
в концентрации 4 · 10 –3 М в течение 10 мин. Отбор
проб после стрессового воздействия проводился
в объёме 100 мкл, интенсивность биолюминесценции измеряли с использованием микропланшетного биолюминометра LM 01T (Immunotech,
Чехия).
Количественную оценку индукции биолюминесценции проводили по формуле
Fi =
luxAi ⋅ B0
,
luxA0 ⋅ Bi
где luxA0 — световая эмиссия суспензии клеток
до стрессового воздействия; luxAi — световая
эмиссия суспензии клеток непосредственно после
стрессового воздействия; В0 — количество жизнеспособных клеток до стрессового воздействия;
Вi — количество жизнеспособных клеток после
стрессового воздействия.
Параллельно измерению интенсивности биолюминесценции проводили учёт жизнеспособных клеток, высевая аликвоты по 10 мкл на поверхность LB-агара с последующей инкубацией
в течение 24 ч при 37 °C и подсчётом количества
колониеобразующих единиц (КОЕ).
Результаты и обсуждение. Предметом первого фрагмента проведённых экспериментальных
исследований явилось изучение роли АОБ в ответе бактериальных клеток на температурное воздействие, оцениваемое по уровню биолюминесцентного отклика E. coli ibpA’::lux, соответствующего индукции белков теплового шока (в частности, белка-шаперона IbpA). Проведение предварительного эксперимента, направленного на выявление собственного влияния АОБ в отношении
штамма E. coli ibpA’::lux, позволило обнаружить
дозозависимые эффекты на уровень свечения и
ростовую способность клеток. Основанный на
этих данных расчёт фактора индукции биолюминесценции (Fi) позволил выявить зависимость
экспрессии стрессовых регулонов от концентрации АОБ, выраженную в слабой индукции гена
ibpA малыми концентрациями ауторегуляторов,
но в значительной репрессии указанного гена
при увеличении присутствия данных молекул
до концентрации 10 –3 М.
Регистрация исследуемых параметров при нагревании клеток, предварительно инкубированных с различными гомологами АОБ, позволила
выявить ряд взаимосвязанных эффектов, определяемых как концентрацией, так и строением АОБ,
а именно длинной алкильного радикала. Так,
было обнаружено, что короткоцепочечные АОБ
(С7-, С9-АОБ), обусловливая подавление синтеза
белков теплового шока, ведут к формированию
повышенной терморезистентности клеток, что
подтверждается данными их ростовой способности. В свою очередь, длинноцепочечные АОБ
(С11-, С12-, С18-АОБ) в низких концентрациях
вызывают умеренную индукцию шаперонов, защищая клетки от последующего нагревания, а в
высоких — обусловливают выраженную репрессию их синтеза, что в последующем ведёт к повышению чувствительности клеток к нагреванию
(рисунок, а).
Второй блок исследований был посвящён
изуче­нию роли АОБ в ответе бактериальных клеток на УФ-облучение, оцениваемое по уровню
биолюминесцентного отклика E. coli recA‘::lux,
соответствующего индукции гена recA, вовлечённого в систему SOS-ответа. Анализ собственных эффектов АОБ в отношении данного штамма продемонстрировал сходный с предыдущим
штаммом характер влияния, заключающийся
в снижении абсолютных значений биолюминесценции, а также уменьшении оцениваемого количества КОЕ.
Проведённое комплексное исследование эффектов АОБ на уровень активации SOS-системы
при воздействии УФ-излучения позволило обнаружить существенную репрессию SOS-ответа,
прогрессирующую с увеличением длины алкильного радикала, а следовательно, и гидрофобности
молекулы. Результаты свидетельствуют о преимущественно ингибирующем характере влияния
АОБ на SOS-ответ клеток при их облучении летальной интенсивности на фоне сохранения исходного количества жизнеспособных клеток (рисунок, б).
Третий фрагмент работы был направлен на выявление роли АОБ в ответе бактериальных клеток на воздействие окислителя — параквата, оцениваемом по уровню отклика E. coli soxS’::lux, соответствующего индукции гена soxS, являющегося транскрипционным активатором ряда генов,
обеспечивающих ответ клетки на присутствие
окислителя. Исследование собственных эффектов АОБ позволило констатировать аналогичную
зависимость от особенностей химического строения используемых гомологов и их концентрации.
Исследование влияние АОБ на уровень индук-
57
Роль алкилоксибензолов в регуляции стрессового ответа бактерий
Fi , %
Fi , %
а
120
б
120
Fi , %
100
100
100
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
10 –6
10 –5
10 –410 –3–310 –3 C, M
C7-АОБ
0
0
10 –5
C9-АОБ
10 –4
C11-АОБ
в
120
10 –3 C, M
0
0
C12-АОБ
10 –6
10 –5
10 –4 10 –3 C, M
C18-АОБ
Значения фактора индукции биолюминесценции (ось ординат) биосенсоров
при соответствующем стрессовом воздействии после предварительной инкубации с АОБ
в различных концентрациях (ось абсцисс): а) E. coli ibpA’::lux; б) E. coli recA‘::lux; в) E. coli soxS’::lux
ции гена soxS в присутствии параквата позволило
обнаружить разнонаправленные эффекты (рисунок, в). Длинноцепочечные гомологи в небольших
концентрациях (10 –6 и 10 –5 М) индуцируют активацию SoxS-регулона, в концентрации 10 –4 М демонстрируют антиоксидантные эффекты, снижая
уровень биолюминесценции ниже контрольных
значений, и при увеличении их присутствия до
10 –3 М приводят к отключению стрессового регулона. Короткоцепочечные АОБ блокируют активацию регулона с одновременным снижением
чувствительности бактериальных клеток к воздействию окислителя, что выражается в сохранении большего количества жизнеспособных клеток; защитный эффект возрастает с увеличением
концентрации АОБ.
В целом результаты проведённого исследования позволяют определить потенциальные мишени АОБ, задействованные в развитии позитивной
и негативной регуляции стрессовых генов, что
представляет большой интерес для дальнейшего
практического использования в экологии, биотехнологии, медицине и ветеринарии.
Список литературы
1. Ткаченко, А. Г. Молекулярные механизмы
стрессорных ответов у микроорганизмов. Екатеринбург : УрО РАН, 2012. 265 с.
2. Эль-Регистан, Г. И. Адаптогенные функции
внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов
/ Г. И. Эль-Регистан, А. Л. Мулюкин, Ю. А. Николаев, Н. Е. Сузина, В. Ф. Гальченко, В. И. Дуда //
Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. С. 446–456.
3. Mulyukin, A. L. Formation of resting cell by
non-spore-forming microorganisms as a strategy of
long-term survival in the environment / A. L. Mulyukin, V. S. Soina, E. V. Demkina, A. N. Kozlova,
N. E. Suzina, V. V. Dmitriev, V. I. Duda, G. I. ElRegistan // Proc. SPIE. 2003. Vol. 4939. P. 208–218.
4. Николаев, Ю. А. Роль алкилоксибензолов в
адаптации бактерий к неблагоприятным условиям
роста / Ю. А. Николаев, А. Л. Тарасов, И. А. Борзенков, В. Ф. Гальченко, Г. И. Эль-Регистан // Мик­
робиология. 2010. Т. 79, № 6. С. 760–766.
5. Капрельянц, А. С. Структурно-функциональ­
ные изменения в бактериальных и модельных
мембранах под действием фенольных липидов /
А. С. Капрельянц, М. К. Сулейменов, А. Д. Сорокина // Биол. мембраны. 1987. Т. 4, № 3. С. 254–261.
6. Голод, Н. А. Роль микробных ауторегуляторов — алкилоксибензолов в контроле экспрессии
стрессовых регулонов / Н. А. Голод, Н. Г. Лой­
ко, К. В. Лобанов, А. С. Миронов, Т. А. Воей­кова,
В. Ф. Гальченко, Ю. А. Николаев, Г. И. Эль-­Регистан
// Микробиология. 2009. Т. 78, № 6. С. 731–741.
7. Манухов, И. В. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса / И. В. Манухов, В. Ю. Котова,
Г. Б. Завильгельский // Биотехнология. 2009. № 6.
С. 16–25.