На правах рукописи МАРТИРОСОВА Елена Игоревна
advertisement
На правах рукописи МАРТИРОСОВА Елена Игоревна ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В СТАБИЛИЗАЦИИ И МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНЫХ БЕЛКОВ 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 2 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева совместно с Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович кандидат технических наук Пичугина Татьяна Викторовна Ведущая организация: НТЦ «Лекбиотех» Защита состоится «___» _________ 2007 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., 9 в ауд. 443. С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева. Автореферат разослан «___» ________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 3 Актуальность проблемы. Ферментные белки являются одними из наиболее эффективных участников технологий в пищевой промышленности, в производстве премиксов, фармацевтических препаратов, в кожевенной, текстильной и других отраслях промышленности. Однако, невысокая стабильность белковых макромолекул, ограничивает область их практического применения, что диктует необходимость стабилизации ферментов. Другой фундаментальной проблемой современной биотехнологии, решения которой востребованы практикой, является целенаправленное изменение функциональной активности ферментных белков в сторону, как повышения, так и понижения их активности. В последние годы большое внимание уделяется стабилизации белковых молекул с помощью химических шаперонов (ХШ), представленных низкомолекулярными соединениями, выполняющими такую же функцию, что и молекулярные шапероны [Welch, Brown, 1996; Tatzelt et al., 1996]. В отличие от молекулярных, химические шапероны стабилизируют белки неспецифически к структуре макромолекул в их совместных комплексах, образующихся за счет слабых взаимодействий (гидрофобных, ван-дер-ваальсовых, водородных шаперонам относятся глицерин, связей). К наиболее изученным химическим некоторые аминокислоты, сахара (трегалоза), многоатомные спирты. Химическими шаперонами являются и алкилированные оксибензолы (АОБ), что было обнаружено при изучении механизмов действия микробных ауторегуляторных факторов d1 (фd1) - аутоиндукторов анабиоза, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами [Беспалов с соавт., 2000; Колпаков с соавт., 2000], и участвующих в развитии стрессового ответа клетки [Ильинская с соавт., 2000] и образовании покоящихся форм [Мулюкин с соавт., 1996]. Важным свойством АОБ является показанная для одного из гомологов – С12-АОБ, способность повышать устойчивость модельных ферментов к pH-, UF-, T-воздействиям [Колпаков с соавт., 2000]. Однако, как правило, стабилизация белка сопровождается ингибированием его каталитической активности [Göller, Galinski, 1999]. Поэтому, разработка приемов и выяснение молекулярных механизмов модификации ферментных белков, приводящей к их функциональной стабилизации одновременно с направленным изменением каталитической активности (стимуляция – ингибирование), представляет фундаментальный интерес и имеет важное практическое значение. Цель работы — изучить роль алкилоксибензолов - химических аналогов микробных ауторегуляторных факторов d1, в процессах стабилизации и модуляции 4 активности ферментных белков и разработать приемы модификации ферментов в промышленных препаратах. Задачи исследований 1. Изучить эффекты взаимодействия индивидуальных модельных ферментов с гомологами и изомерами алкилоксибензолов (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозолом) как химическими шаперонами. 2. Разработать приемы модификации алкилоксибензолами ферментных белков в промышленных препаратах с целью их стабилизации и направленной регуляции активности. 3. Изучить механизмы действия АОБ в процессах модификации структуры белков. Научная новизна 1. В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фd1 (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их функциональной стабильности и изменению каталитической активности в сторону, как активации, так и ингибирования. Установлено, что вектор изменения каталитической активности модифицированных АОБ ферментных белков зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора. Показано 2. эффективное модифицирующее действие АОБ на концентрированные (жидкие) промышленные ферментные препараты, обеспечивающее повышение их устойчивости к тепловой денатурации и стимуляцию каталитической активности в широком диапазоне рН и температур. 3. Обнаружено, что структурно различающиеся гомологи АОБ по-разному влияют на характер изменений каталитической активности белков и их физико-химические свойства, такие как вязкость, набухание, взаимодействие с водным окружением. Выявлена корреляция между изменением степени гидрофобности модифицированных алкилоксибензолами ферментных белков и модуляцией их активности. 4. На основании данных динамики и внутримолекулярной реорганизации белков (лизоцима), модифицированных АОБ, предложены гипотезы, объясняющие изменение активности и стабилизацию ферментов в их комплексах с АОБ. Практическая ценность работы 1. Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов для сухих и жидких промышленных препаратов, основанный на 5 использовании алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов белков. Способ позволяет увеличить скорость катализа и глубину превращения промышленных полимерных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина), а также повысить каталитическую активность в широком диапазоне рН и температур. Предложен прием эффективной модификации концентрированных ферментных препаратов алкилоксибензолами за счет дробного внесения АОБ. 2. На основе использования С12-АОБ предложен способ ингибирования ферментативной активности для производств, включающих стадии консервации, в частности, таких как прекращение брожения при производстве пива, кумыса, кваса и др. 3. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: оптимизации технологий получения высокоактивных и стабильных препаратов ферментов; повышения эффективности производств, основанных на ферментативных процессах; разработки эффективных способов защиты материалов от микробных биоповреждений, а также для консервации. Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции по стабилизации белка «Biocatalyst stability» (Тулуза, Франция, 2002); 1-ом и 2-ом Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Всероссийской научнотехнической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003); 2-ой Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов. Структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 186 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 43 рисунками. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЯ ЧАСТЬ Глава 1. Объекты и методы исследования Объекты исследования. Целлюлазы ФП «Целловиридин Г3х» продуцент Trichoderma viride (АО «Восток»), концентрированные ФП глюкоамилазы, продуцент Aspergillus avamori и α-амилазы, продуцент Bacillus subtilis (АО «Биосинтезе», Литва), 6 высокоочищенные β-амилаза из ячменя («Fluka») и трипсин из свиной поджелудочной железы («Sigma»), лизоцим яичный (НПО «Биолар»). Биохимические методы анализа. Выделение микробных алкилоксибензолов проводили, как описано ранее [Светличный с соавт., 1986]. Концентрацию АОБ в образцах определяли колориметрически с диазониевым производным 3,3′-диметоксибензидина (Fast Blue B Salt diazotized — FBB, «Sigma») [Tluscik et al., 1981]. В качестве химических аналогов факторов d1 использовали алкилоксибензолы С7-АОБ, С12-АОБ, и 2-(4-парагидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол), синтезированные в МИТХТ им. М.В. Ломоносова со степенью чистоты 99,9%. АОБ вносили в реакционные среды в виде водно-спиртовых растворов или водорастворимых калиевых солей. Количество белка определяли по методу Лоури [Lowry et al., 1951] и колориметрически с Кумаси синим («Fluka») [Bradford, 1976]. Количество редуцирующих веществ определяли колориметрически с 3,5-динитросалициловой кислотой («Fluka») [Miller, 1959]. Активность целлюлаз определяли по количеству образующихся при гидролизе субстрата (Na-соль карбоксиметилцеллюлозы) редуцирующих веществ [Рухлядева, Полыгалина, 1981]. Активность амилаз определяли по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ [Грачева с соавт., 1982]. Активность трипсина определяли при гидролизе казеина модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт., 1982]. Активность лизоцима определяли по снижению оптической плотности суспензии клеток Micrococcus luteus фазы экспоненциального роста [Gorin et al., 1971]. Значения Km и Vmax β-амилазы были определены из зависимостей Лайнуивера-Бэрка. Физико-химические методы анализа. Вязкость растворов белков определяли вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988]. Степень набухания белка определяли по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001]. Гель-фильтрацию растворов белков проводили на колонке (35,0×2,5 см), заполненной сефадексом G-75 («Chemapol»). Показатель гидрофобности белка (ПГ) определяли по модифицированной методике [Серебрякова с соавт., 2002], где в качестве липофильной фазы использовали хлороформ. Рэлеевское рассеивание Мёссбауэровского излучения белковых систем (РРМИ) регистрировали на установке ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН при энергетическом разрешении ∆ε≈10–9 эв. Молекулярно-динамическое компьютерное моделирование (МДКМ) проводили методами молекулярной динамики и компьютерной графики в программе MoDyp 1.13 build 1a. 7 Статистический анализ проводили стандартными математическими методами (t-тест Стьюдента) в программе Microsoft Excel 2003. Критерий вероятности P ≤ 0,05 принимали достаточным для достоверной разницы между опытной и контрольной группами данных. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 2. Модификация алкилоксибензолами ферментов в промышленных препаратах В наших исследованиях в качестве структурных модификаторов ферментов были использованы индивидуальные соединения - С12-АОБ, С7-АОБ, аналоги фd1 бактерий [Осипов с соавт., 1986], и 2-(4-парагидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол), фd1 дрожжей [Батраков с соавт., 1993], различающиеся числом и положением заместителей (гидроксильных групп) в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала, что определяет степень гидрофобности их молекул и влияет на характер взаимодействия с молекулами биополимеров. Учитывая, что для модификации структуры макромолекул может требоваться определенное время [Березин, 1985; Беспалов с соавт., 2000], опыты проводили двумя способами: (1) одновременно смешивая растворы фермента, модифицирующего фактора и субстрата – беспрединкубационный способ; (2) предварительно стабилизируя фермент модификатором в течение 40 минут – прединкубационный способ. О модифицирующем действии добавок судили по изменению каталитической активности ферментов [Березин, 1985]. Модификация α-амилазы С12-АОБ. Было установлено, что взаимодействие С12-АОБ с α-амилазой (0,1 ед/мл) имело концентрационную зависимость: в низких концентрациях (0,1-0,93 мМ) обуславливало стимуляцию каталитической активности α-амилазы до 130% (от контроля) (рис. 1), при более высоких (выше 1,2 мМ) – вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения активности. Отметим, что стимулирующий эффект длинноцепочечных АОБ в низких концентрациях показан впервые. Другой эффект модификации ферментов С12-АОБ заключался в повышении их операционной стабильности, о чем судили по сохранению ими функциональных свойств в условиях, отличных от «стандартных». Так, стабилизированная (С12-АОБ) α-амилаза имела существенно более широкие температурный и рН-диапазоны катализа (рис. 2, табл. 1). Для других ферментов показаны аналогичные закономерности. 8 2 120 Активность, % 1 100 80 3 1,6 Редуцирующие вещества, г/л 140 1,4 3 1 1,2 2 1 60 0,8 40 0,6 20 1 0,4 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 С12-АОБ, мМ Рис. 1. Концентрационная зависимость действия С12-АОБ на изменение активности ФП α-амилазы в вариантах: 1 прединкубации; 2 без прединкубации; 3 – максимальная активность в контроле (100%) 20 30 40 50 60о 70 Температура , С 80 Рис. 2. Действие С12-АОБ на изменение активности ФП α-амилазы при различных значениях температуры: 1 - контроль (без АОБ); 2 - 0,2 мМ; 3 - максимальная активность в контрольном варианте Модификация ферментов С7-АОБ. Модификация структуры ферментов другим гомологом - С7-АОБ, отличающимся от С12-АОБ меньшим размером алкильного радикала, и вследствие этого, меньшей гидрофобностью, во всем диапазоне применяемых концентраций (0,8-12,9 мМ) обуславливала повышение каталитической активности всех изучаемых ферментов. Для всех ферментов: α-амилазы (0,017 ед/мл), глюкоамилазы (0,03 ед/мл), β-амилазы (0,04 мг/мл), целлюлаз (0,6 мг/мл), трипсина (1,2 мкг/мл) в обоих вариантах опытов, без- и прединкубационном, изменения активности имели осциллаторный характер и зависели от концентрации вносимого С7-АОБ (рис. 3). Максимальный прирост ферментативной активности при внесении С7АОБ был зафиксирован: для целлюлаз на 100% (9,7 мМ), трипсина на 45% (4,8 мМ), глюкоамилазы на 60% (9,7 мМ), α-амилазы на 55% (1,6 мМ), β-амилазы на 70% (4,8 мМ) (рис. 3). При этом для всех исследованных гидролаз в вариантах беспрединкубационной обработки были отмечены два максимума активности. Появление второго можно объяснить вероятной модификацией полимерного субстрата избытком молекул АОБ. Это предположение было подтверждено в опытах с раздельной прединкубацией с С7– АОБ обоих реакционных партнеров - фермента и субстрата. В опытах с предварительной модификацией крахмала было получено такое же увеличение эффективности гидролиза, как и при модификации α-амилазы (на 50%), но 9 концентрации требуемого для этого С7–АОБ были различны: в первом случае 11,29 мМ, а во втором - на порядок меньше 1,61 мМ. Для целлюлаз на изменение активности катализируемой реакции в большей степени влияла модификация субстрата (Nа-КМЦ), а не фермента (рис. 4). Так, при концентрации С7–АОБ 8,06 мМ эта разница составила 180 170 160 150 140 130 120 110 100 2 Активность, % Активность, % 70 %. 1 0 2,5 5 7,5 10 12,5 С7-АОБ, мМ 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 Рис. 3. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменение активности ФП глюкоамилазы в вариантах: 1 - прединкубации; 2 - без прединкубации 2 3 3 1 0 15 2 2,5 5 7,5 10 С7-АОБ, мМ 12,5 15 Рис. 4. Влияние на целлюлолитическую активность ФП "Целловиридин Г3х" раздельной прединкубации с С7-АОБ: 1 - фермента; 2 - субстрата; 3 - фермента и субстрата Вероятно, при модификации субстрата, происходит его частичная реорганизация и увеличение числа доступных сайтов, а возможные изменения степени гидратированности молекул приводят к возрастанию фермент-субстратного узнавания и реакционной способности. В наибольшей степени модификация субстрата С7–АОБ была результативна в реакциях гидролиза целлюлозы, эффективность которого, как было показано ранее, определяется способностью фермента «адсорбироваться» на субстрате [Рабинович, Мельник, 2000]. По-видимому, модификация целлюлозы с помощью АОБ увеличивает эту способность, что повышает скорость и глубину гидролиза (рис. 4). Операционная стабилизация ферментов в результате модификации их структуры С7–АОБ проявляется в значительном расширении диапазона рабочих значений температуры и рН с сохранением оптимумов катализа (табл. 1). Неизменность рН-оптимумов катализа указывает на то, что структурные модификации производными оксибензолов не затрагивают ионогенные группы, участвующие в формировании активного центра ферментов [Березин, 1985]. 10 Модификация глюкоамилазы тирозолом. Эффекты модификации структуры ферментов в комплексах с другим аналогом микробных фd1 – тирозолом, отличающимся от представленных выше АОБ расположением гидроксильных групп и отсутствием гидрофобного алкильного радикала и, поэтому большей полярностью молекулы [Schultz, 1987], продемонстрированы в опытах с ФП глюкоамилазы. Изменение активности модифицированного тирозолом фермента зависело нелинейно от концентрации добавки и способа ее внесения. Максимум увеличения активности наблюдался при дозе модификатора 16,3 мМ и составил 130% (рис. 5). Протекторные свойства тирозола выражались в развитии операционной стабилизации модифицируемого фермента так же, как в случае с другими АОБ. Беспрединкубационная обработка глюкоамилазы данным модификатором позволила достигнуть лучших результатов в рН-протекции фермента (рис. 6), чем в его термопротекции (табл. 1). Продемонстрированная неспецифичность воздействия АОБ на различные ферменты, не противоречит показанному действию химических шаперонов иной структуры, например, осмопротекторов глицин-бетаина, эктоина [Plaza del Pino, Sanchez-Ruiz, 1995; Лойко с соавт., 2002]. 0,8 2 130 Активность, % Редуцирующие вещества, г/л 135 0,7 0,6 125 3 3 0,5 120 0,4 115 1 110 2 0,3 0,2 105 1 0,1 100 0 5 10 15 Тирозол, мМ Рис. 5. Концентрационная зависимость действия тирозола на изменение активности ФП глюкоамилазы в вариантах: 1 - прединкубации; 2 - без прединкубации 1 2 3 4 рН 5 6 7 8 Рис. 6. Действие тирозола на изменение активности ФП глюкоамилазы при различных значениях рН: 1 - контроль (без АОБ); 2 - 0,2 мМ; 3 - максимальная активность в контрольном варианте При объяснении полученных результатов следует учесть, что взаимодействие белков с ХШ, в нашем случае, с короткоцепочечными С7–АОБ и тирозолом и длинноцепочечным С12–АОБ в низких концентрациях, может способствовать: 11 реорганизации белковых цепей в области или вне активного центра фермента; изменению поверхностного заряда белковой глобулы; изменению сольватных оболочек белков. Конформационная реорганизация белковых цепей (вне активного центра) косвенно подтверждается изменением спектра флуоресценции рибонуклеазы, модифицированной С12–АОБ [Колпаков с соавт., 2000]. Так же, как будет показано ниже, имеют место изменения сольватных оболочек белков, функциональные свойства воды в которых отличаются от свойств воды в объемной фазе, что показано для других ХШ [Schein, 1990; Tiwari, Bhat, 2006]. Совокупно это приводит к увеличению молекулярной динамики белка и, вследствие этого, повышению его каталитической активности. Доказательства такого объяснения рассмотрены в 4 главе. Таблица 1. Действие АОБ на изменение ферментативной активности при различных значениях температуры и рН гидролиза Модифицированный фермент С7-АОБ Целлюлазы α - амилаза Глюкоамилаза С12-АОБ α - амилаза Тирозол Глюкоамилаза Изменение границ температурного диапазона катализа Концентрация Диапазон АОБ, мМ температур, о С* Изменение границ рН-диапазона катализа Концентрация АОБ, мМ Диапазон рН, ед. рН* 1,61 2,67 2,18 10 - 65 (50)** 38 - 75 (60) 47 - 69 (60) 1,61 2,67 2,18 2,6 - 7,3 (4,5)** 4,5 - 6,8 (6,0) 2,3 - 5,5 (4,0) 0,21 40 - 65 (60) 0,72 3,9 - 6,7 (6,0) 18,1 54 - 65 (60) 16,3 2,5 - 5,2 (4,0) *В указанных диапазонах активность модифицированного фермента ≥ активности фермента в контроле (при оптимальных значениях температуры и рН) **В скобках указано оптимальное значение температуры/рН для данного фермента Поскольку длинноцепочечный С12-АОБ обладает свойствами ПАВ, то при повышенных концентрациях он образует оболочку мицеллярной структуры вокруг молекулы полимера, что обуславливает снижение конформационной подвижности модифицированного белка [Arakawa et al., 1990; Kaushik, Bhat, 1998]. Вследствие этого увеличивается стабильность глобулы одновременно с ингибированием каталитической активности белка, подобно описанным в работах [Zheng, Ornstein, 1996; Rariy, Klibanov, 1997; Пожарский, Зенченко, 1998; Baskakov, Bolen, 1998; Варфоломеев, Гуревич, 1999]. 12 В заключение сделаем вывод о том, что для максимальной эффективности катализируемых реакций необходим индивидуальный подход к модификации каждого конкретного фермента, учитывающий выбор низкомолекулярного модификатора (добавки), его концентрацию и способ обработки фермента. Глава 3. Биотехнологические аспекты применения алкилоксибензолов Модификация ферментов С7–АОБ в концентрированных ферментных растворах. Для биотехнологических исследований был выбран С7–АОБ, показавший наилучшие результаты по активации и стабилизации ферментов. Модифицировали концентрированные растворы жидких промышленных ФП α- и глюкоамилаз (способ прединкубации), затем разводили до стандартного значения (по единицам активности) фермента и использовали в реакциях гидролиза. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, при одной и той же норме расхода С7-АОБ (0,16 М на стадии прединкубации) 22-26%-ный прирост активности в сочетании с оптимальной кратностью разведения ФП (активность фермента на стадии прединкубации Апрединк = 2,5 и 12,5 ед/мл) был получен на препаратах глюкоамилазы в 25 и 125 раз более концентрированных, чем в стандартных реакциях (Апрединк = 0,1 ед/мл). Максимальная стимуляция (66% прироста активности) была получена для препарата в 12,5 раз более концентрированного (Апрединк = 1,25 ед/мл). Таблица 2. Зависимость повышения активности глюкоамилазы от соотношения числа моль С7-АОБ к единице ферментативной активности (А) (активность фермента без АОБ принимается за 100%) Активность, % 122 126 166 Расходные нормы Концентрированные растворы Стандартные растворы* Прединкубация Гидролиз Прединкубация Гидролиз ФерС7-АОБ, С7-АОБ, ФерС7-АОБ, С7мент, А мМ мент, А АОБ,** ед/мл (моль/ед)×10-3 ед/мл (моль/ед)×10-3 мМ 12,5 0,013 0,4 0,1 0,096 3,2 2,5 0,064 2,5 0,1 0,105 3,5 1,25 0,130 4,0 0,1 0,327 10,9 *Активность ферментного белка в реакционной смеси 0,03 ед/мл; **Концентрация С7-АОБ рассчитана из рис. 3, как соответствующая активности в столбце 1 Таким образом, нами впервые продемонстрирована возможность стабилизации и модуляции активности ферментов алкилоксибензолами в растворах с высоким содержанием белка, что равно применимо как для жидких концентрированных, так и сухих ферментных препаратов. В перспективе промышленного применения 13 разработанный способ стабилизации ферментов обеспечивает снижение как нормы расхода АОБ на единицу фермента, так и объема жидкого ферментного препарата. Возможные способы модификации ферментов с помощью С7-АОБ. С целью снижения расхода АОБ при стабилизации промышленно применяемых ферментных белков α- и глюкоамилазы наряду с одноразовым внесением АОБ (0,02-0,16 М) в ферментный раствор был применен дробный способ его подачи на стадии прединкубации. Раствор АОБ с концентрацией 0,32 М вносили через каждые 20 мин в ферментный раствор (1 объем) порциями по 1/14 – 1/8 объема, так чтобы его конечная концентрация соответствовала заданному значению (рис. 7). Если в области низких концентраций АОБ (до 60 мМ) изменение активности у обоих ферментов не зависело от способа внесения модификатора, то при концентрациях выше 60 мМ способ добавки влиял на результативность реакций гидролиза. Равная стимуляция амилолитической активности (до 140%) наблюдалась при меньших концентрациях дробно вносимого АОБ (0,08 М), чем при его разовом внесении (0,12 М). Таким образом, постепенное наращивание концентрации С7-АОБ на стадии прединкубации фермента приводит к уменьшению расхода модифицирующей добавки на единицу фермента. Стабилизация ферментов алкилоксибензолами в концентрированных ферментных растворах рассматривалась в нашей работе с позиций сохранения их функциональных свойств. • Функциональная стабильность сохранения каталитической активности в условиях, способствующих денатурации белка. Для определения термо-/рН-стабильности модифицированной глюкоамилазы после прединкубации фермента (Апрединк = 2,5 ед/мл) с С7-АОБ (0,16 М) их раствор экспонировали (0-60 мин) при температуре 70оС/рН 2 или 9,5, затем охлаждали/нейтрализовали и определяли остаточную ферментативную активность в реакции гидролиза при стандартном значении температуры/рН. Активность модифицированного С7-АОБ фермента в условиях термо- и рН-денатурации была выше, чем в контроле на протяжении всего времени экспонирования (рис. 8). Если 60 минутное прогревание нативного фермента привело к потере активности до 57%, то модифицированный фермент сохранил свою активность на 73% (по отношению к контролю до прогревания) (рис. 8а). В условиях как кислой, так и щелочной рН-денатурации активность стабилизированного фермента через 30 мин сохранялась на начальном уровне, в то время как активность нативного фермента 14 непрерывно снижалась (рис. 8б). Подобный эффект увеличения устойчивости биополимера к денатурирующим воздействиям при одновременном повышении каталитической активности уже отмечался в литературе для α-химотрипсина, солюбилизированного диизооктилсульфосукцинатом натрия в октане [Березин, 1985], однако для водных растворов ферментов такой эффект показан 150 130 2 а 0,4 1 2 0,3 0,2 0,1 0 120 0 20 40 60 о Длительность прогревания при 70 С, мин 110 1 100 0 0,04 0,08 0,12 0,16 С7 -АОБ в прединкубационной смеси, М Редуцирующие вещества, г/л Активность, % 140 Редуцирующие вещества, г/л впервые. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 б 0 Рис. 7. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменение активности α-амилазы в концентрированных растворах (Апрединк = 1 ед/мл) при различных способах внесения АОБ: разовом (1) и дробном (2) Следует отметить 1 2 30 60 Длительность выдерживания при рН 9,5, мин Рис. 8. Стабильность ФП глюкоамилазы в концентрированном растворе (Апрединк = 2,5 ед/мл) в условиях термо- (а) и рН-денатурации (б): 1 – без С7-АОБ (контроль) и 2 – с С7-АОБ (0,16 М) биотехнологическую перспективность полученных результатов, в частности, для производства моющих средств, где термостабильные и щелочеустойчивые амилазы (протеазы, липазы) могут быть эффективной биологической добавкой для снятия органических загрязнений [Грачева, Кривова, 2000]. • Операционная активности ферментов стабильность в условиях, как проявление отличных от каталитической «стандартных», была 15 продемонстрирована для стабилизированных АОБ ферментов, при их функционировании в широком температурном и рН-диапазонах катализа (табл. 2). Использование С7–АОБ для модификации ферментов в сгущенных препаратах позволяет, также как и в случае с разбавленными растворами ферментов, значительно расширить диапазон рабочих значений температуры и рН. Повышение эффективности функционирования ферментов, модифицированных АОБ, важно для применения ферментов при несоответствии их рН и температурного оптимумов условиям катализа, например: в пивоварении при подкислении молочной кислотой затора, в котором происходит амилолитический гидролиз крахмала зерна [Ермолаева, 2000], или в силосовании при применении целлюлаз в условиях низких температур и закисления среды [Грачева, Кривова, 2000]. Стабильность ферментов при их хранении. Для биотехнологических • целей помимо показанных эффектов важно, чтобы модифицированный с помощью АОБ фермент длительное время сохранял свои новые свойства. Полученные зависимости (рис. свидетельствуют 9) о том, что у ферментов, стабилизированных С7–АОБ, уровень активности был выше, чем в контроле в течение всего времени опыта (35-50 суток). Редуцирующие вещества, г/л 0,4 0,3 Рис. 9. Активность концентрированных растворов ФП глюкоамилазы (Апрединк = 2,5 ед/мл): 1 - без С7-АОБ (контроль) и 2 стабилизированного С7-АОБ (0,16 М) в процессе хранения 2 0,2 1 0,1 1 0 0 10 Установлено 20 30 40 Длительность хранения, сут. следующее: операционная 50 стабильность модифицированных С7–АОБ ферментов в водных растворах варьируется для разных ферментов: менее выражена для α-амилазы, характерна для глюкоамилазы и возрастает при хранении целлюлаз. Стабильность фермента при хранении может быть обусловлена не только изначальной модификацией его структуры при взаимодействии с С7–АОБ, но и ее поддержанием за счет вторичных взаимодействий с окисленными молекулами АОБ. Следует отметить, что алкилоксибензолы обладают выраженной антиоксидантной 16 активностью [Revina et al., 2002] и образующиеся при доступе кислорода продукты их окисления имеют большую биологическую активность, чем нативные молекулы. Так, в параллельно проводимых исследованиях было выявлено, что продукты окисления С7–АОБ повышали активность β-амилазы (180-200%), при этом эффективные концентрации окисленного АОБ были меньше (8,0 мМ), чем неокисленного (12,9 мМ). Таким образом, АОБ можно использовать в качестве стабилизатора при хранении ферментных препаратов в условиях доступа кислорода. Применение алкилоксибензолов для интенсификации процессов переработки промышленных субстратов. Изучение динамики гидролиза промышленных субстратов модифицированными С7-АОБ (4,8 мМ) ферментами показало, что: (1) время полного гидролиза казеина трипсином сократилось в 2 раза, а выход продуктов гидролиза увеличился в 3,4 раза по сравнению с контролем; (2) общее количество продуктов гидролиза крахмала β-амилазой возросло в 1,6 раза при сокращении времени гидролиза в 4-5 раз; (3) время гидролиза крахмала солода сократилось в 10 раз, а количество сахаров увеличилось в 1,5 раза. Отметим, что в биотехнологической промышленности востребованы приемы не только интенсификации, но и ингибирования ферментативных процессов на стадиях консервации конечных продуктов. Этим целям отвечает гомолог С12-АОБ -4 (концентрация ≥ 5·10 М). Глава 4. Изменение физико-химических свойств белков, модифицированных алкилоксибензолами Изменения основных свойств ферментов (активности и стабильности) в их комплексах с различными по гидрофобности АОБ должны быть обусловлены изменениями физико-химических характеристик биополимеров, отражающих, в той или иной степени, конформационные модификации белков и влияющих на кинетические параметры. Физико-химические свойства модифицированных белков. Установлены существенные изменения параметров вязкости (рис. 10) и набухания (рис. 11) растворов желатина, модифицированного С7- и С12-АОБ, которые в области рН < 6 в обоих случаях могут быть обусловлены образованием межмолекулярных водородных связей между протонированными молекулами белка и АОБ, что коррелирует с повышением биологической активности АОБ при рН < 7 [Эль-Регистан с соавт., 2000; Бухарин с соавт., 2005]. В области рН ≥ 7, когда образование водородных связей ингибировано 17 условиями среды, на изменение учитываемых свойств белка влиял только С12-АОБ, способный к гидрофобным отличие от С7-АОБ) водой взаимодействиям за счет (рис. 10, 11). Таким изменяются и отражаются на его 3,5 взаимодействия (в белка с гидрофобности. 80 3 70 3 3 60 2,5 50 2 40 1,5 1 1 1 30 20 0,5 10 0 0 3 5 рН 7 9 Рис. 10. Влияние АОБ на изменение вязкости желатина при различных значениях рН: 1 – контроль, 2 – С7-АОБ (8 мМ), 3 – С12-АОБ (0,05 мМ). По оси ординат отложена вязкость в пуазах, (Пз) А 100 0,1 80 0,08 ПГ, % 25 ПГ 0,06 20 0,04 0,02 15 0 0 0,1 0,2 0,3 С7-АОБ, мМ 0,4 Рис. 12. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменение показателя гидрофобности (ПГ) лизоцима и его каталитическую активность (А). Время прединкубации белка с АОБ 10 мин. 3 4 5 6рН 7 8 9 10 Рис. 11. Влияние АОБ на изменение степени набухания желатина при различных значениях рН: 1 – контроль, 2 – С7-АОБ (8 мМ), 3 – С12-АОБ (0,05 мМ). По оси ординат отложена степень набухания, (%) 0,12 Активность, ОП/мин 30 2 11 ПГ,% 1 2 0,12 0,1 ПГ 0,08 60 0,06 40 А 0,04 20 0,02 0 Активность, ОП/мин 2 % Пз образом, алкильного радикала 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 С12-АОБ, мМ 1,2 Рис. 13. Концентрационная зависимость действия С12-АОБ на изменение показателя гидрофобности (ПГ) лизоцима и его каталитическую активность (А). Время прединкубации белка с АОБ 60 мин. 18 Это было показано при исследовании комплексов лизоцима с разными гомологами АОБ методом их перераспределения в бифазной системе «вода – органический растворитель (хлороформ)». Установлено, что в широком диапазоне концентраций С7-АОБ обуславливал повышение активности при снижении гидрофобности белка (рис. 12), С12-АОБ, напротив, вызывал ингибирование активности при повышении гидрофобности лизоцима (рис. 13). Эти результаты согласуются со способностью ХШ изменять гидратацию молекул белка [Plaza del Pino, Sanchez-Ruiz, 1995]. Изменения физико-химических свойств модифицированных АОБ ферментов (β-амилазы) влияли на изменения основных кинетических параметров Km и Vmax, которые изменялись различным образом при использовании С7-АОБ (4,8 мМ) или С12-АОБ (0,64 мМ) взаимодействия как шаперонов (табл. 3) и позволяют интерпретировать фермент-АОБ как неконкурентную активацию (С7-АОБ) и неконкурентный тип ингибирования (С12-АОБ). Молекулярные механизмы действия алкилоксибензолов на белки*. Для понимания молекулярных событий, приводящих к одновременному повышению функциональной стабильности и активности ферментов, были исследованы молекулярные механизмы взаимодействия лизоцима (модельный объект в динамике белков) с АОБ методом Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ) и молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ). Данные РРМИ (рис. 14) и параллельно проводимого диффузионного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) показали, что в области малых концентраций С7-АОБ и С12-АОБ, при которых возрастает активность лизоцима, существенно возрастает конформационная подвижность, особенно в присутствии С7-АОБ, ослабевают внутримолекулярные водородные связи, возрастает междоменная подвижность. Макромолекула становится более рыхлой, приобретает свойства «жидкой» структуры (fp < 0,3) при гидратации h ≥ 0,25, в отличие от нативного лизоцима (fp > 0,3) в контроле, что объясняет стимуляцию активности фермента (рис. 14). Однако разрыхление не имеет характера денатурации, что фиксируется методом ДРРЛ и объясняет наличие функциональной стабильности. ___________________________ *Исследования проведены совместно с проф. Ю.Ф. Крупянским и сотрудниками лаборатории динамики белков ИХФ им. Н.Н. Семенова РАН, за что автор выражает им глубокую благодарность. 19 0,8 0,7 Таблица 3. Влияние АОБ на изменение кинетических параметров β-амилазы 0,6 1 fp 0,5 0,4 0,3 0,2 Кm, (мкМ) АОБ контроль 6,7±0,3 Vmax, (ммоль/ (мг × мин)) 0,03±0,0003 0,1 3 0 2 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 h Рис. 14. Зависимости доли упругого рассеяния (fp) от степени гидратации (h) для чистого лизоцима (1) 7,1±0,4 0,014±0,0001 С12-АОБ и модифицированного С7-АОБ (2) и С12-АОБ (3) С7-АОБ 6,8±0,2 0,06±0,0008 Моделирование системы (МДКМ) лизоцим-вода-ХШ предполагает, что для больших концентраций АОБ имеет место эффект «предпочтительной гидратации» белка [Gekko, Timasheff, 1981], когда молекулы АОБ располагаются во 2-ом – 3-ем гидратных слоях, соответственно «сжимая» белок, в результате чего уменьшаются равновесные флуктуации доменов и стабилизируется молекула. Вытесненные из непосредственного контакта с белком молекулы С7-АОБ формируют «стэкингобразования» типа стопок тарелок, что не мешает функционированию фермента, тогда как гидрофобные молекулы С12-АОБ образуют мицеллоподобные оболочки вокруг белка, что приводит к инактивации гидролиза. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты исследования роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белков демонстрируют их способность направленно модифицировать структуру белковых макромолекул с образованием комплексов, обладающих повышенной устойчивостью к денатурирующим воздействиям. Повышение стабильности ферментных белков сопровождалось изменением их каталитической активности в сторону как ингибирования, так и активации, что зависело от структуры АОБ и его концентрации. Подобные изменения функциональных свойств белков в их комплексах с различными АОБ коррелировали с изменением физико-химических свойств биополимеров и внутримолекулярных динамических характеристик. 20 Выявленные механизмы воздействия АОБ на функциональную активность и стабильность ферментных белков, позволяют целенаправленно модифицировать структуру белков в промышленных ферментных препаратах различной формы выпуска (жидкие и сухие) с целью повышения их устойчивости к термо- и рН-денатурации и повышения исходной каталитической активности в широком диапазоне температур и рН. ВЫВОДЫ 1. Обнаружена способность химических аналогов микробных ауторегуляторов С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола, изменять конформацию ферментов, обуславливая сопряженные изменения каталитической активности и стабильности белков, что выражается в повышении их термо- и рН-устойчивости и расширении температурного и рН диапазонов катализа. 2. Вектор изменения каталитической активности (стимуляция – ингибирование) модифицированных АОБ ферментов зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора. 3. Алкилоксибензолы влияют на изменение физико-химических свойств белка в их совместных комплексах. Установлена корреляция между изменениями физикохимических свойств гидрофобности, белков, набуханием, модифицированных изменения АОБ молекулярной (вязкостью, массы и степенью четвертичной структуры белка) и структурой АОБ. 4. Применение С7-АОБ при гидролизе промышленных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина) позволяет повысить общую скорость ведения процесса в широком диапазоне рН и температур и увеличить выход конечных продуктов реакции. 5. Показано, что эффект модификации структуры ферментов С7-АОБ зависит от способа его внесения (разовое или дробное). 6. Методами физической химии и молекулярно-динамического компьютерного моделирования установлены изменения внутримолекулярной динамики модифицированных АОБ ферментов (на примере лизоцима). 7. На основании структурно-динамических данных предложена предварительная модель взаимодействия молекул алкилоксибензолов с ферментами и сформулированы гипотезы, объясняющие одновременное увеличение стабильности и изменение активности фермента (стимуляция – ингибирование) при различных концентрациях алкилоксибензолов, различающихся гидрофобностью. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Карпекина Т.А., Степаненко И.Ю., Крылова Е.И., Козлова А.Н., Грачева И.М., Эль-Регистан Г.И. Участие микробных алкилоксибензолов в регуляции автолитической деструкции дрожжевых клеток // Микробиология. 2002. Т. 71. № 5. С. 611-618. 2. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715. 3. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Stepanenko I.Yu., Kozlova A.N., Martirosova E.I., Shanenko E.F., Strakhovskaya M.G., Revina A.A. The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation and heat shock //Advances in Space Research. 2005. V. 36. Р. 1718-1728. 4. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А., Шаненко Е.Ф., Крупянский Ю.Ф., Лойко Н.Г., Эль-Регистан Г.И. Использование алкилоксибензолов для повышения активности и стабильности ферментов// Химическая технология. 2007. № 6. С. 250-256. 5. Karpekina T.A., Stepanenko I.Yu., Krylova E.I, Revina A.A., Boudrant J., El- Registan G.I. Stabilization of enzymes by alkylhydroxybenzenes// 3rd International Conference of Protein Stabilization “Biocatalyst Stability different levels of observation”. Toulouse. 2002. P. 67. 6. Эль-Регистан Г.И., Карпекина Т.А., Степаненко И.Ю., Крылова Е.И., Шаненко Е.Ф., Крылов И.А., Красноштанова А.А., Баурина М.М., Будран Ж. Стабилизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензолами// 1-ый Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2002. С. 195-196. 7. Крылова Е.И., Эль-Регистан Г.И. Стабилизация и модуляция активности жидких ферментных препаратов// 2-ой Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2003. С. 296-297. 8. Степаненко И.Ю., Шишкина М.Л., Мартиросова Е.И., Шаненко Е.Ф., Витол И.С., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Механизм действия алкилоксибензолов на физико-химические свойства белков// Всероссийская научно-техническая конференция-выставка «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации». Москва. 2003. С. 195-199. 22 9. Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Степаненко И.Ю., Мулюкин А.Л., Мартиросова Е.И., Шаненко Е.Ф. Роль алкилоксибензолов в стрессоустойчивости клеток микроорганизмов Международная и конференция механизмы «Микробное их протекторного разнообразие: действия// состояние, 2-ая стратегия сохранения, биологический потенциал». Пермь-Казань-Пермь. 2005. С.108-109. 10. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Использование алкилоксибензолов в процессах повышения активности и стабильности ферментов// Всероссийская Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва. 2005. С. 96-97.
