Каллусогенез и регенерационная способность тканей и органов

Êàëëóñîãåíåç è ðåãåíåðàöèîííàÿ ñïîñîáíîñòü òêàíåé è îðãàíîâ...
ÓÄÊ 581.085
Í.À. Âå÷åðíèíà, Î.Ê. Òàâàðòêèëàäçå, Ñ.Â. Æàðêîâà
Êàëëóñîãåíåç è ðåãåíåðàöèîííàÿ ñïîñîáíîñòü
òêàíåé è îðãàíîâ Allium cepa L. in vitro
Äëÿ ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè ñåëåêöèîííîé
ðàáîòû íà ðàçíûõ åå ýòàïàõ âñå ÷àùå ïðèâëåêàþòñÿ íåòðàäèöèîííûå ìåòîäû. Îäíèì èç íèõ ÿâëÿåòñÿ êóëüòèâèðîâàíèå èçîëèðîâàííûõ êëåòîê,
òêàíåé è îðãàíîâ ðàñòåíèé in vitro. Îäíàêî îñíîâíûì ïðåïÿòñòâèåì íà ïóòè èñïîëüçîâàíèÿ
ýòîãî íàïðàâëåíèÿ èññëåäîâàíèé ìîæåò ñòàòü
îòñóòñòâèå ðåãåíåðàöèîííîé
ñïîñîáíîñòè
ó
êóëüòèâèðóåìûõ in vitro òêàíåé. Ïîýòîìó îäíîé
èç îñíîâíûõ çàäà÷ ýêñïåðèìåíòàòîðîâ òðàäèöèîííî ñ÷èòàåòñÿ ðåøåíèå ïðîáëåìû óïðàâëåíèÿ
ïðîöåññàìè ðåãåíåðàöèè.
 áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ ñïîñîáíîñòü ê ðåãåíåðàöèè îáíàðóæèâàåòñÿ íå ó ïåðâè÷íîãî ýêñïëàíòà, à â âîçíèêøåì îò íåãî êàëëóñå. Óñïåõ ïîëó÷åíèÿ âûñîêîìîðôîãåííîãî êàëëóñà çàâèñèò îò
íàëè÷èÿ â ïåðâè÷íîì ýêñïëàíòå ìèòîòè÷åñêè
àêòèâíûõ êëåòîê. Äëÿ èíäóêöèè êàëëóñà, îñîáåííî ó òðàäèöèîííî ñëîæíûõ â îòíîøåíèè ðåãåíåðàöèîííîé ñïîñîáíîñòè in vitro îáúåêòîâ
èññëåäîâàíèÿ – îäíîäîëüíûõ [1; 2], â òîì ÷èñëå è ïðåäñòàâèòåëåé ñåìåéñòâà Alliaceae, ÷àùå
âñåãî èñïîëüçóþò çàâÿçè è ñåìÿïî÷êè [3].
Âîçìîæíîñòü óïðàâëåíèÿ ïðîöåññàìè ðåãåíåðàöèè in vitro ðàñòåíèé Allium cepa L. ïîçâîëèò
îòíîñèòåëüíî áûñòðî ïîëó÷àòü ãîìîçèãîòíûé ìàòåðèàë èç îáîãàùåííûõ â ãåíåòè÷åñêîì îòíîøåíèè ãèáðèäîâ è èñïîëüçîâàòü åãî â ãåòåðîçèñíîé ñåëåêöèè.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû.  êà÷åñòâå îáúåêòà
èññëåäîâàíèÿ èñïîëüçîâàëè ëóê ñîðòà Åðìàê.
Ïåðâè÷íûìè ýêñïëàíòàìè ÿâëÿëèñü èçîëèðîâàííûå ñåìÿïî÷êè è çàâÿçè, êîòîðûå âû÷ëåíÿëè èç
öâåòêîâ, íàõîäÿùèõñÿ â íåðàñêðûâøèõñÿ ñîöâåòèÿõ äèàìåòðîì 2–2,5 ñì. Ïîâåðõíîñòíóþ ñòåðèëèçàöèþ ñîöâåòèÿ ïðîâîäèëè 0,1% ðàñòâîðîì ñóëåìû â òå÷åíèå 30 ìèíóò ñ ïîñëåäóþùèì
ïðîìûâàíèåì â ÷åòûðåõ ïîðöèÿõ ñòåðèëüíîé
äèñòèëëèðîâàííîé âîäû. Çàòåì ñíèìàëè ñ ñîöâåòèÿ ïîêðûâàëî è âû÷ëåíÿëè ñåìÿïî÷êè è çàâÿçè.
Ýêñïëàíòû êóëüòèâèðîâàëè íà àãàðèçîâàííîé
ïèòàòåëüíîé ñðåäå.  êà÷åñòâå ìèíåðàëüíîé îñíîâû èñïîëüçîâàëè ñðåäó ïî ïðîïèñè BDS [4].
Ñðåäû äîïîëíÿëè ðåãóëÿòîðàìè ðîñòà è ðàçâèòèÿ ðàñòåíèé: 6-áåíçèëàìèíîïóðèíîì (ÁÀÏ),
êèíåòèíîì (Ê), 1-íàôòèëóêñóñíîé êèñëîòîé (ÍÓÊ),
2,4-äèõëîðôåíîêñèóêñóñíîé êèñëîòîé (2,4-Ä), 4àìèíî-3,5,6-òðèõëîðïèêîëèíîâîé êèñëîòîé (ÀÒÕÏ),
ðÍ ñðåäû äîâîäèëè äî çíà÷åíèÿ 5,6–5,8 è
ñòåðèëèçîâàëè â àâòîêëàâå ïðè äàâëåíèè 0,9+0,1
àòì â òå÷åíèå 15 ìèíóò. Âñå îïåðàöèè, òðåáóþùèå ñîáëþäåíèÿ àñåïòè÷åñêèõ óñëîâèé, ïðîâîäèëè â ëàìèíàð-áîêñå.
Êàëëóñ èíäóöèðîâàëè â óñëîâèÿõ òåìíîòû,
à ïðîöåññû ðåãåíåðàöèè – â óñëîâèÿõ ôîòîïåðèîäà 16/8 ÷àñîâ. Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîâîäèëè ïðè 24+1o Ñ.
Äëÿ âû÷ëåíåíèÿ ñåìÿïî÷åê è çàâÿçåé, à òàêæå
ïðè íàáëþäåíèè ðàííèõ ñòàäèé ðàçâèòèÿ ìîðôîãåííûõ ñòðóêòóð â êàëëóñå, èñïîëüçîâàëè ñòåðåîìèêðîñêîï ÌÁÑ-9. Â êàæäîì âàðèàíòå îïûòà
êóëüòèâèðîâàëè 15–20 ýêñïëàíòîâ.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèÿ. Ïðè èíäóêöèè
êàëëóñà îò ñåìÿïî÷åê ëóêà áûëî èñïûòàíî 12
âàðèàíòîâ ïèòàòåëüíûõ ñðåä, ðàçëè÷àþùèõñÿ
ïî ñîñòàâó è êîíöåíòðàöèè ðåãóëÿòîðîâ ðîñòà:
ÁÀÏ (1, 2 è 5 ìêÌ) â ñî÷åòàíèè ñ 2,4-Ä èëè
ÀÒÕÏ (10 è 20 ìêÌ). Îêàçàëîñü, ÷òî èñïîëüçîâàíèå ÁÀÏ â ñî÷åòàíèè ñ ÀÒÕÏ áûëî íåýôôåêòèâíî, òàê êàê íå óäàëîñü èíäóöèðîâàòü ðàçâèòèå êàëëóñà. Òîãäà êàê 50% ñåìÿïî÷åê íà ñðåäå ÂDS
+ ÁÀÏ 2ìêÌ + 2,4-Ä 10ìêÌ ïðîëèôåðèðîâàëè
êàëëóñ. Ïîâûøåíèå êîíöåíòðàöèè 2,4-Ä äî 20
ìêÌ ïðè òîé æå êîíöåíòðàöèè öèòîêèíèíà
ñíèçèëî ýòó ñïîñîáíîñòü äî 6%. Óâåëè÷åíèå
êîíöåòðàöèè ÁÀÏ ñ 1 äî 5 ìêÌ ïðè èñïîëüçîâàíèè 10 ìêÌ 2,4-Ä èçìåíèëî êîëè÷åñòâî ïðîëèôåðèðóþùèõ ñåìÿïî÷åê ñ 14 äî 9%.
Êàëëóñ îò çàâÿçåé èíäóöèðîâàëè íà 20 âàðèàíòàõ ïèòàòåëüíûõ ñðåä. Ðåçóëüòàòû ýòîãî ýêñïåðèìåíòà ïðèâåäåíû â òàáëèöå 1.
Ïðåäñòàâëåííûå äàííûå ïîêàçûâàþò, ÷òî
èíòåíñèâíîñòü êàëëóñîãåíåçà çàâÿçåé, òàê æå,
êàê è ñåìÿïî÷åê, çàâèñåëà îò ïðèðîäû è êîíöåíòðàöèè èñïîëüçóåìûõ àóêñèíîâ. Íàèáîëåå èíäóêòèâíûìè áûëè ñðåäû, äîïîëíåííûå 2,4-Ä è
ÀÒÕÏ. Êîìáèíàöèÿ 1 ìêÌ ÁÀÏ ñ 10 ìêÌ 2,4-Ä
Òàáëèöà 1
Âëèÿíèå ðåãóëÿòîðîâ ðîñòà íà èíòåíñèâíîñòü êàëëóñîãåíåçà (%) çàâÿçåé ëóêà (n = 20)
Öèòîêèíèí
ÁÀÏ
Ê
69
ìêÌ
1
2
5
1
2
ÍÓÊ
5
20
14
–
–
40
–
–
0
–
–
35
Àóêñèí, ìêÌ
2,4–Ä
ÀÒÕÏ
5
10
20 5 10 20
7
75
– 38 0 50
–
50
40 – 55 27
–
–
0
– 33 12
33
–
– 29 –
–
–
–
56 –
– 44
ÁÈÎËÎÃÈß
ïîçâîëèëà èíäóöèðîâàòü êàëëóñ ó 75% ýêñïëàíòîâ. Ïîëó÷åííûå â óñëîâèÿõ òåìíîòû êàëëóñû ïî ìîðôîëîãè÷åñêèì õàðàêòåðèñòèêàì íå
ðàçëè÷àëèñü è ïðåäñòàâëÿëè ñîáîé ïëîòíûé êàëëóñ æåëòîãî öâåòà.
Êàëëóñû, ïîìåùåííûå íà ðåãåíåðàöèîííûå
ñðåäû è â óñëîâèÿ ôîòîïåðèîäà, óæå ÷åðåç äâå
íåäåëè êóëüòèâèðîâàíèÿ ìîæíî áûëî ðàçäåëèòü
íà òðè ìîðôîòèïà: I – áåëûå, ðûõëûå, ìåëêîçåðíèñòûå; II – áåëûå ñ çåëåíûìè î÷àãàìè, ïëîòíûå; III – æåëòûå, ðûõëûå, ãëîáóëÿðíûå. Ïðè÷åì êàëëóñ, èíäóöèðîâàííûé îò ñåìÿïî÷åê, áûë
ïðåäñòàâëåí òîëüêî òðåòüèì ìîðôîòèïîì, òîãäà
êàê êàëëóñ îò çàâÿçåé áûë âñåõ òðåõ ìîðôîòèïîâ.
Ðåãåíåðàöèîííóþ ñïîñîáíîñòü êàëëóñîâ ïðîâåðÿëè íà ÷åòûðåõ òèïàõ ïèòàòåëüíûõ ñðåä (òàáë. 2).
Íàèáîëüøàÿ ÷àñòîòà îáðàçîâàíèÿ ìîðôîãåí-
Òàáëèöà 3
Âëèÿíèå ìîðôîëîãèè êàëëóñà çàâÿçåé ëóêà
íà ðåãåíåðàöèîííóþ ñïîñîáíîñòü
Ðåãóëÿòîðû
ðîñòà, ìêÌ
ÁÀÏ8 + ÀÒÕÏ3
Îáùåå êîëè÷åñòâî
êàëëóñîâ, øò.
44
23
22
15
II
III
II
III
ÁÀÏ8 + 2,4–Ä3
Òàáëèöà 2
Âëèÿíèå ðåãóëÿòîðîâ ðîñòà
íà ðåãåíåðàöèîííóþ ñïîñîáíîñòü è ìîðôîãåíåç
êàëëóñà çàâÿçåé ëóêà
Ðåãóëÿòîðû
ðîñòà, ìêÌ
ÁÀÏ8 + ÀÕÒÏ3
ÁÀÏ8 + 2,4–Ä3
ÁÀÏ4 + ÍÓÊ0,5
ÁÀÏ8
Ìîðôîòèï
êàëëóñà
Ìîðôîãåíåç, %
ïî÷êè
êîðíè
4
0
13
0
18
26
0
46
íîãî êàëëóñà íàáëþäàëàñü â ñðåäå ñ ÁÀÏ 8 ìêÌ,
îäíàêî ïðîèñõîäèëà ðåãåíåðàöèÿ òîëüêî êîðíåé.
Âûñîêèé ïðîöåíò ìîðôîãåíåçà îòìå÷åí íà ñðåäå
BDS + ÁÀÏ 4 ìêÌ + ÍÓÊ 0,5 ìêÌ, ïðè÷åì áîëåå
ïîëîâèíû êàëëóñîâ ðåãåíåðèðîâàëè ïî÷êè. Èñïîëüçîâàíèå â ñîñòàâå ñðåäû 2,4-Ä èíäóöèðîâàëî ðåãåíåðàöèþ òîëüêî ïî÷åê, íå áûëî îòìå÷åíî
íè îäíîãî êàëëóñà ñ ðèçîãåíåçîì. ÀÒÕÏ áûëà
ìåíåå ýôôåêòèâíà ïî ñðàâíåíèþ ñ 2,4-Ä, òàê êàê
òîëüêî ó 4% êàëëóñîâ ïðîèñõîäèëà ðåãåíåðàöèÿ
ïî÷åê. Ïèòàòåëüíûå ñðåäû, â êîòîðûõ ïðîèñõîäèëà èíäóêöèÿ ðèçîãåíåçà, â ïîñëåäóþùèõ ýêñïåðèìåíòàõ íå èñïîëüçîâàëèñü, òàê êàê ïðè ïîñëåäóþùåì êóëüòèâèðîâàíèè ïðîèñõîäèë èíòåíñèâíûé
ñèíòåç ýíäîãåííîãî àóêñèíà, êîòîðûé ñòèìóëèðîâàë ïðîöåññû âòîðè÷íîé äåäèôôåðåíöèðîâêè îðãàíèçîâàííûõ ñòðóêòóð. Îäíàêî ðÿä èññëåäîâàòåëåé îòìå÷àþò, ÷òî èìåííî ñî÷åòàíèå ÁÀÏ
è ÍÓÊ ÿâëÿëîñü îäíèì èç îïòèìàëüíûõ ôàêòîðîâ, ñïîñîáñòâóþùèõ ðåãåíåðàöèè ïî÷åê è ïîáåãîâ ó ëóêà [5]. Âåðîÿòíî, ñëåäóåò ó÷èòûâàòü è
âëèÿíèå ãåíîòèïà íà ðåãåíåðàöèîííóþ ñïîñîáíîñòü
êàëëóñîâ [6; 7].
Ïðè èçó÷åíèè âëèÿíèÿ ìîðôîòèïà êàëëóñà íà
ðåãåíåðàöèîííóþ ñïîñîáíîñòü îêàçàëîñü, ÷òî òîëüêî êàëëóñû II è III òèïîâ áûëè ñïîñîáíû ê
ðåãåíåðàöèè.  òàáëèöå 3 ïðåäñòàâëåíû äàííûå, îòðàæàþùèå âëèÿíèå ìîðôîëîãè÷åñêèõ îñî-
Èíòåíñèâíîñòü
ìîðôîãåíåçà, %
ïî÷êè
êîðíè
40
20
0
33
60
30
0
11
áåííîñòåé êàëëóñà íà åãî ìîðôîãåíåòè÷åñêèé ïîòåíöèàë.
Ðåçóëüòàòû, ïðåäñòàâëåííûå â òàáëèöå 3, ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî áîëüøåé ðåãåíåðàöèîííîé ñïîñîáíîñòüþ îáëàäàë áåëûé êàëëóñ ñ çåëåíûìè î÷àãàìè. Ïðè÷åì â ñðåäå ñ 2,4-Ä åãî
ìîðôîãåíåòè÷åñêèé ïîòåíöèàë áûë âûøå, ÷åì â
ñðåäå ñ ÀÒÕÏ.
Êàëëóñ, èíäóöèðîâàííûé îò ñåìÿïî÷åê, íà ïðîòÿæåíèè âñåãî ïåðèîäà êóëüòèâèðîâàíèÿ ïî ìîðôîëîãèè áûë æåëòûì, ðûõëûì, îâîäíåííûì. Òàêèå òèïû êàëëóñîâ äëÿ ìíîãèõ êóëüòóð, â òîì
÷èñëå è äëÿ ëóêà, ÿâëÿþòñÿ íåìîðôîãåííûìè
èëè ïðîÿâëÿþò î÷åíü íèçêèé ìîðôîãåíåòè÷åñêèé
ïîòåíöèàë.
Íàáëþäàÿ çà äèíàìèêîé èçìåíåíèÿ ìîðôîãåíåòè÷åñêèõ ïðîöåññîâ, êîòîðûå ïðåäñòàâëåíû â òàáëèöå 4, ìîæíî îòìåòèòü, ÷òî ñ óâåëè÷åíèåì
ñðîêà êóëüòèâèðîâàíèÿ ïðîèñõîäèò óìåíüøåíèå
ðåãåíåðàöèîííîé ñïîñîáíîñòè êàëëóñà, èíäóöèðîâàííîãî îò çàâÿçåé ëóêà, íà÷èíàÿ ñ 3-ãî ïàññàæà íà ðåãåíåðàöèîííîé ñðåäå ñ ÀÒÕÏ è ñ 4-ãî ïàññàæà – íà ðåãåíåðàöèîííîé ñðåäå ñ 2,4-Ä.
Ñíèæåíèå ÷àñòîòû ðåãåíåðàöèè ñ óâåëè÷åíèåì ñðîêà êóëüòèâèðîâàíèÿ ñâèäåòåëüñòâóåò î
òîì, ÷òî êàëëóñû ëóêà â îñíîâíîì ðåàëèçóþò ñâîé
ìîðôîãåíåòè÷åñêèé ïîòåíöèàë íà 9–14 íåäåëå
êóëüòèâèðîâàíèÿ, ò.å. ïîëó÷àòü ðàñòåíèÿ-ðåãåíåðàíòû ëóêà öåëåñîîáðàçíî íå ïîçäíåå 2–3 ïàññàæåé. Òàêîé æå ïîäõîä ïðåäïðèíèìàëè è äðóãèå
èññëåäîâàòåëè, ðàáîòàþùèå ñ ðàñòåíèÿìè ëóêà.
Êðîìå òîãî, îòìå÷åíî, ÷òî ÷àñòîòà ðåãåíåðàöèè ðàñòåíèé âûøå ïðè èñïîëüçîâàíèè â êà÷åñòâå
ýêñïëàíòîâ çàâÿçåé, ÷åì ñåìÿïî÷åê [8].
Òàáëèöà 4
×àñòîòà ðåãåíåðàöèè (%) ïëîòíîãî
áåëîãî êàëëóñà ñ çåëåíûìè î÷àãàìè
â çàâèñèìîñòè îò äëèòåëüíîñòè êóëüòèâèðîâàíèÿ
Ðåãóëÿòîðû
ðîñòà, ìêÌ
ÁÀÏ8 + ÀÒÕÏ3
ÁÀÏ8 + 2,4–Ä3
70
1
8
32
2
60
92
Ïàññàæ
3
0
89
4
0
30
Êàëëóñîãåíåç è ðåãåíåðàöèîííàÿ ñïîñîáíîñòü òêàíåé è îðãàíîâ...
Âûâîäû
1. Ìîðôîãåíåòè÷åñêèé ïîòåíöèàë êàëëóñíûõ
òêàíåé çàâÿçåé âûøå, ÷åì ó ñåìÿïî÷åê.
2. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ïëîòíûé áåëûé êàëëóñ ñ
çåëåíûìè î÷àãàìè îáëàäàåò íàèâûñøåé ñïîñîáíîñòüþ ê ðåãåíåðàöèè ïî÷åê.
3. Ïðåîáëàäàíèå â ñðåäå öèòîêèíèíà ÁÀÏ
íàä àóêñèíàìè èíäóöèðóåò ìîðôîãåíåç â êàëëóñíîé êóëüòóðå çàâÿçåé.
4. ×àñòîòà ðåãåíåðàöèè ðàñòåíèé èç êàëëóñíûõ êóëüòóð óìåíüøàåòñÿ ñ óâåëè÷åíèåì ïåðèîäà êóëüòèâèðîâàíèÿ: íàèáîëåå èíòåíñèâíî ïðîöåññû ìîðôîãåíåçà ïðîèñõîäÿò íà 9–14 íåäåëå
êóëüòèâèðîâàíèÿ.
Ëèòåðàòóðà
1. Êîïåðòåê Ë.Ã., Áóòåíêî Ð.Ã. Íàòèâíûå ôèòîãîðìîíû ýêñïëàíòà è ìîðôîãåíåç ïøåíèöû in vitro //
Ôèçèîë. ðàñò. 1995. Ò. 42. ¹4.
2. Êó÷åðåíêî Ë.À. Î íåêîòîðûõ ïàðàìåòðàõ òåõíîëîãèè ðåãåíåðàöèè ðèñà in vitro // Ñ/õ áèîëîãèÿ.
1994. ¹1.
3. Smith B.M., Codwin R.M., Harvey E., Werner
C.P.Gynogenesis from whole flowerbuds in bulb onions
(Allium cepa L.) and luks (A.purrum L.) // J.Genet.
and Breed. 1991. V. 45. ¹4.
4. Êàëèíèí Ô.Ì., Ñàðíàöêàÿ Â.Â., Ïîëèùóê Å.Â.
Ìåòîäû êóëüòóðû òêàíåé â ôèçèîëîãèè è áèîõèìèè
ðàñòåíèé. Êèåâ, 1980.
5. Gemesni J.A., Mantinovich L. In vitro gynogenesis
induction in Hungarion lines of onion (Allium cepa L.)
// Loldsegtermesztesi hut. intez. bull. 1995. V. 27.
6. ×åðíûøîâà Â.Ã., Äîëãèõ Þ.È. Âëèÿíèå ãåíîòèïà íà ñïîñîáíîñòü ê ìîðôîãåíåçó â êóëüòóðå
òêàíåé êóêóðóçû // Áèîëîãèÿ êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê è áèîòåõí: Òåç. äîêë. ìåæäóíàð. êîíô. Íîâîñèáèðñê, 1988.
7. Ðàëäóãèíà Ã.Í.,Ñîáîëüêîâà Ã.È. Ôàêòîðû, âëèÿþùèå íà îðãàíîãåíåç ó ñåìÿäîëüíûõ ýêñïëàíòîâ ðàïñà
// Ôèçèîë. ðàñò. 1995. Ò. 42. ¹6.
8. Bohanes B., Jakse M., Ihan A., Javornik B. Studies
of gynogenesis in onion (Allium cepa L.): Induction
procedurus and genetic analysis of regenerants // Plant
Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 40. ¹3.