1.1. Общая характеристика рецептора IL-6
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук На правах рукописи Костюкова Мария Николаевна ЗНАЧЕНИЕ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 НА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ 14.01.12 – «онкология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Н. Н. ТУПИЦЫН Доктор медицинских наук, профессор Д. Ш. ОСМАНОВ МОСКВА - 2014 г. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 Структура и функциональная активность рецептора интерлейкина-6 1.1. Общая характеристика рецептора интерлейкина-6 9 1.2. Структура внеклеточных доменов рецептора IL-6 и механизм передачи цитокинового сигнала 12 1.3. Экспрессия рецептора IL-6 в норме и при плазмоклеточных опухолях 22 1.4. Типы функциональной активности рецептора IL-6 при множественной миеломе 30 1.5. Заключение 35 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37 2.1. Материалы 37 2.2. Характеристика клинического материала 39 2.3. Методы 40 2.3.1. Работа с культурами клеток 40 2.3.2. Выделение фракции мононуклеарных клеток костного мозга 43 2.3.3. Проточная цитофлуориметрия 43 2.3.3.1. Метод прямой иммунофлуоресценции 43 2.3.3.2. Метод непрямой иммунофлуоресценции 44 2.3.3.3. Количественное определение экспрессии молекул рецептора IL-6 2.3.3.4. Окрашивание внутриклеточных маркеров 45 47 2.3.3.5. Анализ клинических и экспериментальных данных, полученных методом проточной цитометрии 47 2.3.4. Депривация IL-6 в препаратах костного мозга 50 2.3.5. Флуоресцентная микроскопия 50 2.3.6. Выявление генов вируса HHV-8 в опухолевых клетках 51 2.3.7. Статистическая обработка экспериментальных данных 52 3 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 54 3.1. Функциональные особенности внеклеточных доменов gp130 и IL-6Rα субъединиц рецептора IL-6 54 3.1.1. Участие эпитопов рецепторных молекул gp130 и IL-6Rα в дозозависимом связывании IL-6 54 3.1.2. Изучение димеризации рецептора интерлейкина-6 с помощью МКА к gp130 и IL-6Rα на иммортализованных клеточных линиях 59 3.1.3. Регуляция экспрессии рецептора IL-6 его лигандом на клеточных линиях множественной миеломы 64 3.1.4. Определение абсолютных количеств молекул рецептора IL-6 на мембране клеток миеломных линий 66 3.1.5. Изменение активационных состояний (функциональный эпитопный анализ) IL-6Rα и gp130 71 3.1.6. Особенности иммунофенотипов клеточных линий множественной миеломы 76 3.2. Экспрессия рецептора IL-6 у больных множественной миеломой 78 3.2.1. Уровень и характер экспрессии IL-6Rα на мембране опухолевых клеток 78 3.2.2. Взаимосвязь экспрессии рецептора IL-6 с клиникоиммунологическими характеристиками множественной миеломы 83 3.2.3. Экспрессия рецептора IL-6 при морфологически атипичных вариантах множественной миеломы 98 3.3. Регуляция экспрессии рецептора IL-6 на мембране опухолевых плазмоцитов интерлейкином-6 100 3.4. Взаимосвязь инфицированности HHV-8 с экспрессией рецептора IL-6 и с клиническими характеристиками опухолевых клеток множественной миеломы 103 4 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Иммунологическая оценка экспрессии и активации рецептора IL-6 105 105 4.1.1. Определение активационных состояний gp130 и IL-6Rα на клеточных линиях множественной миеломы 4.1.2. Регуляция уровня экспрессии рецептора IL-6 его лигандом 106 107 4.2. Клинико-иммунологические характеристики множественной миеломы и экспрессия рецептора IL-6 110 4.2.1. Уровни экспрессии рецептора IL-6 в CD138+ и CD138субпопуляциях опухолевых плазматических клеток 112 4.2.2. Взаимосвязь экспрессии рецептора IL-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток 4.3. Заключение 118 120 ВЫВОДЫ 126 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 128 5 ВВЕДЕНИЕ Воздействие цитокинов на пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга является мощным фактором гемопоэза и играет центральную роль в опухолевой прогрессии. Так, для многих В-клеточных неоплазий показано резкое повышение уровня основного фактора дифференцировки В-клеток интерлейкина-6 (IL-6) [Rossi, 2012; Hirano et al., 1986]. При этом клетки определенных типов опухолей требуют для пролиферации наличия высокой концентрации экзогенного IL-6, то есть являются IL-6-зависимыми. К таким опухолям относится множественная миелома. Показано, что при множественной миеломе передача сигнала с участием IL-6 является центральным механизмом опухолевой прогрессии [Klein et al., 1990]. Выработка IL-6 при множественной миеломе поддерживается как функционированием аутокринной петли на опухолевых плазматических клетках, так и стромальным микроокружением костного мозга [Kawano et al., 1988; Hata et al., 1993]. Действие IL-6 на клетки опосредуется образованием рецепторного комплекса с участием трансмембранных молекул – лиганд-связывающей молекулы IL-6Rα (CD126, gp80, α-цепь) и трансдуцерной молекулы gp130 (CD130, β-цепь), которые образуют рецептор интерлейкина-6. Исследовательскими группами получены несколько десятков моноклональных антител к внеклеточным доменам IL-6Rα и gp130 и описаны функциональные свойства соответствующих им специфических эпитопов. Методология использования широкого спектра моноклональных антител послужила мощным инструментом для изучения структуры рецептора и передачи им сигнала в живых клетках. Несмотря на это, данные об экспрессии IL-6Rα и gp130 на мембране клеток множественной миеломы, а также об особенностях регуляции опухолевого роста рецептором интерлейкина-6, остаются малочисленными. Основную сложность в получении этих сведений составляют гетерогенность и широкий диапазон уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 на различных экспериментальных клеточных линиях множественной миеломы, а также на 6 опухолевых клетках больных множественной миеломой. Существенно различаются по уровню экспрессии рецептора интерлейкина-6 также опухолевые клетки, присутствующие в одном образце костного мозга больного [Rawstron et al., 2000]. Кроме того, молекулы рецептора интерлейкина-6 во многих случаях проявляют очень низкий уровень экспрессии. Таким образом, несмотря на непосредственное участие рецептора IL-6 в передаче пролиферативного и антиапоптотического сигналов опухолевыми клетками, на настоящий момент не было проведено значимых систематических исследований взаимосвязи рецептора интерлейкина-6 с аберрантными характеристиками плазматических клеток при множественной миеломе. Комплексное исследование значения рецептора интерлейкина-6 на мембране опухолевых клеток при множественной миеломе, а также статистическая оценка взаимосвязей клинических проявлений этого заболевания с экспрессией рецептора интерлейкина-6 представляют на сегодняшний день актуальное направление как в клиническом, так и в молекулярно-биологическом аспектах, и ведут к более глубокому пониманию факторов опухолевой прогрессии множественной миеломы. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучить значение рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках множественной миеломы. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Изучить с помощью моноклональных антител активационные состояния цепей рецептора интерлейкина-6 gp130 и IL-6Rα. 2. Дать количественную оценку компонентам рецепторного комплекса на клетках модельных миеломных культур. 7 3. Описать влияние IL-6 на компоненты рецепторного комплекса gp130 и IL6Rα на экспериментальных моделях, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой. 4. Определить частоту и уровни экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках больных множественной миеломой. 5. Охарактеризовать взаимосвязь экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток. 6. Исследовать взаимосвязь наличия ДНК вируса HHV-8 в клетках костного мозга больных и экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых плазматических клетках. НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые подробно описан на клеточных линиях множественной миеломы, а также воспроизведен на клетках костного мозга больных множественной миеломой селективный механизм обратимого подавления интерлейкином-6 экспрессии его рецептора. Этот механизм проясняет способ функционирования IL-6 на опухолевых клетках в качестве фактора роста. Впервые изучены уровень и характер экспрессии IL-6Rα на клетках больных множественной миеломой во взаимосвязи с иммунологическими и морфологическими характеристиками опухолевого субстрата; выявлены новые закономерности на уровне клинической картины и иммунофенотипа. Показано, что уровень экспрессии CD126 коррелирует с количеством проплазмоцитов в составе опухоли, ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза, и не коррелирует с экспрессией аберрантных маркеров опухолевых плазматических клеток CD45, CD56. Наличие экспрессии CD126 на опухолевых клетках множественной миеломы ассоциировано с увеличением количества клеток CD45-, CD56+. Впервые дифференцированно рассмотрены особенности клеток с наличием и отсутствием на мембране специфического плазмоклеточного антигена CD138 (синдекана-1). Получено яркое подтверждение существенно различающегося уровня CD126 на этих двух субпопуляциях опухолевых клеток. 8 Показано, что инфицированность вирусом герпеса человека 8 типа связана с усилением экспрессии CD126 на мембране опухолевых плазмоцитов. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Научно-практическая значимость настоящей работы характеризуется несколькими аспектами: 1) Методологический: представлен комплексный способ оценки слабой экспрессии рецептора IL-6, применимый как в анализе клинических данных, так и в исследованиях других аналогично экспрессированных молекул; показана возможность иммунологического разграничения активированного и неактивированного состояния димеризующихся рецепторов, которая также может быть воспроизведена в исследованиях активности рекомбинантных молекул IL-6, IL-6Rα, gp130, а также разрабатываемых для терапевтического применения антагонистов этих молекул; 2) клинический: описаны CD138+ и CD138- субпопуляции опухолевых клеток, различающиеся в отношении экспрессии рецептора IL-6, иммунологических характеристик опухоли и клинической картины. Учет данных субпопуляций опухолевых клеток может применяться для оценки прогноза и выбора стратегии противоопухолевого лечения; 3) экспериментальный: полученные в работе результаты анализа иммунофенотипа субпопуляций иммортализованных клеток модельных линий множественной миеломы экспериментального являются изучения плазматических клеток. платформой особенностей для субклонов более глубокого неопластических 9 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Структура и функциональная активность рецептора интерлейкина-6 В обзоре литературы рассмотрены структура, экспрессия и функции мембранных молекул, передающих сигнал интерлейкина-6 в клетку. Основное внимание уделено особенностям функционирования рецептора IL-6 при множественной миеломе Внутриклеточные (ММ). сигнальные пути, активируемые интерлейкином-6, на сегодняшний момент хорошо изучены и представлены в различных монографиях. В связи с этим их описание в данном обзоре приведено кратко. 1.1. Общая характеристика рецептора IL-6 Молекулы рецепторов цитокинов имеют сложную структуру внеклеточных доменов и многоступенчатую систему трансдукции сигнала внутрь клетки. В отличие от рецепторов факторов роста, молекулы рецепторов цитокинов не обладают внутренней киназной активностью. Цитоплазматическая часть рецепторов цитокинов конститутивно ассоциирована с тирозинкиназами семейства активность JAK, которых инициируется активированным димеризованным состоянием рецептора и позволяет запустить внутриклеточный сигнальный каскад. функционирование В основе передачи цитокинового сигнала лежит рецепторного комплекса, состоящего из нескольких трансмембранных и растворимых белков, так называемых цепей рецептора. Альфа-цепью называют молекулу, непосредственно связывающую цитокин; бетацепь стабилизирует связь с цитокином и трансдуцирует сигнал внутрь клетки посредством конформационных изменений внеклеточного и внутриклеточного доменов. gp130, Типичным примером трансдуцера цитокинового сигнала является который функционирует с образованием мультикомпонентных рецепторных комплексов и осуществляет передачу сигнала цитокинов семейства IL-6. На сегодняшний день известны структурная организация и основные 10 принципы действия рецепторного комплекса IL-6, а также связанные с ним сигнальные пути, функционирующие при нормальной дифференцировке и вовлеченные в патогенез ряда заболеваний. Важное место в изучении IL-6зависимых опухолей, в том числе ММ, занимает рецептор интерлейкина-6, его αи β-субъединицы. В настоящем обзоре, исходя из накопленного обширного материала, детально рассматривается функциональное значение внеклеточных доменов молекул рецепторного комплекса IL-6. Сигнальные системы, функционирующие с участием гликопротеина gp130, опосредуют действие десяти цитокинов семейства IL-6, или gp130-цитокинов, список которых в последние годы расширяется. Это IL-6, IL-11, лейкозингибирующий фактор (LIF), онкостатин M, кардиотрофин-1, цилиарный нейротрофный фактор, IL-27, кардиотрофин-подобный цитокин, нейропоэтин. При этом активируются внутриклеточные сигнальные пути JAK/STAT, Ras/MAP, PI3K/AKT [Heinrich et al., 2003] и происходит модуляция апоптотических процессов, роста и дифференцировки клеток [Taga et al., 1997; Heinrich et al., 1998; Peters et al., 1998; Тупицын, 2001]. Повсеместная экспрессия gp130 на клетках человека [Kato et al., 2009] и разнообразие биологических процессов, опосредуемых им, отражаются в сложности механизмов цитокиновой рецепции, высоком уровне патогенетической вовлеченности и, безусловно, привлекательности gp130 как объекта молекулярных исследований [Тупицын, 2000; Тупицын, 2001]. В зависимости от природы воздействующего цитокина, типа и физиологического состояния клеток gp130 участвует в регуляции иммунного ответа, гемопоэза, ответа острой фазы, эндокринных и нейропоэтических процессов, развития сердечной мышцы и т.д. [Fasnacht et al., 2008; Hirano et al., 1994; Yamauchi-Takihara, 2008]. Молекула gp130 может, таким образом, являться терапевтической мишенью при нарушениях этих процессов при условии четкого воздействия на специфические участки связывания цитокинов [Boulanger et al., 2003; Timmermann et al., 2000]. По международной номенклатуре лейкоцитарных дифференцировочных антигенов человека gp130 обозначается как CD130, его 11 экспрессия наиболее ярко выражена в Т-клетках, активированных В-лимфоцитах, плазмоцитах, моноцитах, эндотелиоцитах. Альфа-цепью рецепторного комплекса IL-6 является гликопротеин gp80 (CD126). Также в литературе часто употребляется его название IL-6Rα (Interleukin-6 receptor alpha). Этот белок выполняет лиганд-связывающую функцию и не обладает трансдуцерными свойствами. Профиль экспрессии IL-6Rα в различных типах клеток не коррелирует с экспрессией gp130; более того, анализ изменений и регуляции количества молекул α- и β-цепей рецептора IL-6 на мембране различных типов клеток на сегодняшний день представляет собой важную научную задачу. Для передачи сигнала IL-6 необходимо образование гексамерного комплекса с участием α- и β-цепей рецептора и молекул цитокина. Внутриклеточные механизмы передачи цитокинового сигнала с помощью gp130 довольно подробно описаны [Heinrich et al., 2003; Klein, 1998; Stahl et al., 1994; Ishihara et al., 1995]. Поскольку gp130 не имеет собственного киназного домена, его цитоплазматическая часть, ассоциированная с JAK-киназами, в активированном (димеризованном) состоянии претерпевает фосфорилирование 6ти тирозиновых остатков, каждый из которых отвечает за дальнейшее направление сигнального каскада [Murakami et al., 1991; Stahl et al., 1995]. Процессы, происходящие на поверхности клетки при воздействии цитокинов на внеклеточные домены α- и β-цепей рецептора IL-6, изучены в меньшей степени и являются предметом многолетней дискуссии в области фундаментальных исследований молекулярных механизмов передачи сигнала цитокиновыми рецепторами I типа. Это обусловлено высоким уровнем сложности структуры внеклеточной части gp130, а также разнообразием цитокинов и рецепторных систем, участвующих в непосредственном взаимодействии с ним. Молекула gp130, являясь общим элементом многочисленных экстрацеллюлярных олигомерных рецепторных систем, в состав которых входят цитокин- связывающие трансмембранные и растворимые первичные рецепторы (α-цепи) и непосредственно цитокины, обладает исключительной функцией передачи сигнала внутрь клетки. Говоря о функциональных следствиях такого принципа 12 трансдукции сигнала, отмечают плейотропность (многообразие действия) и взаимозаменяемость функций цитокинов [Bravo et al., 2000]. Изучение распознающих и регуляторных мотивов внеклеточной части gp130 с помощью специфических моноклональных антител, сайт-направленного мутагенеза, рентгеноструктурного анализа и компьютерного моделирования позволило составить на сегодняшний день общее представление о механизмах действия важнейших биологических молекул, принадлежащих обширному семейству gp130-цитокинов, а также их рецепторов, объяснить и предсказать функциональные цитокин-опосредуемые свойства клеток в различных органах и тканях [Steinberg et al., 2009; Jung et al., 2009; Andratsch et al., 2009], однако многие принципиальные вопросы о механизмах рецепции и трансдукции сигнала gp130 остались нерешенными. К числу таких вопросов можно отнести механизмы селективного воздействия определенных цитокинов на определенные типы клеток, принципы распознавания одной рецепторной молекулой топологически и химически различных лигандов, системы регуляции процессов передачи сигнала. Ответы на эти вопросы лежат в плоскости осмысления функционального значения структурных особенностей внеклеточных доменов цепей рецептора и детального анализа экспериментальных данных, относящихся к gp130- сигналингу. 1.2. Структура внеклеточных доменов рецептора IL-6 и механизм передачи цитокинового сигнала 1.2.1. Структура gp130 Строение трансдуцерной молекулы gp130 изучалось с середины 1990-х годов [Bazan, 1990; Cosman, 1993; Bravo et al., 1998] и на данный момент описано подробнейшим образом [Wang et al., 2009]. Молекула gp130 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 130 кДа с длиной полипептидной цепи 918 остатков; цитоплазматический домен содержит 277, трансмембранный – 22, внеклеточный - 619 аминокислотных остатков. N-концевая внеклеточная часть 13 gp130 образована: a) дистальным по отношению к мембране иммуноглобулинподобным доменом (D1, IgD); б) цитокин-связывающим доменом (CHR, цитокинсвязывающий гомологичный район), консервативным для всех рецепторов класса гемопоэтинов; он состоит из двух фибронектиновых доменов III типа (D2, D3), один из которых (D2) характеризуется наличием двух цистеиновых мостиков, а другой (D3) – также консервативным для этой группы цитокиновых рецепторов мотивом WSXWS и в) еще тремя фибронектиновыми доменами III типа (D4, D5, D6), образующими длинную «ножку» рецептора (рисунок 1.1 А). Международная база данных структур белков и нуклеиновых кислот Protein Data Bank (PDB) представляет 10 кристаллических структур с участием молекулы gp130: фосфорилированный в положении Y757 цитоплазматический домен в комплексе с SOCS3 (2HMH, 2BBU); гексамер, образуемый экстрацеллюлярными доменами gp130 D1, D2, D3 c IL-6Rα и IL-6 (1P9M); тетрамер вирусного интерлейкина-6 и доменов D2, D3 gp130 (1I1R); LIF, связанный с D2, D3 gp130 (1PVH); N-концевой домен D3 gp130 (1BJ8), цитокин-связывающий центр gp130 – домены D2-D3 (1BQU); мембранно-проксимальная «ножка» рецептора gp130 – домены D4-D5D6 (3L5I, 3L5J). Нативные молекулы gp130 человека могут быть не только мембранно-ассоциироваными, но также присутствуют во внеклеточном пространстве в растворимой форме. Это гликопротеины с молекулярной массой 100 кДа, фактически являющиеся свободными от трансмембранной и внутриклеточной части молекулами gp130, которые образуются по различным данным [Diamant et al., 1997; Narazaki et al., 1993; Mullberg et al., 1993] либо в результате протеолиза мембранных молекул gp130, либо альтернативного сплайсинга его мРНК. Наличие альтернативной формы gp130, обладающей цитокин-связывающим, но не трансдуцерным свойством, может трактоваться как одно из проявлений антагонистической регуляции передачи сигнала, однако существуют предположения [Gaillard et al., 1999], что gp130 может содержать дополнительные регуляторные участки и самостоятельно связывать не только молекулы комплексов цитокинов с их α–цепями, но и сами α-цепи или другие молекулы. 14 А Б В Рисунок 1.1. - Структура рецептора интерлейкина-6: А. Схематическое изображение внеклеточной части gp130; Б. Схематическое изображение внеклеточной части IL-6Rα; В. Гексамерная архитектура рецепторного комплекса, в образовании которого задействованы сайты IL-6 - I, II, III. Рекомбинантный gp130, представляющий собой внеклеточную часть трансдуцерной молекулы, получают с помощью бакуловирусной экспрессионной системы в клетках насекомых или экспрессируют в клетках CHO и выделяют из надклеточного супернатанта иммунопреципитацией на анти-gp130 моноклональных антителах; он имеет молекулярную массу 65 кДа, не является гликопротеином, но сохраняет цитокин-связывающие свойства [Hibi et al., 1990; Muller-Newen et al., 1998; Liautard et al., 1997]. 1.2.2. Структура IL-6Rα кДНК α-цепи рецептора IL-6 кодирует 468 аминокислот, включая сигнальный пептид (19 остатков), внеклеточный, трансмембранный и короткий внутриклеточный домены (339, 28, 82 аминокислотных остатков соответственно). Молекулярная масса нативного гликозилированного рецептора 80 кДа; его расчетный вес без учета альтернативного сплайсинга и гликозилирования 50 кДа. Клонирование IL-6Rα впервые описано группой японских ученых, открывших обе цепи рецептора IL-6 – gp130 и IL-6Rα [Yamasaki et al., 1988]. Рентгеноструктурное исследование молекулы IL-6Rα [Varghese et al., 2002] 15 выполнено с использованием рекомбинантного не гликозилированного белка, экспрессированного в клетках СНО. Внеклеточная часть молекулы IL-6Rα построена по тому же принципу, что и gp130. В его основе лежат доменная структура, а также присутствие консервативных для цитокиновых рецепторов I класса элементов: WSXWS-мотива, двух консервативных цистеинов и насыщенного пролином участка между цитокин-связывающими доменами. IL6Rα содержит N-концевой Ig-подобный домен (D1) и 2 домена фибронектинового типа (D2 и D3), образующие цитокин-связывающий центр (рисунок 1.1 Б). D1 не участвует в непосредственном распознавании лиганда и инициации сигнала, однако он поддерживает стабильность структуры за счет дисульфидной связи с доменом D2 и способствует интернализации рецептора в клетку [Ozbek et al., 1998]. Трансмембранный и цитоплазматический домены не участвуют в передаче сигнала, в то время как эктодомен IL-6Rα может проявлять самостоятельную биологическую активность в виде растворимого IL-6Rα (sIL-6Rα). Растворимый sIL-6Rα активно участвует в инициации сигнала IL-6 во всех тканях организма, поскольку он наравне с мембранным аналогом связывает IL-6 и активирует повсеместно экспрессированный gp130. Роль этого белка в опухолевых IL-6зависимых процессах интенсивно изучается и будет подробно рассмотрена ниже. В международной базе данных PDB α-цепь рецептора IL-6 представлена тремя кристаллическими структурами: это описанная выше внеклеточная часть (1N26); мембранно-проксимальный домен D3 (2ARW); IL-6Rα в составе гексамера (IL-6)2/(IL-6Rα)2/(gp130)2 – (1P9M). Две молекулы IL6Rα, располагающиеся в гексамере рядом, ориентированы по принципу «голова-хвост» и, вероятно, представляют пространственную организацию рецепторного комплекса в физиологических условиях. 1.2.3. Взаимодействие α- и β-цепей рецептора и архитектура сигнального комплекса рецептора IL-6 В последние годы серия работ, проведенных в Стэндфордском университете C. Garcia и др. [Chow et al., 2002; Chow et al., 2001; Boulanger et al., 2003], 16 существенно дополнила существующие данные о структуре и функциональных свойствах внеклеточных доменов gp130. С помощью кристаллографических и калориметрических методов были описаны и сопоставлены термодинамические и стерические параметры взаимодействующих белковых поверхностей и предложены механизмы образования олигомерных рецепторных комплексов gp130. Так, было показано [Chow et al., 2001; Hammacher et al., 1998], что отличающий gp130 от других рецепторов гемопоэтинов уникальный IgD-домен обладает активирующим передачу сигнала свойством, а процессы сборки многоцепочечных комплексов gp130 проходят ступенчато посредством связывания трех консервативных сайтов цитокина (рисунок 1.1 В). В случае рецепции IL-6 это означает, что сначала цитокин связывается со своей α-цепью IL-6Rα в сайте I молекулы IL-6, образуя комплекс IL-6/IL-6Rα и подготавливая специфический эпитоп в домене СHR (D2, D3) gp130 для сайта II IL-6. Присоединение IL-6/IL-6Rα к CHR gp130 приводит к образованию в тройном комплексе IL-6/IL-6Rα/gp130 подготовительного эпитопа для сайта III IL-6, и, наконец, IgD-домен (D1) gp130 участвует в связывании сайта III цитокина и построении активного гексамера (IL-6)2/(IL-6Rα)2/(gp130)2. Ступенчатость означает также, что в связывании с одним лигандом могут независимо участвовать две молекулы gp130 [Pflanz et al., 2000]. Другим важным открытием в понимании механизма передачи цитокиновых сигналов с участием общей трансдуцерной цепи gp130 явился принцип структурной ригидности, или «термодинамической пластичности» цитокинсвязывающей особенности поверхности построения домена олигомерных CHR gp130, комплексов противопоставляющий gp130 общепринятому «пластическому» механизму, доказанному для ряда гемопоэтиновых рецепторов [Wells et al., 1996; Livnah et al., 1998; Chow et al., 2002]. Эта особенность была последовательно обнаружена при описании взаимодействий вирусного гомолога IL-6 с gp130 [Chow et al., 2001], а затем лейкозингибирующего фактора с gp130 [Boulanger et al., 2003]. Согласно этому принципу во всех случаях комплексообразования пространственная конформация поверхности цитокин- 17 связывающего CHR-домена gp130 не претерпевает пространственные изменения в соответствии со структурой цитокина и остается неизменной, а сродство к химически и стерически разнообразным лигандам достигается за счет амфипатичности большинства аминокислот CHR (участия в связывании в различных случаях преимущественно либо гидрофильных, либо гидрофобных аминокислотных остатков) и существенного изменения их термодинамических характеристик. Такой принцип создает возможности для высокоаффинного связывания гораздо более широкого ряда молекул и не ограничивает их однотипностью структуры активных центров. В то время как наложение поверхностей взаимодействия молекул цитокинов с CHR-доменом демонстрирует преимущественное их перекрывание, gp130 индивидуальные взаимодействия цитокинов, наблюдающиеся по периферии CHR, определяют уникальность связывания конкретного цитокина и могут рассматриваться как структурные мишени для дизайна высокоспецифических цитокиновых антагонистов [Boulanger et al., 2003]. Особое место в ряду олигомерных комплексов с учаcтием gp130 занимает комплекс с продуктом вирусного гомолога интерлейкина-6 – vIL-6. Этот цитокин секретируется клетками, инфицированными вирусом герпеса человека 8-го типа (HHV-8). Сигнальный комплекс представляет собой тетрамерный аналог гексамерного сигнального комплекса c IL-6, в котором исключен IL-6Rα. Это уникальный пример проявления gp130 одновременно и лиганд-связывающих, и трансдуцерных свойств [Chow et al., 2001]. 1.2.4. Применение моноклональных антител в исследованиях рецептора IL-6 и эпитопное картирование молекул gp130 и IL-6Rα Исследования нативных рецепторов в живых клетках предоставляют широкий спектр возможностей для многостороннего изучения действия молекул и их комплексов по сравнению с использованием компьютерных моделей структур рекомбинантных фрагментов белков. Интенсивное изучение gp130 с применением методологии эпитопного картирования оказалось весьма информативным и 18 обеспечило динамический взгляд на структурные особенности образуемых им сложных рецепторных комплексов. Благодаря введению в рутинную практику гибридомной технологии, позволяющей получать уникальные специфические моноклональные антитела, блокирующие эпитопы (антигенные детерминанты) биологических молекул, стало возможным проводить прямые соответствия между определенными элементами структуры и их функциональными свойствами. Этот подход к описанию gp130 применен несколькими группами ученых [Hibi et al., 1990; Liautard et al., 1997, Wijdenes et al., 1995]; суммарное количество функционально различных моноклональных антител (МКА) к эпитопам рекомбинантной внеклеточной части молекулы gp130 превысило 60, а антитела были утверждены на VI Международном рабочем совещании по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека (HLDA Workshop) [Autissier et al., 1997; Clement et al., 1997] и использовались в клинических и лабораторных исследованиях нарушений гемопоэза [Тупицын et al., 1999; Ларионова et al., 2001] и ответа острой фазы [Harrison et al., 1996]. Показано [Clement et al., 1997], что МКА к различным эпитопам gp130 по-разному воздействуют на процессы в клетках, опосредуемые цитокинами семейства IL-6. Блокирование антителами тех или иных участков gp130, в результате чего, как правило, ингибируется стимулируемый цитокином клеточный ответ, позволило легко распределить МКА по группам, соответствующим различным функциональным ответам клеток на воздействие цитокинов семейства IL-6. Такое разделение в некоторой мере коррелирует с пространственным расположением эпитопов, отвечающих за передачу сигнала конкретным цитокином. В дополнение к описанному выше функциональному картированию gp130 с помощью МКА были изучены способности антител конкурировать друг с другом за пространственно близкие участки молекулы [Liautard et al., 1997; Wijdenes et al., 1995, Chevalier et al., 1996]. Примененная для этого in-vitro методология sandwich-ELISA, при которой на поверхности последовательно закрепляются анти-gp130 МКА (X) - gp130 - анти-gp130-биотин МКА (Y), выявила стерические конкурентные отношения всех пар X-Y анти-gp130 МКА (рисунок 1.2 А). 19 Аналогичные исследования выполнены для α-цепи рецептора IL-6. Более трех десятков моноклональных антител к IL-6Rα были выделены и охарактеризованы с позиций функциональной активности в отношении клеток множественной миеломы и пространственной локализации при связывании с определенными группами эпитопов [Gaillard et al., 1993; Liautard et al., 1994]. Большая часть антител была представлена на V и VI Международных рабочих совещаниях по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека (HLDA Workshop) [Gaillard et al., 1993]. Первое выделение и использование анти-IL-6Rα МКА PM-1 и MT18 для определения экспрессии IL-6Rα на различных типах клеток [Shaw, 1993] показало высокую авидность и принципиальные функциональные различия антител. PM-1 конкурентно связывается c IL-6Rα в сайте взаимодействия IL-6 и ингибирует его активность, в то время как МТ18 не препятствует передаче сигнала. Эпитопное картирование, проведенное с использованием методологического подхода, который описан выше для gp130, определило четкие группы эпитопов, участвующих в образовании рецепторного комплекса с участием IL-6Rα (рисунок 1.2 Б) [Liautard et al., 1994; Gaillard et al., 1993]. Цитокин-связывающий сайт IL-6Rα, образованный доменами D2-D3, инактивируется, как описано выше, PM-1 и перекрывающимися с ним эпитопами M37, M113, M139, M164, M195, B-H23, B-R6, B-S2, B-F19, 32, 34, 38, 48, 50 антиIL-6Rα. Иммуноглобулин-подобный домен D1 IL-6Rα связывают MT-18, М91, M5, M43, B-C22, B-C12; эти МКА не влияют на передачу сигнала рецептором, поскольку D1 напрямую не участвует в связывании лиганда. МКА М-11 и М182 препятствуют передаче сигнала на уровне взаимодействия комплекса IL6/IL-6Rα c gp130: их эпитопы расположены в сайте взаимодействия α- и β-цепей, которое оказывает существенное влияние на конформацию рецепторного комплекса. МКА B-F22, B-G18, 17, 22 не проявляют функциональной активности и их эпитопы не перекрываются с описанными участками молекулы IL-6Rα. 20 А Б Рисунок 1.2. - Эпитопное картирование внеклеточных доменов gp130 и IL6Rα цепей рецептора интерлейкина-6 методом ELISA: А: Перекрывание эпитопов gp130 для анти-gp130 МКА, представленных на VI международном рабочем совещании по дифференцировочным лейкоцитарным антигенам человека; Б: Перекрывание эпитопов IL-6Rα для анти-IL-6Rα МКА (по данным Gaillard et al., 1993). Белым цветом отмечены пары антител, распознающие одинаковые эпитопы gp130; серым цветом – существенно перекрывающиеся эпитопы МКА; черным цветом – различающиеся эпитопы пар МКА. 21 Наряду со способностью МКА блокировать передачу сигнала одного или нескольких цитокинов был обнаружен активирующий эффект некоторых антител, то есть некоторые анти-gp130 МКА выступали в роли агонистов и вызывали пролиферацию клеток IL-6-зависимых линий [Wijdenes et al., 1995; Autissier et al., 1997; Clement et al., 1997]. Более внимательное изучение этого феномена показало, что в качестве бесцитокиновых агонистов gp130 выступают пары МКА [Autissier et al., 1997; Muller-Newen et al., 2000], причем такими свойствами обладают вполне определенные сочетания МКА - феномен, явно не объясняющийся функциональной и стерической близостью конкретных эпитопов. Существование агонистических антител уже было показано ранее [Schneider et al., 1997], поэтому в последующих исследованиях найденные пары стали мощным инструментом для детального изучения механизмов активации нативного gp130. Способность некоторых антител приводить цитокиновый рецептор в активированное состояние демонстрирует общие свойства лиганд-связывающих сайтов рецепторов и помогает сформулировать парадигмы рецепции и трансдукции для всего пула распознаваемых молекул. Выявленные пары-агонисты анти-gp130 МКА действуют, как предполагается, согласно механизму структурной мимикрии и/или в результате конформационной модификации определенных сайтов рецептора [Muller-Newen et al., 2000]. В пользу этих предположений говорят также наблюдения того, что определенная ориентация цепей рецептора, вызываемая неспецифическим лигандом или даже модифицированным антагонистом, может приводить к активации и нормальному функциональному действию рецептора [Livnah et al., 1998; Grotzinger et al., 2002; Qureshi et al., 1999]. Принимая во внимание необходимость модификации двух различных сайтов для осуществления трансдукции сигнала gp130 [Timmermann et al., 2000; Planz et al., 2000; Kurth et al., 1999], представляется закономерным участие именно двух МКА в образовании активированного комплекса gp130; при этом следует отметить принадлежность антител в паре к различным участкам gp130. 22 Основными выводами из функциональных экспериментов по замене действия IL-6 стимуляцией димеризации рецептора МКА-агонистами на различных культурах клеток можно считать: a) выявление необходимости участия двух различных районов gp130 в передаче сигнала внутрь клетки; б) структурную мимикрию как основной механизм активации gp130 антителами; в) возможность разработки клинических приложений в гематологии. На основании большого объема экспериментального и фактического материала, полученного учеными нескольких научных групп в последние годы, возникла необходимость в систематизации этой информации, а также в обсуждении наиболее дискуссионных вопросов и постановке задач для практического решения. 1.3. Экспрессия рецептора IL-6 в норме и при плазмоклеточнных опухолях Данные по экспрессии рецептора IL-6 представлены в литературе достаточно широко, поскольку обе компоненты рецепторного комплекса участвуют в передаче сигнала с помощью пролиферативного, анти-апоптотического, провоспалительного сигнальных путей, а также контролируют ряд других процессов, таких как иммунный ответ и гемопоэз. 1.3.1. Экспрессия gp130 Gp130 является важнейшим трансдуцером сигнала десяти цитокинов семейства IL-6 и жизненно важным белком в организме млекопитающих. Показано, что нокаутные по гену gp130 мыши (gp130-/-) погибают на 12 день эмбриогенеза и имеют нарушения развития сердечной мышцы и гемопоэтической ткани [Yoshida et al., 1996]. Gp130 представлен в различной степени на мембране всех типов клеток организма [Hibi et al., 1990; Jones et al., 2011]. В большинстве тканей экспрессия gp130 очень слабая, однако, по материалам Базы Данных V Международного 23 рабочего совещания по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека (HLDA V Workshop) [Shaw, 1993], достаточно яркая экспрессия gp130 присуща эндотелиальным, стромальным, миелоидным клеткам, а также Т- и Влимфоцитам, гепатоцитам. Опухолевые клетки тканей этих типов характеризуются еще более высокой экспрессией gp130. Активация покоящихся В-клеток памяти в присутствии CD40+L фибробластов стимулирует экспрессию gp130 [Jego et al., 2001]. Уровень экспрессии gp130 затем постепенно увеличивается по мере созревания от преплазмобластов до плазмобластов и ранних плазматических клеток. 1.3.2. Экспрессия IL-6Rα Альфа-цепь рецептора IL-6 является лиганд-связывающей компонентой рецепторного комплекса. Ее наличие определяет возможность активации специфичных для IL-6 сигнальных путей, поэтому экспрессия рецептора IL-6 на мембране тканеспецифична. Отсутствие работающего гена IL-6Rα не сказывается на жизнеспособности мышей, приводя к cущественному снижению уровня антиген-индуцируемых аутоиммунных заболеваний и заживления ран [Jones et al., 2011]. IL-6Rα в норме обнаруживается на многих типах клеток и в различных тканях. Тотальный скрининг тканей человека [Kato et al., 2009] выявил IL-6Rα в лимфатической, гемопоэтической, пищеварительной, половой, экзокринной, эндокринной, нервной, мышечной, выделительной, покровной и дыхательной системах организма человека. Значимые количества рецептора присутствуют на мембране Т-клеток, активированных В-клеток, моноцитов, гепатоцитов, а также на CD34+-клетках-предшественниках костного мозга, поскольку IL-6Rα инициирует ростовой и дифференцировочный процессы [Lavabre-Bertrand et al., 1995; Kishimoto, 2010]. Также показано наличие IL-6Rα на В-клетках, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр, но не лимфомы Беркитта [Lasfar et al., 1994]. По данным [Rawstron et al., 2000; Jego et al., 2001] IL-6Rα не определяется на нормальных плазматических клетках и покоящихся В-клетках. Регуляция уровня экспрессии IL-6Rα также зависит от типа клеток и может 24 происходить под действием как самого лиганда IL-6 (например, в гепатоцитах), так и глюкокортикоидов, IL-1, эндотоксинов, ретиноевой кислоты и других сигнальных молекул [Lasfar et al., 1994]. Сопоставление уровней экспрессии gp130 и IL-6Rα на основе Базы Данных V Международного рабочего совещания по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека (HLDA V Workshop) [Shaw, 1993] обрисовывает схожую с gp130 панель клеточных типов, обладающих значительной экспрессией α- и β-цепей рецептора IL-6, причем для gp130 характерен более высокий уровень экспрессии в нормальных клетках и относительно равные количества обеих цепей на опухолевых гемопоэтических клетках, например, эритроидных K-562, миелоидных HL-60, В-лимфоцитах IM9, U266. Напротив, фибробласты и другие стромальные опухолевые клетки, например HeLa, HepG2, Lox, имеют гораздо более высокую экспрессию gp130 по сравнению со значимой, но менее яркой экспрессией IL-6Rα. В работе [Jego et al., 2001] прослежены изменения экспрессии IL-6Rα при прохождении дифференцировочных стадий плазматическими клетками: покоящиеся В-клетки не экспрессируют IL-6R, активированные CD40L+ фибробластами клетки - преплазмобласты сильно экспрессируют IL-6Rα; затем его экспрессия постепенно снижается при переходе в плазмобласты и ранние плазматические клетки. Авторами делается вывод, что IL-6 - ростовой фактор нормальных плазмобластов. 1.3.3. Особенности экспрессии рецептора IL-6 при плазмоклеточных опухолях Интерлейкин-6 принято называть центральным патогенетическим фактором множественной миеломы. Действительно, этот цитокин обеспечивает выживание опухолевых клеток и их пролиферацию в условиях ауто- и паракринного микроокружения, приводит к системной выработке белков острой фазы и резорбции костной ткани активированными остеокластами [Barille et al., 2000; Naka et al., 2002; Kallen, 2002; Mihara et al., 2012]. Взаимодействие IL-6 с опухолевыми клетками невозможно в отсутствие его рецептора на мембране, 25 однако для передачи цитокинового сигнала достаточно присутствия трансдуцерной цепи gp130, в то время как IL-6R может связывать цитокин как на мембране, так и в межклеточном пространстве в растворимом виде (sIL-6Rα). Большинство работ, связанных с изучением молекулярных механизмов опухолей из плазматических клеток, затрагивают вопрос экспрессии на мембране IL-6Rα. Тем не менее, разрозненные клинические и экспериментальные данные не позволяют на сегодняшний день однозначно описать роль рецептора IL-6 в опухолевом процессе. Изучение популяций плазматических клеток человека остается сложной методологической задачей, поскольку в костном мозге в норме их содержание не превышает 0,5% от всех ядросодержащих клеток. В данном разделе приведена информация о свойствах плазматических клеток в контексте экспрессии рецептора IL-6. Изучение клинического материала (образцов аспиратов костного мозга), полученного от больных ММ, выявило различные, зачастую противоречивые факты об экспрессии трансдуцерной и лиганд-связывающей цепей рецептора IL-6 на мембране опухолевых плазмоцитов. Так, уровень экспрессии IL-6Rα по данным [Barille et al., 1999] увеличен в 2-5 раз, а gp130 – в 3-5 раз; по данным [Rawstron et al., 2000] - в 2-4 раза и в 1,5 раза соответственно по сравнению с фоновой экспрессией на нормальных плазматических клетках, что, однако, представляет собой очень небольшое различие из-за крайне низкой фоновой экспрессии этих молекул. Для выявления подобных различий и обработки результатов проточной цитометрии в литературе используются сложные математические подходы. Следует отметить, что при анализе уровня экспрессии мембранных рецепторов необходимо учитывать методологические особенности выявления и подсчета опухолевых клеток [Harada et al., 1993; Osqueteau et al., 1998; Rawstron et al., 2000]. Большинство исследований проводятся методом проточной цитометрии, одним из элементов которого является гейтирование пула клеток в пробе, то есть отсеивание клеток из поля зрения путем последовательного или одновременного наложения определенных характеристик, соответствующих 26 исключительно искомому типу клеток. При рассмотрении плазматических клеток необходимо выделить и опухолевые, и нормальные плазмоциты. В то же время, методологии гейтирования в каждой исследовательской группе различны, что иногда не позволяет напрямую сопоставлять результаты исследований. Ключевой особенностью большинства исследованных случаев MM можно считать различие уровней экспрессии рецептора IL-6 в нормальных и опухолевых плазмоцитах. Это характеризует обе цепи рецептора. IL-6Rα определяется при ММ на мембране 90% опухолевых клеток, причем важно отметить, что плазматические клетки с различными уровнями экспрессии IL-6Rα могут находиться в одной пробе, что говорит об отсутствии регуляции экспрессии рецептора микроокружением [Rawstron et al., 2000]. Опухолевые плазматические клетки с высокой экспрессией IL-6Rα наиболее резистентны к химиотерапии. Гипотеза о сниженном уровне дифференцировки секретирующих IL-6Rα опухолевых плазмоцитов не потвердилась: более зрелые VLA-5+ (СD49e+) клетки [Harada et al., 1993] обнаруживают высокий уровень IL6Rα [Rawstron et al., 2000]. Между уровнями экспрессии цепей рецептора корреляции не обнаружено, однако gp130 на клетках с выраженным IL-6Rα присутствует в достаточном количестве. Мнения ученых о наличии корреляции между количеством IL-6Rα на мембране опухолевых клеток и прогрессией ММ разделились. Так, в работе [Barille et al., 1999] отмечена более частая коэкспрессия gp130 и IL-6Rα при рецидиве ММ (40% больных), чем при первичной диагностике ММ (20% больных). В этой работе также показано, что gp130, но не IL-6Rα, коррелирует с активностью заболевания, что объяснимо с точки зрения достаточной роли трансдуцерной компоненты при передаче цитокинового сигнала. Напротив, недавнее исследование, проведенное группой А. Орфао с помощью многомерного анализа, выявило независимое прогностическое значение экспрессии IL-6R на мембране опухолевых клеток больных ММ, в отличие от не имеющих прогностической значимости количеств gp130 и sIL-6R. Показано, что низкая экспрессия IL-6R соответствует плохому прогнозу [Perez-Andres et al., 2009]. 27 Вместе с тем, в работе [Aleksandrakis et al., 2003] показано постепенное усиление экспрессии IL-6Rα в клетках ММ в 2-5 раз по сравнению с нормальными клетками при прогрессировании заболевания. При МГНГ по данным [Barille et al., 1999] количество пациентов с детектируемым рецептором IL-6 и коэкспрессией обеих цепей рецептора несколько выше, чем при первично диагностируемой ММ, а уровни экспрессии обеих цепей сравнимы с таковыми в начальной стадии ММ. При этом экспрессия IL-6Rα увеличена в 2 раза, а gp130 – менее чем в 2 раза. Схожие результаты для МГНГ продемонстрированы в [Rawstron et al., 2000]: 2-3-кратное увеличение экспрессии IL-6Rα и слабое 1,5-кратное увеличение экспрессии gp130. Интересные данные получены при сравнении экспрессии IL-6Rα и gp130 при МГНГ, ММ и ПКЛ [Perez-Andres et al., 2005]: при плазмоклеточных пролиферативных заболеваниях усиливается экспрессия IL-6Rα, причем уровень экспрессии IL-6Rα и sIL-6Rα для них одинаков. Gp130 при МГНГ остается в норме, и повышается при ММ. При ПКЛ IL-6Rα обнаруживается в 100% случаев [Kraj et al., 2011]. Иммортализованные клеточные линии ММ также проявляют гетерогенность в отношении уровней экспрессии рецептора IL-6 на мембране. Так, по данным [Hardin et al., 1994], только в 4 клеточных линиях из 6 определяется мРНК IL-6Rα, и 2 имеют детектируемый проточной цитометрией уровень экспрессии IL-6Rα. Количественное определение gp130 и IL-6Rα на мембране миеломных клеток [Gaillard et al., 1997] выявило относительно немногочисленные сайты gp130 (800-1000 молекул/кл) и IL-6R (2200-2800 молекул/кл) на IL-6-зависимых клетках XG-1. По другим данным количество IL6Rα на клетках XG-1 составляет 600 молекул/кл и 1000 молекул/кл для клеток XG-2 [Lavabre-Bertrand et al., 1995]. Более низкий количественный диапазон отмечен для клеток OPM-2, RPMI-8226, U-266: 400-600 молекул IL-6Rα и 100-600 молекул gp130 в клетке [Kovacs, 2006]. Соотношение количеств молекул α- и βцепей рецептора на мембране миеломных клеток (IL-6Rα/gp130) также 28 индивидуально для различных клеточных линий. Например, для клеток U266 это соотношение равно 5:1, а для клеток RPMI8226 – 1:1 [Schwabe et al., 1994]. Количество мембранных молекул gp130 и IL-6Rα не изменяется в процессе иммортализации опухолевых клеток, выделенных из костного мозга больных ММ [Barille et al., 1999] и длительного культивирования миеломных клеточных линий [Gaillard et al., 1997]. Протекание апоптотических процессов при культивировании в бессывороточной среде не вызывает уменьшения количества IL-6Rα на клетках миеломных линий ILKM-2 и ILKM-3 [Abroun et al., 2004], не зависит от экспрессии IL-6Rα и может наблюдаться даже при ее высоком уровне [Lavelle et al., 2001]. Клетки стромы костного мозга не индуцируют гиперэкспрессию IL-6Rα, в том числе нетрансформированные клетки при МГНГ не экспрессируют IL-6Rα [Rawstron et al., 2000]. 1.3.4. Роль sIL-6R в активации рецептора IL-6 Для понимания сигнальных процессов с участием IL-6 необходимо учитывать свойства растворимой формы α-цепи рецептора IL-6 – sIL-6Rα, секретируемого в межклеточное пространство нормальными и опухолевыми плазматическими клетками. sIL-6Rα прежде всего является агонистом gp130, выполняя роль цитокин-связывающей α-цепи рецепторного комплекса вместо мембранного IL6Rα, что обуславливает существование аутокринного и паракринного ростовых механизмов ММ [Klein et al., 1989]. Данная активность sIL-6Rα особенно важна при рассмотрении ММ с позиций одной из ведущих парадигм современного канцерогенеза – патогенетической роли опухолевого микроокружения. sIL-6Rα выполняет также ряд других биологических функций. В комплексе с цитокином образуется устойчивая сигнальная частица IL-6/sIL-6Rα [Gaillard et al., 1997; Barille et al., 2000; Ancey et al., , 2003; Pignatti et al., 2003], которая способна не только инициировать сигнальный путь IL-6 в любых клетках организма, но и удерживает короткоживущий цитокин в плазме крови. В молекулярных исследованиях рецептора интерлейкина-6 молекула sIL-6Rα использовалась как шаблон для изучения доменной структуры IL-6Rα [Varghese et al., 2002] и 29 выработки моноклональных антител [Novick et al., 1991] и аптамеров [Meyer et al., 2012] к IL-6Rα. Все типы клеток ММ in vitro и in vivo секретируют sIL6Rα [Thabard et al., 1999]. Увеличение концентрации sIL-6Rα в плазме крови при ММ рассмотрено во многих работах, причем выводы о прогностическом значении концентрации sIL6Rα неоднозначны. Отмечено, что повышение уровня sIL-6R коррелирует со стадией ММ, но не отражает степень агрессивности опухоли [Gaillard et al., 1993; Szczepek et al., 2001]. Выявлена довольно слабая обратная корреляция между концентрацией IL-6 и sIL-6Rα [Perez-Andres et al., 2009]. В то же время ряд работ характеризует sIL-6Rα как показатель активности заболевания и фактор плохого прогноза [Wierzbowska et al.; Kallen, 2002]. Кроме того, воздействие IL-6 на клетки ММ способствует резкому увеличению концентрации sIL-6Rα [Barille et al., 2000]. Поскольку пролиферация IL-6-зависимых клеток ММ (линии XG-1, XG-2) строго зависит от наличия экзогенного sIL-6Rα и ингибируется при его отсутствии, несмотря на наличие мембранной формы рецептора IL-6Rα [Gaillard et al., 1997], то, следовательно, имеющегося количества мембранного IL-6Rα недостаточно для роста иммортализованных клеток ММ (количество мембранного IL-6R в 10 раз меньше, чем требуется для поддержания пролиферации). Этот факт ставит вопрос о роли IL-6Rα на мембране IL-6зависимых клеток ММ. sIL-6Rα играет важную роль в формировании опухолевого микроокружения при ММ. Показано, что перевитая SCID-мышам ММ человека не вызывает у них резорбции костей [Urashima et al., 1997], что объясняется отсутствием хоминга клеток ММ в костный мозг мыши. У человека при ММ опухолевые клетки взаимодействуют с внеклеточным матриксом и стромальными клетками (макрофагами, фибробластами, эндотелиальными клетками, остеобластами) и посредством секреции sIL-6Rα инициируют в них выработку IL-6 и активируют остеокласты [Harousseau et al., 2004; Karadag et al., 2000; Urashima et al., 1997]. Кроме того, паранеопластическое действие sIL-6Rα включает ангиогенез за счет 30 усиления активности матриксной металлопротеазы MMP-2 и секреции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в присутствии IL-6 [Barille et al., 2000]. Патогенетическая роль sIL-6Rα может найти отражение в создании новых таргетных анти-IL-6Rα агентов [Jones et al., 2011; Ancey et al., 2003; Kallen, 2002]. Необходимо, однако, учитывать некоторые особенности sIL-6Rα: после отмены анти-IL-6Rα в кровь высвобождается большое количество интерлейкина-6, защищенного в комплексе с sIL-6Rα от деградации [Lavabre-Bertrand et al., 1995]; концентрация терапевтического анти-IL-6Rα должна рассчитываться исходя из суммы количеств мембранного и растворимого рецепторов. Важную информацию может дать изучение механизма протеолитического высвобождения молекулы sIL-6Rα из мембраны [Althoff et al., 2000]. Подробный анализ биологии IL-6Rα и sIL-6Rα приводит к общему предположению о том, что, несмотря на структурную идентичность, функциональное значение этих рецепторов различно: в то время как IL-6Rα координирует гомеостатические сигналы и является участником анти- апоптотических и ростовых механизмов, sIL-6Rα быстро вырабатывается при инфильтрации нейтрофилов в местах повреждений и при хемотаксисе [Jones et al., 2011; Heinrich et al., 2003]. 1.4. Типы функциональной активности рецептора IL-6 при множественной миеломе Большинство исследований рецептора IL-6 при ММ в последнее время посвящены функциональным эффектам, в которых параллельно задействованы несколько независимых рецепторных систем. Такие процессы транссигнализации становятся возможными в результате действия цитокинов, вырабатываемых клетками микроокружения, а также при нарушениях экспрессии рецепторов на мембране неопластических клеток. 31 1.4.1. Регуляция экспрессии цепей рецептора IL-6 его лигандом Для некоторых иммортализованных клеточных линий ММ показан эффект изменения на мембране количеств IL-6Rα и gp130 в результате изменения во внеклеточном пространстве концентрации их лиганда (IL-6). Несмотря на то, что впервые данный эффект был описан достаточно давно [Portier et al., 1992], до настоящего времени его развернутое изучение проведено не было, и в литературе существуют не связанные друг с другом описания эффектов как позитивной, так и негативной регуляции рецептора IL-6 интерлейкином-6. Исследования на уровне мРНК IL-6Rα выявили обратную зависимость экспрессии IL-6Rα от концентрации экзогенного IL-6 на клетках линий XG-1, XG-5 и RPMI8226, а также в сыворотке больных ПКЛ, получающих анти-IL-6 терапию; количество мРНК IL-6Rα увеличивается в 10-70 раз при культивировании клеточных культур без цитокина в течение 24 часов или на 3-4 день антицитокиновой терапии. Обратный эффект наблюдается при добавлении к клеткам IL-6 или после отмены терапии анти-IL-6: количество мРНК IL-6Rα существенно снижается. [Portier et al., 1992]. Подобная регуляция описана [Lasfar et al., 1994] для клеток XG-1 и RPMI8226 при связывании рецепторов на мембране с меченым 125 I-IL-6. Интересно, что уменьшение количества IL-6Rα происходит в присутствии 1-50 пМ IL-6, в то время как концентрация насыщения им рецептора составляет 1-2 нМ. Отличное от вышеописанного действие IL-6 наблюдается на клетках IL-6независимой линии OPM-2 [Kovacs, 2003; Thabard et al., 2001], где экзогенный IL6 усиливает экспрессию IL-6Rα на 80% и существенно снижает (на 98%) количество gp130 на мембране. При этом усиливается секреция sIL-6Rα. В продолжении этого исследования [Kovaсs, 2006] подтверждены данные для OPM2, однако продемонстрировано значительное усиление экспрессии IL-6R на мембране клеток U266 (на 33%) и RPMI8226 (90%), что расходится c описанными выше литературными данными. Изменения соотношений IL-6Rα/gp130 в присутствии IL-6 выявлены в работах [Schwabe, Zhao et al., 1994; Schwabe, Brini et al., 1994], однако авторы использовали аффинную сшивку цепей рецептора и 32 радиавтографию, что исключило распознавание отдельных молекул IL-6R и gp130 на мембране. Состав полученных с помощью сшивок комплексов с молекулярной массой 100, 125, 145 и 165 кДа также не может быть однозначно интерпретирован. Тем не менее, в этой работе выявлены существенные различия в образовании типов рецепторных комплексов с участием молекул IL-6, IL-6R и gp130 на мембране IL-6-зависимых и IL-6-независимых типов клеток. При ММ гиперэкспрессия IL-6R может возникнуть после отмены анти-IL-6 препарата и привести к появлению высокочувствительных к IL-6 субклонов опухолевых клеток, резистентных к антицитокиновой терапии. Однако масштабные клинические данные по взаимосвязи количественных характеристик gp130 и IL-6Rα с концентрацией экзогенного IL-6, которые могли бы прояснить описанные экспериментальные наблюдения, до настоящего времени отсутствуют. Высказано несколько предположений о функциональной роли рассматриваемого эффекта. Изменение количественного соотношения молекул цепей рецептора IL-6 может служить механизмом регуляции как активности рецептора (его десенсибилизации), так и направленности передаваемого цитокинового сигнала (антиапоптотическое, пролиферативное действия). Кроме того, данный эффект обеспечивает участие трансдуцерных молекул gp130 в независимой активации посредством транссигнализации [Schwabe, Brini et al., 1994]. Снижение количества трансмембранных молекул IL-6Rα и gp130 может происходить по механизмам интернализации (рецептор-опосредованного эндоцитоза) и протеолитического высвобождения растворимых белков sIL-6Rα и sgp130 в межклеточное пространство. Эти процессы инициируются сигнальными молекулами внутри клетки и могут активироваться по интерлейкиновому или другим сигнальным механизмам. Процесс интернализации рецептора IL-6 регулируется фосфорилированием дилейцинового фрагмента, находящегося в цитоплазматическом домене gp130, является конститутивным и не связан напрямую с активацией рецептора цитокином [Heinrich et al., 2003; Thiel et al., 1998]. Выброс sIL-6Rα может быть опосредован IFNα, протеинкиназой C, и ретиноевой кислотой [Schwabe, Brini et al., 1994]. 33 1.4.2. Транссигнализация с участием рецептора IL-6 Важную роль в функционировании рецепторных молекул на поверхности опухолевых клеток играют механизмы взаимной регуляции независимых сигнальных путей при помощи цитокинов, растворимых белков и сигнальных молекул. Для молекул рецептора IL-6 представляются научно значимыми описание и анализ таких взаимодействий на клетках ММ. Известны несколько путей регуляции экспрессии рецептора IL-6. Убедительно показано в ряде работ [Sidell et al., 1991; Otsuki et al., 2003], что ретиноевая кислота дозозависимо усиливает экспрессию IL-6R и ингибирует рост клеток ММ. Присутствие IFNα или TNFα способствует продукции небольших количеств IL-6 клетками ММ [Klein et al., 1990], причем TNFα является фактором выживания [Jourdan et al., 1999] и действует по механизму, не связанному с IL-6. Противоположным действием обладает IFNα, который до недавнего времени применялся при терапии ММ [Демина, 1996]: он дозозависимо ингибирует рост клеток, одновременно индуцируя слабую секрецию IL-6, снижение экспрессии IL-6Rα на IL-6зависимых клетках XG-1 и ее усиление на автономно растущих клетках ММ RPMI8226 [Lasfar et al., 1994]. В работе [Schwabe, Brini et al., 1994] подтверждается снижение экспрессии IL-6Rα при воздействии IFNα на IL-6зависимые клетки (U266), и демонстрируется отсутствие такой регуляции на IL-6независимых клетках RPMI8226. Авторы предлагают двойной механизм изменения количества рецептора IL-6 под действием IFNα, согласно которому продукция IL-6, вызываемая IFNα, снижает количество gp130 в результате интернализации рецептора (гомологичная регуляция), а снижение количества IL6Rα происходит по IL-6-независимому внутриклеточному IFNα-индуцируемому механизму посредством снижения синтеза мРНК IL-6Rα (гетерологичная регуляция). IFNα способен активировать gp130 на клетках ММ в результате внутриклеточных процессов [French et al., 2003]; это возможно, поскольку внутриклеточные сигнальные пути рецепторов IL-6 и IFNα (IL-6Rα и IFNRA) во многом пересекаются, их запуск контролируется ассоциированными с 34 внутриклеточными доменами JAK и Tyk киназами. IFNγ, напротив, снижает количество IL-6Rα на мембране [Lasfar et al., 1994], причем он также ингибирует рост клеток ММ [Klein et al., 1990]. Одним из ключевых факторов роста клеток ММ в последнее время называют IGF-1β [Sprynski et al., 2009]. Этот цитокин проявляет антиапоптотическое и пролиферативное действие на клетки ММ через его рецептор IGF-1R аналогично интерлейкину-6, и, в отличие от TNFα, имеет пересекающийся с IL-6 сигнальный каскад. Для большинства первичных и иммортализованных клеток ММ показано наличие аутокринной ростовой петли IGF-1β, причем ингибирование рецептора IGF-1β выключает и IL-6-сигнализацию. Более того, взаимодействие IL-6 с IL-6Rα инициирует активацию IGF-1R и его сигнальный каскад в отсутствие IGF-1β [Abroun et al., 2004]. При высокой концентрации IL-6Rα на мембране IL-6 способен запускать фосфорилированием фосфорилирование gp130. IGF-1R и сопряженное IGF-1R, IL-6Rα соосаждаются с при иммунопреципитации, что говорит о прямом взаимодействии этих молекул и дает основания говорить о существовании на мембране трансактивирующей рецептосомы. Рецептор IGF-1β в норме не экспрессируется ни в В-клетках, ни в плазматических клетках, ни в плазмобластах и выявляется у 30-50% больных ММ и в 90% миеломных клеточных линий. Он, так же как и рецептор IL-6, имеет прогностическое значение при ММ, которое, однако, коррелирует с транслокацией t(4;14) и другими геномными изменениями, поэтому в большей степени клиническая значимость IGF-1R может быть оценена путем таргетного ингибирования IGF-R1, в том числе в сочетании с ингибированием IL-6R. Аутокринная петля роста и выживания клеток ММ с участием IGF-1β обеспечивает выживание только CD45- клеткок ММ, в то время как CD45+ клетки также запускают эту петлю, но ее недостаточно для выживания в отсутствие IL-6 или IGF-1β [Sprynski et al., 2009; Descamps et al., 2006]. Изучение этого феномена обнаружило целый ряд новых данных об особенностях передачи сигнала рецептором IL-6. Показано, что IL-6-независимые опухолевые плазматические клетки практически не экспрессируют CD45, а IL-6-зависимые обладают яркой 35 экспрессией этого маркера, причем из трех изоформ (CD45RA, CD45RB, CD45R0) CD45RA представлена на миеломных клетках в меньшей степени и не участвует в сигнальном взаимодействии с IGF-1R и gp130, а CD45RB, и в большей степени аберрантная, не экспрессирующаяся в норме [Fujii et al., 1999] CD45R0 при воздействии IL-6 быстро транслоцируются в липидные островки на мембране, где конститутивно присутствуют рецепторы IL-6 и IGF-1R [Li et al., 2005]. Подтверждена близкая локализация CD45R0, IL-6Rα, IGF-1R и некоторых нерецепторных киназ [Ishikawa et al., 2002]. Таким образом, сигнал IL-6 активирует gp130, IGF-1R и CD45, модулируя выживаемость клеток по трем сигнальным механизмам. Интересно также, что в пуле клеток одной клеточной линии могут присутствовать как CD45+, так и CD45- клетки [Ishikawa et al., 2003; Zhou et al., 2004], выживаемость и пролиферация которых активируется по разным механизмам, в обоих случаях через рецептор интерлейкина-6. Участие gp130 в сигнальном пути IL-10 характерно для плазматических клеток в состоянии выраженной пролиферативной активности: IL-10 запускает аутокринную петлю, способствуя появлению на мембране клеток ММ рецептора онкостатина М, который сенсибилизирует опухолевые клетки к передаче сигнала онкостатина М через gp130 для дальнейшей выработки ростового фактора IL-10 [Klein et al., 1999]. Взаимодействие gp130 с молекулами рецепторных тирозинкиназ было показано ранее: выявлены комплекс gp130/ErbB2 в клетках карциномы простаты человека, а также взаимодействие рецептора интерферона IFNAR-1 с gp130 [Qiu et al., 1998; Mitani et al., 2001]. Таким образом, нарушение соотношения молекул IL-6R и gp130 на мембране опухолевых клеток может способствовать трансактивации рецептора и являться важным механизмом передачи сигналов опухолевых клеток. Особое функциональное свойство gp130 взаимодействовать без участия IL6Rα с вирусным гомологом IL-6 (vIL-6) играет патогенетическую роль в ассоциированных с HHV-8 опухолях и рассматривается как один из возможных 36 механизмов активации ангиогенеза и антиапоптотических процессов в IL-6зависимых клетках, в том числе при ММ [Mullberg et al., 2000; Широков, 2006]. 1.5. Заключение Современные данные о структуре, функциях и механизмах действия рецептора интерлейкина-6, полученные несколькими независимыми научными группами, позволяют разрабатывать методы воздействия на субдоменную структуру молекулы и модулировать различные функциональные клеточные ответы: от ответа острой фазы до специфических дифференцировочных сигналов. Актуален вопрос разработки методов терапии множественной миеломы моноклональными антителами к определенным участкам gp130 и IL-6Rα. В последнее время открыты новые сигнальные gp130-активирующие молекулы, в том числе вирусные. Многогранность биологической активности рецептора интерлейкина-6 на мембране неопластических плазматических клеток в большой степени определяется опухолевым микроокружением. Рассмотрение описанных функциональных особенностей рецептора интерлейкина-6, в частности транссигнализации и трансактивации gp130, позволяет расширить представления о сигнальных и патогенетических процессах в опухолевых клетках при ММ. 37 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы 2.1.1. Реагенты и растворы В работе использовали реактивы отечественного производства: фосфатный буферный раствор - PBS (таблетированный, ЭКО-СЕРВИС), среда RPMI1640 (ПанЭко), реагенты ООО «Химмед»: ацетон, фенол, хлороформ, глицерин, изопропанол; гентамицин (40 мг/мл, диметилсульфоксид KRKA), (ОАО «Марбиофарм»). Реактивы зарубежного производства: рекомбинантный интерлейкин-6 (лиофилизованный, фикоэритрин и 35мкг, Diaclone, анти-TCR-1-биотин Франция), (BD, конъюгаты США), телячья стрептавидинэмбриональная сыворотка (HyClone, США), бычий сывороточный альбумин (Sigma, США), среда RPMI1640 c L-глутамином (Gibco RPMI 1640 Medium + Glutamax, Invitogen, Бельгия), среда ORIGEN Freeze Medium (IGEN Inc., США), азид натрия (NaN3, Amresco, США), набор для количественного определения антигенов QIFIKIT (Dako-BioCytex, Франция); реагенты для ПЦР степени чистоты для молекулярнобиологических работ (Sigma-Aldrich, США). Праймеры для ПЦР синтезированы в компании Синтол (Москва). Рекомбинантный аналог интерлейкина-6 SANT5 любезно предоставлен проф. Б. Кляйном (INSERM U475, Монпелье, Франция). Растворы Использовали готовили также с использованием коммерческие бидистиллированной растворы: лизирующий воды. раствор и пермеабилизирующий растворы (BD, США), физиологический раствор (натрия хлорид, 0,9%, ОАО «Биохимик»). 2.1.2. Клеточные линии Иммортализованные клеточные линии множественной миеломы XG-1 и XG-2, культивируемые в присутствии экзогенного IL-6 (IL-6-зависимые), были получены и любезно предоставлены лабораторией проф. Ж. Брошье (INSERM U475, Монпелье, Франция). Субклон XG-2PA, полученный селекцией в 38 присутствии рост-стимулирующих антител B1 и I2 (B1+I2 – зависимые) и мышиные пре-В-клетки BAF130/190, трансфицированные кДНК рецепторов gp130 и LIFR (gp190), были также предоставлены проф. Ж. Брошье. Клеточные линии множественной миеломы IM9 и RPMI8226 (IL-6-независимые) из банка Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, СанктПетербург), были получены из лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (зав. д.б.н. А.Ф. Карамышева). 2.1.2. Антитела Функциональные свойства цепей рецептора IL-6 изучали с применением панелей мышиных МКА к различным эпитопам внеклеточных доменов рекомбинантных gp130 и IL-6Rα человека. Анти-gp130 МКА: A1, A2, A3, B1, B2, I1, I2, C1, C2, C3, C7, D1, D2, D3, E1, E2, F4, G2, G4 и анти-IL-6Rα МКА: M91, M195, M5, M182 и М164; данные антитела были впервые получены и любезно предоставлены лабораторией проф. Ж. Брошье (INSERM U475, Монпелье, Франция). Для регистрации этих антител в реакции непрямой флуоресценции клетки инкубировали с козьими анти-мышиными фрагментами иммуноглобулинов F(ab’)2-FITC («Cорбент Ltd», Россия). Исследования клинического материала проводили с использованием диагностической панели первично меченых флуорохромами МКА (BD, США): CD38-PerCP (клон HIT-2), CD138-FITC (клон MI-15) и конъюгированных с РЕ МКА к CD45 (клон HI30), CD19, CD56, CD3 (клон UCHT1, изотип IgG1) и CD126 (клон М5, изотип IgG1). Тип моноклональности опухолевых клеток определяли с помощью κ-PE/λ-FITC реагента (BD, США). Регуляцию экспрессии рецептора IL6 собственным лигандом изучали в присутствии анти-IL-6 МКА, клон B-E8 (Diaclone, Франция). Изотипическими контролями являлись IgG1-PE и IgG1биотин (BD, США). 39 2.1.3. Оборудование и расходные материалы Для проведения работы с культурами клеток использовали стерильные боксы с ламинарной подачей воздуха БОВ-001-АМС (вариант «СЛШ») и NuAire Labgard Class II, СО2-инкубатор (NuAire, Франция), центрифуги ОС-6М (для микропланшет и вкладышей-фильтров CYTOSET), СМ-6М, ELMI автоматический гематологический анализатор ABX Micros 60 (Horiba ABX, Франция). ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик», Россия. Микроскопический анализ клеточных культур и флуоресцентных препаратов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (увел. х400) и инвертированного микроскопа (увел. х200) Сarl Zeizz (Германия). Трехцветная проточная цитометрия выполнена на приборах FACScan (Becton Dickinson, США) и EPIC XL-MCL (Becton Coulter, США) c использованием коммерческих растворов и рекомендуемых методик. Анализ данных проводили на персональном компьютере с использованием программ WinMDI 2.8 и FCS3. В работе использовали стерильные одноразовые пипетки и культуральные флаконы (25см2), вкладыши-фильтры для приготовления цитоцентрифужных препаратов CYTOSET (MPW, Польша), а также полистироловые круглодонные планшеты 96-луночные (Медполимер, Россия), полистироловые полипропиленовые пробирки объемом 10, 15 мл (Sarstedt, и Германия), микропробирки объемом 1,7 мл и 2 мл (Costar Corning, США). 2.2. Характеристика клинического материала В настоящее исследование включены образцы костного мозга 27 больных множественной миеломой, проходивших лечение в отделениях химиотерапии гемобластозов, трансплантации костного мозга, ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН с 2010 по 2013 годы. Среди больных было 15 мужчин, 12 женщин; медиана возраста на момент 40 исследования составила 61 год. Уровень плазмоцитоза костного мозга составлял 0,6 - 49% клеток плазмоцитарного ряда от общего количества миелокариоцитов (медиана 15,2%). Для установления диагноза у больных выполнялись рентгенологическое обследование костей, цитохимическое биохимический исследование анализ пунктата крови костного и мочи, мозга, а морфотакже иммунофенотипирование плазматических клеток костного мозга методом проточной цитометрии. Клинический диагноз множественной миеломы устанавливался согласно Международной классификации ММ, разработанной в 2005 году Международной рабочей группой по изучению ММ (International Myeloma Foundation, IMF). Биопсию и пункцию костного мозга подвздошной кости осуществляли стандартным методом. Объем аспирата составлял 0,5 – 1,5 мл. Исключали наличие разбавления пунктата периферической кровью морфологически по уровню клеточности и по составу костного мозга. Биопсийный материал подвергали исследованию в течение 1-7 часов после его получения из подвздошной кости. Морфо-цитохимическая часть исследования, являющаяся рутинным этапом диагностической работы и включающая подсчет миелограммы, была выполнена в морфоцитохимической группе лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф., д.м.н. М.А. Френкель). Препараты мазков костного мозга, окрашенные по методу Романовского, исследовали с помощью иммерсионной микроскопии (увел. х 1000). Подсчет лимфоцитов по 250 клеток проводился независимо двумя специалистами для каждого препарата. 2.3. Методы 2.3.1. Работа с культурами клеток 2.3.1.1. Культивирование клеточных линий Клетки множественной миеломы линий RPMI8226 и IM9 культивировали в питательной среде RPMI-1640, содержащей 2мМ L-глутамин, 10% телячью эмбриональную сыворотку и 0,1 мг/мл гентамицин, в стерильных культуральных 41 флаконах 25см2 при 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2. Пересевали клетки каждые 2-4 дня по мере достижения ими плотности 1х106 кл/мл. Для этого отбирали 1-2 мл клеточной суспензии, вносили ее в культуральный флакон и затем добавляли 8-9 мл свежей культуральной среды. Для всех экспериментов использовали клетки в логарифмической фазе роста. Клетки линий XG-1 и XG-2 (IL-6-зависимые), XG-2PA (B1+I2-зависимые), BAF130/190 (LIF-зависимые) культивировали в описанных выше условиях, но с добавлением в среду при пересеве необходимых ростовых факторов: IL-6 5 пМ (0,1 нг/мл), B1 и I2 по 0,5 мкг/мл каждое, LIF 10 пМ, соответственно. 2.3.1.2. Исследование внеклеточных доменов рецептора IL-6 с помощью панели антител к gp130 и IL-6Rα и антагониста IL-6 В основу изучения функциональных особенностей внеклеточных доменов субъединиц рецептора IL-6 gp130 и IL-6Rα был положен принцип оценки количеств отдельных эпитопов gp130 и IL-6Rα методом проточной цитометрии с непрямой детекцией с помощью соответствующих панелей анти-gp130 и анти- IL6Rα МКА. Клетки линий RPMI8226, IM9, XG-1, XG-2, XG-2PA, BAF130/190, находящиеся в логарифмической фазе роста, переносили в пробирки типа «эппендорф», центрифугировали при комнатной температуре 7 мин со скоростью 1000 об/мин и отбирали супернатант, содержащий отработанную ростовую среду. Клетки осторожно ресуспендировали в 500 мкл холодного буферного фосфатного раствора, pH=7,4. В лунки круглодонного 96-луночного планшета вносили на льду по 0,3-0,5 млн. клеток. Добавляли 50 мкл 0,5 мкг/мкл (25 мкг) определенного МКА в PBS, содержащем 0.02% NaN3, хорошо перемешивали и оставляли при +4°С на 30 мин. Затем на льду добавляли PBS до полного объема лунки, аккуратно ресуспендировали, центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин и сразу после окончания центрифугирования стряхивали супернатант. Промывку затем повторяли дважды, после чего проявляли связавшиеся МКА с помощью F(ab’)2FITC, так же, как иммунофлуоресценции). описано в разделе 2.3.3.2 (метод непрямой 42 Данную методику применяли в экспериментах по димеризации и интернализации субъединиц рецептора с вариациями, затрагивающими температуру и время инкубации клеток с МКА. Влияние на эпитопы gp130 и IL-6Rα функционально неактивного аналога IL-6 – суперантагониста IL-6 SANT5 также изучали в рамках описанного метода, в котором связыванию специфических МКА предшествовала стадия преинкубации клеток с аналогом цитокина. Реакции проводили при +4°С при концентрации SANT5 5 пг/мл (0,25 нМ). Промывку клеток перед добавлением анти-gp130 и анти-IL6Rα МКА не проводили. 2.3.1.3. Изучение регуляции экспрессии рецептора IL-6 его лигандом Клетки линий XG-1, XG-2, RPMI8226 культивировали в присутствии и в отсутствии IL-6. Для клеточной линии XG-2PA фактором роста служила пара антител B1+I2 в стандартной ростовой концентрации (12,5+12,5 мкг соответственно). Для осуществления цитокиновой депривации клеткам, не достигшим логарифмической фазы роста (на второй день после пересева) заменяли ростовую среду на новую, не содержащую IL-6 (либо B1+I2). Для этого клетки стерильно осаждали центрифугированием 7 мин при 1000 об/мин, отбирали ростовую среду и переносили культуру в обедненную цитокином среду. Далее методом непрямой цитофлуориметрии оценивали изменения экспрессии gp130 и IL6Rα субъединиц рецептора в течение одних, двух и трех суток роста в условиях депривации. Отдельно оценивали эпитопы А1, С2, М195, М91 рецептора с помощью соответствующих МКА. Контрольным показателем служила экспрессия субъединиц в условиях культивирования клеток в присутствии стандартного количества IL-6 (либо B1+I2). Эффекты добавления IL-6 к клеткам XG-1, XG-2, RPMI8226 наблюдали, подвергнув их вначале цитокиновому голоданию в течение суток, а затем инкубации в присутствии стандартных ростовых количеств IL-6, IL-6-биотин, либо 5 пг/мл SANT5. Клетки подвергали депривации IL-6 по описанной выше методике, а последующую инкубацию с цитокином проводили при +4°C, либо 43 при +37°С в течение 1, 5, 15, 30 и 60 минут. Оценку изменения уровня экспрессии gp130 после 1 часа инкубации в присутствии IL-6 или SANT5 провели для 18 различных эпитопов рецептора. Детекция эпитопов осуществлялась стандартным методом непрямой иммунофлуоресценции. 2.3.2. Выделение фракции мононуклеарных клеток костного мозга Клинический материал, предварительно охарактеризованный морфо- цитохимически по уровню плазмоцитоза и общему содержанию лейкоцитов, использовали для дальнейшего иммунологического и экспериментального исследования. Отбирали 100 мкл цельного образца для молекулярно- биологического исследования на наличие инфицирования вирусом герпеса человека 8-го типа (HHV-8). Основную часть аспирата, составляющую 0,5-1 мл, переносили в пробирку объемом 10 мл, доводили объем до 10 мл PBS, pH=7,4, осторожно перемешивали, центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин и удаляли супернатант. Затем лизировали эритроциты с использованием коммерческого лизирующего буфера Becton Dickinson согласно рекомендуемому протоколу: добавляли 2-4 мл лизирующего раствора, хорошо перемешивали, инкубировали препарат 7-10 мин в темноте при комнатной температуре до состояния прозрачной «лаковой крови», центрифугировали при тех же условиях, удаляли супернатант. Клетки затем осторожно ресуспендировали в 2 мл PBS, после чего осуществляли окончательную промывку и ресуспендировали клетки в минимальном объеме PBS (200-400 мкл). Для реакции использовали по 20-30 мкл на лунку полученного препарата клеток. 2.3.3. Проточная цитофлуориметрия 2.3.3.1. Метод прямой иммунофлуоресценции Окрашивание антигенов первично мечеными антителами проводили в рамках клинического и экспериментального анализа аспиратов костного мозга методом трехцветной проточной цитометрии. Для выявления пула плазматических клеток 44 использовали моноклональные антитела к CD38 и CD138. Подготовленную суспензию клеток мононуклеарной фракции костного мозга объемом 100-120 мкл вносили на льду в лунки 96-луночного планшета, добавляли антитела CD38-PerCP (титр 1:14) и CD138-FITC (титр 1:8), инкубировали 30 мин при +4°С, после чего равные части суспензии клеток, меченых специфическими маркерами плазмоцитов, по 25-30 мкл переносили в 6 отдельных лунок, куда добавляли РЕконъюгированные антитела для определения аберрантного иммунофенотипа опухолевых клеток множественной миеломы: CD45-PE (конечный титр 1:30), CD19-PE (титр 1:30), CD56-PE (титр 1:30), CD3-PE (отрицательный контроль, титр 1:30), CD126-PE (титр 1:15). Инкубировали 30 мин при +4°С, трижды промывали многократным пипетированием в PBS, pH=7,4 и центрифугированием 7 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляли из лунок планшета сразу по окончании центрифугирования. Промытые после реакции клетки ресуспендировали и переносили из лунок планшета в 700 мкл PBS в пробирки для счета. Накапливали по 50000-500000 событий для каждого образца. 2.3.3.2. Метод непрямой иммунофлуоресценции Реакцию клеточными непрямой линиями, флуоресценции содержащими проводили один тип в экспериментах клеток и поэтому с не предусматривающими трехцветного окрашивания при проточной цитометрии. Это позволяло выполнять достаточное количество промывок, сохраняя оптимальное количество клеток в образце, а также достичь высокого соотношения сигнал/фон. Первичные анти-gp130 и анти-IL-6Rα МКА, хранящиеся в заморозке в рабочих аликвотах, однократно размораживали при +4°С и сразу же вводили в реакцию. Рабочая концентрация первичных МКА в реакциях с суспензией клеток культур множественной миеломы составляла 12,5 мкг/мл. Регистрацию сигнала МКА, связавшихся со специфическими эпитопами на поверхности клетки, осуществляли после докрашивания образцов козьими анти-мышиными F(ab’)2-фрагментами, конъюгированными с FITC. Для этого 50 мкл флуоресцентного конъюгата с титром 1:100 добавляли к 50 мкл суспензии 45 трижды промытых клеток, инкубировали при +4°С 30 мин и снова трижды промывали описанным выше способом. Для регистрации флуоресценции методом проточной цитометрии клетки переносили в пробирки для счета и доводили объем образца PBS до 700 мкл. Контрольный образец не содержал первичного МКА, но был окрашен FITC-конъюгатом. Аналогичную методику применяли в экспериментах с МКА, конъюгированых с биотином. В этом случае для получения флуоресцентного сигнала использовали стрептавидин-PE (титр 1:10) вместо F(ab’)2-FITC. 2.3.3.3. Количественное определение экспрессии молекул рецептора Абсолютное количество молекул α- и β-цепей рецептора IL-6 (IL-6Rα и gp130) определяли методом проточной цитометрии с помощью набора реагентов QIFIKIT (Dako-BioCytex, Франция). Определение количества антигенов на мембране клеток проводили в условиях полного насыщения препарата соответствующими МКА. Для МКА A1, A2, A3, I1, B1, B2, G2, C2, D2, M164, M195, M182, M91, M5 эта концентрация составила 25 мкг/мл. МКА проявляли с помощью F(ab’)2 фрагментов FITC-конъюгированных козьих антимышиных иммуноглобулинов. Биотинилированные МКА выявляли с помошью стрептавидин-PE. Условия пробоподготовки для проведения экспериментов были идентичны описанным в разделе 2.3.3.2. Оценка рабочего диапазона области флуоресценции состояла в сравнении гистограмм окрашенных флуоресцентного анти-gp130 или сигнала плазматических анти-IL-6Rα МКА, с клеток фоновым RPMI8226, сигналом отрицательного контроля F(ab’)2-FITC или стрептавидин-PE, и одновременно с флуоресценцией конъюгированных с флуорохромом микросфер (положительный контроль). Калибровочную кривую строили для каждого независимого эксперимента. Для этого при неизменных рабочих характеристиках цитофлуориметра определяли значения logMFI – логарифма среднего значения флуореценции FITC (длина волны эмиссии 521 нм) или PE (575 нм) для набора микросфер, конъюгированных 46 с заданным числом молекул соответствующего флуорофора (рисунок 2.1 А). Микросферы (100 мкл) ресуспендировали в PBS-1% BSA (4°С), затем проводили пробоподготовку аналогично работе с клетками. Типичная калибровочная кривая изображена на рисунке 2.1 Б. Построение кривой в полулогарифмических координатах проводили методом наименьших квадратов, уравнения для линейной функции рассчитывали в программе GraphPad Prizm 5.0. А Б Рисунок 2.1. - Построение калибровочной кривой для определения количества антигенов на мембране клеток: А. Набор стандартизированных микросфер QIFIKIT для построения калибровочной кривой. Б. Общий вид калибровочной кривой для количественного определения мембранных антигенов с помощью набора QIFIKIT. Расчет количества эпитопов (молекул) (N) проводили на основе полученной линейной функции калибровочной кривой по формуле: N = a•logMFI + b, где a и b – константы для данного эксперимента, а MFI – среднее значение интенсивности флуоресценции для данного антитела. В ряде случаев, когда выявлялось существенное различие между функциями, описывающими низкое и высокое количество эпитопов, калибровочную кривую строили с учетом 4-5 концентраций флуоресцента, соответствующих нижней области рабочего диапазона значений флуоресценции. 47 2.3.3.4. Окрашивание внутриклеточных маркеров Для установления типа клональности опухолевых клеток ММ методом проточной цитометрии проводили внутриклеточное окрашивание легких цепей иммуноглобулинов. Аликвоту суспензии клеток мононуклеарной фракции костного мозга объемом 30 мкл вносили в лунку 96-луночного планшета и инкубировали с маркером плазматических клеток МКА CD38-PerCP 30 мин при +4°С (титр антитела 1:15). Дважды промывали клетки PBS, pH=7,4 с центрифугированием 7 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли. После промывок клетки ресуспендировали встряхиванием на вортексе в остаточном надосадке, вносили в лунку 200 мкл пермеабилизирующего раствора Becton Dickinson, хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 8 мин. После инкубации клетки центрифугировали, удаляли супернатант и проводили инкубацию с 10 мкл реагента, содержащего антитела к легким цепям иммуноглобулинов κ-PE/λ-FITC 30 мин при +4°С. После инкубации клетки промывали трижды и вносили в пробирки для счета в 600 мкл PBS. 2.3.3.5. Анализ клинических и экспериментальных данных, полученных методом проточной цитометрии Данные, полученные с прибора FACScan в виде файлов формата .fcs1.0, анализировали в программе WinMDI 2.8. При обработке данных, полученных на клеточных линиях при одноцветном окрашивании, события представляли в координатах прямого и бокового рассеяния и выделяли основную популяцию живых клеток с относительно крупным размером и низкой гранулярностью. Затем по выбранным клеткам строили гистограммы, отражающие распределение флуоресцентного сигнала по количеству событий. В одном рисунке наложением получали два и более пиков, которые сравнивали между собой и с результатами аналогичных экспериментов (рисунок 2.2 А). Анализ данных с трехцветным окрашиванием образцов, в том числе клинического материала, начинали с выявления популяции плазматических 48 клеток из общего числа миелокариоцитов костного мозга путем гейтирования. При высоком уровне плазмоцитов визуально оценивали диапазон размера и гранулярности пула опухолевых клеток в координатах прямого и бокового рассеяния FSC/SSC и затем выделяли клетки с высокой экспрессией CD38 в координатах CD38/SSC (рисунок 2.2 Б). Выбранные таким образом клетки рассматривали в координатах CD38/CD138, в которых логически формировали популяции опухолевого пула CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138- (рисунок 2.2 В, Г). Эти три группы клеток описывали как долю от общего количества лейкоцитов и как долю CD138-негативных клеток от числа плазмоцитов (CD38+). Для маркеров CD38 и CD138 строили также двумерные гистограммы распределения уровней экспрессии по количеству событий и находили среднее геометрическое значение для каждой из трех групп клеток. Анализ экспрессии аберрантных антигенов ММ CD45, CD19, CD56, а также CD126 и выполняли, характеризуя в каждой из трех групп долю клеток с наличием их экспрессии. Логическую границу наличия экспрессии выставляли по совокупности следующих характеристик: визуального разделения пула клеток на «экспрессирующий» и «неэкспрессирующий», клеток, отсекаемых границей сигнал/шум по экспрессии CD3 и по расположению границы пула Т-лимфоцитов. После установления четкой границы экспрессии определяли процент клеток с экспрессией антигена в координатах CD138-FITC/CD45-PE, CD138-FITC/CD19PE, CD138-FITC/CD56-PE, CD138-FITC/CD3-PE, CD138-FITC /CD126-PE. По гистограммам распределения уровней экспрессии находили также среднее геометрическое для этих величин. Экспрессию рецептора IL-6 представляли для каждой из трех групп клеток CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138- в виде характеристик: а) доли CD126позитивных (CD126+) клеток, б) среднего значения флуоресценции MFI, в) среднего геометрического значения Gmean, г) соотношения средних геометрических значений сигнал/шум MFR = Gmean(CD126)/ Gmean(CD3), д) наличия одной или двух отдельных популяций CD126+ и CD126++ и 49 соответствующих им MFR, которые мы обозначили MFRCD126+ = MFR(I) и MFR CD126++ = MFR(II) соответственно. А Б В Г Рисунок 2.2. - Обработка цитофлуориметрических данных: А. Наложение гистограмм, соответствующих флуоресцентному сигналу клеток с выбранными параметрами образцов и окрашенных CD3-PE (отрицательный контроль, закрашенный пик) и CD126-PE (незакрашенный пик); Б, В, Г: Выделение анализируемых популяций плазматических клеток костного мозга больного ММ: Б: гейт R1 в координатах CD38-PerCP/SSC; В: гейты R2 CD38+/CD138+ и R3 - CD38+/CD138- в координатах СD38-PerCP/CD138-FITC; Г: популяция плазматических клеток гейта R1 костного мозга в координатах CD38-PerCP/CD126-PE. Учет слабой экспрессии CD126 проводили также при помощи статистических расчетов коэффициента D Колмогорова-Смирнова, которые подробно описаны в разделе, посвященном статистической обработке результатов. 50 2.3.4. Депривация IL-6 в препаратах костного мозга Эксперименты по влиянию элиминации IL-6 на экспрессию рецептора интерлейкина-6 в клиническом материале проводили в стерильных условиях. Из пробирок с аспиратами костного мозга, полученными для клинического исследования, стерильно отбирали 500 мкл образца, которые инкубировали с 50 мкл анти-IL-6 МКА B-E8 в стандартных условиях культивирования клеточных культур ММ: при 37°С, 5% СО2 и высокой влажности. Концентрация антитела составила 100 мкг/мл. Через 3 часа после начала инкубации из пробирок снова стерильно отбирали 150 мкл инкубированного аспирата, в то время как оставшуюся часть продолжали инкубировать в течение суток. Часть аспирата костного мозга, не подвергавшуюся инкубации с анти-IL-6, немедленно исследовали рутинным образом для подсчета миелограммы и выявления аберрантного иммунофенотипа ММ; полученные значения экспрессии CD126 явились контрольной точкой эксперимента. Инкубированные с анти-IL-6 аликвоты мононуклеарной фракции клеток также подвергали немедленному выделению на льду после инкубации в течение 3 и 24 ч и последующему связыванию с анти-CD3-PE и анти-CD126-PE с использованием стандартных методик, описанных в разделах 2.3.2. и 2.3.3.1. 2.3.5. Флуоресцентная микроскопия Подготовку иммунофлуоресцентных препаратов на стеклах для микроскопического флуоресцентного анализа проводили по следующей схеме. На сухое предметное стекло, обезжиренное смесью Никифорова, устанавливали вкладыш-фильтр для центрифугирования, в который вносили 10 мкл препарата мононуклеарной фракции клеток костного мозга и 40 мкл PBS, pH=7,4. Клетки наносили центрифугированием в течение 7 мин при 1000 об/мин, осторожно извлекали стекло и подсушивали его на воздухе 1 мин. Фиксировали клетки в холодном ацетоне 10 мин, равномерно распределяли на обведенном восковым карандашом пятне клеток каплю двухцветного реагента объемом 10 мкл, 51 содержащего антитела к легким цепям иммуноглобулинов κ-PE/λ-FITC и затем инкубировали 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Отмывали 10 мин в 0,9% растворе хлорида натрия. После удаления излишка жидкости на препарат наносили 10 мкл 50% глицерина и накрывали покровным стеклом. Препарат оставляли во влажной камере и незамедлительно исследовали под микроскопом. Препараты, подготовленные для анализа иммунофлуоресценции клеток, изучали при увеличении х400 во флуоресцентном (флуоресцеин-изотианат, Rфикоэритрин) режиме; изображения получали с помощью встроенной фотокамеры, которой оснащен прибор. 2.3.6. Выявление генов вируса HHV-8 в опухолевых клетках Аликвоты интактного костного мозга больных ММ объемом 100 мкл использовали для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого выделяли ДНК по следующей методике: нерастворимые в феноле фрагменты разрушенных трехкратным замораживанием в 0,1% SDS клеток осаждали центрифугированием 10 мин при 13400 об/мин. ДНК экстрагировали из растворимой фракции в смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугировали в тех же условиях, затем экстрагировали из верхней фазы хлороформом, вновь центрифугировали и осаждали из хлороформа 3М ацетатом натрия в изопропиловом спирте при -20°С. После центрифугирования осадок высушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл деионизованной воды. Исследовали ДНК на наличие трех генов, специфичных для HHV-8: К1, кодирующего трансмембранный вирусный белок, vIL-6 (К2) – аналога человеческого IL-6, и ORF26, кодирующего капсидный белок. ПЦР выполняли в режимах, указанных в таблице 2.1. Контрольным геном служил человеческий ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GADPH). 52 Т а б л и ц а 2.1 - Режимы полимеразной цепной реакции, используемые для амплификации генов HHV-8 Ген, праймеры Денатурация Отжиг Элонгация Количество циклов Длина продукта амплификации GADPH forward 5’-AGTCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’ GADPH reverse 5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’ 94°C, 60°С, 72°С, 40 1 мин 1 мин 1 мин K1 forward 5’-GACCTTGTTGGACATCCCGTACAATC-3’ 190 п.о. K1 reverse 5’- AGGCCATGCTGTAAGTAGCACGGTT-3’ 94°C, 55°С, 72°С, 35 1073 п.о. 1 мин 1 мин 2 мин vIL-6 forward 5’-CAGCCATATGATGTGCTGGTTCAAGTTGTG-3’ vIL-6 reverse 5’-AGCACTCGAGTTACTTATCGTGGACGTCAG-3’ 94°C, 58°С, 72°С, 35 30 с 45 с 45 с ORF26 forward 5’-AGCCGAAAGGATTCCACCAT-3’ 615 п.о. ORF26 reverse 5’-CTGGACGTAGACAACACGGA-3’ 94°C, 30 с 55°С, 30 с 72°С, 30 с 35 233 п.о. Продукты реакции разделяли с помощью ДНК-электрофореза в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Буферный раствор для электрофореза содержал 67 мМ Tris-HCl, pH=8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4 и 0,01% Tween-20; напряжение 90В. ПЦР-продукты вносили по 30 мкл в агарозный гель в 50% глицерине в 1 мМ ЭДТА, рН=8,0 и с 0,025% бромфеноловым синим. Результаты анализа регистрировали визуально в трансиллюминаторе под ультрафиолетом с длиной волны 312 нм. 2.3.7. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics, версия 17.0. Для количественной оценки взаимосвязей между параметрами рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона. Достоверность различий рассчитывали с помощью точного критерия Фишера или 53 критерия Стьюдента. Статистически достоверными принимали различия с p<0,05. Анализ данных, не описывающихся нормальным распределением, а также для категоризованных параметров проводили с помощью непараметрических методов χ2 «хи квадрат» с построением таблиц сопряженности, сравнения выборок по Манну-Уитни, при этом рассчитывали медианы значений. Построение графиков функций второго порядка, а также линейных калибровочных кривых методом наименьших квадратов выполняли в программе GraphPad Prizm 5.0. Метод Колмогорова-Смирнова применяли для выявления слабой экспрессии рецептора на уровне фоновых значений флуоресцентного сигнала клеток. Рассчитывали коэффициент D, коррелирующий с величиной экспрессии [Shinjo et al., 1997], в программе CellQuest, Becton Dickinson (расчеты выполнены в НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина, директор акад. РАМН Рахманин Ю.А.). Для построения распределений использовали исходные данные проточной цитофлуориметрии формата .fcs 1.0. Для всех полученных значений D оценивали уровень достоверности. 54 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Функциональные особенности экстрацеллюлярных доменов gp130 и IL-6Rα субъединиц рецептора IL-6 Под функциональными свойствами фрагментов сложных биологических молекул, таких, как мультидоменные рецепторные цепи, мы понимаем конкретные биохимические взаимодействия с другими фрагментами рецептора или с модуляторами его активности. Функциональные свойства основных структурных единиц внеклеточной части молекул рецептора IL-6 - gp130 и IL-6Rα подробно описаны в главе «Обзор литературы». Более детальное их рассмотрение, с помощью изучения свойств эпитопов моноклональных антител, позволяет описать механизмы функционирования рецептора с позиций конкурентного и стерического замещения IL-6. В настоящем разделе работы экспериментально изучены с помощью анти-gp130 и анти-IL-6Rα МКА особенности экспрессии и активации рецептора IL-6 на культурах IL-6-зависимых и IL-6-независимых иммортализованных клеток множественной миеломы. 3.1.1. Участие эпитопов рецепторных молекул gp130 и IL-6Rα в дозозависимом связывании IL-6 В работе [Liautard et al., 1997] были описаны свойства анти-gp130 МКА, такие как способность ингибировать рост клеток, опосредуемый передачей сигнала от цитокина к gp130, и перекрестная реактивность антител. Эпитопное картирование, раскрывающее пространственные соотношения между эпитопами gp130 и рассмотренное в главе «Обзор литературы», позволило нам выбрать для исследования эпитопы из разных групп МКА, пространственно разнесенные в молекуле рецептора, и, возможно, играющие различную роль в его функционировании. Отобранные по этому принципу МКА A1, B1, C2, M195 составили характеристическую исследования. На клетках экспериментальную линий RPMI8226 и панель XG-2 дальнейшего мы провели 55 цитофлуориметрическую оценку связывания молекул IL-6 с мембраной клеток, в том числе оценили процент интерлейкин-позитивных клеток в присутствии различных концентраций IL-6 (таблица 3.1.1). Для этого инкубировали клетки с биотинилированным IL-6, после чего проявляли связавшийся цитокин с помощью стрептавидин-PE. Расположение пиков флуоресценции относительно пика неспецифической флуоресценции контроля отражает уровень связанного с мембраной IL-6 (рисунок 3.1.1). Т а б л и ц а 3.1.1 - Количество IL-6-позитивных клеток после инкубации с различными концентрациями IL-6-биотин, (%) Конц. IL-6-биотин Линия клеток 0 (стрептавидин-PE) 5 мкг/мл 10 мкг/мл 20 мкг/мл RPMI8226 4 94.5 95 99.6 XG-2 6.2 36 71 85 Клетки RPMI8226, как видно из таблицы 3.1.1, более активно связывают IL-6 по сравнению с клетками XG-2. Рисунок 3.1.1. - Cвязывание IL-6биотин с мембраной клеток миеломы XG-2. Пик 1 – уровень неспецифического связывания PEстрептавидин, [IL-6] = 0; пик 2: [IL-6] =5 мкг/мл; пик 3: [IL-6] = 10 мкг/мл; пик 4: [IL-6]= 20 мкг/мл. При изучении функциональной связи IL-6 - рецептор нам важно было не только определить количественные характеристики процесса связывания цитокина с мембраной клеток миеломных клеточных культур, но и описать дифференцированное влияние IL-6 на детекцию различных эпитопов молекул IL6Rα и gp130. Часть эпитопов, как мы предполагали, непосредственно связывают цитокин, другая часть – не участвуют в этом процессе. Для раститровки IL-6 мы использовали следующие концентрации: 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 56 1 нг/мл, 0,1 нг/мл. При этом определяли изменение количества эпитопов A1, B1, C2 (gp130) и M195 (IL-6Rα) по сравнению с их уровнем до воздействия цитокина. В результате раститровки изотипические контроли для всех концентраций IL-6 совпадали, что позволило провести анализ смещения пиков, соответствующих каждому из антител, в зависимости от концентрации цитокина. На рисунке 3.1.2 показаны пики МКА А1 для всех перечисленных выше шести концентраций IL-6. Видно, что количество эпитопов А1 резко снижается при высоких концентрациях IL-6 по сравнению с исходным количеством; меньшие концентрации приводят к более слабому влиянию. Рисунок 3.1.2. - Экспрессия эпитопа А1 молекулы gp130 на клетках миеломной линии XG-2, культивированных 24 ч в отсутствие IL-6 (сплошная линия) и при воздействии различных концентраций IL-6 (пунктирная линия). Аналогичная картина была получена для эпитопов gp130 B1 и IL-6Rα M195, в то время как положение пика gp130 С2 под действием IL-6 не изменялось. Наиболее наглядно изменение детектируемости эпитопов в присутствии IL-6 можно проиллюстрировать при сопоставлении гистограмм изотипического контроля, как это сделано на рисунке 3.1.3. МКА и 57 А1 В1 58 С2 М195 Рисунок 3.1.3. - Окрашивание клеток XG-2 анти-gp130 (А1, В1, С2) и анти-IL6Rα (М195) МКА после инкубации с различными концентрациями IL-6. Пунктирная линия – МКА; сплошная линия – изотипический контроль. Как видно из рисунка 3.1.3, в присутствии IL-6 уровень С2 не меняется, в отличие от экспрессии эпитопов А1, В1, М195. Изменения экспрессии эпитопов А1, В1, М195 носят строго дозозависимый характер, что иллюстрируют классические кривые ингибирования (рисунок 3.1.4). Уменьшение количества сайтов связывания МКА под влиянием интерлейкина-6 представлено в координатах «изменение флуоресцентного сигнала FL-1 (величина смещения пика влево, ∆FL, рисунок 3.1.2) – логарифм концентрации IL-6» и 59 характеризуется коэффициентом ЕС50 – эффективной концентрацией IL-6, при которой его воздействие составляет половину от максимального. EC50 = 3.2 ng/ml 20 EC50 = 1.1 ng/ml 20 A1 20 B1 ∆ FL 10 10 5 5 -2 0 2 4 6 10 5 0 0 M195 15 ∆ FL 15 15 ∆ FL EC50 = 1.8 ng/ml 0 -2 0 2 4 6 0 log [IL-6] log [IL-6] 1 2 3 4 5 log [IL-6] Рисунок 3.1.4. - Анализ дозозависимого характера воздействия IL-6 на эпитопы А1 и В1 молекулы gp130 и на эпитоп M195 молекулы IL-6Rα. Несмотря на высокую чувствительность рецептора к цитокину (cущественное маскирование эпитопов в присутствии нанограммовых количеств IL-6), полное наложение пиков МКА на область изотипического контроля достигается при гораздо более высоких концентрациях цитокина (10-100 нг/мл, рисунок 3.1.3). 3.1.2. Изучение димеризации рецептора интерлейкина-6 с помощью МКА к gp130 и IL-6Rα на иммортализованных клеточных линиях Для выявления сайтов димеризации рецептора интерлейкина-6 gp130 – при гомодимеризации (gp130-gp130) и при гетеродимеризации (gp130-IL-6Rα) мы изучали изменение доступности эпитопов рецептора для связывания с различными МКА в присутствии и в отсутствии IL-6. Поскольку лиганды, или факторы роста, стимулируют передачу сигнала и обеспечивают димеризацию рецептора, мы выполнили серию экспериментов с клеточными линиями XG-2 и XG-2PA, для роста которых необходимо присутствие ростовых факторов. К клеткам миеломной клеточной линии XG-2 добавляли IL-6 до конечной концентрации 5 пг/мл, в случае XG-2PA рост клеток поддерживали с помощью стимулирующей пары антител B1+I2. 60 Изучали функциональное действие МКА к эпитопам экстрацеллюлярных доменов молекул gp130 (А1, С2, В1, I1, I2) и IL-6Rα (M195, М91). Для контрольных экспериментов использовали мышиные пре-В клетки BAF130/190, трансфицированные кДНК gp130 и gp190 (LIFR). Наличие устойчивой экспрессии gp130 позволило подобрать рабочие концентрации МКА и продемонстрировать отсутствие перекрестного блокирования между эпитопами молекулы gp130 стимулирующих рост клеток антител B1, I1, I2 и не стимулирующих А1, С2. Для этого были изучены все пары «стимулирующее МКА - не стимулирующее МКА». Стимулирующие мышиные МКА B1+I2 связываются с gp130 (рисунок 3.1.5 Г), поэтому для выявления аналогичными мышиными МКА эпитопов рецептора использовали реакцию непрямой иммунофлуоресценции с применением биотинилированных МКА (А1-биотин, C2-биотин, M91-биотин, M195-биотин), которые проявляли с помощью стрептавидин-PE. К клеткам были внесены индивидуальные B1, I1, I2 (преинкубация 1 ч., 37°С), затем - биотинилированные А1, С2 (инкубация 30 мин, 0°С, 0,02% NaN3). В качестве изотипического контроля для первых вносили мышиный IgG1, для вторых – биотинилированный IgG1. Цитофлуориметрический сигнал считывали после окрашивания связавшихся антител стрептавидин-PE. На рисунке 3.1.5 А четко видна экспрессия gp130 (пики А1, С2). При наличии перекрестного блокирования эпитопов преинкубируемое антитело должно исключать доступность эпитопа для вносимого позднее биотинилированного антитела. Поэтому при наличии перекрывания эпитопов детектируемый пик должен быть смещен в область изотипического контроля. Рисунок 3.1.5 Б отражает отсутствие перекрывания эпитопов антител A1 и B1, C2 и B1 (полное совпадение пиков А1 без и с преинкубацией с В1, то же для пары С2 - В1). Слабое перекрывание эпитопов МКА А1 и I1, I2, согласующееся с литературными данными (рисунок 1.2 в главе «Обзор литературы»), полученными методом ELISA (ранее на клетках перекрестное блокирование не изучалось), но не вносящее существенного представлено на рисунке 3.1.5 В. вклада в цитофлуориметрическую картину, 61 Рисунок 3.1.5. - Контрольные эксперименты для анти-gp130 МКА в присутствии В1+I2: А. Связывание антител А1 и С2: сплошная линия – изотипический контроль (мышиный IgG1), пунктирная линия – экспрессия эпитопов на мембранной молекуле gp130; Б. Проявление эпитопов А1 и С2 после преинкубации с В1 – уровень связывания не изменился; В. Проявление эпитопа А1 после преинкубации с I2 и с I1 – некоторое наличие перекрестного связывания; Г. Связывание антител стимулирующей пары В1+I2 с молекулой gp130. В результате активации (димеризации) рецептора эпитоп сайта димеризации gp130 становится пространственно недоступным (пик I2 смещен в область изотипического контроля), при этом эпитоп B1 остается свободным, поскольку он не участвует в гомодимеризации gp130 (пик справа на уровне исходного количества рецептора). При отработке условий димеризации трансдуцерной цепи рецептора интерлейкина-6 gp130 на миеломных клеточных линиях XG-2 и XG-2PA мы варьировали температуру (0°С, 37°С), время преинкубации клеток со стимулирующей парой МКА B1+I2 или контрольной (не стимулирующей) парой МКА B1+I1 и IL-6 (1, 5, 15, 30, 60 мин). Эксперименты выполнены в трех независимых повторах. При 37°С наблюдается четкое влияние стимулирующих 62 МКА на эпитоп А1 (рисунок 3.1.6 A). Показано также, что при 37°С смещение пика А1 превышает смещение пиков С2 и М195 (рисунок 3.1.6 Б). Это означает, что эффект димеризации рецептора преобладает в данных условиях над эффектом его интернализации. Рисунок 3.1.6. - Влияние стимулирующей пары антител на определенные эпитопы молекул gp130 и IL-6Rα. A: снижение уровня эпитопа А1. Закрашенный пик – изотипический контроль, зеленая линия – изначальный уровень, розовая линия – количество доступных для А1 эпитопов после преинкубации с B1+I2; Б: соотношение уровней маркерных эпитопов при воздействии стимулирующей смеси МКА. Сплошная линия – изначальная экспрессия, пунктирная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с B1+I2. Время стимулирования антителами активации рецепторной системы в различной степени влияет на присутствие на мембране различающихся эпитопов молекул gp130 и IL-6Rα. Этот эффект обусловлен несколькими параллельными процессами: маскированием эпитопов вследствие димеризации, интернализацией активированных рецепторных комплексов внутрь клетки, ресинтезом новых молекул на мембране. Эпитоп А1 существенно маскируется через 1 мин, но через 5 минут пик, соответствующий этому эпитопу, вновь занимает исходное положение, возможно, в результате ресинтеза молекулы gp130; далее в течение 15-30 мин преинкубации количество детектируемого эпитопа несколько снижено. Эпитоп С2, не участвующий в димеризации, присутствует на мембране без изменений, а через 30 мин происходит его полное исчезновение. (рисунок 3.1.7 63 A). Описанные закономерности идентичны для обеих линий клеток XG-2 и XG2PA. Исключение составляет эпитоп, принадлежащий молекуле IL-6Rα и распознаваемый антителом М195 (рисунок 3.1.7 Б). На клетках XG-2 он не претерпевает изменений при стимуляции клеток антителами; на клетках XG-2PA он экспрессируется даже после 30 мин преинкубации. А 1 мин 5 мин 15 мин 30 мин Б Рисунок 3.1.7. - Отработка условий детекции димеризации рецептора IL-6. A: влияние времени преинкубации со стимулирующей парой МКА; Б: изменение уровня эпитопа М195 при воздействии стимулирующей смеси МКА. Закрашенный пик – изотипический контроль, сплошная зеленая линия – изначальная экспрессия, голубая пунктирная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с контрольной парой B1+I1, розовая пунктирная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с контрольной парой B1+I2. 64 Рассмотренный принцип цитофлуориметрического детектирования гомодимеризации gp130 в присутствии МКА B1+I2, а также гетеродимеризации c участием IL-6Rα в присутствии IL-6 иллюстрируют результаты экспериментов по выявлению четырех эпитопов: A1, C2, M195, M91. При гомодимеризации gp130 в присутствии МКА B1+I2 (1 мин, 37°С) маскируется в небольшой степени лишь A1 (рис 3.1.7 А), в то время как при димеризации gp130 c участием IL-6Rα в присутствии IL-6 происходит практически полное исчезновение эпитопов А1 (смещение пиков А1 отражает димеризацию gp130) и незначительное снижение экспрессии эпитопа М195, находящегося в сайте связывания IL-6 молекулой IL6Rα (рис. 3.1.8). При этом уровни экспрессии эпитопов С2 gp130 и М91 IL-6R, находящихся вне функциональных сайтов взаимодействия с IL-6 и димеризации gp130, не изменяются. Рисунок 3.1.8. - Изменение количеств маркерных эпитопов gp130 и IL-6Rα при инициирующем их димеризацию воздействии IL-6. Закрашенный пик – изотипический контроль, пунктир – изначальная экспрессия, точечная линия – количество доступных эпитопов после преинкубации с IL-6. 3.1.3. Регуляция экспрессии рецептора IL-6 его лигандом на клеточных линиях ММ Для обогащения мембраны клеток ММ мономерными молекулами рецептора gp130 мы перед экспериментом в течение суток проводили культивирование клеток в отсутствие ростовых факторов. При этом мы отметили воспроизводимые эффекты «апрегуляции рецептора» - существенного усиления экспрессии молекул gp130 и IL-6Rα при цитокиновой депривации и 65 «даунрегуляции рецептора» - существенного уменьшения экспрессии gp130 и IL6Rα в присутствии ростовых факторов. Клетки XG-2 культивировали в течение суток в отсутствии (рисунок 3.1.9 А) и в присутствии (рисунок 3.1.9 Б) IL-6, после чего инкубировали их с антиgp130 МКА (А1, В1, С2), и анти- IL-6Rα МКА (М91, М195), которые проявляли с помощью меченых флуоресцеином F(ab’)2-фрагментов козьих антимышиных антител (GamIg-FITC). При инкубации клеток с IL-6 отмечается уменьшение количеств всех эпитопов gp130 и IL-6Rα, то есть исчезновение молекул рецептора с мембраны, что связано, по-видимому, с эффектом интернализации рецепторного комплекса внутрь клетки. Рисунок 3.1.9. - Изменения экспрессии молекул gp130 и IL-6Rα в зависимости от присутствия экзогенного IL-6 в ростовой среде клеток XG-2. А. усиление экспрессии gp130 в отсутствие IL-6 в течение суток. Сплошная линия – изотипический контроль, пунктирная линия – изначальная экспрессия, точечная линия – наличие маркерных эпитопов через 24 ч. Количество всех эпитопов увеличилось; Б. ослабление экспрессии gp130 в присутствии IL-6 после цитокиновой депривации в течение 24 ч. Сплошная линия – изотипический контроль, точечная линия – изначальная экспрессия, пунктирная линия – наличие маркерных эпитопов через 24 ч. Количество всех эпитопов снизилось. 66 3.1.4. Определение абсолютных количеств молекул рецептора IL-6 на мембране клеток миеломных линий Отсутствие количественных характеристик в отношении уровня экспрессии антигена на мембране цитофлуориметрических индивидуальной клетки в большинстве исследований, оперирование понятиями «слабая», «средняя», «сильная» экспрессия определяемых маркеров, то есть качественный характер исследования - применим в клинических приложениях и затрудняет интерпретацию экспериментальных результатов. Более того, на интенсивность цитофлуориметрического сигнала влияет ряд факторов, таких как настройки фотоумножителя прибора, условия эксперимента, тип флуорофора. Нивелировать их влияние позволяет метод определения абсолютных значений количеств молекул (эпитопов). Для этого мы использовали набор стандартизированных реагентов QIFIKIT. Основу метода представляет принцип линейной взаимозависимости в полулогарифмических координатах характеристик количества связываемых антител и уровня их флуоресценции [Poncelet et al., 1985]. Соотнесение уровня флуоресцентного сигнала с калибровочной кривой позволяет однозначно определить количество флуоресцирующих молекул. Калибровочная кривая строится на основе экспериментальных данных, полученных при идентичных настройках проточного цитофлуориметра с использованием набора микросфер диаметром 10 мкм, имитирующих живые клетки. Микросферы содержат на своей поверхности строго определенное количество молекул флуорофора. Обычно для построения калибровочной кривой используют 5 - 8 концентраций флуорофора. При условии полного насыщения потенциальных сайтов связывания на мембране клеток в присутствии избытка соответствующего МКА происходит одновалентное связывание антиген/флуоресцентно-меченое МКА, что дает возможность оценивать результаты эксперимента по калибровочной кривой. С использованием описанного метода мы оценили экспрессию молекул IL6Rα и gp130 рецептора IL-6 на трех иммортализованных миеломных клеточных линиях: интерлейкин-6-зависимых линиях XG-1 и XG-2, а также культивируемой 67 в отсутствие IL-6 линии RPMI8226. С помощью количественной оценки экспрессии рецептора мы выявили различия между количествами эпитопов, оставшихся свободными для связывания МКА после воздействия IL-6 на клетки (присутствия либо отсутствия в ростовой среде). В таблице 3.1.2 приведены результаты количественного измерения экспрессии рецептора IL-6 и ее динамика при длительной интерлейкиновой депривации. Для анализа использовали МКА к эпитопам gp130 А1, B1, C2 и IL6Rα – М91 и М195, отрицательный контроль – мышиный иммуноглобулин IgG1. Связавшиеся антитела проявляли с помощью F(ab')2-FITC. Фоновые значения количества эпитопов, соответствующие изотипическим контролям, вычитались из общего количества определяемых эпитопов. Миеломные клеточные линии существенно различаются по экспрессии рецептора IL-6. Количества молекул IL-6Rα и gp130 на мембране коррелируют; в нескольких экспериментах мы наблюдали тенденцию к слабому преобладанию IL-6Rα. Уровень экспрессии этих цепей для интерлейкин-зависимых линий XG-1 и XG-2 существенно ниже, чем для IL-6–независимой RPMI8226. Т а б л и ц а 3.1.2 - Экспрессия (количество молекул) gp130 и IL-6Rα на миеломных клеточных линиях при обычных условиях культивирования и при различных сроках депривации IL-6 Рецептор gp130 IL-6Rα Клеточная Стандартное Дни депривации IL-6 культивирование линия 1 2 3 XG-1 0 3500 - 4500 4500-6000 6000-7000 XG-2 1500-2000 7000-10000 6000-7500 4000-6000 RPMI8226* 15000-25000 25000-30000 10000-12500 8000-10000 XG-1 0 3500 700 1500 XG-2 4500 18000 7500 2500 RPMI8226* 23000 25000-30000 10500 8000-10000 * Примечание: RPMI8226 не является IL-6-зависимой линией и может служить контролем. Клетки, отмытые от цитокина в течение 1 суток, интенсивно экспрессируют рецептор, после чего эффект депривации несколько снижается. Усиление 68 экспрессии выражали в процентах от уровня экспрессии, регистрируемой при стандартном культивировании клеток, и рассчитывали его по формуле: Xусил = 100*(Nнач/Nдепривац - 1), где Nнач и Nдепривац – количества молекул рецептора до и после 24 ч культивирования клеток в отсутствие цитокина, соответственно. Наиболее интенсивный ответ демонстрируют клетки XG-2 (экспрессия обеих цепей рецептора увеличилась на 300-500%), клетки XG-1 увеличили экспрессию рецептора на 60-70% (по отношению к уровню экспрессии после 1 суток депривации IL-6). Клетки RPMI8226 в наименьшей степени реагируют на отсутствие IL-6. Интересно, что краткая (в течение одних суток) депривация IL-6 клеток XG-1 инициирует экспрессию значимых количеств рецептора при изначально не детектируемых его количествах на мембране. Влияние IL-6 на отмытые от цитокина клетки также изучено на трех клеточных линиях и в зависимости от времени интерлейкиновой депривации. Рекомбинантный IL-6 добавляли к клеткам в конечной концентрации 10 мкг/мл. Диаграммы (рисунок 3.1.10) иллюстрируют существенное изменение количества некоторых эпитопов после добавления к клеткам IL-6. Степень уменьшения количества эпитопов в присутствии IL-6 выражали в процентах ингибирования экспрессии рецептора IL-6, вычисленных по формуле Хингиб (%) = 100*(1-(NIL-6/NДЕПРИВАЦ), где NIL-6 и NДЕПРИВАЦ – количества молекул цепей рецептора после добавления IL-6 и при цитокиновой депривации клеток соответственно. Результаты вычисления представлены в таблице 3.1.3. Эффект влияния IL-6 различен при 1 и 3 днях цитокиновой депривации, причем на клетках с высоким уровнем экспрессии рецептора (XG-2, RPMI8226) он выражен гораздо сильнее (маскирование отдельных эпитопов более 90%). В целом отмечается более резкое снижение количества эпитопов IL-6Rα. Таким образом, IL-6 подавляет экспрессию как на IL-6-зависимых, так и на IL-6независимых миеломных клетках человека. 69 XG-2 XG-1 7000 1200 6000 1000 5000 800 N N 4000 600 3000 400 2000 200 1000 0 0 A1 A2 A3 I1 - IL-6 B1 B2 G2 A1 A2 A3 - IL-6 + IL-6 I1 B1 B2 G2 + IL-6 RPMI 8226 25000 20000 N 15000 10000 5000 0 A1 A2 I1 - IL-6 B1 B2 G2 + IL-6 Рисунок 3.1.10. - Количества эпитопов молекул gp130 и IL-6Rα, определяемые на миеломных клеточных линиях XG-2, XG-1, RPMI8226 до (сиреневые столбики) и после (красные столбики) инкубации клеток с IL-6. Т а б л и ц а 3.1.3 - Влияние IL-6 на экспрессию gp130 и IL-6Rα клетками миеломных линий после цитокиновой депривации (в % ингибирования экспрессии) Линия клеток XG-1 XG-2 RPMI8226 МКА (эпитоп) 1 день депривации IL-6 3 дня депривации IL-6 A1 B1 C2 M195 A1 B1 C2 M195 A1 B1 C2 M195 -1.2 20.8 -59.5 88.9 81.9 88.8 46.6 98.8 56.5 95.5 79.6 82.4 36.6 52.8 1.6 76.3 69.7 78.8 1.2 91.7 -113.5 77.5 -4.4 53.8 70 Воздействие биотинилированного IL-6 на клетки изучали в аналогичном эксперименте с помощью PE-флуорофора (данные не приводятся). Общие тенденции воздействия IL-6 сохранялись, при этом на клетках линий XG-1 и RPMI8226 эффект снижения экспрессии рецептора проявился слабее, а на клетках XG-2 для некоторых эпитопов обнаруживались существенные различия с влиянием небиотинилированного IL-6 (возможно, сказывалось влияние конъюгирования с биотином). Непосредственное связывание IL-6 и IL-6-биотин с мембраной клеток миеломы мы показали в следующем эксперименте. Клетки RPMI8226 инкубировали c биотинилированным IL-6, который выявляли с помощью стрептавидин-PE. С использованием четырех концентраций цитокина построили кривую насыщения мембраны клеток IL-6 (рисунок 3.1.11). Добавление высокой (10 мкг/мл) рабочей концентрации не биотинилированного IL-6 к каждому образцу приводило к вытеснению им меченого аналога и снижало флуоресцентный сигнал фикоэритрина. Следует отметить, что полученные значения количества связанных с мембраной клеток RPMI8226 молекул IL-6 (10000-80000 молекул) намного превышают найденные с количество связанных молекул помощью МКА величины. 80000 IL-6-биотин в отсутствие IL-6 60000 IL-6-биотин в присутствии 10мкг/мл IL-6 40000 20000 0 0 2 4 6 8 10 [IL-6-биотин], нг Рисунок 3.1.11. - Кривая насыщения мембраны клеток RPMI8226 IL-6-биотин и конкурентное вытеснение его не меченым IL-6. Химическая модификация (конъюгирование) цитокина, либо мутации (полученные методом сайт-направленного мутаганеза) могут проявляться не 71 только как изменения активности белка, но и влиять на специфику его связывания с рецептором. Нам интересно было оценить влияние биотинилирования IL-6 на связывание с фунционально активным эпитопом рецептора А1. Ранее мы показали (разделы 3.1.1 и 3.1.4), что биотинилированный IL-6 связывается с мембраной клеток RPMI8226 и конкурирует с немеченым цитокином. Рисунок 3.1.12 демонстрирует маскирование эпитопа А1, выраженное в процентах А1позитивных клеток под действием IL-6 (4,6% А1+) и IL-6-биотин (3,9% А1+) в равной степени. Рисунок 3.1.12. - Оценка количеств A1-позитивных клеток RPMI8226 в присутствии рекомбинантного IL-6 и его конъюгата с биотином: А. Фоновая флуоресценция FITC; Б: Флуоресценция клеток при окрашивании МКА А1; В, Г: Полное исчезновение эпитопа А1 в присутствии IL-6 и IL-6-биотин, соответственно. 3.1.5. Изменение активационных состояний IL-6Rα и gp130 под действием IL-6 (функциональный эпитопный анализ) В экспериментах по количественному определению и димеризации молекул рецептора IL-6 мы выявили неодинаковый характер изменений детектируемости эпитопов А1, В1, С2 - gp130 и М195, М91 - IL-6Rα, соответствующих различным пространственным и функциональным сайтам рецептора IL-6. Для дальнейшего цитофлуориметрического исследования рецептора IL-6 на клетках миеломы и описания функций его эпитопов мы также воспользовались возможностями, предоставляемыми методологией распознавания функционально различных эпитопов. 72 Экспрессия IL-6Rα и gp130 на клеточных линиях XG-1, XG-2, RPMI8226, выявляемая данными антителами в условиях депривации IL-6, позволила наблюдать процесс снижения количества рецептора его цитокином в динамике 13 суток (рисунок 3.1.13) и обнаружить отличия между смещениями пиков A1, B1, M195 и смещением пика C2 при воздействии цитокина на клетки после 3 суток депривации (рисунок 3.1.14). Инкубацию клеток с IL-6 в этой серии экспериментов проводили при 0°С и в присутствии 0,02% азида натрия с целью исключить побочные физиологические клеточные эффекты (пиноцитоз и интернализацию молекул рецептора). XG-1 XG-2 73 RPMI8226 Рисунок 3.1.13. - Уровень экспрессии эпитопов МКА A1, B1, C2, M195 на клетках линий XG-1, XG-2 и RPMI8226. Динамика изменения экспрессии в течение трех суток бесцитокинового культивирования клеток. Сплошная линия – изотипический контроль, пунктирная линия – экспрессия антигена. Рисунок 3.1.14. - Влияние IL-6 на иммунофенотип клеток миеломы после трех суток бесцитокинового культивирования клеток. Сплошная линия – уровень флуоресценции, добавления IL-6, соответствующий пунктирная линия - количеству уровень эпитопа до флуоресценции, соответствующий количеству эпитопа после добавления IL-6. 74 Как видно из рисунка 3.1.13, после 3 суток культивирования в отсутствие цитокина на мембране всех трех типов миеломных клеток экспрессируется достаточное для цитофлуориметрического анализа количество молекул рецептора, его α- и β-цепей, причем гистограммы отображают одинаковое количество всех четырех эпитопов. Функциональные различия эпитопов проявляются в присутствии цитокина: A1, B1, M195 исчезают, в то время как эпитоп С2 не маскируется (рисунок 3.1.14). В группе эпитопов, не претерпевающих изменений при активации рецептора интерлейкином-6, также оказались эпитопы групп С (С3, С7), D (D1, D3), E (E1, E2) - для gp130 и эпитопы M5, M91 - для IL-6Rα. В серии экспериментов на трех различных миеломных клеточных линиях, имеющих как IL-6-зависимый (XG-1, XG-2), так и IL-6-независимый (RPMI8226) характер роста и существенно различающихся по количественным характеристикам экспрессируемого рецептора (XG-1<<XG-2<<RPMI8226), мы также наблюдали воспроизводимые изменения эпитопного иммунофенотипа, иллюстрируемые рисунком 3.1.15. Рисунок 3.1.15. - Влияние IL-6 (100 нг/мл, 30 мин, 0°С, 0,02% NaN3) на 75 эпитопный иммунофенотип клеток XG-1, XG-2 и RPMI8226 в условиях экспрессии на их мембране рецептора IL-6 (24 часа бесцитокинового культивирования клеток). Сплошная красная линия – изотипический контроль, пунктирная красная линия - количество эпитопа до добавления IL6, пунктирная зеленая линия - количество эпитопа после добавления IL-6. Наконец, полученные результаты были подтверждены в экспериментах с более высокой температурой инкубации клеток с IL-6 (37°С): в данном случае наблюдались эффекты как изменения иммунофенотипа, так и изменения количества молекул рецептора. На рисунке 3.1.16 четко видно смещение пиков всех эпитопов, включая С2, однако в значительно большей степени маскируются эпитопы А1, B1 и M195. Рисунок 3.1.16. - Изменение эпитопного иммунофенотипа клеток RPMI8226 при инкубации IL-6 в условиях возможной интернализации рецептора (37°С). Сплошная линия – изотипический контроль, пунктирная линия - количество эпитопа до добавления IL-6, точечная линия - количество эпитопа после добавления IL-6. Для подтверждения функциональной роли исследуемых эпитопов gp130 в процессе связывания цитокина мы использовали «супер-антагонист интерлейкина-6» - SANT5 – рекомбинантный аналог IL-6, способный связываться с gp130, но препятствующий последующей димеризации рецептора [Sporeno et al., 1996]. На клетках линий XG-1 и XG-2 в присутствии SANT5 мы отметили одинаковое уменьшение количества ряда эпитопов группы B; при этом мутантный аналог цитокина, в отличие от белка дикого типа, не затрагивает эпитопы групп A и I (таблица 3.1.4). 76 Т а б л и ц а 3.1.4 - Влияние IL-6 и его антагониста SANT5 на эпитопный иммунофенотип gp130 Эпитоп A1 A2 A3 I1 XG-1 ↓ ↓ ↓ XG-2 ↓ ↓ XG-1 • XG-2 • B1 B2 C1 C3 C7 D1 D3 E1 E2 F4 G2 G4 ↓ ↓ ↓ • • • • • • • • • • ↓ ↓ ↓ ↓ • • • • • • • • ↑ • • • • ↓ ↓ • • • • • • • • • • • • • ↓ ↓ • • • • • • • • • • Клеточные линии IL-6 SANT5 ↓ - уменьшение количества эпитопов более чем на 50%; ↑ - увеличение количества эпитопов более чем на 50%; • - отсутствие изменений количеств детектируемых эпитопов. Таким образом, проведенные эксперименты показывают сходство эффектов, вызываемых интерлейкином-6 при высоком уровне экспресии его рецептора на мембране клеток всех трех миеломных линий – XG-1, XG-2, RPMI8226. Различия влияния IL-6 на эпитопы молекул его рецептора групп А, В и С свидетельствует о различном характере участия соответствующих структурных фрагментов в передаче цитокинового сигнала. 3.1.6. Особенности иммунофенотипов клеточных линий ММ с различными профилями экспрессии рецептора IL-6 Мы провели серию экспериментов по иммунофенотипированию IL-6независимых клеточных линий ММ с целью выявить тенденции изменения экспрессии IL-6Rα (CD126) в совокупности с основными диагностическими маркерами ММ на разных этапах культивирования клеток. В таблице 3.1.5 приведены средние показатели по результатам 3-5 независимых экспериментов для каждой клеточной линии. Клетки ММ в процессе длительного культивирования и пересевания меняют свои свойства, несмотря на их иммортализованную природу. В лабораторной практике четкого критерия вырождения клеточных культур нет, 77 однако мы отмечали существенное снижение экспрессии IL-6Rα после 2-3 месяцев непрерывного культивирования клеток (свыше 50-го пассажа). Изучение иммунофенотипа клеток, особенно с описанием популяций CD138-, проясняет особенности подобных изменений в опухолевых клетках. Т а б л и ц а 3.1.5 - Экспрессия IL-6Rα и иммунофенотипы клеточных линий множественной миеломы Кл. линия, %СD138- Гейт RPMI8226 0-4%CD138RPMI8226 (длительное %CD45+ %CD19+ %CD56+ %CD126+ CD38+/CD138+ 4 4 43 82 CD38+/CD138+ 7 4 21 80 CD38+/CD138- 52 н.о. 51 42 IM9 82%CD138- CD138+ 96 86 1,2 0,85 IM9 (длительное CD138+ 88 85 37 44 CD138- 93 95 0,1 1,5 CD38+/CD138+ CD38+/CD138CD38+/CD138+ 8 8 17 6 2 8 4,5 2 7 75 78 95 CD38+/CD138- 18 2,5 2 58 культивирование) 68%CD138 - культивирование) 81%CD138RPMI1640 63%CD138RPMI1640 (длительное культивирование) 48%CD138 - Аберрантные маркеры всех трех клеточных линий не зависят от наличия CD138, за исключением CD45, который имеет тенденцию к более сильной экспрессии на клетках CD138-. На всех трех культурах клеток CD138- популяция обладает существенно более низкой экспрессией IL-6Rα; при этом уровень экспрессии CD126 на CD138-позитивных клетках остается высоким. Важно также отметить, что для клеточной культуры IM9, представленной, строго говоря, не классическим, а лимфобластным вариантом ММ, и не экспрессирующей ни плазмоклеточный маркер CD38, ни IL-6Rα, характерен связанный с культуральным «старением» артефакт появления популяции CD38+/CD126+ клеток. Таким образом, в некоторых случаях плазмоклеточных неоплазий опухолевые клетки могут как утрачивать, так и возобновлять экспрессию СD38, СD138, CD126. 78 3.2. Экспрессия рецептора IL-6 у больных множественной миеломой 3.2.1. Уровень и характер экспрессии IL-6Rα на мембране опухолевых клеток Экспрессия α-цепи рецептора интерлейкина-6 на мембране плазматических клеток костного мозга больных ММ была охарактеризована цитофлуориметрически на клиническом материале аспиратов костного мозга 27 больных при наличии значительного количества опухолевого субстрата – плазматических клеток в костном мозге. Основываясь на литературных данных, относящихся к клеточным линиям множественной миеломы, а также на данных клинических исследований, проведенных ранее и рассмотренных в главе «Обзор литературы», мы предполагали показать экспрессию IL-6Rα в широком диапазоне интенсивности, в том числе яркую при прогрессии заболевания. Для достижения наилучших показателей чувствительности мы использовали конъюгированное с РЕ анти-IL-6Rα (CD126) МКА, имеющее преимущество перед аналогичным FITCмечеными МКА. Обнаруженный нами уровень экспрессии IL-6Rα на плазматических клетках, гейтированных в координатах SSCLow/CD38++, был преимущественно очень низким, за исключением нескольких случаев (табл. 3.2.1). Тем не менее, тщательный анализ цитофлуориметрических данных в большинстве наблюдений демонстрировал четкое положительное различие между экспрессией CD126 и контрольным отрицательным маркером CD3. Методология численного представления данных при слабой экспрессии белков отлична от рассмотрения ярко экспрессируемых молекул, поскольку классические параметры доли позитивных клеток и категории high/dim/low в данном случае не применимы [Rawstron et al., 2000]. Наиболее пригодны два метода описания низких значений экспрессии рецептора: анализ соотношения (MFR, mean fluorescence ratio) средних значений интенсивности флуоресценции MFI (mean fluorescence intensity) рецептора и контрольного маркера MFR = MFICD126/MFICD3 [Jego et al., 2001, Perez-Andres et al., 2009] и непараметрический анализ гистограмм распределения 79 интенсивности флуоресценции рецептора и контроля по Колмогорову-Смирнову [Young, Графическая 1977]. иллюстрация теста Колмогорова-Смирнова представлена на рисунке 3.2.1. В этом методе логическим основанием перехода от непараметрического коэффициента D (K-S) к уровню экспрессии является доказанная строгая корреляция экспрессии молекул на мембране клетки со степенью различия форм исследуемого и контрольного распределений [Shinjo et al., 1997]; при этом значение D (K-S) может варьировать от 0 (отсутствие различий между экспериментальным и контрольным распределением, полное отсутствие экспрессии) до 1 (ярко выраженное наличие экспрессии). А Б Рисунок 3.2.1. - Описание уровня слабой экспрессии CD126 с помощью теста Колмогорова-Смирнова с использованием цитофлуориметрических данных: А. Исходные множества данных, находящиеся в области низкой флуоресценции; Б. Статистически обработанные данные охарактеризованы коэффициентом D (K-S), отражающим различия формы и сдвига между распределениями. В некоторых работах [Kovacs, 2006] используют также характеристику смещения среднего геометрического исследуемого распределения от контроля 80 (∆Gmean). Таким образом, мы представили все значения экспрессии IL-6Rα (CD126) в виде характеристик а) классической доли рецептор-позитивных клеток %CD126+, б) соотношения средних значений интенсивности сигнала и шума (контроля) MFR(I) = Gmean (CD126+)/ Gmean (CD3), и в) коэффициента Колмогорова-Смирнова D (K-S), рассчитанного в программе CellQuest с использованием непосредственно исходной базы цитофлуориметрических данных. Т а б л и ц а 3.2.1 - Экспрессия IL-6Rα на опухолевых клетках больных ММ %СD126+ Пациент Знач. Асх. Тре. Бел. Вер. Лер. Рад. Гор. При. Зол. Бур. Ерш. Бад. Кар. Над. Кон. Зар. Шаш. Ива. Гри. Мам. Арш. Люб. Фра. Пло. Кап. Скл. Кул. 5,30 0,70 0 15,80 28,50 3,90 5,30 22,20 12,40 3,20 5,30 0,25 1,30 6,10 33,90 67,00 21,10 0,40 2,10 20,70 1,50 20,20 15,30 5,35 0,50 6,90 1,50 Налич. экспр D (K-S) Знач. Налич. экспр + + + + + + + 0,63 0,38 0,67 0,27 0,13 0,47 0,28 0,17 0,33 0,04 0,25 0,33 0,6 0,78 0,46 0,1 0,1 0,42 0,13 0,54 0,29 0,19 + + + + + + + + + + + + + 0,275 + + + + + + + + + + + + + Статистические характеристики Диапазон 0-67% экспрессии 5,3% Медиана + 74% Доля CD126 + + + + + + MFR(I) Знач. Налич. экспр 1,45 0,85 1,12 1,50 2,16 1,45 1,17 1,61 1,55 1,19 1,00 1,05 1,21 0,98 2,20 4,08 1,80 1,11 1,10 1,44 1,15 1,77 1,34 1,27 0,62 1,20 0,77 MFR(II) Знач. Доля(%) CD126++ 8,59 13,58 15,8% 1,2% 4,97 7,66 3,6% 1,2% 1,43 0,4% 4,00 4,31 0,5% 7,5% 4,24 4,72 4,67 4,4% 2,7% 3,0% 7,90 1,1% 9,30 1,3% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0,04-0,78 0,62-4,08 0,29 76% 1,21 81% 1,430,413,58 15,8% 4,85 2,0% 44% (СD126++) 81 В рамках получения клинических данных мы оценили основные метрологические характеристики метода с использованием рабочего анти-IL-6Rα МКА: точность, правильность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) с использованием двух дополнительных анти-IL-6Rα-PE (разные лоты другого производителя), анти-IL-6Rα M-91-биотин, а также различных титров рабочего МКА - в начале и в середине сбора клинических данных. Проведенные методологической эксперименты адекватности детекции позволили нам убедиться уровня экспрессии CD126 в на плазмоцитах. Анализ показал, что отклонение в повторах не превышало 2%; уровень экспрессии, измеренный с МКА двух фирм-производителей не различался более чем на 10%; использование двойного окрашивания для детекции CD126 выявило сходимость как значений уровня, так и характера экспрессии наблюдаемого маркера. Исходя из представленных в таблице 3.2.1 значений для каждой из описанных выше характеристик экспрессии CD126, мы ввели категории наличия либо отсутствия экспрессии рецептора на мембране клеток. В случае процентного выражения уровня антиген-позитивных клеток условием наличия экспрессии явилась положительная разность между средними геометрическими значениями уровней флуоресценции CD126 и контроля (CD3), т.е. разница сигнал-шум. Аналогично, с помощью соотношения сигнал/шум описано наличие экспрессии для категории MFR(I). Разграничение же наличия и отсутствия экспрессии, описанной в статистических значениях D (K-S), потребовало определенной математической обработки данных индивидуально по каждому пациенту. Методика подобной оценки предложена [Young, 1977] и критически обсуждена в ряде работ [Lampariello, 2000; Watson, 2001] и состоит в проверке нулевой гипотезы теста при сравнении расчетного коэффициента D (K-S) со значением D = 1,953· крит. n1 + n 2 , где коэффициент 1,953 задан достоверностью p<0,001, а n1·n 2 n1 и n2 – количества событий (клеток), составивших сравниваемые распределения CD126 и CD3 соответственно. Поскольку применение коэффициента 82 Колмогорова-Смирнова обнаруживает очень высокую чувствительность метода [Parikh et al., 1999], приводящую в ряде случаев к ложноположительным результатам анализа, мы выбрали жесткие ограничения по достоверности. Нижняя часть таблицы 3.2.1 показывает обобщенные характеристики экспрессии CD126, которые демонстрируют сходимость результатов анализа уровня экспрессии с помощью параметров %CD126+, MFR(I), D (K-S): 70-80% пациентов характеризуются наличием CD126 на мембране опухолевых клеток, при этом количество рецептор-положительных клеток мало (около 5%), так же как мала и яркость наблюдаемой экспрессии (медиана соотношения сигнал/шум = 1,21). Доля случаев, при которых %CD126+ > 10%, составила 37% от общего числа пациентов и 50% от случаев с наличием CD126 на мембране. Характер наблюдаемой слабой экспрессии CD126 в большинстве случаев был мономорфным (рисунок 3.2.2 А), то есть все клетки составляли одну популяцию с уровнем экспрессии в зоне границы сигнал-шум. Однако в ряде случаев (у 44% пациентов) нами отмечено также наличие небольших популяций клеток, ярко экспрессирующих CD126 (рисунок 3.2.2. Б). Такие популяции мы охарактеризовали с помощью отдельного параметра: MFR(II) = Gmean(CD126++)/Gmean(CD3), значения которого также представлены в таблице 3.2.1. А Б Рисунок 3.2.2. - Характер экспрессии CD126 на опухолевых клетках больных ММ: А. Мономорфная слабая экспрессия CD126 (пациент Зар.); Б. Наличие отдельных популяций клеток CD126+ и CD126++ (пациент Гри.). 83 Медиана уровня яркой экспрессии CD126 (в случае ее наличия) составила 4,85, то есть данная популяция клеток экспрессирует CD126 сильнее основной популяции не более, чем на одну единицу в логарифмической шкале. Медиана доли CD126++ клеток составила 2% от общего числа флуоресцентно окрашенных плазмоцитов. Этот показатель, как мы видим, не ниже экспериментальной погрешности, кроме того, для избежания ошибочного включения неспецифического сигнала в расчеты в каждом случае данная популяция клеток была внимательно изучена в сравнении с популяцией, детектируемой маркером отрицательного контроля (CD3). Поскольку, согласно данным литературы [Rawstron et al, 2000], CD126 может быть по-разному экспрессирован на клетках одного образца, мы сочли важным учет и изучение популяций опухолевых плазмоцитов с высоким уровнем экспрессии рецептора интерлейкина-6. 3.2.2. Взаимосвязь экспрессии рецептора IL-6 с клинико-иммунологическими характеристиками опухолевых клеток Описанные в предыдущем разделе характер и уровень экспрессии рецептора IL-6Rα могут являться факторами прогрессии при опухолевом процессе и влиять на клиническую картину заболевания, поэтому на следующем этапе нашего исследования мы провели анализ взаимосвязей между экспрессией CD126 и клинико-иммунологическими параметрами ММ. В число таких параметров вошли характеристики пула плазматических клеток: их содержание в костном мозге (в процентном выражении), наличие и доля морфологически незрелых форм опухолевых клеток – проплазмоцитов, характеристики аберрантного иммунофенотипа (экспрессия диагностических маркеров ММ CD138, CD45, CD19, CD56, а также наличие у большей части опухолевого пула злокачественного иммунофенотипа CD45-/CD19-/CD56+), наличие инфицированности вирусом герпеса 8-го типа HHV-8, возраст пациентов. Наиболее полную характеристиками картину мы взаимосвязей составили с экспрессии помощью CD126 параллельного с этими анализа экспериментальных данных экспрессии CD126, полученных тремя расчетными 84 методами, а также данных, описанных в категориях наличия/отсутствия экспрессии CD126 и наличия ее относительно высокого (>10%), либо низкого (<10%) уровня. Числовые параметры опухолевых клеток мы рассмотрели с помощью корреляционного анализа по Пирсону. Уровень сопряженности рассматриваемых характеристик в категориальном выражении (наличие/отсутствие свойства) мы оценили с помощью построения таблиц сопряженности хи-квадрат. Для выявления воздействия анализируемого свойства на категориальные показатели мы применили тест Манна-Уитни для всех рассматриваемых характеристик. Это помогло дополнить логическую картину, построенную на основе данных хи-квадрат. 3.2.2.1. Экспрессия IL-6Rα в субпопуляциях плазмоцитов CD138+ и CD138Работа с клиническими данными, полученными методом многоцветной проточной цитофлуориметрии, опирается в первую очередь на четкие методологические процедуры выделения пула данных исследуемых клеток из множества данных всех клеток костного мозга. Это достигается путем логического задания гейтирования. стандартных Использованная маркерных нами характеристик методика гейтирования клеток – материала множественной миеломы подробно описана в разделе 2.3.3.5 в главе «Материалы и методы». Одним из стандартных шагов данной методики является обнаружение плазматических клеток путем выявления яркой экспрессии специфичных маркеров CD38 и CD138. Параллельное использование этих двух характеристических молекул существенно увеличивает чистоту анализируемой группы клеток. Однако многочисленные данные литературы описывают опухолевую популяцию клеток при ММ как неоднородную, в которой обычно преобладают CD138-позитивные клетки, но обнаруживаются также четкие группы плазматических клеток, не несущих этот маркер [Van Vangelborgh et al., 2012; Hosen et al., 2013]. Роль CD138 может затрагивать ключевые механизмы выживания и гомеостаза опухолевых клеток, что на настоящий момент не до 85 конца изучено. Описание опухолевых клеток только в рамках CD138положительной популяции делает невозможным рассмотрение части механизмов регуляции опухолевого процесса, связанных с потерей этого маркера. Поэтому одной из важных задач нашего исследования стало дифференцированное описание и сравнение экспрессии CD126 и свойств опухолевых клеток в трех различных гейтах: CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138-. Основные клинические характеристики плазматических клеток больных, включенных в исследование, суммированы в таблице 3.2.2. Эти характеристики относятся ко всем опухолевым клеткам, без разделения их на иммунологические типы. Т а б л и ц а 3.2.2 - Характеристики опухолевых клеток больных ММ Пациент %PC %proPC %CD138Асх. Тре. Бел. Вер. Лер. Рад. Гор. При. Зол. Бур. Ерш. Бад. Кар. Над. Кон. Зар. Шаш. Ива. Гри. Мам. Арш. Люб. Фра. Пло. Кап. Скл. Кул. 11 15,2 0,6 14,6 31,4 23 3,2 32,2 47,4 0,6 48,2 5,2 33,2 13 49 29,8 12 10,4 19,4 8,4 17,6 8,6 19,8 23,8 6,8 35 6 Статистические характеристики Диапазон 0,6 - 49% Медиана 15,2% 0 5,6 0 1,8 3,8 2,4 0 4,6 17,4 0 19,8 0 1,2 5 27,4 17,2 5,2 0 2,6 0 8,2 0 7,4 1,8 1,8 6 0 50,20 0,00 74,20 0,00 3,20 1,90 3,10 54,30 2,20 28,00 0,00 2,50 1,80 2,60 1,80 0,75 24,10 8,80 10,10 72,00 4,10 2,00 0,00 6,90 44,00 0,90 60,40 0 - 27,4% 2,4% 0 - 74,2% 3,1% 86 Как видно из таблицы, выборка характеризуется средним уровнем плазмоцитоза, наличием в препаратах значимой доли морфологически незрелых форм клеток плазмоцитарного ряда - проплазмоцитов (proPC) и наличием в 23 случаях из 27 (85% наблюдений) клеток, не экспрессирующих CD138, с широким диапазоном доли этой популяции (от 0 до 74% всего опухолевого клона). Взаимосвязь между описанными параметрами плазматических клеток для всей выборки была нами изучена с помощью корреляционного анализа и непараметрических методов и изложена в следующем разделе. В таблице 3.2.3 представлены иммунологические характеристики опухолевых клеток, дифференцированно полученные для гейтов CD38+/CD138+, CD38+/CD138-: данные по экспрессии CD126, полученные с помощью трех расчетных методов, а также экспрессия аберрантных маркеров ММ CD45, CD19, CD56. Наиболее заметное визуальное различие между гейтами СD138+ и СD138заключается в яркой экспрессии CD126, которая наблюдается только в гейте СD138+, в то время как характер экспрессии аберрантных маркеров и иммунофенотип опухолевых клеток в обоих гейтах в большинстве случаев совпадает. Кроме того, сравнение уровней экспрессии рецептора IL-6 между клетками CD138+ и СD138- в тесте Манна-Уитни показало статистически достоверное различие %CD126 (р=0,003; медиана + %CD126 (СD138+)=6,1; медиана %CD126+(СD138-)=0), что характеризует экспрессию CD126 на клетках CD138+ как достоверно более высокую по сравнению с экспрессией рецептора на клетках СD138-. Диагностические маркеры ММ в аналогичном тесте различий между гейтами не проявляют (%CD45+: p=0,11; %CD19+: p=0,16; %CD56+: p=0,12). На основе представленных в таблице 3.2.3. цитофлуориметрических данных был проведен статистический анализ взаимосвязей между экспрессией CD126 и параметрами опухолевых плазматических клеток, результаты которого изложены в разделах 3.2.2.2 – 3.2.2.4. 87 88 3.2.2.2. Корреляционный анализ клинических характеристик ММ и уровня экспрессии IL-6Rα Мы изучили численные соотношения клинико-иммунологических характеристик костного мозга 25 больных ММ с помощью оценки линейной корреляции Пирсона CD38+/CD138+, для опухолевых CD38+/CD138- с плазмоцитов последующим в CD38+, гейтах сравнением полученных коэффициентов с критическими показателями, соответствующими p<0,001 (высокая достоверность) и p<0,05 (статистически значимая достоверность) [Fisher et Frank, 1995]. Результаты представлены в таблице 3.2.4. Красным цветом отмечены высоко достоверные линейные зависимости, зеленым – статистически достоверные. Т а б л и ц а 3.2.4 - Корреляционные таблицы зависимости экспрессии рецептора IL-6 и клинических характеристик костного мозга больных множественной миеломой CD38+/CD138+ CD38+ % CD126 %CD126 1,0 D(K-S) 0,86 MFR(I) 0,95 MFR(II) 0,2 0,3 %PC %proPC 0,49 %CD45+ -0,3 %CD19+ 0,0 %CD56+ 0,0 %CD138- -0,1 D MFR (I) 1,0 0,8 1,0 0,4 0,4 0,4 0,3 0,41 0,48 -0,3 -0,3 0,1 -0,2 0,1 -0,1 0,1 -0,2 MFR (II) % CD126 1,0 -0,4 -0,5 -0,1 -0,1 0,3 0,0 D MFR (I) 1,0 0,81 1,0 0,96 0,77 1,0 0,59 0,6 0,67 0,3 0,2 0,3 0,5 0,4 0,46 -0,3 -0,1 -0,2 -0,1 0,0 -0,2 0,0 0,0 -0,2 -0,1 0,2 -0,2 CD38+/CD138MFR (II) % CD126 MFR (I) MFR (II) 1,0 0,57 1,0 0,56 0,83 1,0 1,0 -0,2 0,15 0,01 0,4 0,0 0,3 0,56 0,5 0,1 0,6 0,84 -0,5 0,3 0,0 0,4 0,0 0,39 -0,1 0,0 0,4 0,1 0,2 -0,1 0,0 0,3 0,0 -0,1 1,0 0,63 0,08 0,15 0,11 0,34 0,05 D Важным методологическим результатом является сходимость (наличие статистически достоверной характеристиками экспрессии взаимосвязи) CD126, между полученными всеми числовыми тремя различными расчетными методами. Такая сходимость наблюдается для всех трех гейтов, несмотря на различия абсолютных количеств клеток в них. Благодаря этому результату мы можем говорить о применимости данного аналитического подхода к описанию взаимосвязей экспрессии рецептора интерлейкина-6 с другими 89 параметрами опухолевых клеток. Общая картина корреляций для гейтов CD38+ и CD38+/CD138+ одинакова: наблюдается положительная корреляция экспрессии CD126 и количества проплазмоцитов в костном мозге, а также уровней слабой и яркой экспрессии CD126 (в случае наличия клеток с CD126++). Несколько иная картина характеризует клетки, не экспрессирующие CD138: в этом гейте уровень экспрессии CD126 прямо пропорционален как количеству проплазмоцитов, так и уровню плазмоцитоза; кроме того, наблюдается статистически достоверная линейная зависимость экспрессии CD126 от уровня СD19. Другими важными наблюдениями можно считать то, что показатели клинически значимых аберрантных маркеров не имеют корреляции с CD126, и то, что экспрессия рецептора не коррелирует с количеством клеток CD138-. 3.2.2.3. Анализ сопряженности клинико-иммунологических характеристик ММ и экспрессии рецептора IL-6 Для дальнейшего анализа взаимосвязей уровня CD126 с клиникоиммунологическими характеристиками ММ мы применили ряд непараметрических тестов, одним их преимуществ которых является возможность разделения пациентов на выборки согласно категориальным критериям. Относительно экспрессии рецептора IL-6Rα мы выделили следующие группы пациентов: с наличием/отсутствием экспрессии CD126, выраженной в параметрах D (K-S), %СD126+, MFR(I); группу с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора (CD126>10%); группу с наличием популяции CD126++. Критерий наличия экспрессии, выраженной как D (K-S), заключался в превышении критического значения, как это описано в разделе 3.2.1. Критериями наличия экспрессии CD126, выраженной в %СD126+ и MFR(I), служили положительная разность между средними значениями флуоресценции CD126 и контроля и значение MFR(I) > 1 соответственно. Уровень экспрессии аберрантных маркеров CD45, CD19 и CD56 категоризовали по принципу преобладания доли клеток с наличием экспрессии (>50%). Мы предприняли попытку учитывать наличие среднего уровня 90 экспрессии этих маркеров (>25%), что, однако, не привело к выявлению какихлибо новых закономерностей и даже несколько снизило чувствительность теста, проведенного с ограничением 50% (данные не приводятся). На основании морфологических данных мы выделили группы пациентов со средним (>10%) и высоким (>30%) плазмоцитозом, группу с наличием, а также c высоким уровнем проплазмоцитов (>10% от всех плазматических клеток). Кроме того, мы изучили взаимосвязи в группах пациентов с наличием и отсутствием популяции CD138- (>5% для отсечения возможных артефактов), ее средним (>10%), и высоким (>50%), содержанием в пуле опухолевых клеток. Для полученных таблиц сопряженности и расчета коэффициентов хиквадрат при попарном сравнении свойств мы выделяли взаимосвязи с p<0,05 (статистически значимые) и p<0,1 (близкие к статистически значимым). Тип выявленных взаимосвязей - прямых, либо реципрокных определяли путем изучения отклонения экспериментального количества соответствий признаков от математического ожидания соответствий. В таблице 3.2.5. суммированы результаты данного теста. Красным цветом отмечены статистически значимые взаимосвязи между характеристиками, зеленым – близкие к статистически значимым. Для двух гейтов опухолевых плазмоцитов, несущих и не несущих на мембране синдекан CD138, картины взаимосвязей клинико-иммунологических характеристик костного мозга с экспрессией рецептора интерлейкина-6 представляются совершенно разными. Так, на клетках, экспрессирующих CD138, сильно и положительно взаимосвязаны слабая и яркая экспрессия рецептора. Основная, слабая экспрессия CD126 положительно связана с суммарным количеством зрелых и незрелых типов опухолевых клеток и с экспрессией CD56, и реципрокно - с экспрессией CD45. Также получено свидетельство ассоциации потери CD138 опухолевыми клетками и экспрессии CD126 на клетках, продолжающих экспрессировать этот маркер. Интересно, что уровень CD19 не взаимосвязан с экспрессией CD126, в отличие от двух других клинически значимых маркеров. Стоит также отметить, что взаимосвязи касаются именно 91 наличия экспрессии CD126 и не связаны с увеличением количества клеток, несущих на мембране рецептор. В то же время, на клетках CD138- ни одна описанная взаимосвязь не была выявлена. Т а б л и ц а 3.2.5 - Анализ сопряженности клинико-иммунологических характеристик ММ и экспрессии рецептора IL-6 (таблица коэффициентов хи-квадрат) CD38+/CD138+ Налич CD126 (%) Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126>10% Налич CD126++ CD45+>50% CD19+>50% CD56+>50% PC>10% PC>30% Налич proPC proPC>10% Налич CD138CD138->10% CD138->50% Налич CD126 (D) CD126 >10% CD38+/CD138Налич CD126++ 27 25 4,5 5,3 27 6,2 3,1 0,3 1,5 2,9 0,95 3,4 Налич CD126 (D) CD126 Налич >10% CD126++ 23 10,7 -7,6 2,1 2,3 5,1 3,25 3,9 Налич CD126 (%) -10,8 1,8 5,9 16,8 3,7 9,6 5 0,67 4,4 4,4 -2,8 0,3 2,1 0,71 3,2 1,3 1,3 0,34 0,08 0,05 5,4 21 3,5 6,9 23 1,3 0,006 0,04 1,1 1,8 0,002 0,006 1,7 0,04 0,09 1,7 0,75 2,4 0,75 3,2 1,4 0,4 0,1 0,3 0,7 0,06 27 0,72 0,06 0,96 1,74 1,5 2,7 0,07 0,13 0,68 0,4 23 0,034 0,09 0,006 0,34 1,7 0,98 1,6 1,1 0,1 0,002 0 1,5 0,88 0,09 0,43 1,74 0,77 2,7 0,43 1,31 0,62 0,34 Единственной найденной закономерностью можно считать ассоциацию усиления экспрессии CD126 на клетках CD138- у пациентов, имеющих яркую экспрессию CD126++ в гейте CD138+. Мы полагаем, что полученные данные достоверны и могут быть обсуждены в терминах механизмов малигнизации клеток множественной миеломы, поскольку между родственными параметрами экспрессии CD126 (%CD126, D, наличия CD126>10%) в гейте CD138-, тем не менее, наблюдаются ожидаемые взаимосвязи, рассчитанные по данным, относящимся к событиям в этом гейте. Аналогичная картина была также получена при учете в гейте CD138- пациентов, имеющих только большое количество событий, и не оставляющих сомнений в четкости описания популяции (данные не приводятся). 92 Для описания характера выявленных в таблицах сопряженности взаимосвязей и поиска тенденций свойств усиливаться или ослабляться в сочетании друг с другом мы применили непараметрический тест Манна-Уитни. Группы пациентов формировали на основе тех же категоризаций, которые применялись в тесте хи-квадрат; соотносили их c количественными критериями иммунофенотипа и экспрессии CD126 дифференцированно для клеток с наличием и отсутствием CD138. Сначала мы проанализировали эффекты изменения параметров опухолевых клеток в группах с категоризованными показателями экспрессии CD126: наличием и отсутствием рецептора интерлейкина-6, наличием более 10% клеток, экспрессирующих его, а также в группе пациентов с наличием популяций яркой экспрессии CD126. Результаты этого анализа представлены в таблице 3.2.6. Статистически достоверные (p<0,05) различия в группах пациентов выделены красным цветом; различия, близкие к статистически достоверным (p<0,1), выделены зеленым цветом. Т а б л и ц а 3.2.6 - Различия клинико-иммунологических параметров в группах пациентов в зависимости от наличия экспрессии CD126 (достоверности различий, р) Категоризованные параметры CD38 /CD138+ CD38+/CD138Налич Налич Налич Налич CD126> CD126> + Налич Численные CD126 (%) CD126 (D) параметры 10% CD126++ CD126 (%) CD126 (D) 10% %CD126++ %PC конст 0,009 0,47 0,002 0,13 0,12 0,11 0,46 0,31 0,84 %proPC %CD138Возраст %CD45+ %CD19+ %CD56+ 0,57 0,19 0,3 0,11 0,95 0,47 0,008 0,12 0,012 0,022 0,31 0,019 0,1 0,41 0,056 0,18 0,47 0,09 0,55 0,79 0,35 0,27 0,38 0,49 0,69 0,37 0,3 0,69 0,9 0,15 0,26 0,21 0,21 0,75 1 0,06 0,89 0,4 0,62 0,23 0,65 0,7 Сопоставление закономерностей, полученных для клеток CD138+ и CD138-, в целом воспроизводит картину, полученную в тесте хи-квадрат. Группы пациентов с наличием экспрессии CD126 на мембране клеток CD138+ имеют статистически достоверные отличия от пациентов с CD126- по уровню 93 плазмоцитоза, проплазмоцитов, CD45 и CD56. Также в этом тесте повторно показано, что в этих группах нет различий по экспрессии CD138 и CD19. Наличие яркой экспрессии CD126 не разграничивает случаи ММ по экспрессии основной CD126+ популяции клеток. Интересен также результат, выявивший возрастные различия в группах пациентов с наличием (у пожилых больных) и отсутствием (преимущественно у более молодых больных) экспрессии CD126. В гейте CD138тенденции влияния CD126 на характеристики клеток не прослеживаются; выявлена лишь близкая к статистически достоверной разница уровней CD56 в группах с наличием и отсутствием CD126 на этих клетках. Далее мы рассмотрели влияние самих категорий клинико- иммунологических параметров на уровень CD126, то есть эффекты изменения CD126 в группах пациентов с различным уровнем плазмоцитоза, проплазмоцитов и с преобладанием экспрессии аберрантных маркеров. Достоверности таких различий приведены в таблице 3.2.7, цвета для выделения используются так же, как и в таблице 3.2.6. Т а б л и ц а 3.2.7 - Различия уровня экспрессии СD126 в группах пациентов в зависимости от клинико-иммунологических параметров (достоверности различий, р) Численные параметры + CD38 /CD138+ CD38+/CD138- D(K-S) MFR(I) ∆Gmean (CD126/ CD3) CD126++ (%) CD126 0,024 0,61 0,87 0,82 0,41 0,31 0,048 0,21 0,47 0,67 CD56+>50% PC>10% PC>30% Налич proPC proPC>10% Налич CD138- 0,09 0,094 0,019 0,64 0,75 0,038 0,54 0,49 0,73 0,28 0,25 0,027 0,085 0,3 0,88 0,092 0,18 0,35 CD138->10% CD138->50% 0,52 0,47 Категоризо ванные CD45+>50% CD19+>50% CD126 (%) D(K-S) MFR(I) ∆Gmean (CD126/ CD3) 0,36 0,65 0,62 0,65 0,57 0,89 0,83 0,91 0,67 0,13 0,02 0,66 0,79 0,73 0,75 0,94 0,21 0,66 0,26 0,068 0,74 0,12 0,06 0,5 0,13 0,9 0,45 0,4 0,1 0,54 0,49 0,37 0,66 0,04 0,07 0,03 0,9 0,34 0,62 0,5 0,85 0,95 0,7 0,62 0,6 0,16 0,12 0,56 0,68 0,48 0,23 0,28 0,9 0,47 0,42 0,53 0,93 0,64 0,93 0,6 (%) Из таблицы видно, что в группах пациентов с различиями по уровню плазмоцитоза, количеству проплазмоцитов, наличию CD45 и CD56 эти 94 характеристики отражаются на общем уровне экспрессии CD126, при этом подтверждается отсутствие взаимосвязи CD19 и CD138 c CD126. Однако данные закономерности прослеживаются лишь в выражении уровня CD126 классическим параметром доли CD126-позитивных клеток, либо в отдельных случаях разностью сигнал-шум. Непараметрический коэффициент D и соотношение сигнал/шум MFR(I), которые, как мы показали, коррелируют с процентным выражением экспрессии рецептора, в данном тесте оказались нечувствительными. Учитывая сравнительно низкий уровень достоверности полученных различий (для большинства параметров р<0,1), можно предположить направленность причинноследственных взаимосвязей рассмотренных характеристик ММ: наличие экспрессии CD126 является фактором, опосредующим изменения уровней проплазмоцитов, CD45 и CD56, а не является зависимым от них. Это следует из того, что факт наличия экспрессии CD126 имеет высоко достоверную взаимосвязь с %proPC, %CD45+, %CD56+ , но при этом, напротив, высокие уровни %proPC, %CD45+, %CD56+ не достоверно обеспечивают усиление экспрессии CD126. Интересно, что в то же время данный тест показал четкое различие по CD126 в группах c высоким и низким плазмоцитозом (р<0,05), в то время как тест хиквадрат выявил эту закономерность лишь как близкую к статистически достоверной (р<0,1). Возможно, высокий уровень плазмоцитов может независимо влиять на экспрессию CD126. Для клеток CD138- описанные закономерности не соблюдаются; основным фактором, затрагивающим уровень CD126, можно считать наличие большого количества проплазмоцитов (р<0,05) в сочетании с высоким уровнем плазмоцитоза (р<0,1), что подтверждает единственную выявленную для клеток CD138- в тесте хи-квадрат закономерность. 3.2.2.4. Соотношение уровня экспрессии IL-6Rα с аберрантными иммунофенотипами ММ Рассмотрение иммунофенотипа (ИФТ) как комплексной характеристики плазматической клетки при ММ отражает меру ее злокачественной трансформации и является важным диагностическим инструментом [Rawstron et 95 al., 2008; Kara et al., 2004; Cho et al., 2013]. ИФТ нормальных плазмоцитов характеризуется сочетанием CD45+/CD19+/CD56-; напротив, опухолевые клетки при развернутом процессе ММ проявляют ИФТ CD45-/CD19-/CD56+. В то же время, на разных стадиях лечения и у разных пациентов могут преобладать клетки с любой из 8 комбинаций аберрантных маркеров. Мы проанализировали ИФТ 27 больных ММ совместно с параметрами экспрессии рецептора интерлейкина-6 на мембране опухолевых клеток в гейтах CD38+/CD138+ и CD38+/CD138-, а также изучили взаимосвязи изменений ИФТ и уровня CD126 между этими гейтами. Символом «ИФТ--+» мы обозначили классический злокачественный иммунофенотип CD45-/CD19-/CD56+. Первая задача данного раздела работы заключалась в проверке гипотезы о том, что наличие и отсутствие экспрессии CD126 соответствует в большей степени злокачественному либо здоровому иммунофенотипу. Для этого мы рассчитали доли клинических случаев, в которых аберрантные маркеры CD45 и CD19 были экспрессированы на большей части опухолевых клеток (>50%), а CD56 – на меньшей (<50%), а затем доли этих случаев с условием, что СD126 не экспрессирован на мембране. Иными словами, мы рассмотрели соответствие отсутствия СD126 компонентам здорового ИФТ в сравнении с общим уровнем экспрессии маркеров при ММ (таблица 3.2.8). Т а б л и ц а 3.2.8 - Соответствие наличия экспрессии CD126 параметрам ИФТ опухолевых клеток ММ CD38+/CD138+ Доля от всей выборки CD45+ CD19 + CD56Налич ИФТ--+ CD38+/CD138- Доля при отсутствии экспрессии CD126 D(K-S) CD126 (%) Доля от всей выборки Доля при отсутствии экспрессии CD126 D(K-S) CD126 (%) 15% 15% 75% 50% 100% 50% 39% 7% 75% 50% 67% 50% 26% 59% 43% 17% 57% 17% 48% 39% 55% 40% 81% 39% Действительно, в случаях отсутствия рецептора интерлейкина-6 на мембране наблюдается тенденция к уменьшению характерной для злокачественных клеток экспрессии всех трех диагностических маркеров ММ как на клетках CD138+, так и CD138-. Интересно, что доля преобладания случаев со 96 злокачественным ИФТ--+ в отсутствии CD126 закономерно уменьшается для клеток CD138+, но остается неизменной для клеток CD138-. Следующая задача состояла в изучении закономерностей изменения характеристик ИФТ и уровня CD126 между гейтами CD138+ и CD138-. Обобщенные данные по ИФТ больных ММ позволяют сделать вывод, что в гейте CD138- снижена по сравнению с клетками CD138+ доля пациентов, имеющих ИФТ--+ (р<0,1): 39% наблюдений с ИФТ--+ в гейте CD138-, в то время как 59% наблюдений с ИФТ--+ в гейте CD138+ и 56% наблюдений с ИФТ--+ при анализе всех CD38+ клеток. Изменения экспрессии маркеров между гейтами CD138+ и CD138- в наибольшей степени касаются CD45 (8 из 13 различий параметров ИФТ), в средней – CD56 (6 из 13 различий), и в меньшей степени – CD19 (4 из 13 различий). Изменения экспрессии хотя бы одного из аберрантных маркеров между гейтами CD138+ и CD138- наблюдались у 13 из 23 пациентов с наличием популяции CD138-. Соотнесение этих данных с экспрессией CD126 в тесте сопряженности признаков хи-квадрат иллюстрирует таблица 3.2.9; красным цветом отмечены статистически достоверные различия (р<0,05), зеленым – близкие к статистически достоверным (р<0,1). Т а б л и ц а 3.2.9 - Анализ сопряженности характеристик ИФТ и экспрессии рецептора IL-6 (таблица коэффициентов хи-квадрат) CD38+/CD138+ (%) Налич CD126 (D) CD126 >10% (%) Налич CD126 (D) 5,8 6,2 2,8 0,5 0,006 0,02 2,6 0,07 0,37 0,52 0,03 2,3 0,02 0,35 0,62 0,87 0,04 0,2 0,18 0,42 0,29 8,1 5,6 2,6 0,7 0,08 1,5 0,07 0,12 0,17 0,01 0,34 2,4 0,05 0,73 Налич CD126 Налич ИФТ--+ Налич измен ИФТ Налич измен CD45 Налич измен CD19 Налич измен CD56 CD38+/CD138Налич CD126 ++ Налич CD126 CD126 >10% Расчеты коэффициента сопряженности признаков подтвердили высоко достоверную взаимосвязь уровня экспрессии CD126 и наличия злокачественного ИФТ--+ для клеток CD138+ и отсутствие такой взаимосвязи для клеток СD138-. 97 Неожиданным высоко достоверным результатом оказалось изменение уровня CD19 при утере клетками CD138+ синдекана-1 только в случае отсутствия CD126 на их мембране. Интересно, что уровни CD19 и CD126 в пределах одного гейта не взаимосвязаны. При разделении пациентов на группы, соответствующие наличию/отсутствию ИФТ--+, а также наличию/отсутствию между гейтами CD138+ и CD138- изменений ИФТ и экспрессии аберрантных маркеров, мы применили тест Манна-Уитни в отношении характеристик экспрессии рецептора IL-6. Статистически достоверно (р=0,045) различается уровень экспрессии CD126+ (выраженный в %) в группах с наличием и отсутствием ИФТ--+ на клетках CD138+, но не CD138-. Количество клеток с яркой экспрессией рецептора (CD126++) не зависит от наличия ИФТ--+. В качестве численных характеристик изменения экспрессии CD126 между двумя гейтами мы использовали соотношения DCD126(CD138+)/DCD126(CD138-) и GmeanCD126(CD138+)/GmeanCD126(CD138-). При оценке в тесте Манна-Уитни взаимосвязей различий между клетками CD138+ и CD138- экспрессии CD126 и различий экспрессии аберрантных маркеров на этих субпопуляциях получено еще одно свидетельство взаимосвязи изменений уровней CD19 и CD126 при потере плазматическими клетками синдекана-1. Кроме того, прослеживается определенная взаимосвязь различий CD126 в двух гейтах с изменением уровня CD45 (р=0,09) и изменениями иммунофенотипа в целом (р=0,026) (таблица 3.2.10). Т а б л и ц а 3.2.10 - Различия экспрессии рецептора IL-6 в зависимости от изменений характеристик ИФТ между гейтами CD138+ и CD138- (достоверность в тесте Манна-Уитни, р) категориальные численные Налич измен CD45 Налич измен CD19 Налич измен CD56 Налич измен ИФТ DCD126(CD138+)/ DCD126(CD138-) 0,23 0,024 0,27 0,25 0,09 0,007 0,78 0,026 0,2 0,38 0,3 0,12 GmeanCD126(CD138+)/ GmeanCD126(CD138-) %СD126++ 98 3.2.3. Экспрессия рецептора IL-6 при морфологически атипичных вариантах ММ Опухолевый субстрат случаев 10-15% ММ бывает представлен морфологически нетипичными вариантами плазматических клеток, в том числе незрелыми и плазмобластными формами, а также расщепленными или многоядерными клетками. В ходе нашего исследования были описаны два случая с атипичной морфологией злокачественных клеток, диагностика которых проводилась на основе иммунологической верификации аберрантного ИФТ ММ. Первый случай (пациент Мох.) характеризовался ярко выраженной лимфоидной морфологией опухолевых клеток с бластной структурой хроматина (рисунок 3.2.2 А). Общая клинико-иммунологическая картина, включающая множественные литические поражения костей, перестройку костной структуры, секрецию белка Бенс-Джонса k-типа, повышенные уровни С-реактивного белка и β2- микроглобулина, инфильтративное образование из неопластических клеток на слизистой желудка в сочетании с иммуногистогимическим и цитофлуориметрическим анализом опухолевых клеток позволили установить диагноз множественная миелома, плазмобластный вариант. Второй случай (пациент Зар.) морфологически представлял собой вариант множественной миеломы проплазмоцитов с преобладанием (17,2%) над зрелыми плазматическими опухолевыми клетками (12,6%) и присутствием в субстрате опухоли скоплений клеток, содержащих атипичные двуядерные элементы (рисунок 3.2.3 Б). Описанные случаи ММ представляют для нас особенный интерес, поскольку плазмобластному варианту ММ всегда соответствует высокий пролиферативный индекс [McKenna et al., 2008; Greipp et al., 1998], а наличие двуядерных клеток также говорит о пролиферативных и антиапоптотических проявлениях у клеток. В связи с этим мы исследовали в описанных случаях экспрессию IL-6Rα - главного фактора пролиферации и выживания при ММ. 99 А Б Рисунок 3.2.2. - Морфологические особенности опухолевых клеток при морфологически атипичных вариантах ММ. А. Аспират костного мозга больного Мох., ув. х1000. Морфологически клетки напоминают лимфоидные бластные элементы среднего и крупного размера с умеренным ядерноцитоплазматическим отношением. В большинстве клеток форма ядер округлая, в некоторых – неправильная; структура хроматина рассеянная, в части клеток видны остатки нуклеол. Цитоплазма базофильная, не содержит включений; Б. Аспират костного мозга больного Зар., ув. х1000. «Пламенеющая» зрелая плазматическая клетка с низким ядерно- цитоплазматическим отношением содержит 2 ядра округлой формы с конденсированным хроматином, базофилия цитоплазмы свидетельствует о гиперэкспрессии парапротеина. Характер экспрессии рецептора интерлейкина-6 при морфологически атипичных вариантах ММ мы изучили в комплексе с клинико- иммунологическими параметрами костного мозга (таблица 3.2.11). В обоих наблюдениях ИФТ характеризовался низкой экспрессией CD56, необычной для неопластических клеток при ММ. Различия между клетками CD138+ и CD138- подпадают под тенденцию, выявленную нами в предыдущем разделе: в отсутствие синдекана-1 увеличен уровень CD45 и снижен уровень CD19. 100 Т а б л и ц а 3.2.11 - Экспрессия СD126 и иммунофенотип атипичных неопластических клеток Опухолевые клетки, % Проплазмоциты,% %CD138Гейт %CD45+ %CD19+ %CD56+ %CD126+ Мох. >50 7,8 CD138+ 29,2 0,2 30,2 73,3 Зар. 29,8 17,2 0,75 CD13834,9 0,1 35,5 0 CD138+ 3,2 0,5 0,4 67 CD13821,0 0 0 0 Экспрессия CD126 имеет уникальный характер в обоих случаях. Так, при плазмобластном варианте ММ неопластические клетки разделяются на 2 субпопуляции в соответствии с принадлежностью к CD138+ и CD138- типам: в гейте CD138+ клетки позитивны по CD126. При ярко выраженной двуядерной морфологии части опухолевых клеток экспрессия рецептора интерлейкина-6 также имела беспрецедентно высокий уровень (67% на клетках CD138+), и при этом не детектировалась в гейте CD138-. 3.3. Регуляция экспрессии рецептора IL-6 на мембране опухолевых плазмоцитов интерлейкином-6 Эффекты прямой регуляции лигандом количества молекул рецептора интерлейкина-6 на мембране клеток миеломных иммортализованных линий подробно описаны нами в разделах 3.1.3 – 3.1.5. Они имеют устойчивую воспроизводимость и представляют исследовательский интерес в контексте объяснения принципа функционирования рецептора интерлейкина-6 в качестве фактора роста и выживания клеток ММ с преимущественно крайне низким выявляемым уровнем рецептора на мембране. Мы поставили задачу воспроизвести эффект усиления экспрессии IL-6Rα непосредственно на клиническом материале аспиратов костного мозга больных ММ. Для этого было необходимо смоделировать культивирование клеток в условиях депривации IL-6, не затрагивая, по возможности, межклеточные механизмы в стерильном препарате костного мозга. Такие подходы, как отмывка 101 клеток от IL-6 и выделение фракции опухолевого субстрата, травматичны для клеток, а также накладывают ограничения по соблюдению стерильности на всех этапах многостадийной методики и по аутокринному воздействию IL-6. Для полной элиминации цитокина более всего подходит анти-IL-6 МКА B-E8, применявшееся для терапии ММ и не имеющее токсичности [Trikha et al., 2003]. Эксперимент проводили независимо на материале аспиратов костного мозга двух больных ММ. В нулевой точке были отобраны аликвоты костного мозга для рутинной морфо-цитохимической и флуориметрической диагностики, а также для определения базового уровня CD126. Другая часть препарата подверглась инкубации с высокой концентрацией анти-IL-6 B-E8 (100 мкг/мл) в стандартных культуральных условиях (5% СО2, 37°С, 100% влажность). Подробная методика эксперимента приведена в разделе 2.3.1.3 главы «Материалы и методы». Детектировали изменение уровня CD126 через 3 и через 24 часа после начала инкубации. Данные об уровне экспрессии CD126 и характеристиках популяции неопластических клеток суммированы в таблице 3.3.1. Т а б л и ц а 3.3.1 - Динамика экспрессии СD126 на опухолевых клетках при депривации IL-6 костного мозга больных ММ Депривация IL-6 0ч. 3ч. 24ч. Параметры плазмоцитов %CD138%CD126+ MFR(CD126/CD3) %CD138%CD126+ MFR(CD126/CD3) %CD138%CD126+ MFR(CD126/CD3) Асх. CD138 + Тре. CD138 - CD138 + 50,2 2,1 1,36 0 0,2 1,5 0,7 0,75 22,4 3,8 2,05 0 4,2 1,52 1,9 1,05 22,0 4,4 2,6 CD138- 0 4,1 1,84 3,6 1,2 - Наиболее показательным параметром экспрессии рецептора IL-6 по результатам обработки цитометрических данных является соотношение сигнал/шум - MFR(CD126/CD3). Видно, что в двух независимых экспериментах при депривации IL-6 экспрессия CD126 растет как на CD138+, так и на CD138клетках, причем более яркий эффект прослеживается в гейте CD138+. Стоит также заметить, что численность популяции клеток CD138- в процессе инкубации 102 уменьшилась в первые 3 часа и затем стабилизировалась (22% от всех СD38+ клеток). Более наглядно изменение экспрессии CD126 иллюстрируют гистограммы распределения сигнала флуоресценции при сравнении с отрицательным контрольным маркером CD3 (рисунок 3.3.1). А Б В Г Д Е Рисунок 3.3.1. - Усиление экспрессии CD126 плазматическими CD38+ клетками (белый пик) в сравнении с фоновым сигналом CD3 (заштрихованный пик) при депривации IL-6 в аспиратах костного мозга двух больных ММ: А, Б, В – пациент Асх. Формирование отчетливого пика CD126 происходит уже через 3 часа инкубации с анти-IL-6; Г, Д, Е – пациент Тре. Нарастание уровня CD126 более слабое и медленное, визуально детектируется через 24 часа; А, Г – Исходная низкая экспрессия CD126; Б, Д – инкубация с анти-IL-6 МКА в течение 3 часов; В, Е - инкубация с анти-IL6 МКА в течение 24 часов. Из рисунка видно, что в обоих случаях нейтрализация IL-6 антителом B-E8 в среде костного мозга при интактных остальных параметрах препарата 103 способствует увеличению экспрессии CD126, воспроизводя таким образом эффект, описанный нами на культурах клеток множественной миеломы в экспериментальных условиях. Данный эффект может лежать в основе механизма регуляции рецептором интерлейкина-6 процессов пролиферации и выживания опухолевых клеток ММ. 3.4. Взаимосвязь инфицированности HHV-8 с экспрессией CD126 и с клиническими характеристиками опухолевых клеток ММ Участие IL-6 в механизмах канцерогенеза, ассоциированного с инфицированием человека вирусом герпеса восьмого типа (HHV-8), связывают с продукцией вирусного гомолога этого цитокина, способного функционировать практически на том же уровне, что и IL-6 человека [Hideshima et al., 2000; Li et al., 2001]. Следовательно, вирусный IL-6 может регулировать сигнальные пути, опосредуемые рецептором интерлейкина-6, и в том числе, влиять на его экспрессию. Мы изучили взаимосвязи между наличием генов HHV-8, выявленных методом ПЦР в клиническом материале ММ и основными клиническими параметрами аспиратов костного мозга 14 больных ММ. Ген вирусного интерлейкина-6 (мРНК, детектированная с помощью ПЦР, раздел 2.3.6.) присутствовал в 8 случаях (57%). Непараметрический тест хи-квадрат обнаружил высоко достоверные сопряженности наличия генов HHV-8 и уровня плазмоцитоза (PC>10%: χ2=5,1; p=0,02), наличия и высокого содержания проплазмоцитов в костном мозге. (Наличие proPC: χ2=7,5; p=0,006; proPC>10%: χ2=7,5; p=0,031). Коэффициенты хи-квадрат, рассчитанные исходя из характеристик экспрессии CD126 и наличия/отсутствия генов HHV-8 в клетках костного мозга больных, приведены в таблице 3.4.1. Характеристики уровня CD126 на клетках как CD138+, так и CD138- показывают близкие к статистически достоверным сопряженности с HHV-8 (р<0,1), которые отмечены в таблице зеленым цветом. Интересно, что яркая экспрессия CD126++, по-видимому, может регулироваться персистенцией вируса в костном мозге больного (р<0,1). 104 Т а б л и ц а 3.4.1 - Анализ сопряженности характеристик экспрессии рецептора IL-6 и инфицированности HHV-8 (таблица коэффициентов хи-квадрат) Категориальные параметры Гейт Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126>10% Наличие HHV-8 CD38+/CD138+ CD38+/CD1383,1 3,1 3,1 2,4 2,9 0 ++ При сравнении групп пациентов с наличием и отсутствием HHV-8 в тесте Манна-Уитни мы также получили свидетельство закономерного изменения уровня CD126 (таблица 3.4.2). Т а б л и ц а 3.4.2 - Различия экспрессии СD126 в группах пациентов в зависимости от инфицированности HHV-8 (достоверности различий, р) Численные параметры Гейт %CD126 D(CD126) MFR(CD126/CD3) ∆Gmean(CD126-CD3) %CD126++ Наличие HHV-8 CD38+/CD138+ CD38+/CD1380,033 0,23 0,19 0,17 0,12 0,02 0,06 0,015 0,16 - Аналогично результатам, полученным в таблицах сопряженности, при сравнении групп по Манну-Уитни проявляются взаимосвязи, определяемые соотношением сигнал-шум, причем они наблюдаются на клетках обоих гейтов CD138+ и CD138-; направленность этих взаимосвязей, оцененная c помощью сравнения с математическим ожиданием для нормального распределения, является положительной как для экспрессии CD126 в обоих гейтах, так и для популяции CD126++. Таким образом, в группе пациентов, инфицированных HHV8, статистически достоверно увеличен уровень экспрессии рецептора IL-6. 105 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Иммунологическая оценка экспрессии и активации рецептора IL-6 В настоящей работе при изучении рецептора IL-6 рассмотрены две белковые компоненты рецепторного комплекса: α-цепь (IL-6Rα, gp80, CD126) и βцепь (gp130) c использованием классических модельных клеточных линий множественной миеломы: XG-1, XG-2 (IL-6-зависимые) и RPMI8226 (IL-6независимая). В основу исследования положено прижизненное описание свойств клеток, обеспечивающееся методом проточной цитофлуориметрии. Для работы сформировали характеристическую панель антител к gp130 и IL-6Rα цепям рецептора IL-6 таким образом, чтобы они оказывали различное воздействие на пролиферацию клеток, связываясь с разными эпитопами внеклеточных доменов белка (согласно данным эпитопного картирования, рисунок 1.2). Присутствие в ростовой среде лиганда рецептора – интерлейкина-6 – во всех экспериментах приводило к существенному уменьшению детектируемых количеств эпитопов обеих цепей рецептора IL-6, то есть к изменению количества молекул рецептора на мембране. Это хорошо согласуется с данными о том, что активированный рецептор претерпевает интернализацию внутрь клетки [Thiel et al., 2000; Zohlnhofer et al., 1992]. Изменение времени воздействия IL-6 на рецептор показало нелинейную динамику количества рецептора на мембране: повидимому, параллельно интернализации имеет место ресинтез молекул рецептора. В попытке исключить описанные эффекты была проведена серия экспериментов в среде, содержащей азид натрия (угнетающий клеточное дыхание и останавливающий физиологические процессы в клетке) при температуре 0°С, что позволяет дифференцировать физиологические эффекты в клетке от биохимических реакций на ее поверхности. В этих условиях, некоторые эпитопы оставались воспроизводимо чувствительными к воздействию IL-6. Для gp130 такими эпитопами являются А1, A2, A3, I1, I2, В1, B2 а для IL-6Rα – M182, M195. Это свойство повторяется на всех изученных линиях клеток. Поскольку 106 неоднозначность влияния IL-6 на различные эпитопы молекул его рецептора свидетельствует о различном характере участия соответствующих структурных фрагментов в передаче цитокинового сигнала, мы предположили участие эпитопов МКА групп А, I и В (gp130), а также МКА М182 и M195 (IL-6Rα) в активации рецептора. 4.1.1. Определение активационных состояний gp130 и IL-6Rα на клеточных линиях множественной миеломы Ключевым этапом механизма активации рецептора интерлейкина-6 является гомодимеризация gp130, происходящая после связывания gp130 и IL6Rα с IL-6 и между собой. Существование агониста рецептора IL-6, представленного парой анти-gp130 МКА B1+I2 [Autissier et al., 1997], дает указание на участие в димеризации тех сайтов белка, которые пространственно ассоциированны с МКА группы В и I. Таким образом, МКА B1 и А1 (пространственно близкое к I2 по данным эпитопного картирования, рисунок 1.2), имеют эпитопы непосредственно в области гомодимеризации gp130, а также связывания с IL-6Rα с gp130 (гетеродимеризации цепей рецептора). Опираясь на данные [Liautard et al., 1997] по влиянию МКА на цитокин-индуцируемую пролиферацию клеток, следует отнести МКА А1 к сайту гомодимеризации (блокирует рост клеток, инициируемый любым цитокином семейства gp130), а В1 – к сайту взаимодействия gp130 и IL-6Rα. Следовательно, наблюдаемые нами в присутствии IL-6 воспроизводимые изменения количества эпитопов А1 и В1 gp130 свидетельствуют о нахождении цепей рецептора в закрытой для антител, димеризованной конформации, то есть в активационном состоянии, при котором произошли связывания gp130-gp130 и IL-6Rα-gp130 соответственно. Отдельно продемонстрировано отсутствие перекрестного блокирования антител между собой. Соответствие детекции анти-IL-6Rα МКА М195 наличию определенного активационного состояния рецептора также следует из функционального свойства антитела блокировать при связывании c IL-6Rα передачу сигнала IL-6, причем не 107 в сайте димеризации gp130-IL-6Rα, а при непосредственном взаимодействии IL6Rα с IL-6. Это убедительно доказывают результаты эксперимента на клетках XG-2PA, активация рецептора которых достигается парой-агонистом В1+I2 в условиях описанного выше блокирования сайтов взаимодействия gp130/IL-6Rα. Рисунок 3.1.7 Б иллюстрирует наличие свободного эпитопа M195 после преикубации клеток с антителами-агонистами. Таким образом, анти-IL-6Rα МКА М195 является маркером связывания IL-6Rα с IL-6. Дополнительным подтверждением найденных функциональных соответствий является однозначное выявление эпитопов A1 и B1 и исчезновение M195 при воздействии в качестве лиганда SANT5 - мутантной формы IL-6, препятствующей связыванию IL-6Rα/IL-6. В этом случае не нарушена димеризация цепей рецептора, однако блокируется передача сигнала на клеточных линиях XG-1 и XG-2. Обобщая полученные результаты, мы сформулировали принцип, согласно которому все описанные ранее типы эпитопов gp130 и IL-6Rα можно разделить на две группы – маркеры цепей рецептора, не зависящие от его активационного статуса (анти-gp130 МКА групп С, D, E, G; анти-IL-6Rα МКА М5, М91) и маркеры определенных состояний образования олигомерного рецепторного комплекса (анти-gp130 МКА групп A, B, I, F; анти-IL-6Rα МКА М195, M182). 4.1.2. Регуляция уровня экспрессии рецептора IL-6 его лигандом Количественная оценка уровней экспрессии gp130 и IL-6Rα на клетках стандартных линий ММ показала схожий профиль экспрессии обеих цепей рецептора, но, однако, выявила существенные различия характера экспрессии между линиями клеток: так, IL-6-независимые клетки RPMI8226 в логарифмической фазе роста характеризуются высоким уровнем gp130 и IL-6Rα (около 25000 молекул на клетку), а IL-6-зависимые XG-1 и XG-2 экспрессируют лишь 0-4000 молекул рецептора на клетку. Однако в условиях депривации ростового фактора на клетках обеих IL-6-зависимых линий отмечается усиление первоначально слабой экспрессии как gp130, так и IL-6Rα. Более того, при 108 цитокиновом голодании в течение продолжительного времени (1-3 суток) происходит резкое увеличение количества молекул рецептора на мембране, и, напротив, в присутствии цитокина IL-6-зависимые клетки ММ снижают уровень экспрессии gp130 и IL-6Rα, т.е. осуществляют «даунрегуляцию» рецептора. Напротив, IL-6-независимые клетки линии RPMI8226, рутинно культивируемые без ростового фактора, в течение 3 суток лишь несколько ослабляют экспрессию рецептора IL-6 на мембране. С помощью инкубации IL-6-зависимых клеток в отсутствии и в присутствии IL-6 мы воспроизводимо модулировали как увеличение, так и снижение количества молекул рецептора IL-6. Наблюдаемый на клетках XG-1 и XG-2 эффект является обратимым (рисунок 3.1.9). Необходимо отметить, что уменьшение количеств всех эпитопов gp130 и IL-6Rα, то есть исчезновение молекул рецептора с мембраны при инкубации с IL-6 связано, в основном, с интернализацией активированного рецепторного комплекса внутрь клетки, а также с протеолитическим высвобождением внеклеточной части рецептора в межклеточное пространство с образованием молекул растворимых форм рецептора. Изменения количества молекул рецептора на мембране могут быть также обусловлены параллельными процессами: маскированием ряда эпитопов вследствие димеризации и ресинтезом новых молекул на мембране. Применение активации и принципа экспрессии дифференцированного рецептора с описания рассмотрением процессов специфических активационных состояний с помощью панели МКА, сформулированного в разделе 3.1.5, позволило нам четко различать эффекты ресинтеза рецептора (накопления молекул, детектируемых всеми МКА), димеризации (исчезновения эпитопов, ассоциированных с активацией рецептора) и интернализации (маскирования всех характеристических эпитопов рецептора) и сделать вывод о наличии эффекта значимого увеличения экспрессии его цепей, то есть появления новых молекул рецептора, в ответ на депривацию IL-6. Действительно, при цитокиновом голодании мембрана клеток обогащается не только мономерными молекулами gp130 и IL-6Rα, характеризуемыми эпитопами А1, В1 и М195, но и маркерами, не связанными с сигнализацией и отражающими количество молекул 109 рецептора до и после депривации (С2, М91, рисунок 3.1.9). Важно отметить, что эффект усиления экспрессии IL-6Rα проявляется ярко в течение первых суток депривации IL-6, и затем быстро ослабевает, в то время как усиление экспрессии gp130 нарастает медленно в течение трех суток, но при этом значительно уступает экспрессии IL-6Rα. Описанная закономерность может свидетельствовать о ведущей функциональной (в том числе антиапоптотической) роли именно IL-6Rα в данном механизме регуляции. Также на основании количественной оценки изменения экспрессии (выраженной в процентах изменения количества характеристических эпитопов через 1 и через 3 суток депривации IL-6, таблица 3.1.3) мы отчетливо наблюдали изначально быстрое нарастание количества эпитопов А1, В1 (появление мономеров gp130) при относительно спокойном нарастании эпитопа C2 (появление новых молекул gp130); эпитоп M195 IL-6Rα на всех трех клеточных линиях появлялся более ярко как в первые, так и на 3-и сутки эксперимента. Немногочисленные литературные данные, в которых упоминается описанный эффект обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии своего рецептора, суммированны в разделе 1.4.1 главы «Обзор литературы» и не являются однозначными, но, однако, указывают на наличие подобной регуляции при ММ. Различия экспрессии рецептора IL-6 между IL-6-зависимыми (слабая экспрессия, модулируемая цитокином) и IL-6-независимыми клетками (сильная экспрессия, не регулируемая IL-6), рассмотренные здесь, могут свидетельствовать о существовании IL-6-опосредованного механизма пролиферации и выживания клеток ММ, специфичного для цитокин-зависимых опухолевых клеток. Наличие интерлейкина-6 механизма цитокином обратной ставит регуляции задачу экспрессии рассмотрения рецептора молекулярных закономерностей функционирования интерлейкин-зависимых опухолевых клеток в новой плоскости: в клинической практике необходимо учитывать не только количество рецепторных молекул gp130 и IL-6Rα на мембране клеток, но также условия существования клеток in vivo и возможность гуморального и паракринного воздействия на передачу ими сигнала IL-6. 110 Актуальность данного аспекта подтверждена нами в экспериментах по изучению уровня экспрессии рецептора IL-6 после депривации костного мозга больных ММ в присутствии избытка анти-IL-6 B-E8. Нейтрализация цитокина в аспиратах костного мозга полностью воспроизвела выявленный на клеточных линиях эффект усиления экспрессии рецептора IL-6 (рисунок 3.3.1). Таким образом, мы показали существование IL-6Rα- и gp130-специфичного механизма, обеспечивающего селективное активирование IL-6-сигнализации на опухолевых клетках путем аутокринной или паракринной модуляции экспрессии рецептора интерлейкина-6. 4.2. Клинико-иммунологические характеристики ММ и экспрессия рецептора IL-6 Обширная взаимосвязей часть настоящего экспрессии исследования лиганд-связывающей основана компоненты на анализе рецептора интрелейкина-6 – его α-цепи, или IL-6Rα (CD126) с клиническими параметрами ММ. IL-6Rα отвечает за IL-6 сигнализацию и экспрессируется, в отличие от βцепи рецептора (gp130), на определенных типах клеток, в том числе, на трансформированных плазматических клетках при ММ. Уровень экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток больных в большинстве случаев очень низкий, в отличие от экспрессии рецептора на стандартных миеломных клеточных линиях, что сложно согласовать с фактом ведущей регуляторной роли IL-6 в пролиферации и выживании клеток при множественной миеломе. Высказываются предположения, что сигнализацию IL-6 модулирует растворимая форма рецептора sIL-6Rα, либо существуют механизмы регуляции экспрессии CD126, активизирующиеся при антиапоптотическом и пролиферативном ответе опухолевых клеток на внешние условия. CD126 экспрессирован, как правило, мономорфно; редко присутствует ярко выраженная небольшая популяция клеток с интенсивной экспрессией – CD126++, которая может иметь собственное функциональное значение [Rawstron et al., 2000]. 111 При оценке взаимосвязей характеристик опухолевых клеток мы параллельно использовали значения экспрессии CD126, полученные тремя расчетными методами обработки цитофлуориметрических данных. Эти значения в тесте Пирсона показали высоко достоверную корреляцию между собой (р<0,001), что позволило нам оперировать в категориях близких к достоверным закономерностей и дополнительно отслеживать воспроизводимость полученных статистических коэффициентов, несмотря на низкое соотношение сигнал/шум экспрессии CD126. Дополнительно мы использовали более жесткий критерий – CD126 > 10%, позволяющий четко разграничить и охарактеризовать наличие и отсутствие эффекта CD126. Важную информацию о механизмах малигнизации плазматических клеток может дать изучение влияния вирусного интерлейкина-6 на экспрессию CD126 опухолевыми клетками при ММ. В группе пациентов, инфицированных вирусом герпеса 8 типа и cодержащих мРНК гена вирусного интерлейкина-6 в клетках костного мозга, мы установили статистически достоверную прямую взаимосвязь (p<0,03) между наличием гена vIL-6 и уровнем экспрессии CD126 на всех опухолевых клетках при ММ (таблица 3.4.2). Однако эта взаимосвязь не может быть интерпретирована как прямое воздействие vIL-6 на рецептор ввиду описанного нами механизма обратной регуляции уровня CD126 интерлейкином-6. Наличие гена вирусного IL-6 высоко достоверно ассоциировано также с наличием проплазмоцитов (р=0,006). Исходя из этого, а также из прямой корреляции уровней CD126 и проплазмоцитов (р<0,001 для корреляции Пирсона), очевидно, что вирусный цитокин активирует продукцию CD126 на опухолевых клетках по механизму, осуществляемому проплазмоцитами. Источником вирусного цитокина могут являться сами проплазмоциты, принимая во внимание, что ранее уже высказывались предположения [Широков, 2006] о персистенции вируса HHV-8 именно в этом типе клеток при ММ. 112 4.2.1. Различия экспрессии CD126 между CD138+ и CD138субпопуляциями опухолевых плазматических клеток В последнее время большую актуальность получили исследования, связанные с различиями экспрессии синдекана-1, или CD138, на клетках опухолевого клона при ММ. Показано, что в большинстве клинических случаев [Paiva et al., 2013; Hosen et al., 2012], а также стандартных клеточных линий ММ [Fuhler et al., 2010; Jakubikova et al., 2011] опухолевые клетки представлены совокупностью CD138+ и CD138- субпопуляций, причем обе они являются клоногенными [Matsui et al., 2004; Van Valckenborgh et al., 2012, Hosen, 2013] и играют роль в патогенезе ММ. Клетки CD138+ зрелые, долгоживущие, составляют, как правило, основную опухолевую массу и проявляют высокий клоногенный и опухоле-инициирующий потенциал, поэтому изначально именно эту субпопуляцию рассматривали при изучении неопластических клеток ММ. В отличие от них, клетки CD138-, слабо экспрессирующие синдекан-1 и имеющие незрелый фенотип [Reid et al., 2010; Kawano et al., 2012], устойчивы к терапевтическим агентам, таким как мелфалан и леналидомид [Van Valckenborgh et al., 2012; Kawano et al., 2012], отражают степень прогрессии ММ, а также апоптотический индекс (как спонтанный, так и индуцированный химиотерапией) [Bataille, et al., 2006]. Более того, наличие существенной популяции CD138клеток ассоциировано с плохим прогнозом, высокой вероятностью рецидива и со способностью к быстрому метастатическому росту [Kawano et al., 2012; Aref et al., 2003]. Появление этой субпопуляции происходит вследствие утери синдекана-1 при его протеолитическом высвобождении в межклеточное пространство [Dhodapkar et al., 1999; Sanderson et al., 2008, Grigoriadis et al., 2010] и сопровождается изменениями профиля экспрессии генов (в том числе XBP-1, IRF4, BMP-1) [Jacak et al., 2013; Kawano et al., 2012; Van Valckenborgh et al., 2012] и параметров иммунофенотипа. Так, на клетках CD138- может увеличиваться экспрессия CD45 [Reid et al., 2010]. Белковая основа молекулы синдекана-1 обычно модифицирована гепарансульфатом, который служит якорем в межклеточном матриксе, а также резервуаром для IL-6 и других факторов роста 113 [Jourdan et al., 1998; Mummery et al., 2000; Sanderson et al., 2002]. При расщеплении и утере синдекана-1 c поверхности клетки ростовые факторы высвобождаются и обеспечивают метастатическую активность и антиапоптотическое действие [Wu et al., 2012]. Показано также, что этот процесс не зависит от исходной активации gp130 [Jourdan et al., 1998]. Кроме того, предполагается, что апоптозиндуцирующим устойчивость CD138- химиотерапевтическим клеток агентам к STAT3- обуславливается ключевой ролью IL-6 сигнализации [Van Valckenborgh et al., 2012]. Несмотря на то, что в некоторых работах оспаривались клоногенность [Chiron et al., 2012] и наличие в костном мозге опухолевых клеток CD138-, в том числе, с отнесением их появления к апоптотическим артефактам при пробоподготовке и хранении аспиратов костного мозга [Jourdan et al., 1998; Zhuang et al., 2005; Christensen et al., 2012], в последние годы убедительно доказана существенная роль клеток CD138- в прогрессии заболевания. Подробно описана соответствующая популяция клеток и на нормальных плазматических клетках [Cocco et al., 2012]. Учитывая представленные выше характеристики CD138 на плазматических клетках при ММ и центральное значение IL-6 в модуляции CD138опосредованного туморогенеза, представляется важным дифференцировать экспрессию рецептора IL-6 на клетках CD138+ и CD138-. Это позволит провести для двух описанных субпопуляций анализ взаимосвязей экспрессии рецептора IL6 с иммуноморфологическими параметрами опухолевых клеток и описать молекулярные закономерности опухолевой прогрессии. Дифференцированная обработка цитофлуориметрических данных клинических препаратов костного мозга больных ММ в гейтах CD38+/CD138+ и CD38+/CD138- позволила установить, что экспрессия CD126 достоверно различается на клетках CD138+ и CD138-: в отсутствие синдекана-1 уровень экспрессии CD126 ниже (р=0,003), на таких клетках не формируются популяции с яркой экспрессией CD126++, однако линейная связь между уровнем экспрессии CD126 и объемом популяции CD138- отсутствует. По данным корреляционного анализа (таблица 3.2.4) для всех плазматических клеткок, как CD138+, так и 114 CD138-, характерна статистически достоверная корреляция уровня экспрессии CD126 с количеством морфологически незрелых форм плазмоцитов в костном мозге; в то же время менее зрелые CD138- клетки проявляют более яркую взаимосвязь уровня CD126 с количеством проплазмоцитов, а также обнаруживают корреляцию уровня CD126 c уровнем плазмоцитоза и с экспрессией СD19. Учитывая статистически достоверное снижение количества морфологически незрелых форм опухолевых клеток при образовании CD138популяции (р<0,03), мы можем предположить экспрессию CD126 в опухолевом пуле клеток преимущественно на проплазмоцитах, что требует дальнейшего иммунологического подтверждения, поскольку маркеры CD38 и CD138 демонстрируют мономорфное распределение между морфологически зрелыми и незрелыми опухолевыми клетками. Такое предположение согласуется с литературными данными о том, что CD126 ассоциирован с менее зрелым фенотипом опухолевых клеток [Rawstron et al., 2000]. Следует отметить, что популяции морфологически незрелых клеток (проплазмоцитов) и иммунологически незрелых клеток (CD138-) оказываются в реципрокной взаимосвязи, что говорит о существенном различии механизмов, определяющих появление этих популяций. Уровень экспрессии CD126, согласно нашим данным, модулируется именно проплазмоцитами. Для всех опухолевых клеток отсутствует также линейная взаимосвязь между уровнями экспрессии CD126 и аберрантных маркеров ММ CD45, CD19, CD56. Исключение составляет корреляция CD126 c уровнем CD19 на клетках CD138-. Эти результаты свидетельствуют об относительной независимости сигнальных путей, модулирующих экспрессию CD126 и характеристических молекул ММ. В то же время тест Манна-Уитни (таблица 3.2.7) показал в гейте СD138+, но не CD138-, увеличение уровня CD126 в группах пациентов с преобладанием клеток, не экспрессирующих CD45 (р=0,024) и экспрессирующих CD56 (р=0,09). В CD138+ популяции усиление экспрессии CD126 происходит в условиях выраженного плазмоцитоза (PC>30%, р=0,019), а также при наличии (р=0,085) и увеличении количества (р=0,092) проплазмоцитов. Клетки CD138-, 115 напротив, не обнаруживают влияния экспрессии CD45 и CD56 на уровень CD126, но, тем не менее, чувствительны к повышению уровня проплазмоцитов (proPC>10%, р<0,05) и плазмоцитоза (р=0,06). Нельзя в этом контексте исключать возможность паракринной стимуляции экспрессии CD126 на клетках CD138проплазмоцитами. Очевидно также, что общее свойство всех ассоциированных с усилением экспрессии CD126 параметров – их принадлежность к характеристикам опухолевой прогрессии ММ. Несмотря на преобладание случаев с наличием четкой экспрессии CD126, мы проследили закономерности, характеризующие появление или исчезновение CD126 на мембране. Непараметрический тест хи-квадрат (таблица 3.2.5) показал для клеток СD138+, но не CD138-, яркую сопряженность наличия CD126 со всеми аберрантными параметрами плазматических клеток: преобладанием CD45-, CD56+, высоким уровнем плазмоцитоза и проплазмоцитов, а также с отсутствием популяции CD138-, за исключением связи с CD19. Аналогичные закономерности демонстрирует тест Манна-Уитни (таблица 3.2.6): в присутствии CD126 на клетках СD138+, но не CD138-, статистически достоверно ослаблена экспрессия CD45 и увеличен уровень CD56; кроме того, CD126 появляется при высоких уровнях проплазмоцитов (р=0,008) и плазмоцитоза (р=0,005). Интересный эффект утраты CD126 клетками СD138+ пациентов более молодого возраста (р=0,012) связан, по-видимому, с трансформацией клеток на фоне высокодозного химиотерапевтического лечения; в этой группе пациентов мы также отметили усиление экспрессии CD45 (p=0,008). Отсутствие описанных закономерностей для клеток CD138- может означать принципиально различный вклад рецептора CD126 в прогрессию заболевания для CD138+ и CD138- клеток. В приведенной ниже таблице 4.1 суммированы все выявленные нами взаимосвязи наличия и уровня экспрессии CD126 с иммуноморфологическими характеристиками опухолевого субстрата на основе цитофлуориметрического анализа аспиратов костного мозга больных ММ. Сила взаимосвязей отражена в виде значений р достоверности различий в тестах Манна-Уитни, коэффициентов корреляции Пирсона и сопряженности признаков хи-квадрат. Красным цветом 116 отмечены статистически достоверные взаимосвязи (р<0,05), зеленым цветом отмечены близкие к статистически достоверным (р<0,1) взаимосвязи. Пропуски значений в ячейках указывают на отсутствие статистически значимых взаимосвязей между параметрами. Таблица наглядно демонстрирует значение CD126 на мембране. Наличие молекул СD126 на мембране СD138-позитивных клеток статистически достоверно взаимосвязано с уровнем плазмоцитоза, наличием и уровнем проплазмоцитов, высокой долей CD138-негативных клеток, преимущественно низким уровнем CD45 и высоким уровнем CD56. Мы полагаем, что фактор наличия CD126 на мембране является строгим молекулярным индикатором злокачественной природы клеток множественной миеломы. Т а б л и ц а 4.1 - Иммуноморфологические характеристики костного мозга больных множественной миеломой, ассоциированные с экспрессией CD126 (достоверности различий, р) Параметры %PC PC>10% PC>30% Налич proPC %proPC proPC>10% %CD138CD138->10% CD138->50% Возраст %CD45 CD45>50% %CD19 CD19>50% %CD56 CD56>50% Налич CD126 0,005 0,024 0,08 0,03 0,008 0,001 CD38+/CD138+ Уровень CD126 0,04 0,04 0,012 0,022 0,001 0,1 0,02 0,09 0,05 0,09 Налич CD126++ CD38+/CD138Налич Уровень CD126 CD126 0,06 0,05 0,02 0,1 0,001 0,04 0,056 0,03 0,05 0,019 0,016 0,09 0,09 0,06 Изменение уровня экспрессии CD126 тесно связано с высоким уровнем плазмоцитоза (PC>30%), уровнем проплазмоцитов и СD45, которые, возможно, участвуют в его модуляции на клетках CD138+. Принципиально иная картина взаимосвязей характеризует CD138- негативные опухолевые клетки: наличие или отсутствие CD126 не ассоциировано 117 с параметрами плазмоцитов, в то время как экспрессия CD126 преимущественно очень низкая и статистически достоверно зависит от уровня проплазмоцитов, количества опухолевых клеток и CD19. Свойства минорных популяций клеток с яркой экспрессией CD126++ не взаимосвязаны с рассматриваемыми параметрами опухолевого субстрата; статистически достоверно показано, что CD126++ клетки образуются в условиях выраженного плазмоцитоза. Обобщая рассмотренные эффекты, необходимо подчеркнуть отличие группы факторов, связанных с присутствием рецептора IL-6 на мембране от факторов, ассоциированных с уровнем его экспрессии. Эффект регуляции экспрессии CD126 его лигандом, подробно описанный в разделе 3.3, воспроизводится как на СD138+, так и на CD138- клетках (таблица 3.3.1), что может означать селективное участие в механизме этого процесса только молекул IL-6, gp130 и IL-6Rα. Клетки CD138- в меньшей степени индуцируют экспрессию CD126, по сравнению с клетками CD138+. Объемы этих двух субпопуляций, согласно данным литературы [Christensen et al., 2012], в процессе эксперимента могут изменяться: CD138+ популяция утрачивает синдекан-1 при инкубации препарата костного мозга вследствие апоптотических процессов, в связи с чем накапливаются клетки CD138-. Интересно, что при инкубации аспиратов костного мозга в присутствии избытка анти-IL-6 МКА мы не наблюдали описанную тенденцию; напротив, в случае наличия в исходном препарате костного мозга 50% клеток CD138-, через 3, а также через 24 часа препарат содержал только 22% клеток CD138-. Кроме того, при изначальном отсутствии CD138- клеток в препарате они не образовывались в течение 24 ч. Такое ингибирование роста CD138-негативной популяции клеток может быть объяснено нейтрализацией IL-6 при высвобождении факторов роста из гепарансульфата вырезаемого синдекана-1, вероятно, играющего важную роль в снижении уровня CD126 на мембране и в последующей трансформации клеток в CD138-. 118 4.2.2. Взаимосвязь экспрессии рецептора IL-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток Рассмотрение экспрессии индивидуальных аберрантных маркеров показало, что для всех опухолевых клеток наличие CD126 сопутствует проявлению злокачественных иммунологических характеристик клетки: экспрессия СD45 и CD19 ослабляется, а CD56 усиливается (таблица 3.2.8). Однако, комплексная диагностическая характеристика ММ ИФТ--+ сопряжена с наличием CD126 (р<0,05) только для клеток CD138+, но не CD138-. Эти данные еще раз подтверждают ассоциацию наличия CD126 на опухолевых клетках с ее малигнизацией, в то же время показывая более слабое влияние CD126 на свойства CD138-негативных плазмоцитов. С использованием данных по экспрессии диагностических маркеров опухолевых клеток ММ, собранных дифференцировано для сосуществующих в пределах одного аспирата костного мозга клеток субпопуляций CD138+ и CD138-, мы проследили изменения, происходящие в клетках при утере CD138. Наиболее лабильный маркер – CD45 экспрессируется на мембране CD138- клеток более интенсивно, чем на CD138+ (р=0,02); уровни CD56 и СD19 на CD138преимущественно снижаются. Имеют место интересные взаимосвязи между наличием и изменением экспрессии CD126, и параметрами иммунофенотипа при сравнении клеток СD138+ с CD138- (таблицы 3.2.9 и 3.2.10): различия уровней CD19 между субпопуляциями ассоциированы с отсутствием CD126 на клетках СD138+ (р=0,004). Более того, различия уровня CD126 между клетками СD138+ и CD138- ассоциированы с различиями уровней CD19 (р=0,01), CD45 (p=0,1) и изменением иммунофенотипа в целом (не только ИФТ--+, р=0,026). Поскольку, согласно нашим данным, уровень экспрессии CD19 строго коррелирует с объемом популяции CD138- (р<0,001 для корреляции Пирсона в гейте СD138+; р<0,05 в гейте СD138-), можно предположить, что утере синдекана-1 предшествует обеднение мембраны клеток СD138+ рецептором IL-6. Образующаяся популяция клеток не чувствительна к проявлению экспрессии CD126 и имеет более 119 агрессивный характер роста и выживания, в том числе, по данным литературы, в отношении химиотерапевтических препаратов. Подобные закономерности мы выявили при тщательном анализе иммунофенотипов иммортализованных клеточных линий ММ (таблица 3.1.2): популяция CD138-, возникающая, как правило, при длительном культивировании клеток линий RPMI8226 и IM9, характеризуется усилением экспрессии CD45, снижением уровня CD19 и значимым обеднением мембраны CD126. Плазмобластоидная линия IM9, характеризующаяся отсутствием маркера CD38 и фенотипом CD38-/CD138+/CD126-, при старении формирует значительную (80% клеток) популяцию CD38-/CD138-/CD126-, а также популяцию (20% клеток) CD38+/CD138+/CD126+. Данные наблюдения создают платформу для экспериментального изучения свойств CD138-негативных популяций клеток ММ. Рассмотренные выше закономерности сформулированы на основе клинических наблюдений, представляющих собой морфологически типичную ММ, однако в случаях с атипичной морфологией неопластических клеток мы выявили особенное поведение рецептора IL-6. Плазмобластные клетки с лимфоидной морфологией, представленные в виде двух популяций с плазмоклеточным ИФТ (таблица 3.2.11, пациент Мох.), в гейте CD138+ демонстрировали CD126+ на 73,3% клеток. Подобный фенотип мы наблюдали при культивировании клеток лимфобластоидной линии IM9 (раздел 3.1.6). В другом морфологически атипичном случае (таблица 3.2.11, пациент Зар.) при плазмоклеточной морфологии опухолевых клеток с присутствием двуядерных неопластических элементов соблюдались общие иммунофенотипические закономерности, однако количество CD138+/CD126+ клеток достигало 67%. Закономерности и механизмы, определяющие дивергентную экспрессию рецептора IL-6 в редких клинических случаях, необходимо рассмотреть в отдельном исследовании. 120 4.3. Заключение Множественная миелома – заболевание, характеризующееся пролиферацией злокачественного клона плазматических клеток в костном мозге. Медиана общей выживаемости при ММ составляет 3-4 года, при этом течение заболевания на всех стадиях находится во взаимосвязи различных трансформирующих факторов, в том числе, микроокружения опухолевых клеток в костном мозге и химиотерапевтического воздействия. Несмотря на большое число цитокинов и мембранных молекул, влияющих на пролиферацию, выживание и миграцию опухолевых плазматических клеток, показано, что при ММ первостепенную роль в опухолевом процессе играет воздействие IL-6. В то же время, имеющиеся сведения о рецепторных компонентах сигнального комплекса IL-6 не позволяют точно описать закономерности и взаимосвязи его воздействия на основные этапы роста опухоли. Результирующая иммуноморфологическая картина ММ оказывается гетерогенной не только при описании общих характеристик заболевания, но также и в пределах одного организма. Так, в одном аспирате костного мозга могут присутствовать клетки с различными уровнями экспрессии рецептора IL-6 - CD126, что оставляет дискуссионной тему об аутокринной или же паракринной регуляции интерлейкином-6 процессов в опухолевых клетках. В настоящей работе, с целью описания значения молекул рецептора IL-6 на опухолевых плазматических клетках, на экспериментальных клеточных линиях и на клиническом материале больных ММ проведено исследование уровня и характера экспрессии трансдуцерной и лигандсвязывающей цепей рецептора IL-6 gp130 и IL-6Rα, изучены механизм активации рецептора и регуляция его экспрессии лигандом - интерлейкином-6, а также описаны взаимосвязи экспрессии рецептора с клиническими характеристиками опухоли. Экспериментальные исследования, проведенные нами как на IL-6зависимых, так и IL-6-независимых клеточных линиях ММ, выявили возможность иммунологического цитофлуориметрического разграничения эффектов, 121 связанных с активацией рецептора: при использовании различных МКА к внеклеточным доменам gp130 и IL-6Rα можно легко визуализировать связывание лиганда с определенными цепями рецептора, а также взаимодействие рецепторных субъединиц между собой. Основу такой методологии составили: а) варьирование условий связывания МКА с рецептором; б) разделение МКА на группы в зависимости от функциональной роли их специфических эпитопов. Описание отдельных активационных состояний рецептора, возникающих при связывании IL-6 и при димеризации gp130 и IL-6Rα (гомодимеризация gp130/gp130, гетеродимеризация gp130/IL-6Rα), имеет высокую практическую значимость для разработки терапевтических МКА и при экспериментальных исследованиях сигнального пути IL-6. Другим результатом данной части работы явилась возможность цитофлуориметрической детекции интернализации и ресинтеза (экспрессии) молекул рецептора IL-6 отдельно от его активационных состояний. Нами описан и экспериментально воспроизведен на различных типах клеток ММ эффект обратной регуляции экспрессии цепей рецептора IL-6Rα и gp130 интерлейкином-6. Данный эффект заключается в усилении экспрессии обеих молекул в условиях отсутствия цитокина, и, наоборот, обеднения мембраны этими молекулами в присутствии цитокина. Более того, нам впервые удалось смоделировать процесс усиления экспрессии CD126 на диагностическом материале свежеполученных от больных ММ аспиратов костного мозга, сохранив при этом стерильность и интактность препарата в отношении клеточного состава и ростовых факторов. Таким образом, мы показали отсутствие модуляторов регуляции уровня CD126 в, по крайней мере, одном из возможных механизмов ответа на IL-6. Данный механизм проясняет способ функционирования слабо экспрессированного CD126 как рецептора фактора роста клеток ММ. Настоящая работа содержит также обширную часть, посвященную изучению уровня, характера и закономерностей экспрессии CD126 на опухолевых клетках больных ММ. Уровень экспрессии CD126 на опухолевых клетках является преимущественно очень низким, в выражении доли позитивных клеток 122 составляет единицы процентов, поэтому он был охарактеризован тремя независимыми методами, в том числе с помощью сравнения распределений сигнал-шум по Колмогорову-Смирнову. Статистическая погрешность измерения не превысила 2% от сигнала в единицах флуоресценции. Важнейшими факторами взаимосвязи CD126 с клиническими параметрами ММ, по результатам корреляционного анализа, можно считать наличие морфологически незрелых плазматических клеток - проплазмоцитов, а также их долю от всех опухолевых клеток в костном мозге. Мы показали, что в присутствии проплазмоцитов происходит усиление экспрессии CD126 на всех опухолевых клетках при ММ. Вторым по значимости фактором, связанным с CD126, представляется уровень плазмоцитоза, который также коррелирует с уровнем проплазмоцитов. Яркая экспрессия CD126 взаимосвязана только с высоким уровнем плазмоцитов. Наличие экспрессии CD126 на мембране сопутствует проявлению аберрантных иммунологических характеристик клетками CD38+: увеличению доли клеток с CD45-, CD19-, CD56+. В то же время отсутствует линейная зависимость уровней экспрессии CD126 и аберрантных маркеров. Интересно, что инфицированность вирусом герпеса человека 8 типа (HHV-8), имеющим в геноме вирусный аналог IL-6, также находит отражение в высоко достоверной прямой взаимосвязи с уровнем экспрессии CD126 и с количеством проплазмоцитов. Мы предполагаем наличие экспрессии CD126 преимущественно на мембране проплазмоцитов, что требует подтверждения в дальнейших исследованиях. В настоящей работе в контексте ключевой роли IL-6 и модулируемой им экспрессии CD126 мы предприняли попытку вскрыть значение выявляемого в большинстве клинических наблюдений сосуществования двух субпопуляций опухолевых плазматических клеток - с наличием и отсутствием экспрессии синдекана-1 (CD138) на мембране. Изучение этих субпопуляций является одним из наиболее актуальных вопросов при рассмотрении ММ в последние годы. Различными исследовательскими группами убедительно показано, то CD138негативные (CD138-) клетки устойчивы к химиотерапии, обладают умеренным опухоль-инициирующим потенциалом, связаны с метастатической активностью, 123 возникновением рецидивов и плохим прогнозом. Следует отметить, что данная, преимущественно минорная, популяция клеток опухолевого клона до последнего времени оставалась не учтенной при использовании стандартной процедуры выявления плазматических клеток в цитофлуориметрических исследованиях, поскольку синдекан-1 рассматривался как специфический плазмоклеточный маркер. Вместе с тем, в настоящей работе мы показали статистически достоверное различие экспрессии CD126 на клетках популяций CD138+ и CD138-; клетки CD138- экспрессируют CD126 в меньшей степени (как в отношении частоты экспрессии, р=0,001, так и по уровню экспрессии, р=0,003). Более того, по данным ассоциировано непараметрического на клетках анализа, CD138+, но наличие не CD126 CD138-, с на мембране проявлением иммуноморфологических характеристик опухолевого субстрата: высоких уровней плазмоцитоза, проплазмоцитов, высокой экспрессии CD138, CD56, низкой экспрессии CD45 и наличием аберрантного иммунофенотипа CD45-/CD19-/CD56+. Таким образом, выявлено существенное различие значения CD126 между клетками CD138+ и CD138-. В то же время, уровень экспрессии, в отличие от факта наличия CD126 на мембране, в меньшей степени (р<0,1) ассоциирован с аберрантными параметрами опухолевых клеток. На основании существенного различия между ролью наличия рецептора на мембране и изменением уровня его экспрессии мы предполагаем существование модулирующего воздействия CD126 на аберрантные иммунологические параметры опухолевой клетки. Следует отметить, что эффект обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии CD126 проявляется на обоих типах клеток, CD138+ и CD138-. Кроме того, мы выявили ряд закономерностей, сопровождающих утерю опухолевыми клетками синдекана-1. Уровень и наличие CD126 не связаны с объемом CD138-негативной популяции клеток, который, по нашим данным, строго зависит лишь от уровня плазмоцитоза (р=0,017) и наличия проплазмоцитов (р=0,01) в опухолевом клоне. Изменения уровня CD126 при утере синдекана-1 сопровождаются изменением различных параметров иммунофенотипа (р<0,03). Неожиданным параметром, ассоциированным с отсутствием экспрессии CD126, 124 оказалось изменение уровня CD19 (р<0,001) при утере клетками синдекана-1, при этом CD19 в наименьшей степени ассоциирован с экспрессией CD126 как на CD138+, так и на CD138- клетках. Эти данные являются основанием для подтверждения возможной прямой регуляции между CD126 и CD19 в клетках CD138- методами 4-цветной проточной цитометрии и выявления мРНК CD19 и CD126 c помощью ПЦР. Интересным наблюдением можно считать ингибирование возникновения CD138-негативной популяции клеток в условиях депривации IL-6. Так, несмотря на то, что в литературе описано высвобождение CD138 из мембраны клеток и накопление CD138- популяции во время хранения аспиратов костного мозга, при инкубации аспиратов костного мозга с анти-IL-6 МКА B-E8 мы отметили существенное уменьшение количества CD138- клеток, а также отсутствие возникновения данной популяции после 24 ч инкубации в случае ее изначального отсутствия в пробе. Описанные факты могут свидетельствовать о позитивной регуляторной роли IL-6 при возникновении CD138- популяции клеток и обратной регуляции этого процесса рецептором IL-6. Дальнейшая работа по сбору и анализу данных о регуляции CD126 и CD138 с помощью анти-IL-6 МКА, возможно, позволит подтвердить это предположение, из которого следует, что терапевтическое применение анти-CD126 МКА при ММ не показано: оно может спровоцировать накопление CD138- клеток – агрессивных в отношении метастазирования и резистентных к химиотерапевтическим препаратам, в то время как применение анти-IL-6 (например, силтуксимаба, [Rossi, 2012]) существенно снизит как пролиферацию CD138+, так и образование CD138- клеток. В ходе работы мы также собрали и проанализировали данные, характеризующие опухолевые популяции CD138+ и CD138- во взаимосвязи с различными клинико-морфологическими параметрами ММ. Эти данные нуждаются в сопоставлении в дальнейшей работе с результатами, полученными для CD126, что, понимания несомненно, послужит платформой для более глубокого биологии опухолевых клеток при ММ. Характеристики соответствующих гейтов для клеток иммортализованных линий ММ, согласно 125 нашим предварительным данным, также отражают выявленные клинические закономерности и могут быть изучены в экспериментальной работе. Комплексная оценка экспрессии CD138, CD126, а также маркеров аберрантного иммунофенотипа (CD45, CD19, CD56) позволяет обозначить иммунологические параметры больных ММ с различным прогнозом и предложить для дальнейшего изучения прогностическую модель, основанную на оценке приведенных выше трех параметров. Данные по оценке слабой экспрессии CD126, полученные в настоящей работе, интересны в методологическом контексте: мы показали сходимость результатов трех расчетных методов анализа цитофлуориметрических данных. Параллельное использование всех трех численных значений, характеризующих уровень слабой экспрессии рецептора, расширило возможности оценки взаимосвязей CD126 c аберрантными параметрами и может быть предложено в качестве метода исследования слабо экспрессируемых на мембране молекул. Отдельного рассмотрения требуют морфологически атипичные варианты ММ: наши данные указывают на существование особых типов экспрессии CD126 при плазмобластной ММ (предположительно CD38+/CD138+/CD126+), а также в случаях с явным усилением пролиферативного индекса клеток (CD38+/CD138+/CD126++). Основную научно-практическую значимость настоящей работы составляют 4 аспекта: методологический (оценка слабой экспрессии рецептора на мембране, а также разграничение активационных состояний рецептора и его ресинтеза); структурно-функциональный (описание процессов, происходящих на внеклеточных доменах рецептора, на уровне эпитопов МКА); фундаментальный (выявление механизма селективной обратной регуляции CD126 интерлейкином6); клинический (обоснованность дифференцированного рассмотрения CD138+ и CD138- субпопуляций опухолевых клеток ММ как новой клинической категории в контексте стратификации и выбора схемы лечения). 126 ВЫВОДЫ 1. Иммунологические методы определения специфических эпитопов цепей рецептора интерлейкина-6 IL-6Rα и gp130 позволяют дифференцировать активированные и неактивированные молекулы рецептора интерлейкина-6 на мембране плазматических клеток. 2. Компоненты рецепторного комплекса IL-6Rα и gp130 экспрессированы на клетках множественной миеломы в равной степени. IL-6-зависимые клетки слабо экспрессируют рецептор интерлейкина-6 (0-4000 молекул/клетку), в отличие от IL-6-независимых клеток (более 20000 молекул/клетку). 3. На линиях клеток продемонстрирован множественной селективный миеломы механизм экспериментально обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина-6. Этот механизм подтвержден на опухолевых плазматических клетках костного мозга больных множественной миеломой. 4. Установлено наличие двух субпопуляций плазмоцитов: CD138-позитивной и CD138-негативной на клеточных линиях множественной миеломы и у больных множественной миеломой. Эти субпопуляции сосуществуют у одного и того же больного. Экспрессия CD126 на клетках CD138+ и CD138- различается: клетки CD138- экспрессируют рецептор IL-6 в меньшей степени (как в отношении частоты экспрессии, р=0,001, так и по уровню экспрессии, р=0,003). 5. Отсутствие CD138 и снижение экспрессии CD126 на опухолевых клетках напрямую взаимосвязаны с аберрантным иммунофенотипом и, в частности, с экспрессией CD19. В условиях подавления активности интерлейкина-6 (депривации) CD138-негативная популяция ингибируется. Выраженность плазмоцитоза костного мозга и пропорции проплазмоцитов в миелограмме, в отличие от экспрессии аберрантных маркеров (CD45, CD19, CD56), напрямую коррелируют с уровнем CD126 на мембране опухолевых плазматических клеток. 6. Ген вирусного интерлейкина-6 HHV-8 обнаружен в клетках костного мозга 57% больных множественной миеломой. Установлен факт усиления экспрессии рецептора интерлейкина-6 в HHV-8-позитивных наблюдениях. 127 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИФТ – иммунофенотип МГНГ – моноклональная гаммапатия неясного генеза МКА – моноклональное антитело ММ – множественная миелома ПКЛ – плазмоклеточный лейкоз ПЦР – полимеразная цепная реакция BSA – бычий сывороточный альбумин D(K-S) – непараметрический коэффициент Колмогорова-Смирнова FITC – изотиоцианат флуоресцеина gp130 – (CD130) - β-цепь, трансдуцерная субъединица рецептора IL-6 gp80 - (CD126, IL-6Rα) – α-цепь рецептора IL-6, лиганд-связывающая субъединица рецептора интерлейкина-6 HHV-8 – вирус герпеса человека 8 типа IFNα – интерферон альфа IGF-1β – инсулиноподобный фактор роста-1β IGF-1R – рецептор инсулиноподобного фактора роста-1β IL-6 – интерлейкин-6 LIF – лейкозингибирующий фактор, цитокин семейства gp130. MFI – среднее значение флуоресценции (англ. mean fluorescence intensity) MFR – соотношение средних значений флуоресценции PBS – фосфатно-солевой буферный раствор PC – плазмоциты proPC – проплазмоциты PE – фикоэритрин STAT-3 – сигнальный белок и активатор транскрипции-3 TNFα – фактор некроза опухоли альфа vIL-6 – вирусный аналог человеческого интерлейкина-6 128 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Демина, Е.А. Альфа-интерферон в современном лечении миеломной болезни / Е.А. Демина, О.М. Вотякова // Гематология и трансфузиология. - 1996. - № 2. - С. 32-36. 2. Ларионова, В.Б. Роль рецептора цитокинов gp130 в росте и дифференцировке нормальных и опухолевых гемопоэтических клеток. II. Моноклональные антитела к интерлейкину-6 в лечении множественной миеломы. Данные литературы и описание случая / В.Б. Ларионова, В.В. Птушкин, Е.А. Демина, О.М. Вотякова, Д.Ш. Османов, А.И. Павловская, Н.Н. Тупицын, Н.В. Жуков, Н.В. Любимова, Л.Ю. Андреева, А.А. Молодык, Л.М. Родионова, О.Г. Зимина, И.А. Полторакин, Е.Г. Турнянская // Гематология и трансфузиология. - 2001. - Т. 46. - №5. - С. 3-8. 3. Тупицын, Н.Н. Роль рецептора цитокинов gp130 в гемопоэзе / Н.Н. Тупицын // Современная онкология. - 2001. - Т. 3. - С. 29-31. 4. Тупицын, Н.Н. Фундаментальные вопросы регуляции опухолевого роста через ИЛ-6 рецепторный комплекс / Н.Н. Тупицын // IV Ежегодная Российская конференция ESMO. - 2000. - С. 19-20. 5. Тупицын, Н.Н. Активация рецепторного комплекса интерлейкина-6 при Bклеточных неходжкинских лимфомах человека / Н.Н. Тупицын, Е.Н. Шолохова, Л.Ю. Андреева, Д.Ш. Османов, Н.А. Пробатова, З.Г. Кадагидзе, П.А. Зейналова // Вестник ОНЦ РАМН. - 1999. - Т. 2. - С. 11-18. 6. Широков, Д.А. Экспрессия интерлейкина-6 человека и его вирусного гомолога при неходжкинских лимфомах и множественной миеломе: Дис. канд. биол. наук: 14.00.14 / Широков Дмитрий Алексеевич. - ГУ РОНЦ РАМН. – М., 2006. – 121 с. 7. Abroun, S. Receptor synergy of interleukin-6 (IL-6) and insulin-like growth factorI in myeloma cells that highly express IL-6 receptor alpha / S. Abroun, H. Ishikawa, N. Tsuyama, S. Liu, F.J. Li, K. Otsuyama, X. Zheng // Blood. - 2004. V. 103. - P. 2291-2298. 129 8. Alexandrakis, M.G. Relationship between circulating serum soluble interleukin-6 receptor and the angiogenic cytokines basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in multiple myeloma / M.G. Alexandrakis, F.H. Passam, A. Boula, A. Christophoridou, G. Aloizos, P. Roussou, D.S. Kyriakou // Ann. Hematol. - 2003. - V. 82. - P. 19-23. 9. Althoff, K. Shedding of interleukin-6 receptor and tumor necrosis factor alpha. Contribution of the stalk sequence to the cleavage pattern of transmembrane proteins / K. Althoff, P. Reddy, N. Voltz, S. Rose-John, J. Müllberg // Eur. J. Biochem. – 2000. - V. 267. - P. 2624-2631. 10. Ancey, C. A fusion protein of the gp130 and interleukin-6Ralpha ligand-binding domains acts as a potent interleukin-6 inhibitor / C. Ancey, A. Küster, S. Haan, A. Herrmann, P.C. Heinrich, G. Müller-Newen // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 16968-16972. 11. Andratsch, M. A key role for gp130 expressed on peripheral sensory nerves in pathological pain / M. Andratsch, N. Mair, C.E. Constantin, N. Scherbakov, C. Benetti, S. Rose-John, M. Kress et al. // J. Neurosci. – 2009. - V. 29. - P. 1347313483. 12. Aref, S. Syndecan-1 in multiple myeloma: relationship to conventional prognostic factors / S. Aref, T. Goda, M. El-Sherbiny // Hematology. - 2003. - V. 8. - P. 221228. 13. Autissier, P. Activation of the gp130 signaling pathway by monoclonal antibodies directed against the gp130 molecule / P. Autissier, J. Liautard, J. Brochier, J.P. Gaillard // Eur. J. Immunol. - 1997. - V. 27. - P. 794-797. 14. Autissier, P. Activation of the gp130 signalling pathway by monoclonal antibodies directed against the gp130 molecule / P. Autissier, J. Liautard, R-X. Sun, N. Cotte, B. Klein, J. Brochier, and J.P. Gaillard // Leucocyte Typing VI. - Garlang Publishing, Inc., London, 1997. - P. 845-847. 15. Barillé, S. The role of interleukin-6 and interleukin-6/interleukin-6 receptor-alpha complex in the pathogenesis of multiple myeloma / S. Barillé, R. Bataille, M. Amiot // Eur. Cytokine Netw. - 2000. - V. 11. - P. 546-551. 130 16. Barillé, S. CD130 rather than CD126 expression is associated with disease activity in multiple myeloma / S. Barillé, W. Thabard, N. Robillard, P. Moreau, D. Pineau, J.L. Harousseau, R. Bataille, M. Amiot // Br. J. Haematol. - 1999. - V. 106. - P. 532-535. 17. Bataille, R. The phenotype of normal, reactive and malignant plasma cells. Identification of "many and multiple myelomas" and of new targets for myeloma therapy / R. Bataille, G. Jégo, N. Robillard, S. Barillé-Nion, J.L. Harousseau, P. Moreau, M. Amiot, C. Pellat-Deceunynck // Haematologica. - 2006. - V. 91. - P. 1234-1240. 18. Bazan, J.F. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily / J.F. Bazan // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1990. - V. 87. - P. 69346938. 19. Boulanger, M.J. Convergent mechanisms for recognition of divergent cytokines by the shared signaling receptor gp130 / M.J. Boulanger, A.J. Bankovich, T. Kortemme, D. Baker, and K.C. Garcia // Mol. Cell. - 2003. - V. 12. - P. 577-589. 20. Bravo, J. Receptor recognition by gp130 cytokines / J. Bravo, and J.K. Heath // EMBO J. - 2000. - V. 19. - P. 2399-2411. 21. Bravo, J. Crystal structure of a cytokine-binding region of gp130 / J. Bravo, D. Staunton, J.K. Heath, and E.Y. Jones // EMBO J. - 1998. - V. 17. - P. 1665-1674. 22. Chevalier, S. Interleukin-6 family of cytokines induced activation of different functional sites expressed by gp130 transducing protein / S. Chevalier, M. Fourcin, O. Robledo, J. Wijdenes, A. Pouplard-Barthelaix, and H. Gascan // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 14764-14772. 23. Chiron, D. The peripheral CD138+ population but not the CD138- population contains myeloma clonogenic cells in plasma cell leukaemia patients / D. Chiron, S. Surget, S. Maïga, R. Bataille, P. Moreau, S. Le Gouill, M. Amiot, Pellat- C. Deceunynck // Br. J. Haematol. - 2012. - V. 156. - P. 679-683. 24. Cho, Y.U. Immunophenotypic characterization and quantification of neoplastic bone marrow plasma cells by multiparametric flow cytometry and its clinical significance in Korean myeloma patients / Y.U. Cho, C.J. Park, S.J. Park, H.S. Chi, 131 S. Jang, S.H. Park, E.J. Seo et al. // J. Korean Med. Sci. – 2013 – V. 28. - P. 542549. 25. Chow, D. Structure of an extracellular gp130 cytokine receptor signaling complex / D. Chow, X. He, A.L. Snow, S. Rose-John, and K.C. Garcia // Science. - 2001. - V. 291. - P. 2150-2155. 26. Chow, D.C. A structural template for gp130-cytokine signaling assemblies / D.C. Chow, L. Brevnova, X.L. He, M.M. Martick, A. Bankovich, and K.C. Garcia // Biochim. Biophys. Acta. - 2002. - V. 1592. - P. 225-235. 27. Christensen, J.H. Characterization of potential CD138 negative myeloma "stem cells" / J.H. Christensen, P.V. Jensen, I.B. Kristensen, N. Abildgaard, M. Lodahl, T. Rasmussen // Haematologica. - 2012. - V. 97. - P. e18-e20. 28. Clement, C. Different epitopes on gp130 related to different biological activities as defined by monoclonal antibodies / C. Clement, J. Wijdenes // Leucocyte Typing VI Garlang Publishing Inc., London. - 1997. - P. 847-850. 29. Cocco, M. In vitro generation of long-lived human plasma cells / M. Cocco, S. Stephenson, M.A. Care, D. Newton, N.A. Barnes, A. Davison, A. Rawstron et al. // J. Immunol. - 2012. - V. 1892. - P. 5773-5785. 30. Cosman, D. The hematopoietin receptor superfamily / D. Cosman // Cytokine. 1993. - V. 5. - P. 95–106. 31. Descamps, G. CD45neg but not CD45pos human myeloma cells are sensitive to the inhibition of IGF-1 signaling by a murine anti-IGF-1R monoclonal antibody, mAVE1642 / G. Descamps, S. Wuillème-Toumi, V. Trichet, C. Venot, L. Debussche, T. Hercend, M. Collette // J. Immunol. - 2006. - V. 177. - P. 42184223. 32. Dhodapkar, M.V. Syndecan-1 (CD 138) in myeloma and lymphoid malignancies: a multifunctional regulator of cell behavior within the tumor microenvironment / M.V. Dhodapkar, R.D. Sanderson // Leuk. Lymphoma. - 1999. - V. 34. - P. 35-43. 33. Diamant, M. Cloning and expression of an alternatively spliced mRNA encoding a soluble form of the human interleukin-6 signal transducer gp130 / M. Diamant, K. 132 Rieneck, N. Mechti, X.G. Zhang, M. Svenson, K. Bendtzen, and B. Klein // FEBS Lett. - 1997. - V. 412. - P. 379-384. 34. Fasnacht, N. Conditional gp130 deficient mouse mutants / N. Fasnacht, W. Müller // Semin. Cell. Dev. Biol. - 2008. - V. 19. - P. 379-384. 35. Fisher, R.A. Statistical Tables for Biological, Agricultural and Medical Research, 6th ed. / R.A. Fisher, Y. Frank. - Longman Group, Ltd., London, 1995. - Table VII. 36. French, J.D. Transactivation of gp130 in myeloma cells / J.D. French, D.K. Walters, D.F. Jelinek // J. Immunol. - 2003. - V. 170. - P. 3717-3723. 37. Fuhler, G.M. Bone marrow stromal cell interaction reduces syndecan-1 expression and induces kinomic changes in myeloma cells / G.M. Fuhler, M. Baanstra, D. Chesik, R. Somasundaram, A. Seckinger, D. Hose, M.P. Peppelenbosch et al. // Exp. Cell. Res. - 2010 - V. 316. - P. 1816-1828. 38. Fujii, R. MPC-1-CD49e- immature myeloma cells include CD45+ subpopulations that can proliferate in response to IL-6 in human myelomas / R. Fujii, H. Ishikawa, M.S. Mahmoud, H. Asaoku, M.M. Kawano // Br. J. Haematol. - 1999. - V. 105. P. 131-140. 39. Gaillard J.P. mAb against human gp80 IL-6 receptor / J.-P. Gaillard, J. Liautard, C. Duperray and J. Brochier // Leucocyte Typing V, Boston. – 1993. - P. 1891-1894. 40. Gaillard, J.P. Interleukin-6 receptor signaling. I. gp80 and gp130 receptor interaction in the absence of interleukin-6 / J.P. Gaillard, J.C. Mani, J. Liautard, B. Klein, and J. Brochier // Eur. Cytokine Netw. – 1999. - V. 10. - P. 43-48. 41. Gaillard, J.P. Increased and highly stable levels of functional soluble interleukin-6 receptor in sera of patients with monoclonal gammopathy / J.P. Gaillard, R. Bataille, H. Brailly, C. Zuber, K. Yasukawa, M. Attal, N. Maruo et al. // Eur. J. Immunol. - 1993. - V. 23. - P. 820-824. 42. Gaillard, J.P. Major role of the soluble interleukin-6/interleukin-6 receptor complex for the proliferation of interleukin-6-dependent human myeloma cell lines / J.P. Gaillard, J. Liautard, B. Klein, J. Brochier // Eur. J. Immunol. - 1997. - V. 27. - P. 3332-3340. 133 43. Gaillard, J.P. mAb against human gp80 IL-6 receptor / J.-P. Gaillard, J. Liautard, C. Duperray, J. Brochier; in S.E. Schlossman et al. (Eds) // Leucocyte Typing V, Boston. – 1995. - P. 1891-1894. 44. Greipp, P.R. Plasmablastic morphology -an independent prognostic factor with clinical and laboratory correlates: Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) myeloma trial E9486 report by the ECOG Myeloma Laboratory Group / P.R. Greipp, T. Leong, J.M. Bennett et al. // Blood. - 1998. - V.91. - P. 2501-2507. 45. Grigoriadis, G. CD138 shedding in plasma cell myeloma / G. Grigoriadis, S. Whitehead // Br. J. Haematol. - 2010. - V. 150. - P. 249. 46. Grötzinger, J. Molecular mechanisms of cytokine receptor activation / J. Grötzinger // Biochim. Biophys. Acta. - 2002. - V. 1592. - P. 215-223. 47. Hammacher, A. The immunoglobulin-like module of gp130 is required for signaling by interleukin-6, but not by leukemia inhibitory factor / A. Hammacher, R.T. Richardson, L.J. Angus, D.J. Hilton, N.A. Nicola, J. Wijdenes et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273. - P. 22701-22707. 48. Harada, H. Phenotypic difference of normal plasma cells from mature myeloma cells / H. Harada, M.M. Kawano, N. Huang, Y. Harada, K. Iwato, O. Tanabe, H. Tanaka et al. // Blood. - 1993. - V. 15. - P. 2658-2663. 49. Hardin, J. Interleukin-6 prevents dexamethasone-induced myeloma cell death / J. Hardin, S. MacLeod, I. Grigorieva, R. Chang, B. Barlogie, H. Xiao, J. Epstein // Blood. - 1994. - V. 84. - P. 3063-3070. 50. Harousseau, J.L. Multiple myeloma / J.L. Harousseau, J.Jr. Shaughnessy, P. Richardson // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. - 2004. - P. 237256. 51. Harrison, P. Inhibition of the acute-phase response in vivo by anti-gp130 monoclonal antibodies / P. Harrison, T. Downs, P. Friese, R. Wolf, J.N. George, and S.A. Burstein // Br. J. Haematol. - 1996. - V. 95. - P. 443-451. 52. Hata, H. Interleukin-6 gene expression in multiple myeloma: a characteristic of immature tumor cells / H. Hata, H. Xiao, M.T. Petrucci, J. Woodliff, R. Chang, J. Epstein // Blood. – 1993. – V. 81. – P. 3357-3364. 134 53. Heinrich, P.C. Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway / P.C. Heinrich, I. Behrmann, G. Müller-Newen, F. Schaper, and L. Graeve // Biochem. J. - 1998. - V. 334. - P. 297-314. 54. Heinrich, P.C. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation / P.C. Heinrich, I. Behrmann, S. Haan, H.M. Hermanns, G. MüllerNewen, F. Schaper // Biochem. J. - 2003. - V. 15. - P. 1-20. 55. Hibi, M. Molecular cloning and expression of an IL-6 signal transducer, gp130 / M. Hibi, M. Murakami, M. Saito, T. Hirano, T. Taga, and T. Kishimoto // Cell. 1990. - V. 63. - P. 1149-1157. 56. Hideshima, T. Characterization of signaling cascades triggered by human interleukin-6 versus Kaposi's sarcoma-associated herpes virus-encoded viral interleukin 6 / T. Hideshima, D. Chauhan, G. Teoh, N. Raje, S.P. Treon, Y.T. Tai, Y. Shima et al. // Clin. Cancer. Res. - 2000. - V. 6. - P. 1180-1189. 57. Hirano, T. Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily / T. Hirano, T. Matsuda, and K. Nakajima // Stem Cells. - 1994. - V. 12. - P. 262-277. 58. Hirano, T. Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin / T. Hirano, K. Yasukawa, H. Harada, T. Taga, Y. Watanabe, T. Matsuda, S. Kashiwamura et al. // Nature. – 1986. – V. 324. - P. 73-76. 59. Hosen, N. Multiple myeloma-initiating cells / N. Hosen // Int. J. Hematol. – 2013. – V. 97. - P. 306-312. 60. Hosen, N. CD138-negative clonogenic cells are plasma cells but not B cells in some multiple myeloma patients / N. Hosen, Y. Matsuoka, S. Kishida, J. Nakata, Y. Mizutani, K. Hasegawa, A. Mugitani // Leukemia. - 2012. - V. 26. - P. 21352141. 61. Ishihara, K. Molecular basis of the cell specificity of cytokine action / K. Ishihara, T. Hirano // Biochim. Biophys. Acta. - 2002. - V. 1592. - P. 281-296. 62. Ishikawa, H. Requirements of src family kinase activity associated with CD45 for myeloma cell proliferation by interleukin-6 / H. Ishikawa, N. Tsuyama, S. Abroun, 135 S. Liu, F.J. Li, O. Taniguchi, M.M. Kawano // Blood. - 2002. - V. 15. - P. 21722178. 63. Ishikawa, H. Interleukin-6-induced proliferation of human myeloma cells associated with CD45 molecules / H. Ishikawa, N. Tsuyama, M.M. Kawano // Int. J. Hematol. - 2003. - V. 78. - P. 95-105. 64. Jacak, J. Expression analysis of multiple myeloma CD138 negative progenitor cells using single molecule microarray readout / J. Jacak, H. Schnidar, L. Muresan, G. Regl, A. Frischauf, F. Aberger, G.J. Schütz, J. Hesse // J. Biotechnol. - 2013 – V. 164. - P. 525-530. 65. Jakubikova, J. Lenalidomide targets clonogenic side population in multiple myeloma: pathophysiologic and clinical implications / J. Jakubikova, S. Adamia, M. Kost-Alimova, S. Klippel, D. Cervi, J.F. Daley, D. Cholujova et al. // Blood. 2011. - V. 1177. - P. 4409-4419. 66. Jego, G. Interleukin-6 is a growth factor for nonmalignant human plasmablasts / G. Jego, R. Bataille, C. Pellat-Deceunynck // Blood. - 2001. - V. 15. - P. 1817-1822. 67. Jones, S.A. Therapeutic strategies for the clinical blockade of IL-6/gp130 signaling / S.A. Jones, J. Scheller, S. Rose-John // J. Clin. Invest. - 2011. - V. 121. - P. 33753383. 68. Jourdan, M. Tumor necrosis factor is a survival and proliferation factor for human myeloma cells / M. Jourdan, K. Tarte, E. Legouffe, J. Brochier, J.F. Rossi, B. Klein // Eur. Cytokine Netw. - 1999. - V. 10. - P. 65-70. 69. Jourdan, M. The myeloma cell antigen syndecan-1 is lost by apoptotic myeloma cells / M. Jourdan, M. Ferlin, E. Legouffe, M. Horvathova, J. Liautard, J.F. Rossi, J. Wijdenes et al. // Br. J. Haematol. - 1998. - V. 100. - P. 637-646. 70. Jung, I.D.Oncostatin M induces dendritic cell maturation and Th1 polarization / I.D. Jung, K.T. Noh, C.M. Lee, S.H. Chun, S.K. Jeong, C.H. Yun, Y.K. Shin et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - V. 394. - P. 272-278. 71. Kallen, K.J. The role of transsignalling via the agonistic soluble IL-6 receptor in human diseases / K.J. Kallen // Biochim. Biophys. Acta. - 2002. - V. 11. - P. 323343. 136 72. Kara, I.O. Flow cytometric evaluation of bone marrow plasma cells using CD19, CD45, CD56, CD38, and CD138 and correlation with bone marrow infiltration ratio in multiple myeloma patients / I.O.Kara, B. Sahin, S. Paydas, S. Cetiner // Saudi Med. J. - 2004. - V. 25. - P. 1587-1592. 73. Karadag, A. Human myeloma cells promote the recruitment of osteoblast precursors: mediation by interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor / A. Karadag, A.M. Scutt, P.I. Croucher // J. Bone Miner. Res. - 2000. - V. 15. - P. 1935-1943. 74. Kato, A. IL-6R distribution in normal human and cynomolgus monkey tissues / A. Kato, T. Watanabe, M. Yamazaki, T. Deki, M. Suzuki // Regul. Toxicol. Pharmacol. - 2009. - V. 53. - P. 46-51. 75. Kawano, Y. Multiple myeloma cells expressing low levels of CD138 have an immature phenotype and reduced sensitivity to lenalidomide / Y. Kawano, S. Fujiwara, N. Wada, M. Izaki, H. Yuki, Y. Okuno, K. Iyama et al. // Int. J. Oncol. – 2012. - V.41. – P. 876-884. 76. Kawano, M. Autocrine generation and requirement of BSF-2/IL-6 for human multiple myelomas / M. Kawano, T. Hirano, T. Matsuda, T. Taga, Y. Horii, K. Iwato, H. Asaoku et al. // Nature. – 1988. – V. 332. – P. 83-85. 77. Klein, B. Production of growth factors by human myeloma cells / B. Klein, M. Jourdan, A. Vazquez, B. Dugas, R. Bataille // Cancer Res. - 1987. - V.47. - P. 4856-4860. 78. Klein, B. Interleukin-10 and Gp130 cytokines in human multiple myeloma / B. Klein, Z.Y. Lu, Z.J. Gu, V. Costes, M. Jourdan, J.F. Rossi // Leuk. Lymphoma. 1999. - V. 34. - P. 63-70. 79. Klein, B. Interleukin-6 is the central tumor growth factor in vitro and in vivo in multiple myeloma / B. Klein, X.G. Zhang, M. Jourdan, J.M. Boiron, M. Portier, Z.Y. Lu, J. Wijdenes et al. // Eur. Cytokine Netw. - 1990. V. 1. - P. 193-201. 80. Klein, B. Paracrine rather than autocrine regulation of myeloma-cell growth and differentiation by interleukin-6 / B. Klein, X.G. Zhang, M. Jourdan, J. Content, F. Houssiau, L. Aarden, M. Piechaczyk et al. // Blood. - 1989. - V. 73. - P. 517-526. 137 81. Klein, B. Update of gp130 cytokines in multiple myeloma / B. Klein // Curr. Opin. Hematol. - 1998. - V. 5. - P. 186-191. 82. Kovacs, E. How does interleukin-6 affect the membrane expressions of interleukin6 receptor and gp130 and the proliferation of the human myeloma cell line OPM-2 / E. Kovacs // Biomed. Pharmacother. - 2003. - V. 57. - P. 489-494. 83. Kovacs, E. Multiple myeloma and B cell lymphoma. Investigation of IL-6, IL-6 receptor antagonist (IL-6RA), and GP130 antagonist (GP130A) using various parameters in an in vitro model / E. Kovacs // ScientificWorldJournal. - 2006. V.6. - P. 888-898. 84. Kraj, M. Flow cytometric immunophenotypic characteristics of plasma cell leukemia / M. Kraj, J. Kopeć-Szlęzak, R. Pogłód, B. Kruk // Folia Histochem. Cytobiol. - 2011. - V. 49. - P. 168-182. 85. Kurth, I. Activation of the signal transducer glycoprotein 130 by both IL-6 and IL11 requires two distinct binding epitopes / I. Kurth, U. Horsten, S. Pflanz, H. Dahmen, A. Küster, J. Grötzinger, P.C. Heinrich, and G. Müller-Newen // J. Immunol. - 1999. - V. 162. - P. 1480-1487. 86. Lasfar, A. Differential regulation of interleukin-6 receptors by interleukin-6 and interferons in multiple myeloma cell lines / A. Lasfar, J. Wietzerbin, C. Billard // Eur. J. Immunol. - 1994. - V. 24. - P. 124-130. 87. Lavabre-Bertrand, T. Detection of membrane and soluble interleukin-6 receptor in lymphoid malignancies / T. Lavabre-Bertrand, C. Exbrayat, J. Liautard, J.P. Gaillard, P.P. Baskevitch, N. Poujol, C. Duperray et al. // Br. J. Haematol. - 1995. V. 91. - P. 871-877. 88. Lavelle, D. Histone deacetylase inhibitors increase p21(WAF1) and induce apoptosis of human myeloma cell lines independent of decreased IL-6 receptor expression / D. Lavelle, Y.H. Chen, M. Hankewych, J. DeSimone // Am. J. Hematol. - 2001. - V. 68. - P. 170-178. 89. Li, F.J. A rapid translocation of CD45RO but not CD45RA to lipid rafts in IL-6induced proliferation in myeloma / F.J. Li, N. Tsuyama, H. Ishikawa, M. Obata, S. 138 Abroun, S. Liu, Y. Maki, M.M. Kawano et al. // Blood. - 2005. - V. 105. - P. 32953302. 90. Li, H. Detection of direct binding of human herpesvirus 8-encoded interleukin-6 (vIL-6) to both gp130 and IL-6 receptor (IL-6R) and identification of amino acid residues of vIL-6 important for IL-6R-dependent and -independent signaling / H. Li, H. Wang, J. Nicholas // J. Virol. - 2001. - V. 75. - P. 3325-3334. 91. Liautard, J. Epitope analysis of human IL-6 receptor gp80 molecule with monoclonal antibodies / J. Liautard, J.P. Gaillard, J.C. Mani, C. Duperray, M. Jourdan, B. Klein, J. Brochier et al. // Eur. Cytokine Netw. - 1994. - V. 5. - P. 293300. 92. Liautard, J. Specific inhibition of IL-6 signalling with monoclonal antibodies against the gp130 receptor / J. Liautard, R.X. Sun, N. Cotte, J.P. Gaillard, J.C. Mani, B. Klein, and J. Brochier // Cytokine. - 1997. - V. 9. - P. 233-241. 93. Livnah, O. An antagonist peptide-EPO receptor complex suggests that receptor dimerization is not sufficient for activation / O. Livnah, D.L. Johnson, F.P. Barbone, Y. You, K.D. Liu, M.A. Goldsmith et al. // Nat. Struct. Biol. - 1998. - V. 5. - P. 993-1004. 94. Matsui, W. Characterization of clonogenic multiple myeloma cells / W. Matsui, C.A. Huff, Q. Wang, M.T. Malehorn, C.I. Civin, R.J. Jones et al. // Blood. - 2004. V. 103. - P. 2332-2336. 95. McKenna, R.W. Plasma cell neoplasms. In: WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues / R.W. McKenna, R.A. Kyle, W.M. Kuehl et al. In S.H. Swerdlow, E. Campo, N.L. Harris et al. (Eds). - Lyon: IARC Press, 2008. – P. 202-207. 96. Meyer, C. Interleukin-6 receptor specific RNA aptamers for cargo delivery into target cells / C. Meyer, K. Eydeler, E. Magbanua, J. Grötzinger, G. Mayer, S. Rose-John, U. Hahn // RNA Biol. - 2012. - V.9. - P. 67-80. 97. Mihara, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions / M. Mihara, M. Hashizume, H. Yoshida, M. Suzuki, M. Shiina // Clin. Sci. (Lond.). - 2012. - V. 122. - P. 143-159. 139 98. Mitani, Y. Cross talk of the interferon-alpha/beta signalling complex with gp130 for effective interleukin-6 signalling / Y. Mitani, A. Takaoka, S.H.Kim, Y. Kato, T. Yokochi, N. Tanaka, T. Taniguchi // Genes Cells. - 2001. - V. 6. - P. 631-640. 99. Müllberg, J. IL-6 receptor independent stimulation of human gp130 by viral IL-6 / J. Müllberg, T. Geib, S. Rose-John et al. // J. Immunol. - 2000. - V. 164. - P. 46724677. 100. Müllberg, J. Differential shedding of the two subunits of the interleukin-6 receptor / J. Müllberg, E. Dittrich, L. Graeve, T. Taga, T. Kishimoto, P.C. Heinrich, S. Rose-John et al. // FEBS Lett. - 1993. - V. 332. - P. 174-178. 101. Müller-Newen, G. Soluble IL-6 receptor potentiates the antagonistic activity of soluble gp130 on IL-6 responses / G. Müller-Newen, A. Küster, J. Wijdenes, P.C. Heinrich et al. // J. Immunol. - 1998. - V. 161. - P. 6347-6355. 102. Müller-Newen, G. Studies on the interleukin-6-type cytokine signal transducer gp130 reveal a novel mechanism of receptor activation by monoclonal antibodies / G. Müller-Newen, A. Küster, J. Wijdenes, F. Schaper, and P.C. Heinrich // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. - P. 4579-4586. 103. Mummery, R.S. Characterization of the heparin-binding properties of IL-6 / R.S. Mummery, C.C. Rider // J. Immunol. - 2000. - V. 1650. - P. 5671-5679. 104. Murakami, M. Critical cytoplasmic region of the interleukin 6 signal transducer gp130 is conserved in the cytokine receptor family / M. Murakami, M. Hibi, T. Taga, T. Kishimoto et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1991. - V. 88. - P. 11349-11353. 105. Naka, T. The paradigm of IL-6: from basic science to medicine / T. Naka, N. Nishimoto, T. Kishimoto //Arthritis Res. - 2002. - V. 4. - P. S233-S242. 106. Narazaki, M. Soluble forms of the interleukin-6 signal-transducing receptor component gp130 in human serum possessing a potential to inhibit signals through membrane-anchored gp130 / M. Narazaki, K. Yasukawa, T. Saito, G.D. Yancopoulos, T. Taga, T. Kishimoto et al. // Blood. - 1993. - V. 82. - P. 11201126. 140 107. Novick, D. Monoclonal antibodies to the soluble human IL-6 receptor: affinity purification, ELISA, and inhibition of ligand binding / D Novick., H. Engelmann, M. Revel, O. Leitner, M. Rubinstein // Hybridoma. - 1991. - V. 10. - P. 137-146. 108. Ocqueteau, M. Immunophenotypic characterization of plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance patients. Implications for the differential diagnosis between MGUS and multiple myeloma / M. Ocqueteau, A. Orfao, J. Almeida, J. Bladé, J.F. San Miguel et al. // Am. J. Pathol. - 1998. - V. 152. - P. 1655-1665. 109. Otsuki, T. Effects of all-trans retinoic acid (ATRA) on human myeloma cells / T. Otsuki, H. Sakaguchi, T. Hatayama, P. Wu, A. Takata, F. Hyodoh // Leuk. Lymphoma. - 2003. - V. 44. - P. 1651-1656. 110. Ozbek, S. The membrane proximal cytokine receptor domain of the human interleukin-6 receptor is sufficient for ligand binding but not for gp130 association / S. Ozbek, J. Grötzinger, B. Krebs, M. Fischer, J. Müllberg, S. Rose-John et al. // J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273. - P. 21374-21379. 111. Paiva, B. Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile / B. Paiva, T. Paino, J.M. Sayagues, M. Garayoa, L. San-Segundo, A. Orfao, J.F. San Miguel et al. // Blood. - 2013 – V. 1222. - P. 3591-3598. 112. Parikh, H.H. Evaluation of an alternative to the Kolmogorov-Smirnov test for flow cytometric histogram comparisons. / H.H. Parikh, W.C. Li, M. Ramanathan // J. Immunol. Methods. - 1999. - V. 229 – P. 97-105. 113. Perez-Andres, M. Soluble and membrane levels of molecules involved in the interaction between clonal plasma cells and the immunological microenvironment in multiple myeloma and their association with the characteristics of the disease / M. Perez-Andres, J. Almeida, M. Martin-Ayuso, N. De Las Heras, J. Galende, J.F. San Miguel, A. Orfao et al. // Int. J. Cancer. - 2009.- V. 124. - P. 367-375. 114. Pérez-Andrés, M. Clonal plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance, multiple myeloma and plasma cell leukemia show different expression profiles of molecules involved in the interaction with the 141 immunological bone marrow microenvironment / M. Pérez-Andrés, J. Almeida, J.F. San Miguel, A. Orfao et al. // Leukemia. - 2005. - V. 19. - P. 449-455. 115. Peters, M. Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor: direct stimulation of gp130 and hematopoiesis / M. Peters, A.M. Müller, and S. Rose-John // Blood. 1998. - V. 92. - P. 3495-3504. 116. Pflanz, S. Two different epitopes of the signal transducer gp130 sequentially cooperate on IL-6-induced receptor activation / S. Pflanz, I. Kurth, J. Grötzinger, P.C. Heinrich, and G. Müller-Newen // J. Immunol. - 2000. - V. 165. - P. 70427049. 117. Pignatti, P. High circulating levels of biologically inactive IL-6/SIL-6 receptor complexes in systemic juvenile idiopathic arthritis: evidence for serum factors interfering with the binding to gp130 / P. Pignatti, L. Ciapponi, P. Galle, M.B. Hansen, D. Novick et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - V. 131. - P. 355-363. 118. Poncelet, P. Cytofluorometric quantification of cell-surface antigens by indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies / P. Poncelet, P. Carayon // J. Immunol. Methods. - 1985. - V. 85. - P. 65-74. 119. Portier, M. Up-regulation of interleukin (IL)-6 receptor gene expression in vitro and in vivo in IL-6 deprived myeloma cells / M. Portier, D. Lees, E. Caron, M. Jourdan, J.M. Boiron, R. Bataille, B. Klein // FEBS Lett. - 1992. - V. 302. - P. 3538. 120. Qiu, Y. Requirement of ErbB2 for signalling by interleukin-6 in prostate carcinoma cells / Y. Qiu, L. Ravi, H.J. Kung // Nature. - 1998. - V. 393. - P. 83-85. 121. Qureshi, S.A. Mimicry of erythropoietin by a nonpeptide molecule / S.A. Qureshi, R.M. Kim, Z. Konteatis, D.E. Biazzo, H. Motamedi et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1999. - V. 96. - P. 12156-12161. 122. Rawstron, A.C. The interleukin-6 receptor alpha-chain (CD126) is expressed by neoplastic but not normal plasma cells / A.C. Rawstron, J.A. Fenton, J. Ashcroft, A. English, R.A. Jones, G. Morgan et al. // Blood. - 2000. - V. 96. - P. 3880-3886. 123. Rawstron, A.C. Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders / A.C. Rawstron, A. 142 Orfao, M. Beksac, L. Bezdickova, R.A. Brooimans, H. Bumbea, K. Dalva et al. // Haematologica. - 2008. - V. 93. - P. 431-438. 124. Reid, S. Characterisation and relevance of CD138-negative plasma cells in plasma cell myeloma / S. Reid, S. Yang, R. Brown, K. Kabani, D. Joshua et al. // Int. J. Lab. Hematol. – 2010. - V. 32. – P. e190-e196. 125. Rossi, J.F. Interleukin-6 is a therapeutic target for disimmune disease and cancer / J.F. Rossi // Haematopoiesis Immunol. - 2012. - V. 1. - P. 8-32. 126. Sanderson, R.D. Syndecan-1 in B lymphoid malignancies / R.D. Sanderson, M. Børset // Ann. Hematol. - 2002. - V. 81. - P. 125-135. 127. Sanderson, R.D. Syndecan-1: a dynamic regulator of the myeloma microenvironment / R.D. Sanderson, Y. Yang // Clin. Exp. Metastasis. – 2008 –V. 25. - P. 149-159. 128. Schneider, H. Homodimerization of erythropoietin receptor by a bivalent monoclonal antibody triggers cell proliferation and differentiation of erythroid precursors / H. Schneider, W. Chaovapong, D.J. Matthews, C. Karkaria, T. Lorenzini et al. // Blood. - 1997. - V. 89. - P. 473-482. 129. Schwabe, M. Disruption by interferon-alpha of an autocrine interleukin-6 growth loop in IL-6-dependent U266 myeloma cells by homologous and heterologous down-regulation of the IL-6 receptor alpha- and beta-chains / M. Schwabe, A.T. Brini, M.C. Bosco, F. Rubboli, H.F. Kung et al. // J. Clin. Invest. - 1994. - V. 94. P. 2317-2325. 130. Schwabe, M. Differential expression and ligand-induced modulation of the human interleukin-6 receptor on interleukin-6-responsive cells / M. Schwabe, J. Zhao, H.F. Kung // J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269. - P. 7201-7209. 131. Shinjo, K. Erythropoietin receptor expression on human bone marrow erythroid precursor cells by a newly-devised quantitative flow-cytometric assay / K. Shinjo, A. Takeshita, M. Higuchi, K. Ohnishi, R. Ohno // Br. J. Haematol. - 1997. - V. 96. - P. 551-558. 132. Shinjo, K. Expression of granulocyte colony-stimulating factor receptor increases with differentiation in myeloid cells by a newly-devised quantitative flow- 143 cytometric assay / K. Shinjo, A. Takeshita, K. Ohnishi, R. Ohno // Br. J. Haematol. - 1995. - V. 91. - P. 783-794. 133. Show, S. Leukocyte differentiation antigen database V Workshop / S. Show. et al. (Eds) // Leucocyte Typing V, Boston. – 1993. 134. Sidell, N. Retinoic acid-induced growth inhibition of a human myeloma cell line via down-regulation of IL-6 receptors / N. Sidell, T. Taga, T. Hirano, T. Kishimoto, A. Saxon // J. Immunol. - 1991. - V. 146. - P. 3809-3814. 135. Skiniotis, G. Structural organization of a full-length gp130/LIF-R cytokine receptor transmembrane complex / G. Skiniotis, P. Lupardus, M. Martick, T. Walz, and K.C. Garcia // Mol. Cell. - 2008. - V. 31. - P. 737-748. 136. Sporeno, E. Human interleukin-6 receptor super-antagonists with high potency and wide spectrum on multiple myeloma cells / E. Sporeno, R. Savino, L. Ciapponi, G. Paonessa, A. Cabibbo et al. // Blood. - 1996. - V. 87. - P. 4510-4519. 137. Sprynski, A.C. The role of IGF-1 as a major growth factor for myeloma cell lines and the prognostic relevance of the expression of its receptor / A.C. Sprynski, D. Hose, B. Barlogie, J. Moreaux et al. // Blood. - 2009. - V. 113. - P. 4614-4626. 138. Stahl, N. Association and activation of Jak-Tyk kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6 beta receptor components / N. Stahl, T.G. Boulton, T. Farruggella, N.Y. Ip, S. Davis, F.W. Quelle et al. // Science. - 1994. - V. 263. - P. 92-95. 139. Stahl, N. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosinebased motifs in cytokine receptors / N. Stahl, T.J. Farruggella, T.G. Boulton, Z. Zhong, JE.Jr. Darnell, and G.D. Yancopoulos // Science. - 1995. - V. 267. - P. 1349-1353. 140. Steinberg, G.R. Ciliary neurotrophic factor stimulates muscle glucose uptake by a PI3-kinase-dependent pathway that is impaired with obesity / G.R. Steinberg, M.J. Watt, M. Ernst, M.J. Birnbaum, B.E. Kemp, and S.B. Jørgensen // Diabetes. - 2009. - V.58. - P. 829-839. 141. Szczepek, A.J. Expression of IL-6 and IL-6 receptors by circulating clonotypic B cells in multiple myeloma: potential for autocrine and paracrine networks / A.J. 144 Szczepek, A.R. Belch, L.M. Pilarski // Exp. Hematol. - 2001. - V. 29. - P. 10761081. 142. Taga, T. Gp130 and the interleukin-6 family of cytokines / T. Taga, T. Kishimoto // Annu. Rev. Immunol. - 1997. - V. 15. - P. 797-819. 143. Thabard, W. IL-6 upregulates its own receptor on some human myeloma cell lines / W. Thabard, M. Collette, M.P. Mellerin, D. Puthier, S. Barillé, R. Bataille, M. Amiot // Cytokine. - 2001. - V. 14. - P. 352-356. 144. Thiel, S. Constitutive internalization and association with adaptor protein-2 of the interleukin-6 signal transducer gp130 / S. Thiel, H. Dahmen, G. Müller-Newen, P.C. Heinrich, L. Graeve et al. // FEBS Lett. - 1998. - V. 441. - P. 231-234. 145. Thiel, S. Termination of IL-6-induced STAT activation is independent of receptor internalization but requires de novo protein synthesis / S. Thiel, U. Sommer, M. Kortylewski, C. Haan, I. Behrmann, P.C. Heinrich, L. Graeve // FEBS Lett. - 2000. - V. 470. - P. 15-19. 146. Timmermann, A. Different epitopes are required for gp130 activation by interleukin-6, oncostatin M and leukemia inhibitory factor / A. Timmermann, S. Pflanz, J. Grötzinger, A. Küster, P.C. Heinrich, G. Müller-Newen et al. // FEBS Lett. - 2000. - V. 468. - P. 120-124. 147. Trikha, M. Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cancer: a review of the rationale and clinical evidence. / M. Trikha, R. Corringham, B. Klein, J.F. Rossi // Clin. Cancer Res. - 2003. - V. 9. - P. 4653-4665. 148. Urashima, M. The development of a model for the homing of multiple myeloma cells to human bone marrow / M. Urashima, B.P. Chen, S. Chen, K.C. Anderson et al. // Blood. - 1997. - V. 90. - P. 754-765. 149. Van Valckenborgh, E. Tumor-initiating capacity of CD138- and CD138+ tumor cells in the 5T33 multiple myeloma model / E. Van Valckenborgh, W. Matsui, P. Agarwal, S. Lub, C. Empsen et al. // Leukemia. - 2012. - V. 26. - P. 1436-1439. 150. Varghese, J.N. Structure of the extracellular domains of the human interleukin-6 receptor alpha–chain / J.N. Varghese, R.L. Moritz, M.Z. Lou, N.E. Hall, R.J. Simpson et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2002. - V. 99. - P. 15959-15964. 145 151. Wang, X. Structural biology of shared cytokine receptors / X. Wang, P. Lupardus, S.L. Laporte, and K.C. Garcia // Annu. Rev. Immunol. - 2009. - V. 27. - P. 29-60. 152. Wells, J.A. Hematopoietic receptor complexes / J.A. Wells, A.M. de Vos // Annu. Rev. Biochem. - 1996. - V. 65. - P. 609-634. 153. Wierzbowska, A. Circulating IL-6-type cytokines and sIL-6R in patients with multiple myeloma / A. Wierzbowska, H. Urbańska-Ryś, T. Robak // Br. J. Haematol. - 1999. - V. 105. - P. 412-419. 154. Wijdenes, J. Interleukin-6 signal transducer gp130 has specific binding sites for different cytokines as determined by antagonistic and agonistic anti-gp130 monoclonal antibodies / J. Wijdenes, P.C. Heinrich, G. Müller-Newen, C. Clément, and B. Klein et al. // Eur. J. Immunol. - 1995. - V. 25. - P. 3474-3481. 155. Wu, Y.H. Removal of syndecan-1 promotes TRAIL-induced apoptosis in myeloma cells / Y.H. Wu, C.Y. Yang, W.L. Chien, K.I. Lin, M.Z. Lai // J. Immunol. - 2012. - V. 188. - P. 2914-2921. 156. Yamasaki, K. Cloning and expression of the human interleukin-6 (BSF-2/IFN beta 2) receptor / K. Yamasaki, T. Taga, Y. Hirata, H. Yawata, T. Kishimoto et al. // Science. - 1988. - V. 241. - P. 825-828. 157. Yamauchi-Takihara, K. gp130-mediated pathway and heart failure / K. YamauchiTakihara // Future Cardiol. - 2008. - V. 4. - P. 427-437. 158. Young, I.T. Proof without prejudice: use of the Kolmogorov-Smirnov test for the analysis of histograms from flow systems and other sources / I.T. Young // J. Histochem. Cytochem. – 1977. – V. 25. - P. 935-941. 159. Zhou, Q. The protein tyrosine phosphatase CD45 is required for interleukin 6 signaling in U266 myeloma cells / Q. Zhou, Y. Yao, S.G. Ericson // Int. J. Hematol. - 2004. - V. 79. - P. 63-73. 160. Zohlnhöfer, D. The hepatic interleukin-6 receptor. Down-regulation of the interleukin-6 binding subunit (gp80) by its ligand / D. Zohlnhöfer, L. Graeve, S. Rose-John, H. Schooltink, E. Dittrich, P.C. Heinrich // FEBS Lett. - 1992 – V. 306. - P. 219-222.
