Цуркан Я.С

АННОТАЦИЯ
Диссертации на соискание ученой степени доктора философии(PhD)
по специальности 6D070100-«Биотехнология»
Цуркан Яны Сергеевны
«Селекция микроорганизмов с высоким содержанием практически
значимых полиненасыщенных жирных кислот»
Общая характеристика работы
Работа посвящена сравнительному изучению и отбору потенциально
перспективных микроорганизмов - продуцентов практически значимых для
человека и животных ПНЖК, изучению содержания липидных компонентов
биомассы, их состава, а также подбору условий выращивания отобранных
культур для повышения выхода целевого продукта.
Актуальность темы исследований
Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в
жизнедеятельности
человека
и
многих
животных.
Основными
представителями ПНЖК являются линолевая (С18:2n-6), α- и -линоленовые
(С18:3n-3 и С18:3n-6), арахидоновая (С20:4n-6), эйкозапентаеновая (С20:5n3) и докозагексаеновая (С22:6n-3) кислоты. Линолевая и линоленовая
кислоты служат предшественниками более длинноцепочечных жирных
кислот. Арахидоновая кислота трансформируется в эйкозаноиды,
лейкотриены и простаноиды - биологические регуляторы сердечнососудистой, нервной, репродуктивной и иммунной систем организма.
Эйкозапентаеновая кислота влияет на развитие инфекционных процессов,
оказывая сильное противовоспалительное действие. ПНЖК находят широкое
применение в медицине, фармацевтике, косметологии, питании и других
областях жизнедеятельности человека. Они необходимы для нормального
роста и развития организма, в особенности детского, играют важную роль в
предупреждении и лечении многих иммунных, воспалительных и сердечнососудистых заболеваний, например, ревматоидного артрита, ишемической
болезни сердца, а также рака.
В организме млекопитающих ПНЖК не могут синтезироваться de novo и
должны поступать извне. В настоящее время в качестве источников для
получения ПНЖК применяются растительные масла и морепродукты. В
животных жирах содержание ПНЖК незначительно. В связи с уменьшением
рыбных запасов, пригодных для посева земель актуальной проблемой
является поиск новых источников ПНЖК, потенциально пригодных для
проведения биотехнологических исследований в области их производства.
Перспективными продуцентами липидов, в том числе ПНЖК в
последние годы считаются микроорганизмы, так как они имеют ряд
преимуществ в сравнении с растительным сырьем и морепродуктами. К ним
относятся:
- быстрые темпы накопления биомассы на простых средах;
- возможность выращивания биомассы в местах, непригодных для
посева растений;
- синтез и накопление в клетках до 70% липидов, в том числе из них до
50% составляют ПНЖК.
Цель исследований - отбор микроорганизмов с высоким содержанием
практически значимых полиненасыщенных жирных кислот.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- выделение микроорганизмов из природных источников;
- изучение динамики роста данных микроорганизмов;
- изучение липидного и жирнокислотного состава выделенных культур
микроорганизмов;
- идентификация культур с наибольшим содержанием липидов и ПНЖК;
- подбор условий культивирования для повышения содержания липидов
и ПНЖК у перспективных штаммов.
Объектами исследований являлись микроводоросли, грибы, дрожжи и
бактерии, выделенные из водоемов и прибрежных почв Казахстана: г.
Алматы и Алматинской области, г. Актау, г. Астаны, г. Шымкента и с. Акбай
Южно-Казахстанской области.
Материалы исследования - липидные и жирнокислотные экстракты из
биомассы микроорганизмов.
Методы исследования:
Выделение микроорганизмов из природных источников и получение
чистых культур проводили по стандартным микробиологическим методикам.
Динамику роста культур микроорганизмов определяли по изменению
оптической плотности, используя нефелометрический метод, и по приросту
биомассы. Липиды экстрагировали из биомассы методом Кейтс и Гарбуса,
основанном на избирательном элюировании веществ различными
растворителями. Экстракцию жирных кислот проводили по методу Кристи с
получением метиловых эфиров жирных кислот. Экстракты жирных кислот
анализировали методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии.
Идентификацию микроорганизмов осуществляли по морфологическим
признакам, используя таксономические определители, а также методом
определения нуклеотидной последовательности фрагмента 18S rRNA
(микроводоросли) и ITS региона (грибы), с последующим определением
идентичности нуклеотидной последовательности с последовательностями,
депонированными в международной базе данных Gene Bank. Хромосомную
ДНК выделяли СТАВ методом. Концентрацию ДНК определяли
спектрофотометрически. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с
помощью полимеразной цепной реакции.
Научная новизна.
Проведен скрининг по параметрам динамики роста, накопления
биомассы, липидов и практически ценных ПНЖК среди 147 культур
микроорганизмов, выделенных из различных источников Республики
Казахстан.
Отобраны и идентифицированы 2 новых штамма микроводорослей
Dictyochlorella globosa 15в, Pleurosigma sp. 29в и 2 новых штамма грибов
Petromyces alliaceus 45г, Mucor circinelloides 21г с высоким содержанием
липидов и ПНЖК;
Впервые для идентифицированных штаммов определены условия
культивирования, повышающие содержание целевого продукта;
Впервые установлен характер зависимости содержания липидов и
ПНЖК у штаммов микроводорослей Dictyochlorella globosa 15в, Pleurosigma
sp. 29в от
времени культивирования и концентрации в среде
культивирования азота;
Впервые установлен характер зависимости содержания липидов и
ПНЖК у штаммов грибов Petromyces alliaceus 45г, Mucor circinelloides 21г от
времени культивирования и добавления в среду культивирования глюкозы,
глицерина и цинка;
Впервые показано, что штаммы микроводорослей Dictyochlorella globosa
15в, Pleurosigma sp. 29в и грибов Petromyces alliaceus 45г, Mucor circinelloides
21г являются перспективными для их применения в качестве продуцентов
полиненасыщенных жирных кислот.
Научная и практическая значимость диссертационной работы:
Научная значимость работы определяется тем, что найдены новые
перспективные микроорганизмы-продуценты полиненасыщенных жирных
кислот.
Практическая
значимость
работы
обусловлена
тем,
что
идентифицированные штаммы микроводорослей и грибов Dictyochlorella
globosa 15в, Pleurosigma sp. 29в, Petromyces alliaceus 45г, Mucor circinelloides
21г, выделенные из водоемов и почв Казахстана, перспективны в качестве
продуцентов липидов и ценных ПНЖК. Результаты, полученные при
исследовании зависимости содержания липидов и ценных ПНЖК от условий
культивирования, могут быть рекомендованы в качестве научной основы для
разработки технологии получения препаратов практически значимых
полиненасыщенных жирных кислот.
Положения, выносимые на защиту:
- идентифицированные новые штаммы микроводорослей Dictyochlorella
globosa 15в, Pleurosigma sp. 29в характеризуются высоким содержанием
липидов и полиненасыщенных жирных кислот, наличием практически
значимых полиненасыщенных жирных кислот: альфа-линоленовой,
арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот.
- идентифицированные новые штаммы грибов Petromyces alliaceus 45г,
Mucor circinelloides 21г характеризуются высоким содержанием фракции
ПНЖК и наличием практически значимых ПНЖК: гамма-линоленовой и
эйкозапентаеновой кислот.
- снижение концентрации азота в среде культивирования
микроводоросли Pleurosigma sp. 29в обеспечивает повышение содержания
липидов, полиненасыщенных жирных кислот, в том числе АК, ЭПК и не
влияет на данные показатели у штамма Dictyochlorella globosa 15в.
- добавление в среду культивирования штаммов грибов Mucor
circinelloides 21г и Petromyces alliaceus 45г избытка источника углерода
(глюкозы или глицерина) и микроэлемента цинка не оказывает достоверного
влияния на содержание липидов и ПНЖК у обоих штаммов.
Личный вклад автора: Автор диссертации участвовал в выборе
объекта исследования, определении цели работы, постановке задач
исследования, в проведении экспериментов. Результаты экспериментальных
исследований проанализированы автором самостоятельно.
Публикации.
Основные результаты диссертационной работы отражены в 16 научных
трудах, два из которых опубликованы в издании с ненулевым импактфактором; один, в издании, входящем в базу данных Scopus; 4 - в
республиканских научных журналах из перечня Комитета; 9 публикаций в
материалах международных конференций и конгрессов.
Объем и структура диссертации: Диссертационная работа изложена на
105 страницах, содержит 24 таблицы и 31 рисунок, 1 приложение; состоит из
введения, 3 основных разделов, заключения и списка использованной
литературы, включающего 230 наименований.