Copyright © 2004 Elsevier B

1
Перспективы разработки новых методов диагностики и поиска лекарственных
средств с использованием микрочипов
Вегарий Артаваздович САКАНЯН
ProtNeteomix (ПротНетеомикс), г. Нант, Франция
Нантский университет
Тел : 33-251125620
Факс: 33-251125637; 33-251125626
v.sakanyan@protneteomix.com
Vehary.Sakanyan@univ-nantes.fr
Ключевые слова: белковые микрочипы, микрочипы малых молекул, молекулярные
взаимодействия, диагностика, поиск новых лекарств
Резюме
Микрочипы малых молекул и белков, предназначенные для высоко-пропускного
скрининга и широко-масштабного анализа молекулярных взаимодействий, открывают
многообещающие перспективы для медицины и фармацевтичекой промышленности.
Эта быстро развивающаяся область высоких технологий позволяет перевести изучение
сложных физиологических и патологических процессов на качественно новый уровень,
что является предпосылкой для разработки эффективных методов диагностики и
терапии различных заболеваний. В обзоре кратко представлено современное состояние
проблемы и на примере результатов, полученных под руководством автора,
рассмотрены реальные возможности микрочипов для решения актуальных задач в
медицине. Автор особо подчеркивает, что объединение в одну платформу микрочипов
различного назначения позволит ускорить обнаружение новых лекарств и повысить
рентабельность поисковых программ.
2
Введение
Изучение и понимание сложных молекулярных взаимодействий, вовлеченных в
ключевые биологические процессы, является актуальной проблемой современной
медицины и фармакологии. В этом контексте, белковые чипы, которые явились
логическим следствием прогресса в определении первичной последовательности
генома различных организмов, открывают широкие перспективы в изучении функций
множества белков, включая протеому человека. Действительно, широко-масштабный
анализ белковых взаимодействий с помощью микрочипов представляется ключевым
этапом для выяснения природы многих патологических процессов и для последующей
разработки миниатюрных средств ранней диагностики и прогностики заболеваний
человека. Более того, появление недавно в арсенале чиповой технологии микрочипов
малых молекул дает новые возможности для высоко-пропускного скрининга библиотек
химических соединений (химиотек) и поиска эффективных молекул против многих
заболеваний.
Технология белковых микрочипов
В начале 1990 годов, Р. Экинс математически обосновал и экспериментально
доказал, что чувстительность детекции взаимодействия двух белков, одного
иммобилизованного в виде небольшой точки на плоской поверхности (твердая фаза) и
другого в жидкой фазе, выше чем когда оба белковых партнера находятся в жидкой
фазе (Ekins and Chu, 1999). Белковые чипы представляют собой упорядоченно
расположенные на плоской поверхности образцы в виде пятен (точек) диаметром 50500 микрон. Этот формат позволяет проводить на небольшой площади одновременный
анализ сотен и тысяч индивидуальных белков на предмет взаимодействия с разными
молекулами, такими как белки, пептиды, антитела, антигены, нуклеиновые кислоты,
липиды, лиганды и т. д. (Snapyan and Sakanyan, 2007).
Технология белковых чипов состоит из трех основных этапов: (i) наработки и
подготовки образцов, (ii) нанесения и иммобилизации образцов на выбранную
поверхность, (iii) детекции сигналов и их анализа (Рис. 1). Микрочипы обычно готовят
на предметном стекле для световой микроскопии, который покрыт особым слоем для
обеспечения ковалентного или нековалентного связывания белков. Выбранная
поверхность должна обеспечить высокое качество точек, низкий фон и чувствительную
детекцию сигнала.
В настоящее время наиболее широко используется флуоросцентный метод
детекции сигналов с белковых чипов с привлечением лазерных сканнеров, ранее
разработанных для чипов ДНК. Предложены разные приемы внесения
флуоресцентного красителя в молекулярную пробу; для мечения белков широко
применяется метод химической "биоконъюгации".
Критический порог чувствительности детекции флуоресцентного сигнала
зависит от соотношения «сигнал-шум» на использованной поверхности. Наиболее
популярные для исследований на чипах флуорофоры поглощают и излучают в видимом
диапазоне 500–650 нм. Однако молекулы, содержащие кольцевую структуру, могут
провоцировать при лазерном сканировании аутофлуоресцентный эффект при этих
длинах волн, что повышает фон и снижает чувствительность детекции (Sakanyan and
Yeretssian, 2007). Мы предложили использовать флуорофоры, излучающие в ближнем
3
инфракрасном диапазоне (IRDyes), которые поглощают и излучают при длине волны
700-800 нм (Ghochikyan et al., 2002). Это позволило повысить чувствительность
детекции, без привлечения приемов амплификации сигнала, до нескольких десятков
аттомолей белка-мишени, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране
(Snapyan et al., 2003).
Подробную информацию по иммобилизации белков при приготовлении чипов и
по этапам технологии можно найти в предыдущих обзорах автора (Sakanyan, 2004 ;
2005).
Рис. 1. Разнообразие белковых чипов разработанных на фирме ProtNeteomix и в
Нантском университете.
Использование белковых чипов в медицине
Во многих лаборатотиях были разработаны разнообразные приложения
белковых чипов для медицинских исследований (Таблица 1). Пожалуй, сегодня
наиболее широко применяются чипы антител для определения изобилия заданных
белков в клинических образцах. Антитела проявлят высокое сродство к молекуламмишеням и поэтому являются наилучшими кандидатами для определения
концентрации соответствующих белков. Две версии микрочипов моноклональных
антител используются для сравнения экспрессии белков (up и down регуляция) и
4
определения их относительного количества в сложных биологических образцах
(сыворотка, лимфотическая жидкость, моча, биопсия).
Таблица 1. Применение белковых микрочипов в медицинских целях.
Качественная и количественная оценка профиля белков
Определение эффективности пост-трансляционных модификаций
белков (фосфорилирование, ацетилирование, и т. п.)
Поиск диагностических биомаркеров
Идентификация терапевтических мишеней
Поиск новых ферментных активностей
Качественная и количественная оценка иммуного ответа
Скрининг белков и пептидов для разработки вакцин
Разработка методов иммунологического анализа
Разработка диагностических и прогностических средств
Определение эффекта лекарств
Разработка лекарственных средств
Первый метод измеряет интенсивность флуоресцентного сигнала путем
сравнения конкуренции одновременно сотен белков в двух в клеточных лизатах,
меченых двумя разными флуорофорами, за связывание с антителами
иммобилизованными на подложке (Рис. 2). Он позоляет оценить глобальную
регуляцию экспрессии множества белков в разных образцах и при различных условиях,
что приобретает важное значение для задач системной биологии. Кроме того, этот
метод существенно облегчает целенаправленный поиск потенциальых биомаркеров,
помогает обосновать гипотезу терапевтической мишени, ускоряет оценку действия
лекарственных средств на обработанные клетки и т. п. Разработанный на нашей фирме
MAGYarray со 124 иммобилизованными антителами был с успехом использован для
сравнения профиля белков в клеточных линиях рака молочной железы (Yeretssian et al.,
2005) и оценки экспрессии белков в хиларных и периферийных холангиоцарциномах
печени (Guedj et al., 2009)..
Основным препятствием при профилировании белков является недостаточная
специфичность антител. Традиционный подход в преодолении этого препятствия
заключается в использовани сэндвича из двух антител, которые распознают различные
эпитопы одного и того же белка. Первое из них, иммобилизованное на подложке,
захватывает нужный белок, а второе, вносимое в жидкую фазу, узнает захваченный
белок. Техника сэндвича позволяет количественно определить уровень экспрессии
заданного белка, что важно для достоверной диагностики патологического процесса.
Эта техника дает хорошие результаты для оценки эффективности фосфорилирования
белков, которое играет важную роль во многих клеточных процессах. Чтобы упростить
анализ фосфорилирования тирозина одновременно во многих мишенях, мы с недавних
пор используем единственное моноклональное антитело, характеризующееся
способностью узнать модифицированную аминокислоту в различных белках. Само
биотинилированное
антитело
обнаруживают
последующей
реакцией
со
стрептавидином, меченым большим числом IRDyes.
5
В сотрудничестве с Ветеринарной школой г. Нанта мы использовали чипы
антител фирмы R&D Systems для изучения сигнальных путей при нейродистрофической миопатии собаки (Feron et al., 2009). Комплексный анализ этой модели
с привлечением других методов позволил установить важную роль фосфатазы PTEN в
патогенезе, что обнадеживает в поиске новых путей лечения тяжелой болезни Дюшена
у человека.
Рис. 2. Микрочипы малых молекул (А) и антител (B), объединенные в одну
технологическую платформу. Микрочипы малых молекул предназначены для высокопропускного скрининга химиотек и оптимизации первичных кандидатов (lead);
микрочипы антител предназначены для оценки эффекта отобранных молекул на
глобальную регуляцию заданных белков в обработанных клетках.
Широкую популярность в медицинских исследованиях получил также метод
микрочипов с иммобилизованным общим белком, известный под названим "белковый
чип с обратной фазой". Моноклональное антитело вносится в жидкую фазу для
обнаружения белка-мишени в клеточном экстракте иммобилизованном на подложке.
Такой метод особенно ценен при сравнении профиля экспрессии и фосфорилирования
белков одновременно во многих клинических образцах и при кинетичесих
исследованиях с отбором большого числа проб. Недавно, совместно с сотрудниками
Турского университета нам удалось значительно повысить чувствительность этого
метода внесением дополнительной стадии энзиматической амплификации сигнала во
флуоресцентную детекцию биотинилированных антител с помощью стрептавидина,
меченого IRDye (Dupuy et al., in press]. В результате стало возможным проследить
6
фосфорилирование белков, представленных в очень низких концентрациях, на уровне 1
аттомоля белка в клеточном лизате .
Чипы с иммобилизованными белками и пептидами приобрели особую ценность
при анализе иммунного ответа, определении профиля антител в сыворотке больных и
быстрого поиска потенциальных антигенов при разработке вакцин. В частности,
совместно с Университетом Мехико мы приготовили и использовали пептидные чипы с
иммобилизованными фаговыми частицами (phage display) для оценки IgG ммунного
ответа у ВИЧ-инфицированных больных (Arnaud et al., 2004). Связывающая активность
нескольких
десятков
пептидных
последовательностей,
напоминающих
иммунодоминантный эпитоп gp41, была исследована в сыворотке больных до и после
антивирусной терапии. Была отмечена хорошая корреляция между данными,
полученными с помощью метода ELISA и микрочипов с иммобилизованным
миметическими пептидами (Рис. 3, A). Однако, метод имунного анализа на микрочипах
оказался более чувствительным и требующим меньшего количества сыворотки, что
выгодно отличает его от традиционного подхода.
В другой совместной работе с сотрудниками INRA (Nantes) было показано, что
для обнаружения белков коровьего молока, проявляющих антигенные свойства и
вызывающие аллергию у детей от нескольких недель до нескольких месяцев, которые
лишились материнского молока, методом иммунологического анализа на чипах
требуется почти в 40 раз меньше крови по сравнению с методом ELISA (Gaudin et al.,
2008 ; Рис. 3, B). Безусловно, такой щадящий прием становится важным аргументом в
пользу диагностических микрочипов, когда клинический материал доступен в очень
ограниченном количестве.
Рис. 3. Анализ иммунного ответа в крови пациентов с помощью пептидных и белковых
микрочипов. Определение относительной концентрации IgG в крови больных ВИЧ в
ответ на пептиды-миметики эпитопа gp41 с помощью ELISA и микрочипов (А) и
относительной концентрации IgE в крови аллергических детей в ответ на белки
коровьего молока (B).
7
Микрочипы, содержащие высоко-специфичные атигены могут использоваться
как "отпечатки" для поиска ауто-антител характерных для вирусных и бактериальных
инфекций. В ближайшей перспективе, белковые чипы кардинально изменят изучение
функциональных сетей на уровне протеомы человеческого организма, что позволит
пресказать последствия ингибирования терапевтических мишеней лекарствами при
сложных заболеваниях.
Поиск новых лекарств
Одной из важнейших проблем, стоящих перед фармацевтической индустрией,
является ускорение и удешевление создания лекарств направленных против известных
мишеней. Еще до недавнего времени скрининг библиотек химических соединений
преимущественно был направлен на поиск соединений, которые влияют на функцию
белка, что часто является трудоемкой и дорогой процедурой. В последние годы
методология клеточного и биохимического скрининга обогатилась геномными,
протеомными и метаболическими подходами (Рис. 4). Однако, прямой поиск
кандидатов на лекарство среди огромного числа малых молекул все еще является
актуальной задачей.
Рис. 4. Высоко-пропускные методы скрининга химиотек для поиска кандидатов на
создание лекарств.
8
Наша фирма разработала новый метод скрининга химиотек на микрочипах,
приготовленных путем нековалентного связывания малых молекул (Sakanyan, 2008).
Химические и природные соединения с разной структурой могут быть
иммобилизованы на одну ту же поверхность без привлечения химических стадий, что
подчеркивает унверсальность метода (Рис. 2,А). Соединения, способные
взаимодйствовать с каталитическим или другим сайтом отбираются прямым образом,
по появлению флуоресцентного сигнала с анализируемого белка-мишени.
Специфичность взаимодействия затем подтвердждается отсутствием взаимодействия с
тем же белком, инактивированным термической обработкой или конкурентным
связыванием за мишень с известной молекулой или другими приемами. Метод
позволяет анализировать также плохо-растворимые соединения, тем самым расширяя
поиск потенциальных ингибиторов. Полученные данные по поиску антибактериальных
и антираковых соединенй на микрочипах малых молекул показывают их преимущества
как в оперативном так и экономическом плане.
После отбора молекул-кандидат, их дальнйшая активность обычно исследуется
на животных моделях. Эта задача может быть облегчена с использованием микрочипов
антител и живых тест-клеток. Следует отметить, что поисковые программы лекарств
уже сегодня оцениваются более чем в один миллиард евро на каждый проект
длительностью от 8 до 12 лет. Поэтому, чтобы уменьшить огромные затраты на
открытие и создание новых лекарств, особенно перспективным выглядит интеграция
микрочипов различного назначения в одну последовательную технологическую
цепочку (см. Рис. 2).
Заключение
Прогресс в разработке микрочипов за последние годы подчеркивает новый этап
в биологии и медицине в изучении фундаментальных вопросов молекулярных
взаимодействий и решении актуальных проблем здравохранения. Mожно говорить уже
о наночипах, которые будут характеризоваться наличием на небольшой площади
десятков если не сотен тысяч точек анализируемых образцов. Белковые микрочипы уже
существенным образом повлияли на области медицины связанные с оценкой
гуморального иммунитета при аутоиммунных заболеваниях, аллергии, инфекционных
болезней и рака (Sakanyan and Arnaud, 2008). Они вероятно займут особое место в
ранней диагностике сложных заболеваний и в выборе индивидуальной терапии.
Возможность одновременного анализа многих тысяч молекулярных
взаимодействий в одном эксперименте при небольшом потреблении клинического
материала, с высокой чувствительностью и при низкой стоимости всей процедуры
придает микрочипам малых молекул и белков неоспоримые преимущества перед
другими технологиями, используемыми в настоящее время фармацевтическими
компаниями для поисковых программ. Объединенные в одну технологическую
платформу, микрочипы разного назначения могут ускорить скрининг химиотек и дать
важную информацию о возможной токсичности и терапевтическом потенциале
отобранных активных молекул до дорогостоящих пре-клинических и клинических
испытаний. Такой подход будет способствовать улучшению рентабельности создания
лекарственных средств, в чем сегодня очень заинтересована фармацевтическая
индустрия.
9
Благодарности
Исследования под руководтсвом автора финансировались в рамках программ
«Post-Génome » (департамент Pays de la Loire), EUR-Intafar (Европейское сообщество),
RIB 2007 и PNANO 2007 (Французский фонд ANR), а также Нантским Университетом
и фирмой ProtNeteomix (www.protneteomix.com).
Автор благодарит всех сотрудников и коллег участвующих в разработке
технологии биологических чипов, в решении соответствующих научных задач. Особая
благодарность Ирине Прошиной-Саканян за моральную поддержку в течение многих
лет.
Литература
Arnaud M.-C., Gazarian T., Palacios Rodriguez Y., Gazarian K., Sakanyan V. Array
assessment of phage displayed peptide mimics of Human Immunodeficiency Virus type 1
gp41 immunodominant epitope: binding to antibodies of infected individuals. Proteomics
2004, 4: 1959-1964.
Dupuy L., Gauthier C., Durand G., Musnier A., Heitzler D., Herledan A., Sakanyan V.,
Crépieux P., Reiter E. A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to
analyse signaling pathways by reverse-phase protein array (in press).
Ekins, R. and Chu, F. Microarrays: their origins and applications. Trends Biotechnol. 1999,
17: 217-218.
Feron M., Guevel L., Rouger K., Dubreil l., Arnaud MC, Ledevin M., Megeney LA, Cherel
Y., Sakanyan V. PTEN contributes to profound PI3K/Akt signalling pathway deregulation
in dystrophin-deficient drug muscle. Amer. J. Pathol. 2009, 174: 1459-1470.
Gaudin J-C., Rabesona H., Choiset Y., Yeretssian G., Chobert J-M., Sakanyan V., Drouet
M., Haertlé T. Assessment of the IgE-mediated immune response to milk-specific proteins
in allergic patients using microarrays. Clinical and Experimental Allergy 2008, 38: 686693.
Ghochikyan A., Karaivanova I., Lecocq M., Vusio P., Arnaud M.C., Snapyan M., Weigel
P., Guevel L., Buckle M., Sakanyan V. Arginine operator binding by heterologous and
chimeric ArgR repressors from E. coli and B. stearothermophilus. J. Bacteriol. 2002, 184:
6602-6614.
Guedj N., Zhan Q., Perigny M., Rautou P. E., Degos F., Belghiti J., Farges O., Bedossa P.,
Paradis V. Comparative protein expression profiles of hilar and peripheral hepatic
cholangiocarcinomas. J. Hepatol. 2009, 51: 93-101.
Sakanyan V. Puces à protéines: nouvelle approche du diagnostic des maladies infectieuses.
Antibiotiques 2004, 6: 185-192.
Sakanyan V. High-throughput and multiplexed protein array technology: protein-DNA and
protein-protein interactions. J. Chromatography B 2005, 815: 77-95.
10
Sakanyan V. Molecular interactions on microarrays. Eur. Biopharm. Review 2008,
November, 74-78.
Sakanyan V. and Yeretssian G. Near infrared fluorescence detection of antigen-antibody
interactions on microarrays. In: Spectral Techniques in Proteomics. Ed. D. Sem, CRC
Press 2007, p. 185-205.
Sakanyan V. and Arnaud M.-C. Puces à protéines et les perspectives des applications
médicales. ITBM-RBM 2008, 28: 187-193.
Snapyan M., Lecocq M., Guevel L., Arnaud M.-C., Ghochikyan A., Sakanyan V.
Dissecting DNA-protein and protein-protein interactions involved in bacterial
transcriptional regulation by a sensitive protein array method combining a near-infrared
fluorescence detection. Proteomics 2003, 3: 647-657.
Snapyan M. and Sakanyan V. DNA interactions with protein microarrays. In: Functional
protein microarrays in drug discovery. Ed. P. Predki, Taylor & Francis Group, LLC 2007,
p. 309-328.
Yeretssian G., Lecocq M., Lebon G., Hurst H., Sakanyan V. Competition on nitrocelluloseimmobilized antibody arrays: from bacterial protein binding assay to protein profiling in
breast cancer cells. Mol. Cell. Proteomics 2005, 4: 605-617.