α-токоферола в оксидативном стрессе роль тимоцитов крысы, индуцированном пероксидом водорода и менадионом

ЕКсПЕРИмЕНТАльНі РОбОТИ
УДК 577.161.3
роль α-токоферола в оксидативном стрессе
тимоцитов крысы, индуцированном пероксидом
водорода и менадионом
Г. В. ПЕТРОВА, Г. В. ДОНЧЕНКО
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
e-mail: petrova@biochem.kiev.ua
Исследовали влияние α-токоферола и его аналогов α-токоферилацетата и α-токоферилхинона,
не обладающих свойствами антиоксидантов, на выживаемость тимоцитов крысы и внутриклеточное
содержание активных форм кислорода (АФК) при моделировании оксидативного стресса пероксидом
водорода и менадионом. Установлено, что способность α-токоферола ингибировать индуцированную
развитием оксидативного стресса гибель тимоцитов незначительна, не зависит от наличия в структуре хроманового ядра его молекулы свободной ОН-группы, ответственной за проявление антиоксидантных свойств, и не коррелирует с его влиянием на содержание внутриклеточных АФК. Эффективность в данной модели предшественника глутатиона N-ацетил-L-цистеина свидетельствует о
вовлечении в эти процессы других систем антиоксидантной защиты. Полученные данные позволяют
заключить, что α-токоферол не играет основную роль в защите клеток от повреждающего действия
АФК, что ставит под сомнение его способность предотвращать оксидативный стресс.
К л ю ч е в ы е с л о в а: α-токоферол, α-токоферилацетат, α-токоферилхинон, менадион, пероксид водорода, оксидативный стресс, активные формы кислорода, N-ацетил-L-цистеин.
О
ксидативный стресс, определяемый
как нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в пользу
первых [1], является одним из основных индукторов гибели клетки. Поскольку повышенная продукция клеткой активных форм
кислорода (АФК) приводит к потенциальной
угрозе оксидативного повреждения биомолекул, в клетке существует многоуровневая система антиоксидантной защиты, включающая
ферментативные и низкомолекулярные антиоксиданты [2]. Одним из жирорастворимых
низкомолекулярных антиоксидантов традиционно считается витамин Е. Хотя все компоненты природного витамина Е (α-, β-, γ-, δ-токоферолы и соответствующие токотриенолы)
обладают приблизительно равной антиоксидантной активностью in vitro, только α-токоферол способен оказывать антиапоптическое
действие, в то время как большинство других
родственных α-токоферолу соединений, равно
как и его синтетические производные (например, токоферилсукцинат) потенциально токсичны для клетки [3,4].
Биологическое действие α-токоферола в
основном связывают с его способностью предотвращать пероксидное окисление липидов
при развитии оксидативного стресса. Мнение
об α-токофероле как антиоксиданте настолько устоялось в научной среде, что зачастую,
94
обнаружив ингибирующее действие α-токоферола на тот или иной процесс, исследователи
a priori делают вывод о связи этого процесса
с повышенной продукцией АФК. Однако необходимо отметить, что теория антиоксидантного действия витамина Е в организме не
является безупречной и общепринятой. Свидетельство тому недавнее появление в печати двух обзоров ведущих специалистов в области биохимии витамина Е, отстаивающих
прямо противоположные точки зрения. Так,
по мнению A. Azzi [5], α-токоферол безоговорочно не является антиоксидантом in vivo, а
выступает в качестве лиганда для пока еще не
идентифицированных специфических белков
(рецепторных или факторов транскрипции),
принимая таким образом участие в передаче
сигнала в клетке и экспрессии генома. С другой стороны, M. G. Traber и J. Atkinson [6] (чей
обзор также назван вполне однозначно «Витамин Е – антиоксидант и ничего более») считают, что единственная функция α-токоферола
в организме – это защита от окисления остатков ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов в мембране и поддержание таким образом ее структурной организации. Все иные
обнаруженные «неантиоксидантные» формы
биологической активности α-токоферола, как,
например, ингибирование ферментов, являющихся ключевыми в биохимической регуляции
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Г. В. ПЕТРОВА, Г. В. ДОНЧЕНКО
(протеинкиназа С, фосфолипаза А 2, ферменты
синтеза лейкотриенов и простагландинов) являются следствием антиоксидантного действия
α-токоферола, поскольку прямо зависят от
окислительно-восстановительного состояния
клетки. И хотя во вступительной к журнальному номеру статье делается попытка примирить
прямо противоположные взгляды оппонентов
на биологическую роль витамина Е в организме [7], вполне очевидно, что проблема далека
от своего разрешения.
В связи с этим целью настоящей работы
было изучение влияния α-токоферола и его
производных, не обладающих свойствами антиоксиданта – α-токоферилацетата и α-токоферилхинона, а также антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина на выживаемость тимоцитов
крысы и внутриклеточное содержание АФК
при модуляции оксидативного стресса пероксидом водорода и менадионом.
материалы и методы
В работе использовали следующие реактивы: D,L-α –токоферол, N-ацетил-L-цистеин,
менадион ( витамин К3, 2-метил-1,4-нафтохинон), МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолий бромид), 2′,7′-дихлорофлуоресциндиацетат, дигидроэтидий, агароза для
электрофореза, протеиназа К (Sigma, США).
Среда RPMI-1640, HEPES (Serva, США). Остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией хч и чда.
Работа проводилась на белых крысах-самках с массой тела 100–150 г.
Получение тимоцитов, подсчет количества клеток и определение их изначальной жизнеспособности с использованием красителя
трипанового синего проводили как описано
ранее [8]. Жизнеспособность свежевыделенных
тимоцитов составляла не менее 97%.
Для индукции оксидативного стресса
около 2 × 106 клеток ресуспендировали в 1 мл
среды RPMI-1640, содержащей 10 мМ HEPESNaOH буфер, рН 7,3, 0,1% БСА, 100 U/мл
пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и
50 мкМ β-меркаптоэтанол. Гидрофобные вещества добавляли из маточных спиртовых растворов, предварительно разведенных средой
инкубации, содержание этанола в пробе не
превышало 0,1%. Клетки инкубировали при
37 °С 18 час, после чего осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин) и отмывали 1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР,
в мМ: NaCl – 136,9, KCl – 2,7, Na2HPO4 – 8,1,
KH2PO4 – 1,5, рН 7,2).
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Оценку жизнеспособности клеток в рутинных экспериментах проводили с использованием МТТ-теста. Реакцию проводили в 96луночных планшетах. Клетки инкубировали
18 ч в 200 мкл культуральной среды как описано выше. Планшеты центрифугировали при
200 g 5 мин, надосадочную жидкость удаляли.
К осадку клеток добавляли 90 мкл свежей среды и 10 мкл раствора МТТ (исходная концентрация 5мг/мл в ЗФР). После инкубации в течение 1,5 ч при 37 °С клетки с образовавшимся
формазаном осаждали центрифугированием
при 400 g 10 мин и отмывали в аналогичных
условиях 200 мкл ЗФР. Осадок подсушивали
в течение ночи, добавляли 150 мкл диметилсульфоксида и определяли поглощение света раствором формазана при 570 нм. За 100%
принимали количество формазана, образовавшегося в аликвоте свежевыделенных интактных тимоцитов.
Экстракцию фрагментированной ДНК
проводили согласно методу [9]. Качественную
идентификацию фрагментов ДНК проводили
с помощью электрофореза в 1%-м геле агарозы
в 40 мМ трис-ацетатном буфере, рН 8,0, содержащем 1 мМ Na2 ЭДТА, при напряжении
электрического поля 5 V/см.
Активность каспазы-3 оценивали по
уровню гидролиза специфического пептидного субстрата Ас-DEVD-pNA, приводящего
к высвобождению р-нитроанилина согласно
техническому протоколу фирмы-производителя (Sigma).
Уровень пероксида водорода в клетке оценивали с использованием 2′,7′,-дихлорофлуоресциндиацетата, который способен проникать
через плазматическую мембрану и под воздействием внутриклеточных эстераз превращаться в
необладающий флуоресценцией 2′,7′-дихлорофлуоресцин. Последний в присутствии АФК
(преимущественно пероксида водорода) превращается в интенсивно флуоресцирующий
2′,7′-дихлорофлуоресцеин [10].
Уровень образования супероксида измеряли с использованием флуоресцентного зонда
дигидроэтидия, который при взаимодействии
с супероксидом дает два флуоресцирующих
продукта [11].
Клетки (2 × 106/мл) инкубировали в культуральной среде с 20 мкМ 2′,7′-дихлорофлуоресциндиацетатом или 50 мкМ дигидроэтидием при 37 °С в течение часа, осаждали, дважды
отмывали ЗФР. Уровень флуоресценции измеряли при таких длинах волн: возбуждения
504 нм, эмиссии 529 нм для 2′,7′-дихлорофлуоресциндиацетата и соответственно 510 и 590 нм
95
ЕКсПЕРИмЕНТАльНі РОбОТИ
для дигидроэтидия на спектрофлюориметре LS-50 (Perkin Elmer, Швейцария). Данные
представлены как кратность увеличения (число раз) относительно контрольных тимоцитов.
Экспериментальные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистическая достоверность результатов
оценивалась в программе SigmaPlot2000 с помощью t-критерия Стьюдента.
гибель клеток, во многом зависит от вида
клеточной культуры. В наших экспериментах
установлено, что кривая гибели тимоцитов
крысы линейна в области концентрации Н2О2
10–100 мкМ. Была выбрана концентрация
100 мкМ, вызывающая гибель половины клеток при времени инкубации 18 ч (врезка на
рис. 1). Электрофорез образовавшихся низкомолекулярных фрагментов ДНК показал наличие апоптической лестницы (рис. 2), однако
при этом не наблюдалась активация каспазы-3
(данные не представлены). Известно, что гибель клеток под действием Н2О2 не происходит
по классической схеме апоптоза, а зачастую
проявляет биохимические признаки одновременно как апоптоза, так и некроза. Хотя морфологические признаки индуцированной пероксидом водорода гибели клеток карциномы
толстого кишечника HT-29 свидетельствуют о
наличии апоптоза, активация каспазы не была
обнаружена [12]. С другой стороны, экспозиция клеток Т-лимфомы человека с 50 мкМ
Н2О2 приводит к активации каспаз 3 и 9 и, в
конечном результате, к апоптозу. Инкубация
с 500 мкМ пероксидом водорода не вызывает
активации каспаз и гибель клеток происходит
по некротическому пути, однако выход из митохондрий цитохрома с наблюдается в обоих
случаях [13]. Обработка клеток MCF-7 различ-
результаты и обсуждение
Несмотря на широкое использование Н2О2
в качестве агента, индуцирующего оксидативный стресс, механизм, по которому он опосредует гибель клетки, до конца не выяснен. По
сути Н2О2 не является свободным радикалом,
поскольку не имеет неспаренного электрона на
внешней орбитали. Обладая достаточно высокой, по сравнению с другими формами АФК,
способностью проникать через биологические
мембраны, Н2О2 является довольно слабым
окислителем, а его токсичность для биологических систем в основном определяется способностью в присутствии ионов двухвалентных металлов вступать в реакцию Фентона с
образованием высоко реакционно-способного
гидроксил-радикала [2].
Концентрация пероксида водорода, вызывающая апоптическую или некротическую
Жизнеспособность клеток, %
Жизнеспособность клеток, %
100
80
60
100
80
60
40
20
0
0 10 20
50
Н 2О2, мкМ
100
40
20
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 1. Жизнеспособность тимоцитов крысы при инкубации с пероксидом водорода в различных концентрациях (врезка) и добавлении α-токоферола и его аналогов (рис.): 1 – контроль; 2 – Н2О2 , 100 мкм;
3 – +α-токоферол, 100 мкм; 4 – +α-токоферилацетат, 100 мкм; 5 – +α-токоферилхинон, 100 мкм;
6 – +N-ацетил-L-цистеин, 10 мм (M ± m, n = 6), *p < 0,001 относительно добавления Н2О2
96
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Г. В. ПЕТРОВА, Г. В. ДОНЧЕНКО
0
20
50
100
Концентрация Н2О2, мкМ
Рис. 2. Электрофореграмма низкомолекулярных
фрагментов ДНК хроматина тимоцитов крысы,
образующихся при действии пероксида водорода
в различных концентрациях. Представлена типичная картина распределения из трех независимых экспериментов
ными концентрациями Н2О2 приводит как к
активации каспазы-7, так и к индукции каспазонезависимой клеточной гибели [14]. Очевидно, что в случае с тимоцитами крысы гибель
клеток также опосредована как апоптическим,
так и некротическим процессом.
Как видно на рис. 1, α-токоферол в концентрации 100 мкМ достоверно повышает
выживаемость клеток, подвергшихся воздействию Н2О2, однако, вопреки ожиданиям, эффект оказался довольно низким. Кроме того,
повышение выживаемости клеток не было специфично по отношению к α-токоферолу, его
производные, не способные проявлять свойства антиоксиданта (α-токоферилацетат и α-токоферилхинон), повышали жизнеспособность
клеток практически в той же степени, что и
α-токоферол. И, наконец, полное предупреждение гибели клеток, подвергшихся действию
Н2О2, наблюдалось при действии N-ацетил-Lцистеина. Известно, что восстановленный глутатион
(γ-глутаминил-L-цистеинил-глицин)
играет одну из главных ролей в защите клетки
от повреждающего действия оксидантов. Однако добавление к культуре клеток глутатиона
неэффективно вследствие его плохого проникISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
новения через клеточную мембрану. Напротив, N-ацетил-L-цистеин быстро проникает
в клетку, где в результате деацетилирования
превращается в L-цистеин, стимулируя таким
образом синтез глутатиона. Кроме того, помимо свойств предшественника синтеза глутатиона, N-ацетил-L-цистеин per se обладает
нуклеофильными и антиоксидантными свойствами [15].
По данным литературы, действие α-токоферола на апоптоз и некроз клеток, индуцированный Н2О2, неоднозначно и, прежде всего,
зависит от вида клеточной культуры. Так, в
культуре клеток РС 12 и первичной культуре
астроцитов α-токоферол ингибировал индуцированный пероксидом водорода апоптоз [16,
17], но был менее эффективен по отношению
к некротической гибели клеток [17]. В то же
время α-токоферол, в отличие от N-ацетил-Lцистеина, не ингибировал апоптоз культуры
клеток эндометрия [18].
Измерение количества Н2О2 внутри клетки показало неожиданно небольшое, но статистически значимое увеличение флуоресценции
относительно контрольного уровня (рис. 3),
причем максимальное значение наблюдается
через 1 час инкубации клеток с Н2О2, остается
неизменным в течение 18 час и существенно
не повышается при увеличении концентрации экзогенного Н2О2 до 500 мкМ (данные
не представлены). α-Токоферол и N-ацетилL-цистеин снижают значение показателя до
контрольного уровня, в то время как α-токоферилацетат и α-токоферилхинон оказывают
менее выраженный эффект (рис. 3). Несмотря
на то, что повышение внутриклеточного содержания АФК рассматривается как неопровержимое доказательство возможности развития оксидативного стресса, в литературе нет
однозначного мнения о необходимой степени
этого повышения. Так, при инкубации клеток
линии HMC-1 мастоцитомы человека с Н2О2,
увеличение его внутриклеточного содержания
не превышало 20% [19]. В культуре эндотелиальных клеток наблюдалось двукратное [20],
а в культуре макрофагов – четырехкратное
[21] повышение внутриклеточного содержания Н2О2, причем во всех случаях происходила гибель клеток. Кроме того, существуют
экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что цитотоксичность оксидантов
не всегда прямо коррелирует с внутриклеточным образованием АФК, а защитный эффект
антиоксидантов зависит от типа стрессорного
агента [22]. В нашем случае цитопротекторное
действие α-токоферола и его аналогов прак97
ЕКсПЕРИмЕНТАльНі РОбОТИ
Кратность увеличения, число раз
тически не зависит от структуры хроманового
ядра (рис. 1) и хотя α-токоферол в наибольшей
степени снижает внутриклеточное содержание
пероксида водорода, ингибирующим эффектом
обладают также α-токоферилацетат и α-токоферилхинон, не проявляющие антиоксидантных
свойств. Интересно, что N-ацетил-L-цистеин,
полностью восстанавливающий жизнеспособность тимоцитов (рис. 1), снижает внутриклеточное содержание Н2О2 практически в той же
степени, что и α-токоферол. Вполне вероятно,
что высокая выживаемость тимоцитов в данном случае обусловлена способностью N-ацетил-L-цистеина улавливать помимо пероксида
водорода иные АФК.
Ранее нами было показано, что α-токоферол, α-токоферилацетат и α-токоферилхинон
не предотвращают окислительное превращение оксигемоглобина в метгемоглобин в эритроцитах крысы, однако все три соединения в
равной степени эффективно ингибируют гемолиз эритроцитов, проявляя мембраностабилизирующие свойства [23]. Известно, что Н2О2
способен вызывать структурные изменения
биологических мембран, увеличивая текучесть
мембран астроцитов и стабилизируя жидкокристаллическую структуру искусственных
мембран, состоящих из липидного экстракта
мозга крысы [24]. Вполне вероятно, что структурирование плазматической мембраны и, как
результат, снижение ее проницаемости для
находящегося во внеклеточном пространстве
Н2О2 обеспечивает защитный эффект α-токоферола и его производных в случае с тимоцитами.
Необходимо отметить, что в данной модели Н2О2 изначально находится во внеклеточном
пространстве, что может и не соответствовать
физиологическим условиям, при которых АФК
образуются непосредственно внутри клетки.
В связи с этим нами была использована модель оксидативного стресса, индуцируемого
производным витамина К – менадионом (витамин К 3, 2-метил-1,4-нафтохинон). Менадион
вызывает оксидативный стресс за счет способности в результате одноэлектронного восстановления превращаться внутри клетки в радикал семихинона, который, в свою очередь,
вступая в окислительно-восстановительный
цикл с молекулярным кислородом, приводит
к образованию АФК, в основном супероксида
[25]. Кроме того, установлено, что цитотоксическое действие менадиона может быть непосредственно связано с пероксидным окислением липидов [26].
Как показано на врезке рис. 4, тимоциты крысы довольно чувствительны к действию
менадиона. Половина количества тимоцитов
гибнет при его концентрации 20 мкМ, а повышение концентрации до 100 мкМ приводит к массовой гибели клеток. Увеличение
количества «апоптических» фрагментов ДНК
наблюдается лишь при концентрации менадиона 10 мкМ, дальнейшее повышение концентрации цитотоксического агента приводит
к индукции некротической гибели тимоцитов
(рис. 5). Хотя по данным литературы менадион
в концентрации ниже 40 мкМ либо не проявляет цитотоксического действия [27,28], либо
вызывает апоптоз [26], и лишь в концентрации
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1
2
3
4
5
6
Рис. 3. Внутриклеточное содержание пероксида водорода в тимоцитах крысы при инкубации с пероксидом водорода и добавлении α-токоферола и его аналогов: 1 – контроль; 2 – Н2О2 , 100 мкм;
3 – +α-токоферол, 100 мкм; 4 – +α-токоферилацетат, 100 мкм; 5 – +α-токоферилхинон, 100 мкм;
6 – +N-ацетил-L-цистеин, 10 мм (M ± m, n = 5), * p < 0,001 относительно добавления Н2О2
98
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Г. В. ПЕТРОВА, Г. В. ДОНЧЕНКО
100
Жизнеспособность клеток, %
100
Жизнеспособность клеток, %
80
60
80
60
40
20
0
0
40
10 20
50
100
Менадион, мкМ
20
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 4. Жизнеспособность тимоцитов крысы при инкубации с менадионом в различных концентрациях (врезка) и добавлении α-токоферола и его аналогов (рис.): 1 – контроль; 2 – менадион, 20 мкм;
3 – +α-токоферол, 100 мкм; 4 – +α-токоферилацетат, 100 мкм; 5 – +α-токоферилхинон, 100 мкм;
6 – +N-ацетил-L-цистеин, 10 мм (M ± m, n = 6), * p < 0,001 относительно добавления менадиона
100 мкМ и выше индуцирует некроз. Как следует из рис. 4, α-токоферол повышает выживаемость клеток при действии менадиона в концентрации 20 мкМ, однако, как и в случае с
Н2О2, жизнеспособность клеток увеличивается
незначительно. При концентрации менадиона
50 мкМ и выше мы не обнаружили существенного ингибирующего эффекта α-токоферола (данные не представлены). Тем не менее,
в этом случае способность ингибировать цитотоксическое действие менадиона проявляет
лишь α-токоферол, в то же время как α-токоферилацетат и, особенно α-токоферилхинон,
вызывают дополнительное увеличение гибели
клеток. N-ацетил-L-цистеин, как и в случае с
Н2О2, практически полностью восстанавливает жизнеспособность тимоцитов.
Повышение
содержания
супероксида
внутри клетки при концентрации менадиона
20 мкМ составляет около 25%, однако при увеличении его концентраций до субтоксичных
для тимоцитов, уровень супероксида превышает базальный почти в 3 раза (врезка на рис. 6).
То есть, как и в случае моделирования оксидативного стресса пероксидом водорода, для индукции менадионом гибели клеток достаточно
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
0 10
20 50 100
Концентрация менадиона, мкМ
Рис. 5. Электрофореграмма низкомолекулярных
фрагментов ДНК хроматина тимоцитов крысы,
образующихся при действии менадиона в различных концентрациях. Представлена типичная
картина распределения из трех независимых экспериментов
99
ЕКсПЕРИмЕНТАльНі РОбОТИ
4
3
2
Кратность увеличения, числоо раз
Кратность увеличения, число раз
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
10 20
50
100
Менадион, мкМ
1
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 6. Внутриклеточное содержание супероксида в тимоцитах крысы при инкубации с менадионом
в различных концентрациях (врезка) и добавлении α-токоферола и его аналогов (рис.): 1 – контроль;
2 – менадион, 20 мкм; 3 – +α-токоферол, 100 мкм; 4 – +α-токоферилацетат, 100 мкм; 5 – +α-токоферилхинон, 100 мкм; 6 – +N-ацетил-L-цистеин, 10 мм. M ± m, n = 5, * p < 0,05 относительно
добавления менадиона
повышение уровня АФК не более чем на 30%.
Однако, в отличие от внутриклеточного содержания Н2О2, α-токоферол и α-токоферилацетат
не изменяют, а α-токоферилхинон, напротив,
достоверно увеличивает продукцию клеткой
супероксида (рис. 6). Как показано нами ранее,
α-токоферилхинон не является токсичным для
тимоцитов [8], хотя его аналог с укороченной
до 6 атомов углерода боковой цепью обладает
выраженными цитотоксическими свойствами
[29], что обусловлено повышенным проникновением короткоцепочечных производных
α-токоферола через плазматическую мембрану
и накоплением их в клетке в концентрациях,
достаточных для проявления цитотоксических
свойств. Синергизм в действии менадиона и
α-токоферилхинона может определяться сходством их химической структуры, поскольку
оба они являются замещенными n-хинонами,
имеющими боковые изопреноидные цепи. Кроме того, α-токоферилхинон, как и менадион,
способен генерировать супероксид и синглетный кислород [30]. Поэтому даже незначительное количество α-токоферилхинона на
фоне повышения продукции АФК химически
сходными соединениями может приводить к
100
усилению оксидативного повреждения клетки.
Именно этим, очевидно, обусловлена потенциальная токсичность для организма высоких доз
α-токоферола и наличие сложных механизмов
его транспорта и метаболизма, направленных
на поддержание относительно низких концентраций в клетке [31]. Кроме того, сходные пути
метаболизма для витаминов Е и К [32], а также активация ими экспрессии гена CYP3A4,
ответственного за катаболизм ксенобиотиков
[33], свидетельствуют о возможности побочных эффектов также при совместном введении
этих витаминов.
Хотя α-токоферол защищает тимоциты от
токсического действия менадиона, при этом не
наблюдается снижение количества внутриклеточного супероксида, что не подтверждает способность α-токоферола выступать в качестве
антиоксиданта. Очевидно, что в данном случае его цитопротекторное действие обусловлено иной, более специфической биологической активностью. Отметим, что способность
α-токоферола ингибировать цитотоксичность
различных агентов связывают с активацией
им экспрессии генов, ответственных за синтез
цитохрома Р450, что приводит к повышению
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Г. В. ПЕТРОВА, Г. В. ДОНЧЕНКО
катаболизма ксенобиотиков [34,35]. Однако такой механизм в большей степени свойственен
клеткам печени, обладающим наиболее мощной системой детоксикации, и где происходят
основные процессы, обеспечивающие биодоступность α-токоферола [31]. Вопрос о том,
возможен ли такой механизм в клетках других
тканей, остается открытым.
Таким образом, способность α-токоферола ингибировать индуцированную развитием
оксидативного стресса гибель тимоцитов незначительна, не зависит от наличия в структуре хроманового ядра его молекулы свободной ОН-группы, ответственной за проявление
антиоксидантных свойств, и не коррелирует
с его влиянием на содержание внутриклеточных АФК. Полученные данные позволяют
заключить, что α-токоферол не играет основной роли в защите клеток от повреждающего
действия АФК, что ставит под сомнение его
способность предотвращать оксидативный
стресс. Эффективность в данной модели предшественника глутатиона N-ацетил-L-цистеина
свидетельствует о вовлечении в этот процесс
других систем антиоксидантной защиты.
роль α-токоферолу
в оксидативному
стресі тимоцитів щура,
індукованому пероксидом
водню та менадіоном
Г. В. Петрова, Г. В. Донченко
Інститут біохімії ім О. В. Палладіна
НАН України, Київ;
e-mail: petrova@biochem.kiev.ua
Досліджували вплив α-токоферолу та його
аналогів, що не виявляють властивостей антиоксиданту – α-токоферилацетату та α-токоферилхінону, – на виживаність тимоцитів щура
і внутрішньоклітинний вміст активних форм
кисню (АФК) за моделювання оксидативного
стресу пероксидом водню й менадіоном. Установлено, що здатність α-токоферолу інгібувати
індуковану розвитком оксидативного стресу
загибель тимоцитів незначна, не залежить від
наявності у структурі хроманового ядра його
молекули вільної ОН-групи, відповідальної
за прояв антиоксидантних властивостей, і не
корелює з його впливом на вміст внутрішньоклітинних АФК. Ефективність у даній моделі
попередника синтезу глутатіону N-ацетил-Lцистеїну свідчить про залучення в ці процеси інших систем антиоксидантного захисту.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3
Одержані дані дозволяють зробити висновок,
що α-токоферол не відіграє основної ролі в захисті клітин від ушкоджувальної дії АФК, що
ставить під сумнів його здатність запобігати
оксидативному стресу.
К л ю ч о в і с л о в а: α-токоферол, α-токоферилацетат, α-токоферилхінон, менадіон,
пероксид водню, оксидативний стрес, активні
форми кисню, N-ацетил-L-цистеїн.
role of α-tocopherol
in oxidative stress of rat
thymocytes induced
by hydrogen peroxide
and menadione
G. V. petrova, G. V. Donchenko
Palladin Institute of Biochemistry, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: petrova@biochem.kiev.ua
Summary
T paper deals with studying the effect of
α-tocopherol and its analogues (α-tocopheryl acetate and α-tocopheryl quinine) showing no antioxidant properties on rat thymocytes survival
and intracellular content of reactive oxygen species (ROS) at H2O2 and menadione-induced oxidative stress. It is established, that the ability of
α-tocopherol to inhibit the thymocytes destruction
induced by the development of oxidative stress is
insignificant. It does not depend on the presence
of free OH-group in the structure of α-tocopherol molecule responsible for development of antioxidant properties, and does not correlate with its
influence on intracellular ROS content. The efficiency of the glutathione synthesis predecessor
N-acetyl-L-cysteine in the given model testifies to
the involving of other systems of antioxidative protection in these processes. The obtained data allow
to conclude, that α-tocopherol does not play the
main role in the protection of cells against ROS
damaging action that calls into question its ability
to prevent the oxidative stress.
K e y w o r d s: α-tocopherol, α-tocopheryl acetate, α-tocopheryl quinone, menadione, hydrogen
peroxide, oxidative stress, reactive oxygen species,
N-acetyl-L-cysteine.
1. Sies H. / Oxidative Stress and Vascular
Disease. Ed. J. F. Keaney Jr. Boston: Kluwer
Academic. – 2000. – Р. 1–8.
2. Genestra M. // Cellular Signal. – 2007. – 19,
N 9. – Р. 1807–1819.
101
ЕКсПЕРИмЕНТАльНі РОбОТИ
3. Петрова Г. В., Капралов А. А., Донченко Г. В.
// Укр. біохім. журн. – 2003. – 75, № 6. –
С. 25–34.
4. Sylvester p. W. // Vitam. Horm. – 2007. –
76. – Р. 329–356.
5. Azzi A. // Free Radic. Biol. Med. – 2007. – 43,
N 1. – Р. 16–21.
6. Traber M. G., Atkinson J. // Ibid. – 2007. – 43,
N 1. – P. 4–15.
7. Brigelius-Flohe R., Davies K. J. A. // Ibid. –
P. 2–3.
8. Петрова Г. В., Капралов А. А., Донченко Г. В.
// Укр. біохім. журн. – 2003. – 75, № 1. –
С. 78–84.
9. Herrmann M., Lorenz H. M., Voll R. et al. //
Nucleic Acids Res. – 1994. – 22, N 24. –
P. 5506–5507.
10. LeBel C. p., Ischiropoulos H., Bondy S. C.
// Chem. Res. Toxicol. – 1992. – 5, N 2. –
P. 227–231.
11. Carter W. O., Narayanan p. K., Robinson J. p.
// J. Leukoc. Biol. – 1994. – 55, N 2. – P. 253–
258.
12. Koren R., Wacksberg S., Weitsman G. E. et al.
// J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2006. –
101, N 2–3. – P. 151–160.
13. Saito Y., Nishio K., Ogawa Y. et al. // Free.
Radic. Res. – 2006. – 40, N 6. – P. 619–630.
14. Weitsman G. E. , Koren R., Zuck E. et al. //
Free Radic. Biol. Med. – 2005. – 39, N 2. –
P. 266–278.
15. De Flora S., Izzotti A., D’Agostini F. et al. //
Carcinogenesis. – 2001. – 22, N 7. – P. 999–
1013.
16. Liu C. S., Chen N. H., Zhang J. T. //
Phytomedicine. – 2007. – 14, N 7–8. –
P. 492–497.
17. Mazlan м., Mian T. S., Top G. M. et al. //
J. Neurogical. Sci. – 2006. – 243, N 1–2. –
Р. 5–12.
18. Estany S., palacio J. R., Barnadas R. // J.
Reproduct. Immunol. – 2007. – 75, N 1. –
P. 1–10.
102
19. Kempna p., Reiter E., Arock M. et al. // J. Biol.
Chem. – 2004. – 279, N 49. – P. 50700–
50709.
20. Haendeler J., popp R., Goy C. et al. // Ibid. –
2005. – 280, N 52. – P. 42945–42951.
21. Chow J. M., Shen S .C., Huan S. K. et al. //
Biochem. Pharmacol. – 2005. – 69, N 12. –
P. 1839–1845.
22. piga R., Saito Y., Yoshida Y. et al. //
Neurotoxicology. – 2007. – 28. – P. 65–75.
23. Петрова Г. В. // Укр. біохім. журн. – 2007. –
79, № 4. – С. 41–47.
24. Zhu D., Tan K. S., Zhang X. et al. // J. Cell
Sci. – 2005. – 118, N 16. – P. 3695–3703.
25. Monks T. J., Lau S. S. // Crit. Rev. Toxicol. –
1992. – 22, N 5–6. – P. 243–270.
26. Chiou T. J., Chu S. T., Tzeng W. F. //
Toxicology – 2003. – 191, N 2–3. – P. 77–
88.
27. Wrуbel M., Jurkowska H. // Acta Biochem.
Pol. – 2007. – 54, N 2. – P. 407–411.
28. Verrax J., Cadrobbi J., Marques C. et al. //
Apoptosis. – 2004. – 9, N 2. – P. 223–233.
29. Петрова Г. В., Донченко Г. В. // Укр. біохім.
журн. – 2005. – 77, N 4. – С. 77–83.
30. Crisostomo A. G., Moreno R. B., Navaratnam S.
et al. // Free Radic. Res. – 2007. – 41, N 6. –
P. 730–737.
31. Traber M. G. // Annu. Rev. Nutr. – 2007. –
27. – P. 347–362.
32. Landes N., Birringer M., Brigelius-Flohe R. //
Mol. Asp. Med. – 2003. – 24, N 6. – P. 337–
344.
33. Mustacich D. J., Leonard S. W., Devereaux M. W.
// Free Radic. Biol. Med. – 2006. – 41, N 7. –
P. 1069–1078.
34. Traber M. G. // Arch. Biochem. Biophys. –
2004. – 423, N 1. – P. 6–11.
35. Gonzаlez R., Collado J. A., Nell S. et al. //
Free Radic. Biol. Med. – 2007. – 43, N 10. –
P. 1439–1452.
Получено 22.01.08
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 3