На правах рукописи МАКАРОВА АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ
advertisement
На правах рукописи МАКАРОВА АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С ПРИ ВОСПАЛЕНИИ И РЕПАРАЦИИ ТКАНЕЙ 03.00.13 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 1 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор С.М. Струкова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук Е.Г. Колокольчикова, кандидат биологических наук А.Е. Коган ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт Физиологически Активных Веществ РАН Защита диссертации состоится 21 мая 2007г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Автореферат разослан 20 апреля 2007г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б.А. Умарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. При повреждении тканей активируются процессы свертывания крови и воспаления, образуется ряд протеиназ, в том числе сериновые протеиназы системы гемостаза - тромбин, фактор Ха (фХа) и активированный протеин С (АРС). Тромбин - ключевой прокоагулянт, поскольку превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, активирует факторы V, VIII, XI, XIII свертывания крови. Связывая рецепторы, активируемые протеиназами (PAR1 и PAR4), тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов, активацию клеток крови, соединительной ткани и запускает процессы воспаления (Coughlin 2000, 2005; Струкова 2001, 2006). Вместе с тем, тромбин регулирует свертывание крови по механизму отрицательной обратной связи, поскольку связывает на эндотелии нерасщепляемый рецептор – тромбомодулин и превращает протеин С в антикоагулянт - активированный протеин С. АРС, в свою очередь инактивирует факторы Va и VIIIa, участвующие в образовании протромбина, и тем самым блокирует процесс тромбообразования (Esmon 2003, 2005). В последнее противовоспалительном время и активно развивается антиапоптотическом представление действии АРС о на эндотелиальные клетки и моноциты, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе (Joyce еt аl., 2004; Mosnier, Griffin 2006). Показано взаимодействие АРС с двумя мембранными рецепторами эндотелиальным рецептором протеина С (ЕРСR) (Esmon 2000) и РАR1 эндотелия (Reiwald, Ruf 2005; Feistritzer et al., 2006). Рецепторы PAR1 экспрессируются всеми клетками, вовлекаемыми в процессы свертывания крови, воспаления и репарации тканей, что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций организма и в патогенезе хронических процессов (Macfarlane еt аl., 2001; Струкова 2001, 2006). В связи с этим весьма актуальным является изучение механизмов противовоспалительного действия АРС. рецептор-опосредованных 3 Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, β-гексозаминадазу, протеазы, цитокины, оксид азота (NO) и др. (Metcalfe еt аl., 1997). NO регулирует активность тучных клеток, повышая уровень цГМФ, секрецию медиаторов и ингибируя агрегацию тромбоцитов (Bunnett 2006). Тучные клетки тонкого кишечника секретируют дуоденазу (ЕС 3.4.21) – сериновую протеиназу, обнаруженную в слизистой двенадцатиперстной кишки, которая помимо участия в активации протеиназ пищеварения, может играть роль в воспалении (Pemberton et al., 2002). Роль АРС и других сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PAR на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) (Струкова 2001). Ранее в нашей лаборатории было установлено PAR1опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PAR1 (PAR1-AP) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток (Strukova еt аl., 1996, 1999). На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие тромбина и PAR1-АР, что свидетельствует о дополнительной экспозиции PAR1 на тучных клетках в условиях воспаления (Dugina еt аl., 2003). Иммобилизованный в полимерные матрицы PAR1-АР ускоряет заживление кожных ран (у мышей и крыс), что подтверждает регуляторную функцию агонистов PAR1 при воспалении - первой фазе заживления ран (Strukova et al., 2001, 2002; Дугина и др., 2004). Однако до настоящего времени не было исследовано влияние АРС на активность тучных клеток при воспалении. В связи с этим изучение участия тучных клеток в реализации противовоспалительного действия АРС, а также влияние АРС на процесс заживления экспериментальной актуальным и перспективным. язвы желудка представляется весьма 4 Цели и задачи исследования. Цель работы – выявление механизмов действия активированного протеина С (АРС) на секреторную активность тучных клеток при воспалении, и выяснение участия АРС в репарации тканей на модели экспериментальной язвы желудка. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать динамику появления протеиназ системы гемостаза (фXа, тромбина, АРС) в перитонеальной жидкости (на модели острого воспаления у крыс). 2. Изучить влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в моделях спонтанной и вызванной активации. Оценить влияние АРС на активность тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом. 3. Исследовать PAR- опосредованные механизмы действия АРС на тучные клетки. 4. Исследовать действие АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка. Научная новизна работы. На модели острого воспаления у крыс впервые обнаружено появление сериновой протеиназы системы гемостаза – АРС, вслед за появлением тромбина в перитонеальной жидкости. Впервые показано, что противовоспалительное действие АРС может реализовываться через регуляцию активности тучных клеток. В моделях спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток выявлено, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Кроме того, впервые показано протекторное влияние АРС на секреторную активность тучных клеток, полученных от крыс с острым воспалением. Впервые установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PAR1 рецепторов, поскольку их десенситизация тромбином предотвращает вызываемое АРС снижение секреции β-гексозаминидазы, а 5 инактивированный APC не имитирует действие фермента на тучные клетки. Показано, что действие АРС на тучные клетки блокируется катепсином G и протеиназой желудочно-кишечного тракта и тучных клеток – дуоденазой, которая, как установлено, стимулирует секрецию медиаторов воспаления перитонеальными тучными клетками через PAR1. Показано, что регуляция секреторной активности тучных клеток АРС обусловлена усилением генерации эндогенного оксида азота, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME - ингибитора образования NO. На модели экспериментальной язвы желудка у крыс впервые показано, что АРС при однократном введении сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных функций активированного протеина С в процессах воспаления. Нами обнаружено появление протеиназ системы гемостаза (тромбина и АРС) в перитонеальной жидкости на модели острого воспаления у крыс. Впервые выявлено противовоспалительное действие АРС на перитонеальные тучные клетки в норме и при воспалении. Показано, что АРС блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками через высокоспецифичную активацию PAR1 рецептора и аутокринную регуляцию оксидом азота ответа тучных клеток. Имеют практическое значение данные о том, что АРС, подобно пептидуагонисту PAR1, иммобилизованному в полимерные микрочастицы, способен ускорять (после однократного внутрижелудочного введения) заживление экспериментальной язвы желудка. Создание нового класса антиульцерогенных препаратов на основе АРС и пептидов-агонистов PAR1 представляется перспективным в связи с их высокой эффективностью. 6 Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были доложены на I Съезде физиологов СНГ (Россия, Дагомыс, 2005), Всероссийской Современные конференции достижения» «Тромбозы, (Россия, геморрагии, Москва, 2005), ДВС-синдром. Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2006), 18-м Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (USA, San-Diego, 2006), заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2006), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Россия, Москва, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (в том числе 6 статей). Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 246 источников). Работа иллюстрирована 47 рисунками. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. В работе использовали самцов крыс Вистар весом 250-300г. Материалы: АРС (Chromogenix, Sigma); синтетический пептид – агонист PAR1 (PAR1-АР, SFLLRN) (Biosyntan, Berlin, Germany; Российский Кардиологический Научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва, 7 Россия); дуоденаза (26.5кДа, любезно предоставлена к.х.н. Т.С. Замолодчиковой, ИБХ РАН, Москва); фактор Xa, α-тромбин человека, фиколл400, L-NAME, фенилметилсульфонил фторид (PMSF), хромогенный субстрат для β-гексозаминидазы - р-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (Sigma); хромогенные субстраты для АРС - pyroGlu-Pro-Arg-pNA (S-2366), для тромбина - H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238), для фХа - Boc-Pro-Gly-Arg-pNA (S2222) (Chromogenix); для дуоденазы - Tos-Gly-Pro-Lys-pNA (Sigma); АДФ, фактор активации тромбоцитов (PAF) (Serva); вещество 48/80 (Biomol); Трис (ICN). Раствор Тироде (все реактивы Sigma): NaCl 145мМ, HEPES 10мМ, KCl 5мМ, CaCl2 1мМ, MgCl2 1мМ, глюкоза 5мМ, 0.1% сывороточного альбумина, рН 7.4; буфер Na-HEPES: NaCl 145мМ, HEPES 10мМ, рН 7.4. В работе использовали следующие методы: Определение содержания АРС, тромбина и фХа в перитонеальной жидкости крыс при воспалении. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 40%-го раствора тиогликолата Na в дозе 4г/кг (по методу Pejler, 1999) в модификации Dugina et al., 2003). В исследуемые интервалы времени (1-30 мин, 1-17 часов после инициации перитонита) отбирали образцы экссудата из перитонеальной полости, клетки отделяли центрифугированием и в супернатанте определяли содержание общего белка (по методу Бредфорд) и амидазную активность ферментов по отношению к специфическим хромогенным субстратам: тромбина - S2238 (H-D-Phe-Pip-ArgpNa), АРС - S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) или фХа - S2222 (Boc-Pro-Gly-ArgpNA). Стандартные препараты тромбина (1000 NIH ед/мг), АРС и фХа использовали для построения калибровочных графиков. Количество протеиназ рассчитывали на общее количество белка в пробе. Для характеристики воспаления рассчитывали индекс дегрануляции (ИД) тучных клеток по формуле: ИД=Д/(Д+Н), где Д – количество дегранулированных тучных клеток, Н – количество не активированных тучных клеток. 8 Концентрирование и определение активности АРС. АРС (Chromogenix, CША) освобождали от примеси солей и пептидов (< 10кДа) и концентрировали в пробирках Центрикон-10 пятикратным центрифугированием и отмывкой. Определяли амидазную активность APC по отношению к хромогенному субстрату S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) и антикоагулянтную активность АРС по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) свертывания плазмы крови человека. Количество АРС рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта (АРС, Sigma). Активность дуоденазы определяли спектрофотометрически по отношению к субстрату Tos-Gly-Pro-Lys-pNA. Влияние протеиназ и пептидов-агонистов PAR1 на секрецию перитонеальных тучных клеток. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости самцов крыс линии Вистар по методу Thon, Uvnas (1967) в нашей модификации. Перитонеальные тучные клетки инкубировали (10 мин при 37°С) с препаратами: АРС; АРС, инактивированного PMSF; дуоденазы; дуоденазы, инактивированной SBВI; тромбина; фактора Ха; PAR1-AP. Для ингибирования синтеза NO, тучные клетки инкубировали с 300 мкМ L-NAME (30 мин при 37°С). Исследовали действие АРС (0.5-20нМ) на клетки, активированные веществом 48/80 (400мкг/мл). Отбирали аликвоты для определения активности β-гексозаминидазы методом Schwartz et al. (1982) по расщеплению хромогенного субстрата - р-нитрофенил-N-ацетил-β-D- глюкозаминида. Вычисляли содержание β-гексозаминидазы по формуле: %секреции=А/(А+Б)·100%, где А – содержание β-гексозаминидазы в супернатанте, Б – в осадке. Десенситизировали PAR1 рецепторы 100нМ тромбином до добавления действующих концентраций агонистов (АРС, фХа, дуоденазы). Принцип метода основан на способности активированных рецепторов к интернализации и толерантности к последующим предъявлениям агониста. 9 Исследование активности тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом. Для стабилизации клеток использовали антагонист Н1 гистаминовых рецепторов – кетотифен, который вводили животным интрагастрально (Dugina et al., 2003) за 10 часов и за 1 час до введения тиогликолата. Животным контрольной группы вводили кетотифен по той же схеме. Затем внутрибрюшинным введением тиогликолата Na вызывали острое воспаление у крыс и через 16 часов после его индукции выделяли перитонеальные тучные клетки и исследовали их активацию агонистами. Определение агрегации тромбоцитов. Для анализа агрегации тромбоцитов использовали богатую тромбоцитами плазму (PRP) человека. Из цитратной крови получали PRP и бедную тромбоцитами плазму (PPP). Агрегацию тромбоцитов определяли с помощью лазерного агрегометра (Биола, Россия). Действие АРС на заживление экспериментальной язвы желудка. На модели повреждения слизистой оболочки желудка у крыс ледяной уксусной кислотой по методу Okabe (1971) в нашей модификации изучали действие АРС (Chromogenix). АРС (110 мкг/200г веса) вводили интрагастрально в плюроническом геле спустя 2 часа после операции. Динамику заживления язвы желудка оценивали на 3 и 7-е сутки после операции. Критериями оценки были относительная площадь язвы и параметры морфометрического анализа образцов грануляционной ткани. Статистическую обработку данных проводили, используя t-критерий Стьюдента. Результаты представлены как средние значения из 4-6 независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Различия считали достоверными при значении Р<0.05. n - количество животных в эксперименте. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика появления протеиназ гемостаза в перитонеальной полости крыс при воспалении Ранее в нашей лаборатории было показано увеличение проницаемости эндотелия сосудов тонкого кишечника и появление тромбина в перитонеальной 10 полости крыс в первые 30-й мин острого воспаления (Киселева и др., 2004). Мы предположили, что другие протеиназы гемостаза - фактор Ха, предшествующий тромбину и АРС, образуемый при активации тромбином (связанным с тромбомодулином эндотелия сосудов) профермента - протеина С – могут проникать в очаг острого воспаления из кровотока. Определение активности ферментов перитонеальной жидкости по отношению к амидазному субстрату Boc-Pro-Gly-Arg-pNA, специфичному к фактору Ха, не выявило появления фактора Ха в исследуемые промежутки времени (5-180 мин после индукции воспаления). Вместе с тем, подтверждено появление тромбина (специфически расщепляющего H-D-Phe-Pip-Arg-pNa) в очаге воспаления. При этом максимум концентрации тромбина (2.37±0.88 нМ/мг белка, n=6) наблюдали уже на 10-й минуте после индукции перитонита. Концентрация тромбина в перитонеальной жидкости оставалась достоверно высокой на протяжении первых 30 минут воспаления, а затем снижалась. Рис. 1. Динамика появления АРС в перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления в течение 17 часов (n=6), *Р<0.05 – по отношению к 1-й мин воспаления. Появление АРС в перитонеальной полости нами было обнаружено на 60-й минуте после индукции воспаления - в концентрации, в 3.6 раза 11 превышающей исходную концентрацию (1 мин). Максимальную концентрацию АРС регистрировали на 120-й минуте развития воспаления (4.91±0.9 нМ/мг белка, n=6) (рис.1). Отсроченное появление АРС в перитонеальной полости можно объяснить малой эффективностью протеолиза профермента протеина С тромбином, что обусловлено блокадой экспрессии рецептора тромбина – тромбомодулина, при остром воспалении (Esmon, 2003). У животных контрольной группы не наблюдали генерации фактора Ха, тромбина и АРС в исследуемые временные точки. Доказательства в пользу появления тромбина в перитонеальной жидкости при воспалении были получены в следующей серии экспериментов с помощью высокоселективного специфического ингибитора тромбина – гирудина. Показано, что в присутствии гирудина в перитонеальной жидкости крыс на 1030 мин после индукции воспаления не регистрируется амидазная активность по отношению к специфическому субстрату тромбина. Вместе с тем, присутствие гирудина не влияло на амидазную активность перитонеальной жидкости по отношению к специфическому субстрату АРС. Так как нами было обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной жидкости крыс при воспалении, в следующей серии экспериментов мы исследовали действие АРС и других протеиназ на перитонеальные тучные клетки в норме (спонтанная активность) и при их активации индукторами дегрануляции. 2. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток (в моделях спонтанной и вызванной активации) При исследовании влияния АРС на спонтанно активированные тучные клетки крысы нами было выявлено протекторное действие фермента на клетки. Установлено, что в группе клеток с низкой спонтанной активностью (13.0±3.1%) АРС в концентрациях 0.5 и 1.0 нМ вызывал достоверное снижение секреции β-гексозаминидазы на 54% и 28.4% (соответственно) относительно спонтанного уровня секреции (Р<0.05, n=7). В группе тучных клеток с высокой спонтанной активностью (23.2±8.0%) 12 обнаружено усиление протекторного эффекта АРС в низких концентрациях (0.5, 1.0 и 2.5 нМ, ЕС50=0.19 нМ) на клетки: достоверное снижение секреции βгексозаминидазы соответственно на 43.8%, 36.7% и 25.1% относительно спонтанного уровня секреции (Р<0.05, n=6). При концентрациях АРС ниже 0.2 нМ (0.05 и 0.1 нМ) и выше 2.5 нМ (5.0-20 нМ) не наблюдали достоверного изменения секреции β-гексозаминидазы (Рис. 2). Рис. 2. Изменение секреции β-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками крысы (с разной спонтанной секрецией) под действием АРС (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к спонтанной секреции (СП), n=6). Во второй серии экспериментов исследовано влияние АРС на секрецию медиатора тучными клетками, активированными стимулятором экзоцитоза веществом 48/80, которое непосредственно активирует G-белок и индуцирует сигнальные пути, приводящие к дегрануляции тучных клеток (Metcalfe et al., 1997). В наших экспериментах вещество 48/80 в концентрации 400 мкг/мл вызвало высокую степень дегрануляции тучных клеток, а уровень секреции βгексозаминидазы такими клетками составил 53.6±5.7%. Предварительная инкубация тучных клеток с АРС в диапазоне концентраций 0.5-2.5 нМ достоверно снижала вызванную веществом 48/80 секрецию β-гексозаминидазы до 47.6±0.8 - 38.3±1.7% (Р<0.01, n=6) (Рис.3). Более высокие концентрации АРС (≥3 нМ) не вызывали достоверных изменений индуцированной веществом 48/80 секреции. 13 Рис. 3. Влияние АРС на вызванную веществом 48/80 секрецию β-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, n=6). В третьей серии экспериментов мы исследовали действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом, который вызывали внутрибрюшинным введением тиогликолата Na. Для стабилизации клеток использовали антагонист Н1 гистаминовых рецепторов – кетотифен. Секреция β-гексозаминидазы тучными клетками под действием вещества 48/80 была принята за 100%. Было показано, что в опытной группе (тучные клетки, полученные от животных с перитонитом) АРС в концентрациях 0.01, 0.05, 0.1 и 1.0 нМ снижал секрецию β-гексозаминидазы на 30.96±8.9, 38.52±9.8, 37.93±1.4 и 38.6±13.35% (относительно действия вещества 48/80) (Р<0.05, n=5) (Рис.4). В контрольной группе АРС в тех же концентрациях не вызвал изменений в секреции β-гексозаминидазы тучными клетками. Эти данные свидетельствуют в пользу нашей гипотезы о том, что АРС в низких концентрациях регулирует активность тучных клеток не только в норме, но и при воспалении (остром перитоните у крыс), блокируя секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. 14 Рис. 4. Действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом (вызванная веществом 48/80 секреция β-гексозаминидазы принята за 100%, *Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, n=5). Так как активация свертывания крови при воспалении ведет к образованию ряда протеиназ системы гемостаза, предшествующих появлению АРС, в следующих экспериментах нами было проведено сравнение эффекта АРС с действием других протеиназ (фактора Ха и тромбина) на тучные клетки. Показано, что фактор Ха в диапазоне концентраций 0.2-45 нМ вызывал повышение секреции β-гексозаминидазы тучными клетками. Максимум секреции медиатора составил 40.3±8.3% при спонтанной секреции 18.7±7.3% (Р<0.05, n=8). При этом предварительная (в течение 10 минут) инкубация тучных клеток с фактором Ха не влияла на секрецию, вызванную веществом 48/80. Сравнение эффекта фактора Ха с действием тромбина на тучные клетки показало, что фактор Ха - более сильный индуктор дегрануляции, поскольку его максимальное провоспалительное действие проявляется в значительно меньших (на 2 порядка) концентрациях (ЕС50 = 0.64нМ), чем действие тромбина (ЕС50 = 87нМ). Таким образом, фактор Ха, образуемый на стадии инициации свертывания крови в низких (нМ) концентрациях, еще до появления 15 тромбина может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секрецию тучных клеток. Известно, что тучные клетки тонкого кишечника секретируют, наряду с катепсином G - антагонистом/агонистом PAR1, триптазой - агонистом PAR2, сериновую протеиназу - дуоденазу, первоначально обнаруженную в бруннеровых железах двенадцатиперстной кишки (Zamolodchikova et al., 2000; Pemberton et al., 2002). О роли дуоденазы в воспалительных реакциях организма и регуляции активности тучных клеток перитонеальной полости нет данных. Мы предположили, что дуоденаза, помимо участия в каскаде активации ферментов пищеварения, может регулировать секреторную функцию тучных клеток через активацию рецепторов PAR1. Обнаружено, что дуоденаза в концентрациях 1.0, 8.0 и 80 нМ вызывает повышение секреции βгексозаминидазы на 30, 69 и 159% относительно уровня спонтанной секреции (Р<0.05, n=5). Положительная дозозависимая корреляция секреции β- гексозаминидазы от концентрации дуоденазы может указывать на ее провоспалительную активность. Однако, предварительная инкубация клеток с дуоденазой (0.1-80 нМ) не влияла на секрецию, вызываемую веществом 48/80. Итак, наши данные свидетельствуют о том, что протеиназы гемостаза АРС, тромбин и фактор Ха и протеиназа тучных клеток – дуоденаза, участвуют в регуляции начальных стадий воспаления, вызывая повышение (тромбин, фактор Ха, дуоденаза) или снижение (АРС) секреции медиатора воспаления - βгексозаминидазы тучными клетками. Обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной полости крыс при воспалении и выявлен защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС (0.01-10 нМ) на тучные клетки, полученные от животных с перитонитом. 3. Механизмы действия АРС на тучные клетки Участие рецепторов PAR в действии АРС на тучные клетки Об участии рецепторов PAR в реализации действия протеиназы на функцию клетки может свидетельствовать изменение ответа клетки при действии инактивированной протеиназы, не способной расщеплять рецептор, а 16 также изменение ответа клетки на АРС после десенситизации PAR. Для проверки предположения о действии АРС на тучные клетки через PAR получали инактивированный с помощью PMSF фермент. Инактивация АРС приводила к потере более 98% амидазной активности по отношению к специфическому хромогенному субстрату (pyroGlu-Pro-Arg-pNA). Обнаружено, что инактивированный АРС теряет способность регулировать активность тучных клеток и секреция β-гексозаминидазы в ответ на инактивированный АРС (1нМ) составила 22.9±4.9% при спонтанной секреции - 22.8±3.7% (Рис. 5 А). В то же время активная форма АРС (1нМ) вызывала достоверное снижение секреции тучных клеток - до 14.7±3.6% (P<0.05, n=6). Эти данные свидетельствует о действии АРС на тучные клетки через протеолитически расщепляемый рецептор (PAR), хотя не опровергают возможного вклада нерасщепляемого рецептора EPCR в реализацию действия АРС. Рис. 5. Отмена эффекта АРС (черные столбцы) на тучные клетки после инактивации фермента (полосатый столбец) (А) или десенситизации PAR1 тромбином (100нМ, 10мин, полосатые столбцы) (Б), *Р<0.05 по отношению к спонтанной секреции (СП), n=4. В следующей серии опытов для выяснения подтипа PAR рецепторов, опосредующих действие АРС на тучные клетки, проводили десенситизацию 17 PAR1 тромбином. Показано, что десенситизация PAR1 отменяла ответ клеток на последующие предъявления АРС (Рис. 5 Б), при этом сохранялся ответ клеток на вещество 48/80, вызывающее дегрануляцию клеток без участия специфических рецепторов. Так, если АРС в концентрациях 0.7-1.5 нМ вызывал достоверное снижение секреции β-гексозаминидазы тучными клетками относительно спонтанного уровня, то после десенситизации PAR1 рецепторов тромбином этот эффект при последующих предъявлениях АРС отсутствовал (Р<0.05, n=4). Об участии рецепторов PAR1 в реализации действия АРС на тучные клетки также свидетельствуют эксперименты, в которых предварительная инкубация клеток с АРС (1.2 нМ) отменяла провоспалительный эффект пептида-агониста PAR1 (50 мкМ) (Рис. 6). Эти данные подтверждают гипотезу о регуляторном действии АРС на тучные клетки через активацию PAR1. Рис. 6. Предварительная активация тучных клеток АРС (1.2 нМ) отменяла провоспалительное действие PAR1-AP (50 мкМ) на клетки (*Р<0.05 - по отношению к спонтанной секреции (СП), n=4). Выяснение типа рецептора фактора Ха на тучных клетках показало, что десенситизация PAR1 тромбином (100нМ) не влияла на секрецию медиатора, вызванную фактором Ха (45 нМ), что свидетельствует о его действии на тучные клетки не через PAR1. Предварительная обработка тучных клеток АРС (0.9 нМ) 18 так же не влияла на вызванную фактором Ха (2.4 нМ) секрецию ßгексозаминидазы. Возможно, рецептором фактора Ха на тучных клетках (как и на других клетках (Strukova 2006)) является PAR2 . Рис. 7. Отмена действия дуоденазы (полосатые столбцы) на тучные клетки после десенситизации PAR1 тромбином (100нМ, 10мин, черные столбцы), n=4. Рис. 8. Предварительная инкубация тучных клеток с катепсином G (4мкМ) или дуоденазой (8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0.5 нМ, черные столбцы) на тучные клетки. * Р<0.05 - по отношению к спонтанной секреции (СП), n=5. 19 Рецептором на тучных клетках для дуоденазы, по-видимому, является PAR1, т.к. блокада ферментативной активности дуоденазы с помощью SBBI (соевый ингибитор протеиназ Баумана-Бирка) привела к существенному ингибированию (на 40%) способности дуоденазы активировать тучные клетки, а десенситизация PAR1 рецепторов тромбином отменяла действие дуоденазы (20 нМ) на клетки (Р<0.05, n=4) (Рис. 7). Эти данные свидетельствуют о том, что действие дуоденазы на тучные клетки может реализоваться через рецептор PAR1. Мы предположили, что дуоденаза работает подобно катепсину G, как агонист/антагонист (терминатор) рецептора. В следующих экспериментах было показано, что предварительная инкубация тучных клеток с катепсином G (4мкМ) - антагонистом рецептора PAR1, или дуоденазой (8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0.5 нМ) на тучные клетки (Рис.8). Еще одно подтверждение действия дуоденазы на клетки, как антагониста PAR1, получено в экспериментах по влиянию дуоденазы на агрегацию тромбоцитов, индуцированную пептидом PAR1-AP. Показано, что дуоденаза (16 и 160 нМ) снижала вызванную PAR1-AP (30-100мкМ) агрегацию тромбоцитов. Таким образом, рецептором АРС на тучных клетках служит PAR1 и он же является рецептором дуоденазы, которая может работать подобно катепсину G – как агонист/антагонист рецептора. Вклад NО в действие АРС на секреторную активность тучных клеток Показано, что обнаруженное нами снижение секреции β-гексозаминидазы под действием АРС обусловлено освобождением тучными клетками эндогенного NO, т.к. предобработка (30 минут) тучных клеток 300 мкМ LNAME до добавления АРС (0.5-2.5нМ) приводила к достоверному повышению в 1.5 раза секреции β-гексозаминидазы относительно уровня секреции в присутствии АРС (P<0.01, n=4) (Рис. 9). 20 Вызванное АРС снижение секреции медиатора тучными клетками, обработанными дегранулятором - веществом 48/80, также как обусловлено освобождением ими NO, т.к. предварительная инкубация клеток с L-NAME отменяла эффект снижения секреции β-гексозаминидазы под действием АРС на активированные веществом 48/80 тучные клетки (Рис. 9). Рис. 9. Предварительная инкубация тучных клеток с L-NAME (300мкМ) отменяет действие АРС на клетки. Слева – спонтанноактивированные клетки, справа – клетки, активированные веществом 48/80. Черные столбцы - действие АРС, белые - прединкубация клеток с L-NAME и последующее действие АРС (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к контролю, n=4). О вкладе NO в вызванную АРС регуляцию секреции тучными клетками свидетельствуют результаты медиаторов экспериментов с клетками, полученными от животных контрольной группы (к опыту с острым воспалением), получавших кетотифен (см. выше), который блокирует освобождение оксида азота (Eliakim et al., 1995). У этих тучных клеток АРС (в эффективных протекторных концентрациях (0.5-1nM)) не вызвал изменений в секреции β-гексозаминидазы. По-видимому, АРС, подобно тромбину (Strukova еt аl., 1999), может 21 вызывать аутокринную регуляцию освобождения NO тучными клетками. Наши данные подтверждают предположение о том, что рецепторы PAR на клетках-мишенях служат сенсорами протеиназ и вовлекаются в сопряжение процессов свертывания крови и воспаления (Strukova, 2006). 4. Влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка у крыс Недавно показано, что АРС стимулирует пролиферацию клеток в культуре кератиноцитов [Xue et al., 2005], вызывает ускорение заживления кожных ран у крыс, стимулируя ангиогенез, реэпителизацию и ингибируя воспаление [Jackson et al., 2005] и блокирует воспалительные ответы слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки у экспериментальных животных [Isobe et al., 2004]. Наши эксперименты показали, что АРС, подобно пептиду-агонисту PAR1 (PAR1-AP), при однократном внутрижелудочном введении может ускорять заживление экспериментальной язвы желудка. Анализ образцов ткани желудка в очаге язвообразования на 3 сутки после операции показал, что у животных опытной группы, которым вводили АРС уже на 3 сутки эксперимента воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контролем. Наблюдалось увеличение клеток с признаками фибробластической дифференцировки, что свидетельствует об ускоренном созревании предшественников фибробластов, мигрирующих в раневую зону. У животных, которым вводили АРС, содержание нейтрофилов было в 2 раза ниже, а фибробластов более чем в 1.5 раза выше, чем в контроле (Р<0.05, n=3). На 7 день после операции в грануляционной ткани животных, которым вводили АРС, преобладали четко ориентированные фибробластические элементы. Количество нейтрофилов было снижено в 2.3 раза, а количество фибробластов увеличено в 1.5 раза по сравнению с контролем (Р<0.05, n=3) (Рис. 10). 22 Рис. 10. Морфологические изменения подслизистой оболочки желудка на 3 (слева) и 7 (справа) сутки эксперимента (гематоксилин, эозин, ув. х400). Вверху - опытная (АРС), внизу – контрольная группа. Диаграммы отражают клеточный состав подслизистой оболочки желудка на 3 (слева) и 7 (справа) сутки эксперимента. Черные столбцы – физ. раствор (n=3), белые – АРС (n=3), *Р<0.05 по сравнению с контролем. Таким образом, на модели экспериментальной ацетатной язвы желудка показано, что АРС при однократном внутрижелудочном введении блокирует воспалительные ответы, сокращая фазу воспаления и сдвигая фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка. 23 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, установлено, что активированный протеин С может регулировать активность тучных клеток. В модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы (iv vitro) показано, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций (нМ) блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PAR1, поскольку десенситизация тромбиновых PAR1 рецепторов на тучных клетках отменяет вызванное APC снижение секреции β-гексозаминидазы. О действии АРС через расщепляемые рецепторы PAR свидетельствуют данные о том, что инактивированный PMSF APC, лишенный протеолитической активности, не имитирует действие фермента. Показана высокая специфичность активации PAR1 тучных клеток APC (EC50=0.19нМ). Установлено, что противовоспалительное действие низких концентраций АРС на тучные клетки, обусловлено усилением генерации NO, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME ингибитора образования NO. Показано, что действие низких концентраций АРС на тучные клетки блокируют эндогенные протеиназы: катепсин G и протеиназа желудочно-кишечного тракта – дуоденаза, которая активирует тучные клетки через рецепторы PAR1. На модели острого экспериментального воспаления у крыс обнаружено появление в перитонеальной полости сериновых протеиназ – АРС и тромбина, и выявлен противовоспалительный ответ перитонеальных тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом на низкие (пМ-нМ) концентрации АРС. Обнаружено, что при экспериментальной ацетатной язве желудка у крыс АРС, введенный однократно, сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о новой функции АРС - регуляции активности тучных клеток, что существенно расширяет представления о противовоспалительных свойствах АРС. 24 ВЫВОДЫ 1. На установлено, модели что острого индукция экспериментального воспаления перитонита сопровождается у крыс появлением в перитонеальной полости тромбина и АРС. Максимальная концентрация тромбина наблюдается на 10-й минуте, АРС - на 120-й минуте воспаления. Перитонеальные тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, отвечают на низкие концентрации АРС (0.05–10нМ) снижением секреции β-гексозаминидазы. 2. Показано, что активированный протеин С проявляет противовоспалительную активность в модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы. АРС дозозависимо в диапазоне низких концентраций блокирует спонтанную, вызванную веществом 48/80 и агонистами PAR1 секрецию β-гексозаминидазы тучными клетками. 3. Установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через PAR1, поскольку десенситизация PAR1 рецепторов тромбином отменяла вызванное низкими концентрациями АРС (<2.5 нМ) снижение секреции βгексозаминидазы, инактивированный PMSF APC не имитировал действие фермента на тучные клетки, и АРС модулировал дегрануляцию тучных клеток, вызванную тромбином и PAR1-AP. 4. Предобработка тучных клеток катепсином G или дуоденазой, которая, как показано, активирует тучные клетки через рецепторы PAR1, отменяет защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС на тучные клетки. 5. Противовоспалительное действие низких концентраций АРС на перитонеальные тучные клетки, обусловлено усилением генерации NО, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME. 6. На модели экспериментальной ацетатной язвы желудка у крыс показано, что АРС при однократном введении ускоряет заживление язвы, сокращая фазу воспаления и сдвигая на более ранние сроки фазу пролиферации. 25 Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Макарова А.М., Киселева Е.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Участие рецептора активируемого протеиназой (PAR1) в регуляторных функциях тромбина при воспалении. // Научные труды I Съезда физиологов СНГ, под редакцией Р.И. Сепиашвили. М.: Медициназдоровье. 2005., Т.1., с. 13-14. 2. Макарова А.М., Киселева Е.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Тромбин регулирует активность клеток, участвующих в воспалении через PAR рецепторы. // Материалы Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения». Москва. 2005., с. 65-66. 3. Русанова А.В., Макарова А.М., Марквичева Е.А., Грандфис К., Струкова С.М. Пептид – агонист рецептора тромбина как новый антиульцерогенный фактор. // Материалы международной конференции «Биотехнология и медицина». Москва. 2006., с. 217. 4. Русанова А.В., Макарова А.М., Струкова С.М., Марквичева Е.А., Горбачева Л.Р., Сташевская К.C., Васильева Т.В., Сидорова E.И., Беспалова Ж.Д., Грандфис К. Пептид агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процессы в модели язвы желудка у крыс. // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. Т.142. № 7. с. 42-46. 5. Макарова А.М., Русанова А.В., Горбачева Л.Р., Умарова Б.А., Струкова С.М. Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы. // Бюлл. эксп. биол. мед., 2006. Т.142. № 10. с. 382-385. 6. Макарова А.М., Русанова А.В., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Агонисты PAR-рецепторов – модуляторы процессов воспаления и репарации тканей. // Материалы XIII Международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Гурзуф. 2006. с. 232-234. 7. Makarova A., Zamolodchikova T.S., Rumsh L.D., Smirnov M., Strukova S. APC and duodenase can control an inflammation via the PARs on mast cells. // 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis Proteolysis. USA, San-Diego. 2006. р. 178-179. 8. Markvicheva Е., Stashevskaya K., Strukova S., Prudchenko I., Rusanova A., Makarova A., Vasilieva T., Bespalova J., Grandfils Ch. Biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide for gastric ulcer treatment in rats. // J. Drug Del. Sci. Tech., 2006. V.16 (4). P. 321-325. 9. Сташевская К.С., Марквичева Е.А., Струкова С.М., Русанова А.В., Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Прудченко И.А., Зубов В.П., Грандфис К. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. // Биомедицинская химия, 2006. Т.52 (1). с. 83-94. 26 10. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Русанова А.В., Струкова С.М. Роль рецептора PAR1 в протекторном противовоспалительном действии активированного протеина С // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). Москва. 2007. с. 132-133. 11. Струкова С.М., Горбачева Л.Р., Сторожевых Т.П., Макарова А.М., Ишивата С. Нейропротекторные и противовоспалительные свойства агонистов рецепторов, активируемых протеиназами. // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). Москва. 2007. с. 231. 12. Макарова А.М., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Дуоденаза активирует перитонеальные тучные клетки крысы через рецепторы 1-типа, активируемые протеиназами. // Биоорг. Хим., 2007. №4. (в печати). 13. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Смирнов М., Струкова С.М. Роль рецептора PAR1 в протекторном действии активированного протеина С при неиммунной активации тучных клеток. // Биомедицинская Химия. 2007 (в печати). 14. Макарова А.М., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Новые противовоспалительные функции активированного протеина С. // Материалы XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва. 2007 (в печати). 15. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Разнонаправленное действие сериновых протеиназ - активированного протеина С и дуоденазы на тучные клетки. // Материалы VI ферментов». Москва. 2007 (в печати). симпозиума «Химия протеолитических
