1 002353 2 Область техники, к которой относится изобретение
advertisement
1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лептину, цитокину, продуцируемому адипоцитами и оказывающему воздействие на различные типы клеток и тканей. В более частном плане это изобретение относится к принципиально новым применениям лептина в области онкологии. Предпосылки создания изобретения Лептин, продуцируемый адипоцитом цитокин, регулирующий массу тела, был идентифицирован позиционным клонированием мышиного ob гена (Zhang и др., 1994), и было обнаружено его действие как на потребление пищи, так и на термогенез (Campfield и др., 1995; Collins и др., 1996; Halaas и др., 1995; Pelleymounter и др., 1995; Weigle и др., 1995). Участки, обладающие высоким сродством к связыванию лептина, локализуются в хориоидальном сплетении; экспрессионное клонирование кДНК из этой ткани дает лептиновый рецептор (OB-R) (Tartaglia и др., 1995). Известные активности лептина передаются через его рецептор в гипоталамус. Лептиновые рецепторы тем не менее экспрессируют еще и в другие органы, особенно в почку, легкое и печень (Cioffi и др., 1996; Lee и др., 1996; Tartaglia и др., 1995). Кроме того, другая роль лептиновых рецептор-сплайсинговых вариантов, различающихся своим цитоплазматическим доменом, заключается в специфическом действии на ткань мыши (Lee и др., 1996). Поэтому в дополнение к контролю за потреблением пищи и температурой тела, лептин может оказывать влияние и на другие физиологические функции. Несмотря на то, что лептин продуцируется адипоцитами, недавний вывод о зависимости между избытком жира и высокими уровнями лептина в сыворотке крови находится в противоречии с представлением о том, что лептин понижает потребление пищи и массу тела (Considine и др., 1996; Frederich и др., 1995; Lonnqvist и др., 1995; Maffei и др., 1995). Эта зависимость и твердо установленная связь между ожирением и резистентностью к инсулину (Ferber и Golay, 1995), подтверждают, что лептин способен модулировать инсулинрегулируемые ответы. Действительно, недавно было опубликовано, что лептин значительно уменьшает базальное и инсулин-индуцированное тирозин-фосфорилирование субстрата-1 инсулинового рецептора (IRS-1). Это действие лептина на IRS-1 фосфорилирование является специфическим, поскольку не уменьшается тирозин-фосфорилирование β-цепи инсулинового рецептора (IR) (Cohen и др., 1996). Тирозин-фосфорилирование IRS-1 с помощью IR киназы является ключевой стадией в рецепторной сигнальной системе инсулина, что приводит ко многим из известных инсулиновых активностей (Araki и др., 1994; Cheatham и Kahn, 1995; Myers и др., 1994; Myers и др., 1994; 002353 2 Myers и White, 1993; Rose и др., 1994; Tamemoto и др., 1994; White и Kahn, 1994). Передача сигнала IRS-1 в прямом направлении по ходу транскрипции опосредуется несколькими ассоциированными белками, один из которых является связывающим белком-2, ассоциированным с рецептором фактора роста (GRB2) (Cheatham и Kahn, 1995). Инсулиновый рецептор (IR) рассматривают в качестве метаболического рецептора, передающего действие инсулина на гомеостаз глюкозы. Как таковой, он экспрессируется на терминационно дифференцируемые (terminally differentiated) ткани, такие как жировая ткань, печень и мышечная ткань. Однако многие исследования показали, что IR является потенциально митогенным рецептором in vitro и in vivo, когда экспрессируется в опухолевые клетки. Например, функциональные инсулиновые рецепторы (IRs) были обнаружены в нескольких клеточных линиях рака молочной железы, как было установлено тирозин-фосфорилированием IR в ответе на лечение инсулином. Кроме того, IR передает митогенный ответ в эти клетки, что установлено введением [3Н]-тимидина (Milazzo и др., 1997; Millazzo и др., 1992). До сих пор не было описано использование лептина в области онкологии в общем плане; лептин до сих пор не был описан как полезное начало для ингибирования пролиферации клеток, особенно пролиферирующих раковых клеток. Краткое изложение сущности изобретения Целью настоящего изобретения является использование лептина в качестве ингибитора клеточной пролиферации, например, использование лептина как ингибитора пролиферации раковых клеток. Другой целью настоящего изобретения является использование одного лептина или лептина в сочетании с другими терапевтическими агентами для лечения различных злокачественных образований. Еще одной целью настоящего изобретения является использование лептина, слитых с лептином белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, любых их активных фрагментов или фракций, любых их активных аналогов или производных, любых их солей и их смесей, для лечения различных злокачественных образований. И еще одной целью настоящего изобретения является использование фармацевтических композиций, содержащих один или более из вышеуказанных лептинов, белков, слитых с лептином, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, любых их активных фрагментов или фракций, любых их активных аналогов или производных, и любых их солей для лечения различных злокачественных образований. 3 Другие цели настоящего изобретения будут указаны ниже или они будут очевидны из нижеследующего раскрытия. Настоящее изобретение предлагает использовать лептин в качестве ингибитора клеточной пролиферации. Лептин может быть использован для лечения различных злокачественных образований либо сам по себе, либо в сочетании с другими терапевтическими агентами или способами. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения заключается в использовании лептина для ингибирования клеточной пролиферации карциномы молочной железы человека. Пролиферация многих типов опухолевых клеток увеличивается в присутствии различных факторов роста, таких как инсулин и инсулиноподобные факторы роста (IGF-I). Стимулирующее рост действие инсулина и IGFI на клетки опосредуется, по крайней мере, частично IRS-1/GRB2 каскадом реакций (Myers и др., 1993). Этот каскад реакций ингибируется лептином. Кроме того, IRS-1 является субстратом рецепторных киназ добавочных факторов роста и цитокинов, включающих IL-4 (ИЛ-4, интерлейкин-4) и IL-9 (ИЛ-9, интерлейкин-9) (Pernis и др., 1995; Yin и др., 1995; Yin и др., 1994). Поэтому лептин может ингибировать митогенные ответы некоторых или всех вышеупомянутых факторов роста и цитокинов, также как и других факторов роста, тем самым ингибируя пролиферацию различных типов опухолевых клеток. Представленные примеры включают ингибирование IGF-I-индуцированной пролиферации и инсулин-индуцированной пролиферации линий T-47D и MCF7 клеток рака молочной железы человека. Настоящее изобретение также предлагает использование для лечения различных злокачественных образований лептина, лептин-слитых белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора или любых их активных фрагментов или фракций, и любых их солей, также как и фармацевтических композиций, содержащих лептин, лептинслитые белки, лептиновые мутеины, агонисты лептинового рецептора, их любые активные фрагменты или фракции, или их любые соли. Более конкретно настоящее изобретение предлагает в качестве ингибиторов пролиферации опухолевых клеток использование активного агента, выбранного из группы, состоящей из лептина, лептин-слитых белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, любых их активных фрагментов или фракций, любых их активных аналогов или производных, любых их солей и любых их смесей. Примеры осуществления вышеуказанных аспектов настоящего изобретения включают: (1) применение указанного активного агента в качестве ингибитора клеточной пролиферации для лечения злокачественных образований у млекопитающих; 002353 4 (2) применение вышеуказанного активного агента в качестве ингибитора опухолей, зависимых от фактора роста; (3) применение вышеуказанного активного агента в качестве ингибитора клеточной пролиферации карциномы молочной железы человека; (4) применение указанного активного агента для лечения карциномы молочной железы человека; (5) применение указанного активного агента для ингибитора стимулирующего рост действия инсулина и IGF-I на опухолевые клетки, как опосредованное, по крайней мере частично, каскадом реакций связывающего белка-2, рецептор-ассоциированного с субстратом-1 инсулинового рецептора (IRS-1)/ростовым фактором (GRD2); (6) применение для лечения опухолей вышеуказанного активного агента в качестве ингибитора митогенных ответов в опухолевых клетках на одну или более рецепторные киназы, факторы роста и цитокины групп, состоящих из ИЛ-4 и ИЛ-9, для которых IRS-1 является субстратом; (7) применение вышеуказанного активного агента в качестве ингибитора базальной, IGF-Iиндуцированной и инсулин-индуцированной пролиферации опухолевых клеток для лечения злокачественных заболеваний молочной железы человека; (8) применение указанного активного агента, в котором указанным активным ингредиентом является лептин и в котором указанный лептин используют в качестве названного выше ингибитора или для указанного лечения. Подобным же образом, настоящее изобретение также предлагает в качестве активного агента, выбранного из группы, состоящей из лептина, лептин-слитых белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, любых их активных фрагментов или фракций, любых их активных аналогов или производных, любых их солей и любых их смесей для использования в приготовлении лекарственного средства для ингибирования пролиферации опухолевых клеток. Примеры осуществления этого аспекта изобретения включают: (1) активный агент, как указано выше, для применения в приготовлении лекарственного средства для лечения злокачественных образований у млекопитающих; (2) активный агент, как указано выше, для использования в приготовлении лекарственного средства для ингибирования опухолей, зависимых от фактора роста; (3) активный агент, как указано выше, для применения в приготовлении лекарственного средства для ингибирования клеточной пролиферации карциномы молочной железы человека; (4) активный агент, как указано выше, для применения в приготовлении лекарственного 5 средства для лечения карцином молочной железы человека; (5) активный агент, как указано выше, для применения в приготовлении лекарственного средства для ингибирования ростстимулирующего действия IGF-I и инсулина на клетки опухоли, как опосредованного, по крайней мере частично, каскадом реакций IRS-1/GRB2; (6) активный агент, как указано выше, для применения в получении лекарственного средства для ингибирования митогенных ответов в опухолевых клетках на одну или более рецепторную киназу, ростовые факторы и цитокины группы, состоящей из IGF-I, ИЛ-4 и ИЛ-9, для каждого из которых IRS-1 является субстратом, для лечения опухолей; (7) активный агент, как указано выше, для применения в получении лекарственного средства для ингибирования базальной IGF-Iиндуцированной и инсулин-индуцированной пролиферации опухолевых клеток, для лечения злокачественных заболеваний молочной железы человека; (8) активный агент, как указано выше, в котором указанным активным агентом является лептин, и указанный лептин используется для приготовления указанного лекарственного средства. Подобным же образом в другом аспекте настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного ингредиента активный агент, как отмечено выше, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель, для ингибирования пролиферации опухолевых клеток. Предпочтительные примеры этого аспекта настоящего изобретения включают: (1) фармацевтическую композицию для лечения злокачественных заболеваний у млекопитающих; (2) фармацевтическую композицию для ингибирования опухолей, зависимых от факторов роста (3) фармацевтическую композицию для ингибирования клеточной пролиферации карциномы молочной железы человека и, тем самым, для лечения карциномы молочной железы человека (4) фармацевтическую композицию для ингибирования стимулирующего рост действия IGF-I и инсулина на клетки опухолей, как опосредованного, по крайней мере частично, каскадом реакций IRS-1/GRB2 (5) фармацевтическую композицию для ингибирования митогенных ответов в опухолевых клетках на одну или более рецепторные киназы, ростовые факторы и цитокины группы, состоящей из ИЛ-4 и ИЛ-9, для каждого из которых IRS-1 является субстратом, и, тем самым, для лечения опухолей; 002353 6 (6) фармацевтическую композицию для ингибирования базальной IGF-I-индуцированной и инсулин-индуцированной пролиферации опухолевых клеток и, тем самым, для лечения злокачественных заболеваний молочной железы человека; (7) фармацевтическую композицию, в которой указанным активным ингредиентом является лептин. Настоящее изобретение также предлагает способ для лечения опухолей у млекопитающих или для ингибирования пролиферации опухолевых клеток у млекопитающих, включающий введение пациенту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, как это отмечено выше, в подходящей лекарственной форме и с помощью подходящего пути введения. Такие лекарственные формы и пути введения обычно определяются врачами после обследования пациента. Другие аспекты и предпочтительные примеры настоящего изобретения представлены ниже или будут очевидны из нижеследующего детального описания настоящего изобретения. Описание фигур Фиг. 1 иллюстрирует зависимость T-47D клеточной пролиферации от инсулина, что определено МТТ-окрашиванием; фиг. 2 - зависимость T-47D клеточной пролиферации от IGF-I, что определено МТТокрашиванием; фиг. 3 - ингибирование инсулин-индуцированной T-47D клеточной пролиферации в 10% фетальной сыворотке коровы мышиным лептином, что определено МТТ-окрашиванием; фиг. 4 - ингибирование инсулин-индуцированной T-47D клеточной пролиферации в 2% фетальной сыворотке коровы (FBS) мышиным лептином, что определялось по окрашиванию кристаллвиолетом; фиг. 5 - ингибирование IGF-I-индуцированной T-47D клеточной пролиферации в 10% фетальной сыворотке коровы (FBS) мышиным лептином, что определялось МТТ-окрашиванием; фиг. 6 - ингибирование IGF-I-индуцированной T-47D клеточной пролиферации в 2% фетальной сыворотке коровы (FBS) мышиным лептином, что определялось по окрашиванию кристаллвиолетом; фиг. 7 - ингибирование IGF-I-индуцированной T-47D клеточной пролиферации в 2% фетальной сыворотке коровы (FBS) лептином человека, что определялось по окрашиванию кристаллвиолетом; фиг. 8 - ингибирование инсулин-индуцированной MCF7 клеточной пролиферации в среде, свободной от сыворотки, мышиным лептином, что определялось по окрашиванию кристаллвиолетом; фиг. 9 - ингибирование IGF-I-индуцированной MCF7 клеточной пролиферации в среде, 7 свободной от сыворотки, мышиным лептином, что определялось по окрашиванию кристаллвиолетом. Детальное описание изобретения Настоящее изобретение касается использования лептина в качестве ингибитора пролиферации опухолевых клеток. Обычно клеточные линии человеческого происхождения, полученные из различных опухолей, могут быть выращены на культуре в присутствии ростовой среды, дополненной фетальной сывороткой теленка в концентрации примерно 10% по объему. Клеточная пролиферация в этих условиях здесь и далее определяется как "базальная клеточная пролиферация". Рост клеточных линий многих опухолевых клеток значительно увеличивается при добавлении различных факторов роста, таких как инсулин, эпидермальный фактор роста или инсулиноподобный фактор-I роста (IGF-I) к вышеуказанной культивируемой среде дополненной сывороткой. Включение лептина в ростовую среду с концентрациями в области от 3 до 600 нМ снижает как базальную клеточную пролиферацию, так и клеточную пролиферацию, зависящую от фактора роста. Результаты экспериментов на клеточной культуре, приведенные ниже на примерах, показывают, что лептин может быть полезным для ингибирования роста различных опухолей. Следовательно, лептин может быть полезен для лечения различных злокачественных образований. В предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения лептин используют для ингибирования клеточной пролиферации рака молочной железы. Когда лептин добавляют к культурам T-47D клеток карциномы протоков молочной железы (American Type Culture Collection, Rockville, MD; штамм № ATCC HTB 133), распространение их пролиферации понижается. Подобным же образом, при добавлении лептина к культурам MCF7 клеток аденокарциномы молочной железы человека (American Type Culture Collection, Rockville, MD; штамм № ATCC HTB 22), распространение их пролиферации уменьшается. Лептин ингибирует как базальную, IGF-I-индуцированную, так и инсулин-индуцированную пролиферацию T-47D и MCF7 клеток. Поэтому лептин может быть особенно полезен для лечения карциномы молочной железы. Ростовое стимулирующее действие инсулина и IFI-I на клетки опосредовано, по крайней мере, частично тирозин-фосфорилированием IRS-1 и последующей ассоциацией IRS-1 с GRB2, приводящей к митогенному ответу. Анти-митогенное действие лептина вызвано его способностью уменьшать базальное, инсулининдуцированное и IGF-I-индуцированное тирозин-фосфорилирование IRS-1, приводящее к связыванию GRB2 с IGF-I. Кроме того, IRS-1 является субстратом рецепторных киназ других 002353 8 ростовых факторов и цитокинов, включая ИЛ-4 и ИЛ-9 (Pernis и др., 1995; Yin и др., 1994). Поэтому лептин может ингибировать митогенные ответы некоторых или всех вышеупомянутых ростовых факторов и цитокинов, так же как и других митогенов, тем самым ингибируя пролиферацию различных типов опухолевых клеток. Далее настоящее изобретение относится к производным лептина и его аналогам, включая лептин-слитые белки, лептиновые мутеины, агонисты лептинового рецептора, или их активные фрагменты или фракции, или соли их всех и фармацевтические композиции, содержащие лептин, лептин-слитые белки, лептиновые мутеины, агонисты лептинового рецептора, их активные фракции или соли их всех для лечения различных типов онкологических заболеваний. При использовании в тексте настоящего изобретения, термин "мутеин" относится к аналогам лептина, в котором один или более из аминокислотных остатков замещен другими аминокислотными остатками, или исключен один или более аминокислотный остаток, или один или более аминокислотный остаток добавлен к первоначальной лептиновой последовательности без значительного изменения активности полученных в результате продуктов по сравнению с базовым типом лептина или его активными фрагментами или фракциями. Эти мутеины получают известным синтезом и/или с помощью сайт-направленной техники мутагенеза или с помощью какого-либо другого подходящего для этого способа, известного в данной области техники. Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, удовлетворительно дубликатную последовательности такого лептина, который обладает по существу одинаковой активностью с лептином или его активными фрагментами или фракциями. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин в значительной мере той же самой активностью как и лептин, обычными экспериментальными методиками, объектами которого является такой мутеин, например, при анализе простой клеточной пролиферации, какой обладает мутеин, который блокирует клеточную пролиферацию, сохраняя значительную активность лептина, и поэтому имеет, по крайней мере, одно из раскрытых применений лептина, и таким образом обладает в значительной мере одинаковой с ним активностью. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения, любой такой мутеин обладает, по крайней мере, 40%-ной идентичностью или гомологичностью в последовательности одного из лептинов. Более предпочтительно, чтобы он обладал, по крайней мере, 50%-ной, по крайней мере, 60%-ной, по крайней мере, 70%-ной, по крайней мере, 80%-ной или, более предпочти- 9 тельно, по крайней мере, 90%-ной идентичностью или гомологичностью. Мутеины лептина или его активных фрагментов или фракций, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие нуклеиновые кислоты, включают конечный набор в значительной мере соответствующих последовательностей в виде пептидов замещения или полинуклеотидов, которые могут быть, как правило, получены одним из общепринятых в данной области способов без использования дополнительных способов эксперимента, основанных на способах и руководстве, представленных в настоящем изобретении. Для детального описания химии и структуры протеинов см. Монографии Schulz, G.E. и др., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; и Creigton Т.Е., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, которые включены в данное изобретение в качестве ссылки. Для представления нуклеотидных последовательных замещений, таких как кодоновые последовательности, см. монографии Ausubel и др., supra, в §§ А.1.1-А.1.24, и Sambrook и др., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience N.Y. §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992) в разделе Appendices С и D. Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением являются изменения, известные как "консервативные" замещения. Консервативные аминокислотные замещения лептиновых полипептидов или белков или его активных фрагментов или фракций могут включать в пределах группы синонимические аминокислоты, которые обладают достаточно сходными физикохимическими свойствами, и такое замещение между членами этой группы будет сохранять биологическую функцию молекулы, Grantham, Science, Vol.185, pp.862-864 (1974). Ясно, что инсерции и делеции аминокислот могут быть также сделаны в определенной выше последовательности без изменения их функций, особенно, если инсерции или делеции включают только несколько аминокислот, например, до тридцати, и особенно, до десяти и не удаляют или заменяют аминокислоты, которые являются существенными в отношении функциональной конформации, например, цистеиновых остатков, Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). Белки и мутеины, полученные такими делециями и/или инсерциями, включены в объем границы настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы синонимические аминокислотные группы были теми группами, которые указаны в таблице I. Более предпочтительными синонимическими аминокислотными группами являются группы, указанные в таблице II, и более предпочтительно, чтобы синони- 002353 10 мические аминокислотные группы были теми, которые указаны в таблице III. Таблица I. Предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Trp Таблица II. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Туr, Ilе, Leu, Phe Tyr Phe, Туr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Аминокислота Синонимическая группа Glu Glu, Gln Met Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Trp Таблица III. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr 11 Ala Val Gly Ile Phe Туr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met Примеры осуществления аминокислотных замещений в белках, которые могут быть использованы для получения мутеинов лептина или его активных фракций для применения в настоящем изобретении, включают любые известные стадии способов, такие как представленные в патентах США RE 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Mark и др.; 5116943, Koths и др.; 4965195, Namen и др.; 4879111, Chong и др.; и 5017691, Lee и др.; и лизинзамещенные белки, представленные в патенте США № 4904584 (Shaw и др.). В другом предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения любой мутеин лептина или его активные фракции для использования в настоящем изобретении обладают аминокислотной последовательностью, по существу соответствующей аналогичной последовательности в лептине. Термин "по существу соответствующий" предназначен для включения в описание белков с незначительными изменениями в аминокислотной последовательности природного белка, которые не влияют на основные свойства природных белков, особенно не влияют на их способность, касающуюся ингибирования клеточной пролиферации. Тип изменений, которые обычно подразумеваются и включаются в выражение "соответствующие по существу", являются теми типами изменений, которые могут быть достигнуты с использованием обычных методов мутагенеза ДНК, кодирующей лептин, что приводит к некоторым небольшим изменениям и к сохранению нужной активности способом, который обсуждался выше. В соответствии с настоящим изобретением мутеины включают белки, кодированные нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизируется с ДНК или РНК, которая кодирует лептин в соответствии с настоящим изобретением при обязательных условиях. Такая нуклеиновая кислота должна являться основным кандидатом для того, чтобы определить, кодирует ли она полипептид, у которого сохраняется функциональная активность лепти- 002353 12 на, описанного в настоящем изобретении. Термин "обязательные условия" относится к условиям гибридизации и последующим условиям промывки, которые, как это принято в данной области техники, обозначаются как "обязательные". См. Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, NY, §§6.3 и 6.4 (1987, 1992), и Sambrook и др., supra. Без ограничения, примеры обязательных условий включают условия промывки на 12-20°С ниже рассчитанной Тm гибрида при исследовании, например, в растворе 2 х SSC (растворе цитрата и хлорида натрия) и 0,5%-ном растворе SDS (растворе додецилсульфата натрия) в течение 5 мин, в растворе 2 х SSC и 0,1%-ном растворе SDS в течение 15 минут; в растворе 0,1 х SSC и 0,5%-ном растворе SDS при 37°С в течение 3060 мин и затем в растворе 0,1 х SSC и 0,5%-ном растворе SDS при 68°С в течение 30-60 мин. Для специалистов в данной области техники ясно, что обязательные условия также зависят от длины ДНК последовательностей, олигонуклеотидных зондов (таких зондов, которые включают 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. При использовании смешанных зондов предпочтительно применять тетраметиламмоний хлорид (ТМАС) вместо SSC. См. Ausubel, supra. Термин "лептин-слитые белки" или просто "слитые белки" означает полипептид, включающий лептин или его активные фракции или его мутеин, слитый с другим белком, который обладает, например, продолжительным временем пребывания в жидкостях организма. Лептин или его активные фракции могут быть таким образом слиты с другим белком, полипептидом или им подобными образованиями. В настоящем контексте термин "соли" относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям присоединения кислот аминогрупп лептина, его активных фракций, мутеинов или их лептин-слитых белков. Соли карбоксильной группы могут быть получены с использованием известных в данной области техники приемов, и включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и им подобные соли, а также соли с органическими основаниями, как например соли, образованные аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и им подобные. Соли присоединения кислот включают, например, соли, образованные минеральными кислотами, такими как, например, хлористоводородная (соляная) кислота или серная кислота, и соли, образованные органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Безусловно, любые такие соли должны обладать по существу одинаковой активностью по отношению к лептину или его активным фракциям. Термин "функциональные производные", как он используется в настоящем контексте, 13 охватывает производные лептина или его активные фрагменты или фракции, и его мутеины и лептин-слитые белки, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующих как боковые цепи на аминокислотных остатках или в N- или С-терминальных группах, способами, известными в данной области техники, и эти производные включаются в настоящее изобретение до тех пор, пока они остаются фармацевтически пригодными, то есть до тех пор, пока они не нарушают активность белка, которая является по существу равной активности лептина, и не придают токсических свойств композициям, содержащим их. Эти производные могут, например, включать полиэтиленгликольные боковые цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и увеличивать пребывание лептина или его активных фракций в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученных реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Nацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные ацильными фрагментами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например таких, как серилили треонил аминокислотные остатки), образованные ацильными фрагментами. При использовании термина "активные фрагменты или фракции" лептина, лептиновых мутеинов и лептин-слитых белков настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или любые предшественники полипептидной цепи лептина, или слитых белков, содержащих любой такой фрагмент лептина, сам по себе или вместе с ассоциированными молекулами или связанными с ними остатками, например остатками сахаров или фосфатными остатками, или агрегатами любых из указанных производных, при условии что указанная фракция по существу имеет ту же активность, как и активность лептина. Далее настоящее изобретение относится к применению природных и синтетических агонистов лептинового рецептора, которые по существу подобны лептину в их способности ингибировать клеточную пролиферацию. Такие агонисты могут быть выбраны из библиотеки пептидов, из библиотеки аналогов пептидов или из случайной (рандомизированной) библиотеки органических молекул. Выбор осуществляется способами, известными в данной области техники, фактически по способности выбранных агонистов связываться лептиновым рецептором. Например, библиотека случайных пептидов может быть получена как прохроматическая (prokaryotic) экспрессия плазмид, осуществляющих ДНК кодирование для случайного пептида, слитого с белком-носителем. Другим примером 002353 14 является система фагового фенотипа, в которой фенотип экспрессии является фагом, включающим ДНК-кодирование случайного пептида, и которая включена в один из внешних фаговых белков. Фаги, кодирующие агонисты или антагонисты слитых пептидов, выделяют из фаговых библиотек, например, пэннингом на подложках, покрытых лептиновым рецептором. Сочлененные (bound) фаги выделяют и затем амплификируют в бактериях. Требуется, как правило, несколько повторов процедуры (прохождений) - пэннинг-амплификация, для того, чтобы получить фаги, экспрессирующие слитые пептиды (expressing fused peptides), обладающие высоким сродством к лептиновому рецептору. Затем выделенный фаг подвергают амплификации и определяют последовательность ДНК, кодирующую пептид. Альтернативно, библиотеки случайных пептидов или библиотеки других молекул получают твердофазным синтезом на полимерных матрицах с использованием способов, известных в данной области техники. Матрицы, несущие пептид или другую молекулу, обладающую сродством к лептиновому рецептору, выбирают из библиотеки, например, путем связывания (фиксации) меченого лептинового рецептора, например, флуоресцентно меченного лептинового рецептора. Затем отбирают положительные матрицы и определяют структуру пептида или другой молекулы, присутствующей на матрице. Если матрица несет пептид, последовательность в пептиде определяют анализом последовательности (аминокислотной) белка. Если матрица является обычной органической молекулой из библиотеки (случайной), то молекулу отделяют от матрицы и определяют ее структуру способами, известными в данной области техники, такими как массспектрометрия, ядерный магнитный резонанс и им подобные. Затем выбранные пептиды, идентифицированные по сродству к лептиновому рецептору, далее отбирают вышеописанным способом по их способности ингибировать клеточную пролиферацию. В соответствии с этим лептин, его активные фракции, лептиновые мутеины, лептиновые слитые белки, агонисты лептинового рецептора и их соли, их функциональные производные и их активные фрагменты или фракции предлагают для лечения различных злокачественных образований, предпочтительно для лечения опухолей, зависимых от ростового фактора, и более предпочтительно, для лечения карцином молочной железы. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению фармацевтических композиций, включающих фармацевтически приемлемый носитель и лептин настоящего изобретения, или его активные мутеины, слитые протеины, агонисты лептинового рецептора и их соли, их функциональные производные или их активные фракции. 15 Фармацевтические композиции настоящего изобретения получают для введения в качестве лекарственного средства смешением лептина или его производных, или агонистов лептинового рецептора с физиологически приемлемыми носителями и/или стабилизаторами, и/или наполнителями, и их получают в лекарственных формах, например, лиофилизацией в дозировочных флаконах. Метод введения может быть выбран из любых приемлемых способов введения для подобных агентов, что будет зависеть от нарушений, которые следует лечить, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, посредством локальной инъекции или местного нанесения или посредством непрерывного вливания, и т.д. Количество введенного активного соединения будет зависеть от способа введения, болезни, которую лечат, и состояния пациента. Локальное введение, например, требует более низкого количества белка по отношению к массе тела, чем внутривенное введение. Типичные активные количества лептина для инъекции составляют 0,1-1000 мкг/кг массы тела и предпочтительно составляют от 1 до 10 мкг/кг. Активные количества производных лептина и агонистов лептинового рецептора могут быть по существу теми же, которые применяются в случае лептина в расчете на моли. Лептин может вводиться больным раком, например, путем инъекций, либо отдельно, либо в сочетании с другими терапевтическими агентами или в сочетании с другими терапевтическими подходами. Далее настоящее изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими его примерами. Пример 1. Определение клеточной пролиферации МТТ-окрашиванием. Реагенты. МТТ-раствор: бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, 5 мг/мл в растворе хлорида натрия с фосфатным буфером. До использования хранится при -20°С. Растворитель: Конц. НСl (450 мкл) в 2пропаноле (100 мл). Методика. Выращивают клетки на 96 луночных планшетах в присутствии различных стимуляторов роста и ингибиторов роста. В определенное время в каждую лунку прибавляют МТТраствор (10 мкл). Инкубируют 2,5-3 ч при 37°С. Супернатант отсасывают в вакууме, используя иглу с точной калибровкой. Прибавляют растворитель (100 мкл) и снимают показатели, характеризующие поглощение, с помощью микропланшетного считывающего устройства, используя 570 нМ фильтр, с вычетом фона при 630 нм. Пример 2. Определение клеточной пролиферации окрашиванием кристаллвиолетом. Методика. 002353 16 Выращивают клетки на 96 луночных планшетах в присутствии различных стимуляторов роста и ингибиторов роста. В определенное время в каждую лунку прибавляют 12,5%ный раствор глутарового альдегида (40 мкл). Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем промывают микропланшет водой, сушат и прибавляют в каждую лунку водный раствор кристаллвиолета (0,1%, 0,1 мл). Затем микропланшет инкубируют в течение 30 мин, промывают водой и снимают показатели при 540 нм с вычетом фона при 630 нм. Пример 3. Определение инсулинзависимой T-47D клеточной пролиферации. T-47D клетки человека (American Type Culture Collection, Rockville, MD; штамм № ATCC HTB 133), были высеяны в 96 луночные планшеты, 3 х 105 клеток на мл в DMEM (в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла) и в 10%-ную фетальную сыворотку коровы (FBS), 0,1 мл на лунку. В различные лунки прибавляли человеческий инсулин в увеличивающихся концентрациях, планшеты инкубировали в течение 72 ч и затем определяли число клеток МТТ-окрашиванием (фиг. 1). Приведены средние результаты из 8 репликаций. Для дальнейших исследований, основываясь на степени клеточной пролиферации, приведенной на фиг. 1, была использована концентрация инсулина, равная 50 нМ. Пример 4. Определение IGF-I-зависимой T-47D клеточной пролиферации. T-47D клетки человека были высеяны в 96 луночные планшеты, 3 х 105 клеток на мл в DMEM и в 10%-ную фетальную сыворотку коровы (FBS), 0,1 мл на лунку. В различные лунки прибавляли человеческий IGF-I в увеличивающихся концентрациях, планшеты инкубировали в течение 3-х дней, и затем определяли число клеток МТТ-окрашиванием (фиг. 2). Приведены средние результаты из 8 репликаций. Для дальнейших исследований, основываясь на степени клеточной пролиферации, приведенной на фиг. 2, была использована концентрация IGF-I, равная 50 нг/мл. Пример 5. Ингибирование лептином инсулин-индуцированной T-47D клеточной пролиферации. T-47D клетки (3 х 105 клеток на мл) в DMEM с 10%-ной FBS были высеяны в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Клетки обрабатывались инсулином (50 нМ) в присутствии или в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина. Планшеты инкубировались при 37°С в 5%-ном CO2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались МТТ. Полученные данные приведены с учетом (±) стандартной ошибки опыта (SE, n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует инсулин-индуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 3). 17 T-47D клетки (3 х 105 клеток на мл) в DMEM дополненной 10%-ной FBS высеивались в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Через день среда заменялась DMEM, дополненной 2%-ной FBS, и через день была проведена обработка инсулином (50 нМ) в присутствии и в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина в DMEM-2%FBS. Планшеты инкубировались при 37°С в 5% СО2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались кристаллвиолетом. Данные приведены с учетом стандартной ошибки опыта, ±SE, (n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует инсулининдуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 4). Пример 6. Ингибирование лептином IGF-Iиндуцированной T-47D клеточной пролиферации. T-47D клетки (3 х 105 клеток на мл) в DMEM, дополненной 10%-ной FBS, были высеяны в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Клетки обрабатывались IGF-I (50 нг/мл) в присутствии или в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина. Планшеты инкубировались при 37°С в 5%-ном СО2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались МТТ. Полученные данные приведены с учетом (±) стандартной ошибки опыта (SE, n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует IGF-I-индуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 5). T-47D клетки (3 х 105 клеток на мл) в DMEM, дополненной 10%-ной FBS, высеивались в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Через день среда заменялась DMEM, дополненной 2%-ной FBS, и через день была проведена обработка IGF-I (50 нг/мл) в присутствии и в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина в DMEM-2% FBS. Планшеты инкубировались при 37°С в 5% CO2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались кристаллвиолетом. Данные приведены с учетом стандартной ошибки опыта, (±SE, n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует IGF-Iиндуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 6). T-47D клетки (3 х 105 клеток на мл) в DMEM, дополненной 10%-ной FBS, высеивались в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Через день среда заменялась DMEM с 2%-ной FBS и через день была проведена обработка IGF-I (50 нг/мл) в присутствии и в отсутствие определенных концентраций человеческого лептина в DMEM-2%FBS. Планшеты инкубировались при 37°С в 5% СО2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались кристаллвиолетом. Данные приведены с учетом стандартной ошибки опыта, (±SE, n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует IGF-Iиндуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 7). 002353 18 Пример 8. Ингибирование лептином MCF7 клеточной пролиферации. MCF7 клетки аденокарциномы молочной железы человека (3 х 105 клеток на мл, American Type Culture Collection, Rockville, MD; штамм № ATCC HTD 22), дополненной 6%-ной FBS, были высеяны в 96 луночные планшеты (0,1 мл на лунку). Через день среда была заменена свободной от DMEM и еще через день клетки были обработаны инсулином (50 нМ) в присутствии или в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина в свободной от сыворотки среде. Планшеты инкубировались при 37°С в 5%-ном СO2 в течение 48 ч. Затем клетки окрашивались кристаллвиолетом. Полученные данные приведены с учетом ± SE (n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует инсулин-индуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 8). Пример 9. Ингибирование лептином IGF-Iиндуцированной MCF7 клеточной пролиферации. MCF7 клетки аденокарциномы молочной железы человека в DMEM с 10%-ной FBS были высеяны в 96 луночные планшеты (3 х 104 клеток на мл, 0,1 мл на лунку). Через день среда была заменена свободной от сыворотки средой. Еще через день клетки были обработаны IGF-I (50 нг/мл) в присутствии или в отсутствие определенных концентраций мышиного лептина в свободной от сыворотки среде. Планшеты инкубировались при 37°С в 5%ном СО2 в течение 96 ч. Затем клетки окрашивались кристаллвиолетом. Полученные данные приведены с учетом ± SE (n=8). Результаты показывают, что лептин значительно ингибирует инсулин-индуцированную клеточную пролиферацию (фиг. 9). Литературные ссылки Araki, E., Lipes, M.A., Patti, М.Е., Bruning, J.С., Haag, В. r., Johnson, R.S., and Kahn. С.R. (1994). Alternative pathway of insulin signalling in mice with targeted disruption of the IRS-1 gene [see comments]. Nature 372, p186-90. Ausubel, F.M. et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology. Campfield, L.A., Smith, F.J., Guisez, Y., Devos, R., and Burn. P. (1995). Recombinant mouse OB protein: Evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks. Science 269, 546-549. Cheatham, В., and Kahn, C.R. (1995). Insulin action and the insulin signaling network. Endocr Rev 16, p117-42. Cioffi, J.A., Shafer, A.W., Zupancic, T.J., Smith-Gbur. J., Mikhail, A., Platika, D., and Snodgrass, H.R. (1996). Novel B219/OB receptor isoforms: Possible role of leptin in hematopoiesis and reproduction. Nature Medicine 2, 585-589. Cohen, В., Novick, D., and Rubinstein, M. (1996). Modulation of insulin activities by leptin. Science 274, 1185-1188. 19 Collins, S., Kuhn, С.M., Petro, A.E., Swick, A.G., Chrunyk, B.A., and Surwit, R.S. (1996). role of leptin in fat regulation. Nature 380, 677. Considine, R.V., Sinha, M.K., Heiman, M.L., Kriauciunas, A., Stephens, T.W., Nyce, M.R., Ohannesian, J.P., Marco, C.C., Mckee. L.J., Bauer, T.L., and Caro, J.F. (1996). Serum immunoreactive leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med 334, 292-295. Felber, J.P., and Golay, A. (1995). Regulation of nutrient metabolism and energy expenditure. Metabolism 44, Suppl 2, p. 4-9. Frederich, R.C., Hamann, A., Anderson, S., Lollmann, В., Lowell, В.В., and Flier, J.S. (1995). Leptin levels reflect body lipid content in mice: Evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nature Med I, 1311-1314. Halaas, J.L., Gajiwala, K.S., Maffei, M., Cohen, S.L., Chait, В.Т., Rabinowitz, D., Lallone, R.L., Вurley, S.K., and Friedman, J.M. (1995). Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene [see comments]. Science 269, р. 543-6. Lee, G.H., Proenca, R., Montez, J.M., Carroll, K.M., Darvishzadeh, J.G., Lee, J.I., and Friedman, J.M. (1996). Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature 379, 632-635. Lonnqvist, F., Arner, P., Nordfors, L., and Schalling, M. (1995). Overexpression of the obese (ob) gene in adipose tissue of human obese subjects. Nature Med I, 950-953. Maffei, M., Halaas, J., Ravussin, E., Pratley, R.E., Lee, G.H., Zhang, Y., Fei, H., Kim, S., Lallone, R., Ranganathan, S., Kerr, P.A., and Friedman, J.M. (1995). Leptin levels in human and rodent: Measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Med I, 1155-1161. Milazzo, G., Sciatta, L., Papa, V., Goldfine, I.D., and Vigneri, R. (1997). ASPB-10 insulin induction of increased mitogenic responses and phenotypic changes in human breast epithelial cells: evidence for enhanced interactions with the insulinlike growth factor-I receptor. Molec. Carcinogenesis 18, 19-25. Millazzo, G., Giorgino, F., Damante, G., Sung, C., Stampfer, M.R., Vigneri, R., Goldfine, I., and Belfiore, A. (1992). Insulin receptor expression in human breast cancer cell lines. Cancer Res. 52, 3924-3930. Myers, M.G., Jr., Sun, X.J., Cheatham, В., Jachna, B.R., Glasheen, E.M., Backer, J.M., and White, M.F. (1993). IRS-1 is a common element in insulin and insulin-like growth factor-I signaling to the phosphatidytinositol 3'-kinase. Endocrinology 132, p. 1421-30. Myers, M.G., Jr., Sun, X.J., and White, M.F. (1994). The IRS-1 signaling system. Trends Biochem Sci 19, p. 289-93. Myers, M.G., Jr., Wang, L.M., Sun, X.J., Zhang, Y., Yenush, L., Schlessinger, J., Pierce, J.H., and White, M.F. (1994). Role of IRS-1-GRB- 002353 20 2 complexes in insulin signaling. Mol Cell Biol 14, p. 3577-87. Myers, M.G., Jr., and White, M.F. (1993). The new elements of insulin signaling. Insulin receptor substrate-1 and proteins with SH2 domains. Diabetes 42, p643-50. Pelleymounter, M.A., Cullen, M.J., Baker, M.В., Hecht, R., Winters, D., Boone, Т., and Collins, F. (1995). Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice [see comments]. Science 269, p540-3. Pernis, A., Witthuhn, В., Keegan, A.D., Nelms, K., Garfein. E., Ihle, J.N., Paul, W.E., Pierce, J.H., and Rothman, P. (1995). Interleukin 4 signals through two related pathways. Proc Natl Acad Sci USA 92, 7971-7975. Rose, D.W., Saltiel, A.R., Majumdar, M., Decker, S.J., and Olefsky, J.M. (1994). Insulin receptor substrate 1 is required for insulin-mediated mitogenic signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA 91, p. 797-801. Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Tamemoto, H., Kadowaki, Т., Tobe, К., Yagi, Т., Sakura, H., Hayakawa, Т., Terauchi, Y., Ueki, К., Кaburagi, Y., Satoh, S., and et al. (1994). Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1 [see comments]. Nature 372, p. 182-6. Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N.H., Culpepper, J., Devos, R., Richards, G. J., Campfield, L.A., Clark, F.Т., Deeds, J., Muir, C., Sanker, S., Moriarty, A., Moore, K.J., Smutko, J.S., Mays, G.G., Woolf, E.A., Monroe, C.A., and Tepper, R.I. (1995). Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 83, 12631271. Weigle, D.S., Bukowski, T.R., Foster, D.C., Holderman, S., Kramer, J.M., Lasser, G., Loftonday, C.E., Prunkard, D.E., Raymond, C., and Kuijper, J.L. (1995). Recombinant ob protein reduces feeding and body weight in the ob/ob mouse. J Clin Invest 96, 2065-2070. White, M.F., and Kahn, C.R. (1994). The insulin signaling system. J Biol Chem 269, p. 1-4. Yin, T.G., Keller, S.R., Quelle, F.W., Witthuhn, B.A., Tsang, M.L.S., Lienhard, G.E., Ihle, J.N., and Yang, Y.C. (1995). Interleukin-9 induces tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 via JAK tyrosine kinases. J Biol Chem 270, 20497-20502. Yin, T.G., Tsang, M.L.S., and Yang, Y.C. (1994). JAK1 kinase forms complexes with interleukin-4 receptor and 4PS/insulin receptor substrate-1-like protein and is activated by interleukin-4 and interleukin-9 in Tlymphocytes. J Biol Chem 269, 26614-26617. Zhang, Y., Proenca, R., Maffei. M., Barone, M., Leopold, L., and Friedman, J.M. (1994). Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372, 425-432. 21 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение активного агента, выбранного из группы, состоящей из лептина, лептинслитых белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, активных фрагментов или фракций любого из них и любых их смесей, в качестве ингибиторов пролиферации опухолевых клеток. 2. Применение по п.1, отличающееся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки злокачественных образований млекопитающих. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что пролиферация опухолевых клеток зависимa от фактора роста. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки карциномы молочной железы человека. 5. Применение по п.1 или 3, отличающееся тем, что стимулирующее рост действие фактора роста на опухолевые клетки опосредовано, по крайней мере частично, субстратом-1 рецептора инсулина (IRS-1)/каскада реакций связывающего белка-2 (GBR2), рецептор-ассоциированного с ростовым фактором. 6. Применение по п.1 или 3, отличающееся тем, что фактор роста выбран из группы, состоящей из рецепторных киназ, ростовых факторов и цитокинов (IGF-1, ИЛ-4, ИЛ-9), субстратом для которых является IRS-1. 7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что пролиферация опухолевых клеток злокачественных образований молочной железы человека индуцирована инсулином. 8. Применение по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что указанный активный агент является лептином. 9. Применение активного агента, выбранного из группы, состоящей из лептина, лептинслитых белков, мутеинов лептина, агонистов лептинового рецептора, активных фрагментов или фракций каждого из них, активного аналога или производного каждого из них, солей каждого из них, а также смесей каждого из них, для приготовления лекарственного средства для ингибирования клеточной пролиферации опухоли. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки злокачественных образований млекопитающих. 11. Применение по п.9 или 10, отличающееся тем, что пролиферация опухолевых клеток зависима от фактора роста. 12. Применение по любому из пп.9-11, отличающееся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки карциномы молочной железы человека. 13. Применение по любому из пп.9-12, отличающееся тем, что стимулирующее рост дей- 002353 22 ствие фактора роста на опухолевые клетки опосредовано, по крайней мере частично, каскадом реакций IRS-1/GBR2. 14. Применение по п.9 или 11, отличающееся тем, что фактор роста выбран из группы, состоящей из рецепторных киназ, ростовых факторов и цитокинов (IGF-1, ИЛ-4, ИЛ-9), субстратом для которых является IRS-1. 15. Применение по любому из пп.9-14, отличающееся тем, что пролиферация опухолевых клеток злокачественных образований молочной железы человека является инсулин-индуцированной. 16. Применение по любому из пп.9-15, отличающееся тем, что указанный активный агент является лептином. 17. Фармацевтическая композиция для ингибирования пролиферации опухолевых клеток, включающая в качестве активного ингредиента агент, выбранный из группы, состоящей из лептина, лептин-слитых белков, лептиновых мутеинов, агонистов лептинового рецептора, активных фрагментов или фракций любого из них, и любых их смесей, а также фармацевтический носитель, разбавитель или наполнитель. 18. Применение фармацевтической композиции по п.17 для лечения злокачественных образований у млекопитающих. 19. Применение фармацевтической композиции по п.17 для ингибирования опухолей, зависящих от фактора роста. 20. Применение фармацевтической композиции по п.17 для ингибирования клеточной пролиферации карцином молочной железы человека. 21. Применение фармацевтической композиции по п.17 для лечения карцином молочной железы человека. 22. Применение по п.19, отличающееся тем, что стимулирующее рост действие фактора роста на опухолевые клетки опосредовано, по крайней мере частично, каскадом реакций IRS1/GBR2. 23. Применение по п.19 или 22, отличающееся тем, что фактор роста выбран из группы, состоящей из рецепторных киназ, ростовых факторов и цитокинов (IGF-1, ИЛ-4, ИЛ-9), субстратом для которых является IRS-1. 24. Применение по любому из пп.17-23, отличающееся тем, что указанный активный агент является лептином. 25. Способ лечения опухолей, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.17 в подходящей дозировочной форме и подходящим способом введения. 26. Способ ингибирования пролиферации опухолевых клеток у млекопитающих, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.17 в подходящей дозировочной форме и подходящим способом введения. 23 002353 24 Фиг. 1 Фиг. 6 Фиг. 2 Фиг. 7 Фиг. 3 Фиг. 8 Фиг. 4 Фиг. 9 Фиг. 5 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, ГСП-9 101999, Москва, Центр, М. Черкасский пер., 2/6
